JPS6336754B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は補酵素Q₁₀の製造方法に関する。 補酵素Ｑは、高等動物から微生物に至るまで動
植物に広く分布し、既に知られているように、生
物の末端電子伝達系の必須成分として重要な役割
を果している。構造的には６位にイソプレノイド
側鎖を有する２，３−ジメトキシ−５−メチル−
１，４−ベンゾキノンであつて、側鎖のイソプレ
ノイド基の数によつて補酵素Q₆からQ₁₀まで各種
の同族体が知られている。これらのなかで補酵素
Q₁₀（以下、CoQ₁₀と称する。）は、各種疾病に対
してすぐれた薬理作用、生理作用を有することが
明らかになるにつれて、医薬品としての需要が増
大しつつある。 このCoQ₁₀を得る方法としては、例えばソラネ
ソール等を出発原料として合成する方法も知られ
ているが、多段階の反応を要すると共に、収率が
低く、さらに純粋に分離することが困難であるた
め、工業的にCoQ₁₀を得るには不適当である。ま
た、動植物組織から抽出する方法も知られている
が、資源が限られていることや抽出操作が煩雑な
こともあつて、やはり工業的には適しない。その
ために、菌体内にCoQ₁₀を含有乃至生産する微生
物がCoQ₁₀の供給源として着目され、既に種々の
方法が提案されているが、CoQ₁₀が呼吸酵素の一
つであるところから、菌体のCoQ₁₀含有量は一般
的には極めて小さく、その分離、精製は必らずし
も容易でない。 そこで、本発明者らは、培養液よりの分離の容
易さ、菌の無害性等から酵母菌に供給源を求め、
単位菌体量当りのCoQ₁₀の含有量を増大させる条
件を広範囲にわたつて鋭意研究した結果、酵母菌
の生育培地に、生体内酸化過程における電子伝達
複合体又はに対する電子伝達阻害剤を添加し
たとき、酵母菌におけるCoQ₁₀の含有量が高めら
れることを見出して、本発明に至つたものであ
る。 従つて、本発明によるCoQ₁₀の製造方法は、
CoQ₁₀を含有する酵母菌を上記電子伝達阻害剤の
共存下に培養し、この菌体よりCoQ₁₀を採取する
ことを特徴とするものである。 既に知られているように、電子伝達複合体と
は、ミトコンドリヤ内膜中に電子伝達系成分が複
合体として存在する四種の一つで、CoQ₁₀よりチ
トクロムＣまでの電子伝達に関与し、この電子伝
達を阻害するものがこの複合体に対する電子伝達
阻害剤である。具体的にはアンチマイシンA₁、
A₃、ｎ−ヘプチルヒドロキシキノリン−Ｎ−オ
キシド、２，３−ジメルカプトプロパノール等が
挙げられる。また、同様に、電子伝達複合体は
チトクロムＣより酸素までの電子伝達に関与し、
その阻害剤の具体例としてアジ化ナトリウム、シ
アン化カリウム、一酸化炭素、硫化ナトリウム等
が挙げられる。電子伝達阻害剤については、例え
ば、「生化学実験講座第12巻エネルギー代謝と生
体酸化（上）」第249頁（日本生化学会編、(株)東京
化学同人発行（1976年）等に説明されている。本
発明において、このような電子伝達複合体又は
に対する電子伝達阻害剤の共存下に酵母菌を培
養して菌体中のCoQ₁₀の含有量を高め得たのは、
理由は必らずしも明らかではないが、これら阻害
剤がいずれもCoQ₁₀以後の電子伝達を阻害するの
で、呼吸鎖に分岐が発生し、この結果として分岐
点以前の成分が増量したのであろう。 本発明において用いる酵母菌は、キヤンデイダ
（Candida）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属
又はクリプトコツカス（Cryptococcus）属に属
するものである。 培地は汎用のものでよく、通常、炭素源及びエ
ネルギー源としてグルコース等の炭水化物や炭化
水素、窒素源として硫安、塩安等のアンモニウム
塩、コーンスチープリカ、酵母エキス等の有機窒
素化合物を適宜に使用し、このほかカリウム塩、
ナトリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、硫酸
塩等の金属塩類を適宜に併用する。 培養は通常の条件下で行なえばよく、例えば、
PHが１〜６、温度が20〜40℃、溶存酸素濃度が
10ppm以下の条件で、通気撹拌又は振とう培養に
より行なう。 本発明において培地への阻害剤の添加方法、添
加時期等は特に制限されず、例えば、培養開始時
又は培養中途において一度に添加してもよく、ま
た、菌の生育状況に応じて適宜の回数に分けて添
加してもよい。阻害剤の添加量も特に制限される
ものではないが、通常は培養液１当りについて
10^-10〜10^-2モルが適する。 尚、阻害剤の添加量が少ないために、所定量を
正確に添加しにくい場合は、該阻害剤を無菌水又
はエチルアルコール等に溶解して添加してもよ
い。 このようにして電子伝達阻害剤の共存下に酵母
菌を培養した後、菌体よりCoQ₁₀を分離、精製す
るには、常法による。例えば、先ず培養液を遠心
分離等して菌体を分離し、これをピロガロール共
存下にアルコール性アルカリでケン化すると共に
CoQ₁₀を抽出する。次に、アルコール抽出液をヘ
キサンで抽出してCoQ₁₀をヘキサンに転溶し、こ
のヘキサンを蒸発させてCoQ₁₀を得る。この精製
は種々の方法によつて行なうことができるが、工
業的にはクロマトグラフイーによる精製が有利で
ある。 以上のように、本発明の方法によれば、電子伝
達複合体又はに対する電子伝達阻害剤の存在
下に酵母菌を培養して菌体中のCoQ₁₀含有量を高
め得たので、CoQ₁₀の分離、精製が容易になると
共に、高収率でCoQ₁₀を得ることができる。 以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。なお、実施例に
おいては、CoQ₁₀の同定は標準品とのペーパーク
ロマトグラフイーの比較によつて行ない、また、
その定量はクラフエン法によつた。 実施例 １ グルコース15ｇ／、硫安３ｇ／、
KH₂PO₄3.6ｇ／、Na₂HPO₄0.9ｇ／、
MgSO₄0.3ｇ／、FeSO₄0.05ｇ／及び酵母エ
キス1.0ｇ／の組成の培地（PH6.0）を加熱殺菌
した後、キヤンデイダ・クルバータ（Candida
curvata）IFO 0732を30℃で30時間前培養した。
この培養液１c.c.を上記と同一組成の加熱殺菌した
培地100c.c.に接種すると共に、第１表に示す量に
てKCNを添加し、500c.c.坂口フラスコ内で30℃、
30時間振とう培養した。 尚、KCNの添加は、添加量0.05および0.5μモ
ル／培養液１の場合は各々KCNの３×10^-4お
よび３×10^-3重量％無菌水溶液にして添加した。 培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を分離
し、乾燥菌体２ｇあたり水15c.c.、メタノール45
c.c.、水酸化ナトリウム３ｇ及びピロガロール0.7
ｇからなる抽出液で80℃、１時間ケン化抽出し
た。この組成の液をｎ−ヘキサン75c.c.にて３回抽
出し、ｎ−ヘキサンを水洗後、減圧留去し、
CoQ₁₀を定量した。結果を第１表に示す。KCN
を添加しない場合も併せて示す。 実施例 ２ 阻害剤として硫化ナトリウムを用いた以外は実
施例１と全く同様にして第２表に示す結果を得
た。 尚、硫化ナトリウムの添加は、該硫化ナトリウ
ムの0.1重量％無菌水溶液にして添加した。 実施例 ３ 阻害剤としてアンチマイシンA₁を用いた以外
は実施例１と全く同様にして第３表に示す結果を
得た。尚、アンチマイシンの添加は、添加量
0.005および0.05μモル／培養液１の場合は、
各々アンチマイシンの３×10^-4および３×10^-3重
量％エチルアルコール溶液にして添加した。 実施例 ４ ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）
AHU−3948を用いた以外は実施例１と全く同様
にして第４表に示す結果を得た。

【表】

【表】

【表】

【表】 実施例 ５ 酵母菌としてクリプトコツカス・アルビダス・
ヴアール・アルビダス（Cryptococcus albidus
var.albidus）IFO 1420を用い、阻害剤として硫
化ナトリウムを用いた以外は実施例１と全く同様
にして第５表の結果を得た。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 補酵素Q₁₀を含有するキヤンデイダ
   （Candida）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属
   又はクリプトコツカス（Cryptococcus）属に属
   する酵母菌を、生体内酸化過程における電子伝達
   複合体又は電子伝達複合体に対する電子伝達
   阻害剤の共存下に培養し、この菌体より補酵素
   Q₁₀を採取することを特徴とする補酵素Q₁₀の製
   造方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の酵母菌をアンチ
   マイシンA₁、アンチマイシンA₃、ｎ−ヘプチル
   ヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド又は２，３−
   ジメルカプトプロパノールの共存下に培養するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の補酵
   素Q₁₀の製造方法。 ３ 特許請求の範囲第１項記載の酵母菌をアジ化
   ナトリウム、シアン化カリウム、一酸化炭素又は
   硫化ナトリウムの共存下に培養することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の補酵素Q₁₀の製
   造方法。