JPS6310997B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は補酵素Q₁₀の製造法に関する。さらに
詳しくは本発明はシユードモナス属に属する細菌
を特定の脂肪族カルボン酸を存在せしめた培地中
で培養して補酵素Q₁₀の生成を増加せしめしかも
その際有利には副生する他の補酵素Ｑ同族体の副
生を抑制して容易に補酵素Q₁₀を採取する補酵素
Q₁₀の製造法に関する。 補酵素Q₁₀は下記の構造式で示される化合物で
ありそして生体内では電子伝達系の一要素として
極めて重要な役割を果している。 この物質が各種疾病に対してすぐれた薬理作用
を示すことはすでに知られている。しかしながら
この物質を商業的に製造することは簡単ではな
い。これを動物の心臓筋肉等から抽出することは
原料が高価なうえに大規模生産が困難である。ま
た合成法による場合には収率が低く、工業的に満
足できるものではない。この点、微生物を用いる
補酵素Q₁₀の製造はその方法によつては経済的な
ものとなりうるものである。 発酵法については従来ロードトルラ、スポロボ
ロマイセス、カンデイダ、トルロプシスに属する
酵母、ノイロスポラ、アスペルギルスに属する糸
状菌、シユードモナス、アグロバクテリウム、ロ
ードスピリラム、ロードシユードモナスに属する
細菌等に補酵素Q₁₀が含有されることが知られて
いるが、その生成量は極めて低くおよそ工業的規
模で補酵素Q₁₀を生成するにはほど遠い。 本発明者等は、シユードモナス属に属する細菌
およびその変異株を用いて、その増殖培地に添加
して単位菌体当りの補酵素Q₁₀の含量を無添加の
場合に比して著しく増大させる化合物について
種々検討した結果、カルボン酸基に対してα位炭
素にオキソ基、ヒドロキシ基、またはハロゲノ基
を有する総炭素原子数４〜６個の脂肪族カルボン
酸の少くとも１種よりなる添加物の存在下に培養
すると単位菌体当りの補酵素Q₁₀の含量を著しく
増大させまたは単位菌体当りの補酵素Q₁₀の含量
を著しく増大させしかもその際他の補酵素Ｑ同族
体の副生を低下させるという知見を得た。本発明
は上記の知見に基づいてさらに研究を重ねた結果
完成されたものである。 本発明に使用する微生物はシユードモナス属に
属し補酵素Q₁₀生産能を有する細菌であればよい
が、特にシユードモナスC1−36（微工研菌寄第
5209号、特公昭61−55955号公報（特願昭54−
124727号）参照）、シユードモナスN842（微工研
菌寄第3154号、特公昭58−29078号公報（特願昭
50−122452号）参照）またはその変異株シユード
モナスN842−M16（微工研菌寄第3155号、特公昭
61−30554号公報（特願昭53−150513号）参照）
などは補酵素Q₁₀を高収率で生産するので好まし
い。 本発明における培養培地は特に制限するところ
はなく、たとえば炭素源としてはグルコース等の
炭水化物、クエン酸等の有機酸、メタノール、グ
リセリン等のアルコール類が使用でき、窒素源と
して硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アン
モニアガス等、無機物として燐酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩その他必
要に応じて微量金属塩等、さらに生育促進物質と
してビタミン等を添加してもよい。 培養に当つてはPH５〜８で20〜40℃において約
２〜10日間好気的に振盪または撹拌培養する。本
発明で使用する添加物は培養開始時かまたは菌体
増殖時に添加すると効果が認められるが、特に対
数増殖期（培養開始後24時間前後）の添加が好ま
しい。添加方法は一度に添加するかまたは発酵状
態に応じて分割して添加できる。添加物の添加量
は培養液に対して0.05〜２％（ｗ／ｖ）、好まし
くは0.1〜0.5％（ｗ／ｖ）量である。 本発明方法において使用するに適当な脂肪族カ
ルボン酸としては総炭素原子数４〜６個の脂肪族
α−ケト酸、α−ハロゲノ酸またはα−ヒドロキ
シ酸が包含される。オキソ基、ハロゲノ基または
ヒドロキシ基等の官能基がカルボン酸基に対して
α位炭素にあり、しかも分子中に末端アルキル基
が存在する場合にはそれは分枝アルキルであるこ
とが好ましい。本発明において好適なことの見出
されたこれら脂肪族カルボン酸としては次のよう
なものが挙げられる。 ケト酸 α−ケトイソカプロン酸 α−ケトイソ吉草酸 ヒドロキシ酸 α−ヒドロキシイソカプロン酸 α−ヒドロキシ吉草酸 α−ヒドロキシイソ酪酸 ハロゲノ酸 α−ブロムイソカプロン酸 α−ブロムイソ吉草酸 培養終了後、培養液から菌体を遠心または過
により常法で分離する。ここで得られた菌体中に
は補酵素Q₁₀が豊富に含有されているので、この
菌体を適当に処理後そのまま栄養剤、医療または
飼料に共することもできる。 また補酵素Q₁₀の単離が所望される場合には出
発物質としての菌体は生菌体または乾燥菌体ある
いは菌体処理物のいずれでも使用できる。補酵素
Q₁₀の単離の方法の一例としては、まずけん化す
るためにメタノール、苛性ソーダおよびピロガロ
ール混液を菌体含有液に添加し、60〜90℃におい
て１〜２時間還流加熱する。次いで不溶物を分離
した後、液相をｎ−ヘキサン等の溶媒で抽出す
る。溶媒層を水洗および脱水後濃縮する。濃縮物
をシリカゲル等のカラムに添加し、ベンゼンなど
で展開すると補酵素Q₁₀が溶出する。所定の画分
を濃縮乾固し、そしてエタノール可溶部分を冷却
放置すると赤黄色の補酵素Q₁₀の粗結晶が得られ
る。さらに再結晶を繰返すと補酵素Q₁₀の純粋な
結晶が得られる。包接化合物による分離、分子蒸
留等を行うことも効果的である。 補酵素Q₁₀の同定はUVスペクトル、融点測定、
アセトン／水（95：５）を展開溶媒とする逆相薄
層クロマトグラフイー、NMR、マススペクトル
等により標準品と比較することにより行つた。 つぎに本発明を実施例により具体的に説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ グルコース２％、KH₂PO₄0.05％、K₂HPO₄0.1
％、MgSO₄・7H₂O0.01％、N₂SO₄0.05％および
コーンステイープリカー１％を含有する培地20ml
にシユードモナスN842−M16を植え付けそして
試験管内で30℃において振盪培養した。培養１日
目にα−ヒドロキシイソ酪酸0.1％を添加して更
に３日間培養した。得られた補酵素Q₁₀の定量値
は培地１当り21mgでありそして乾燥菌体１ｇ当
り7.2mgであつた。 α−ヒドロキシイソ酪酸を添加しない培地で同
様にシユードモナスN842−M16を培養した場合、
得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り16mg
でありそして乾燥菌体１mg当り3.2mgであつた。
上記培地でα−ヒドロキシソ酪酸無添加の場合に
は補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑの含有率は10％であ
つたが、α−ヒドロキシイソ酪酸を添加するとそ
れは６％まで低下した。 実施例 ２ グルコース２％、Na₂SO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.01％、KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％およ
びコーンスチープリカー１％を含有する培地20ml
を試験管に入れ、シユードモナスN842−M16を
植菌しそして30℃で振盪培養する。培養１日目に
後記の添加物を記載の濃度で添加して更に３日間
振盪培養する。培養後、培養液（20ml）を遠心分
離して菌体を回収し、この菌体にアルカリ性メタ
ノール溶液（メタノール80ml、水20ml、
NaOH16ｇおよびピロガロール３ｇの混液）３
mlを加えそして60℃で２時間けん化する。不けん
化物をヘキサンで抽出し、ヘキサンを除去した後
エタノールを加えて溶液とする。このエタノール
溶液について275nｍにおける酸化型および還元
型の吸光度を測定し、標品CoQ₁₀の検量線を用い
て総CoQ生産量を計算する。また高速液体クロマ
トグラフイーによりCoQ₁₀の含有比を求め、総
CoQ生産量とCoQ₁₀含有比よりCoQ₁₀生産量と乾
燥菌体当りのCoQ₁₀含有率を計算する。なお乾燥
菌体収量は660nｍの濁度より計算した。結果を
次表に示す。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 菌体内に補酵素Q₁₀の蓄積能を有するシユー
   ドモナス属に属する細菌をカルボン酸基に対して
   α位炭素にのみオキソ基、ヒドロキシ基またはハ
   ロゲノ基を官能性置換分として有する総炭素数４
   〜６個の脂肪族カルボン酸の少なくとも１種より
   なる添加物の存在下に培地中で培養しそして生成
   した菌体より補酵素Q₁₀を採取することを特徴と
   する、補酵素Q₁₀の製造法。 ２ 前記添加物が培養液に対して0.05〜２％
   （ｗ／ｖ）の量で添加される特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。 ３ 前記添加物が細菌の対数増殖期に培地に添加
   される特許請求の範囲第１項記載の製造法。