JPS5857157B2 - 発酵法によるコエンチ−ムｑ↓１↓０の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法によるコエンチームＱ１ｏ（以下Ｃｏ
Ｑ１０と略す）の製造法に関するものであり、更に詳し
くは、アグロバクテリウム属に属するＣ０ＱＩＯ生産能
を有する微生物の抗癌・抗生物質、コエンチームＱアナ
ログ、糖類の各種薬剤の少すくとも１種に対する抵抗性
変異株あるいはオキサジン系、チアジン系色素に感受性
変異株を栄養培地に培養し、培養液中にＣ３ＱＩＯを生
成蓄積せしめ、該培養液から、Ｃ０ＱＩＯを採取するこ
とを特徴とするＣ３ＱＩＯの製造法に関する。

ＣｏＱ□。

は、広く生物界に分布し、電子伝達系において重要な機
能を持つことが知られているが、最近、本物質が、心不
全症、筋ジストロフィー症その他の疾病に対し、顕著な
薬理効果を有することが明らかとなった。

従来、微生物を用いる発酵法によるＣ３ＱＩＯの製造法
としては、各種の酵母類を培養する方法（特公昭４８−
８８３６号公報、同４８−２５５１７号公報、同５１−
１９０３４号公報、特開昭５２−１０５２８８号公報ら
）あるいは、ロドシュードモナス（特公昭４７−７９５
４号公報、同４８２１５１９号公報）、アルカソゲネス
（特公昭５１−１９０３４号公報）、シュードモナス（
特公昭３６−１４２９３号公報、特開昭５２−４４２９
０号公報、同５２−４７９９０号公報）、プロテウス（
特公昭３６−１４２９３号公報）らの各種細菌類を用い
る方法が知られている。

しかしながら、これらの方法はいずれもＣ６ＱＩＯ生成
量が低くまだ満足すべきものではない。

本発明者らは、さらにすぐれた発酵法によるＣ０ＱＩＯ
の製造法について鋭意検討した結果、アグロバクテリウ
ム属に属し、ＣｏＱ１ｏ生産能を有する微生物の抗癌・
抗生物質、コエンチームＱアナログ、糖類の各種薬剤の
少なくとも１種に対する抵抗性変異株あるいはオキサジ
ン系あるいはチアジン系色素に感受性変異株が親株より
著量のＣ□Ｑｔｏを生産することを見い出し、本発明を
完成するに到った。

アクロバクテリウム属細菌がＣ０ＱＩＯを生成蓄積する
ことは、Ｂｉｏ ｃ ｈｅｍｉｃ ａ ＩＪｏｕｒｎａ
ｌ、１１１，４６１．（１９６９）においてすでに公知
であるが、上記のごとき、薬剤抵抗性あるいは感受性の
附与により、ＣｏＱｌｏの生産力価が増大するという事
実については従来、全く知られておらず、本発明者らに
よる知見が最初のものである。

以下、該知見にもとづいてなされた本発明について詳細
に説明する。

本発明における使用菌としては、アグロバクテリウム属
に属し、Ｃ０ＱＩＯ生産能を有する微生物の抗癌・抗生
物質、コエンチームＱアナログ、糖類の各種の薬剤の少
なくとも１種に抵抗性の変異株あるいはオキサジン系、
チアジン系色素に感受性を有する変異株であればいずれ
も使用可能である。

変異株の誘導に用いる抗癌・抗生物質としては、アドリ
アマイシン、ドーノマイシン、アクチノマイシンーＤ１
アンチマイシン−Ａ１ピエリシジン、ポリミキシン−Ｂ
１バシトラシン、グラミシジンＳ、コリスチン、オリゴ
マイシンなど、コエンチームＱアナログとしては、アド
リアマイシン、ドーノマイシン、２．６−ディブロモ−
６−イソプロピ−ルーＰ−ベンゾキノンなど、糖類とし
ては、グルコース、シュークローズ、フラクトースなど
オキサジン系色素としては、ブリリアントクレジルブル
ー、チアジン系色素としては、メチレンブルーなどが挙
げられる。

又、アグロバクテリウム属に属し、ＣｏＱ１ｏ生産能を
有する微生物で、呼吸阻害剤例えば、アミタール、ロチ
ノン、ピエリシジン、Ｐ−クロロ−マーキュリ安息香酸
、テノイルトリフルオロアセトン、マロン酸、オキザロ
酢酸、アンチマイシンＡ１ ｎ−へブチルヒドロキンキ
ノリン−Ｎ−オキシド、２，３−メルカプトプロパツー
ル、２，６−ディブロモ−６−イソプロピ−ルーＰ−ベ
ンゾキノン、キナクリン、プリマキン、クロロキンなど
、ステロール合成阻害剤、例えば、シトリニン、バシト
ラシン、ラノステロールなど、サルファ剤としては、サ
ルファメサジン、サルファグアニジン、サルファダイア
ジンなど、リピド・サイクル反応阻害剤例えば、バシト
ラシンなど、アミノ酸アナログ、例えば５−メチルトリ
プトファン、５−フルオロトリプトファン、トリプトフ
ァンハイドロキサメイト、Ｐ−フルオロフェニルアラニ
ン、３−アミノチロシン、チロシンハイドロキサメイト
、エチオニン、メチオニンハイドロキサメイト、セレノ
シスチンなど、核酸アナログ、例えば、６−メルカプト
プリン、２−フルオロアデニン、６−アザウラシルなど
の各種の薬剤の少なくとも１種に抵抗性の変異株も本発
明に使用されることが予想される。

本発明方法において使用する各種薬剤抵抗性あるいは、
感受性変異株の誘導は、通常の変異処理により行われる
が、その具体的な方法の一例を次に示す。

ブイヨン・スラント培地（イーストエキス０．５ｇ／ｄ
ｌ、肉エキス１ｇ／ｄｌ、ペプトン１．ｉ／ｄｌ、Ｎａ
ＣｌＯ，５ｇ／ｄｌ、寒天２９／ｄｌ、 ＰＨ７，２
）上で３０℃、２４時間生育させたアグロバクテリウム
属に属しＣ３Ｑ１ｏ生産能を有する微生物（親株）の菌
体を、Ｎ−メチル−Ｒ−ニトロ−Ｎ−＝トロングアニジ
ン２■／１１１１を含む０．０５Ｍ）リス−マレエート
緩衝液（ＰＩ（６，０）中に、約１０７〜１０９菌体／
ａになるように懸濁し、室温に、２０分間放置する。

その後３，０００ｒｐ■で１５分間遠心分離を行い、同
一緩衝液に再び懸濁する。

その懸濁液１１ｆＬｌを栄養培地（グルコース２９／ｄ
ｉ、ペプト７１１／／ｄｌ、イーストエキ、ｚ、 １
ｇ／ｄｉ、 ＮａＣＡＯ，５ｇ／ｄｌ、 ＰＨ７，２）
１０１１Ｌｌに植菌し３０℃で一夜培養集菌し、上記
緩衝液で洗浄後、同一緩衝液に約１０６〜１０７菌体／
ａになるよう懸濁する。

薬剤抵抗性変異株の場合は、上記懸濁液０．１ＴＬｌを
親株の生育を阻止する濃度の薬剤（１０４７ｖｄｌ−１
０，０００４７ｍ１りを含んだ最小培地寒天平板（リン
ゴ酸１ｇ／ｄｌ、リン酸−アンモニウム０．１ｇ／ｄ１
１塩化カリウウ０．０２．９７ｄｌ、硫酸マグネシウム
０．０２ ｇ／ｄｉ、ビオチン３０逝／１１トレースエ
レメント※１ｍ１７ｉ、寒天２９７ｄｉ１ｐＨ７，２）
上に塗布し、出現した集落を抵抗性変異株として選択し
た。

※トレースエレメントは、ホウ酸ソーダ・１０水和物８
８■、モリブデン酸アンモニウム・４水和物３７■、硫
酸亜鉛・７水和物８．８■、硫酸銅・５水和物２７０■
、塩化マンガン・４水和物７．２■、および塩化第二鉄
・６水和物９７０１′ｖを蒸留水に溶かして１１とした
ものをいう。

薬剤感受性変異株の場合は、上記菌体懸濁液を同一緩衝
液で１０２〜１０４菌体／ＴＩＬｌになるよう希釈後、
その０．１−を親株の生育を阻止しない適当濃度（ｉｏ
〜１０００４／ｍｌ！ ）の薬剤を含む最小培地寒天平
板上に塗付し、出現した小集落を感受性株として選択す
るか、または、菌体懸濁液０．１縦を、完全培地寒天平
板（グルコース２ｊｌ／ｄｌ、ペプトン１９７ｄｌ、イ
ーストエキス１ ｇ／ｄｌ。

Ｎａ Ｃ１３０，５ｇ／ｄｉ、寒天２ ｇ／ｄｌ、 Ｐ
Ｈ７，２）上に塗付し、出現した集落を、釣菌し、最小
培地寒天平板と、親株の生育を阻止しない適当濃度の薬
剤を含む最小培地寒天平板上に塗り付け、最小培地寒天
平板上でのみ生育するものを感受性変異株として選択し
た。

本発明方法に使用する微生物の培養培地としては、炭素
源、窒素源、無機物、その他の栄養物を程よく含有する
培地ならば、合成培地、天然培地のいずれもが使用でき
る。

培地に使用する炭素源は、使用菌が利用可能なものであ
れば、いずれの種類を用いてもよい。

すなわち、グルコース、フラクトース、シュークローズ
、廃糖蜜、でんぷん、でんぷん加水分解物などの炭水化
物、グリセリン、ソルビトールなどの糖アルコール、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アラニン、グリ
シンなどのアミノ酸類、乳酸、ピルビン酸、酢酸、リン
ゴ酸、ギ酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、脂肪酸
などの有機酸、ｎ−パラフィンなどの炭化水素、メタノ
ール、エタノール、プロパツール、ブタノールなどのア
ルコール類を単独であるいは、組み合せて使用できる。

使用菌が栄養要求性を示す場合には、その要求性物質が
培地中に添加される。

また、培地あるいは培養液中に各種の物質、例えば、ア
ミノ酸類、核酸関連物質、ビタミン類、有機酸類、脂肪
酸類、アルコール類、ステロール類、その他ｃＯＱ、。

生合成前駆物質およびその関連化合物を培地に添加する
ことによりＣ０ＱＩＯ生成量が増加する場合がある。

培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件下でお
こなわれる。

培養中、培養液のＰＨは５〜９程度が好適である。

中和剤としては、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水
酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム
、水酸化カリウム、尿素らが用いられる。

培養期間は通常３〜７日間で、培養液中および菌体中の
両方にＣｏＱｌｏが蓄積するが、大部分は菌体中に蓄積
する。

培養物からのＣ０ＱＩＯの単離は常法により溶媒抽出そ
の他の操作によっておこなうことができる。

以下に実施例を示す。

実施例 １ グルコース２ｇ／ｄｉ、ペプトン１ｇ／ｄｌ、酵母エキ
ス１ｇ／ｄｉ、食塩０．５ｇ／ｄｌの組成よりなるＰ
Ｈ７，２の種培地３００１ｒＬｌを２１容三角フラスコ
に入れて殺菌する。

これに、アグロバクテリウム・ツメファシェンスＫＹ８
５８２（微工研寄託受理番号第４５００号）（抗癌物質
であり、ＣｏＱｌ。

のアナログであるドーノマイシンに抵抗性の変異株）を
接種し、３０℃で２４時間振盪培養する。

該培養液３００ｄを下記の組成の発酵培地３１を含む５
１容ジヤー・ファーメンタ−に接種し、６ｏｏｒｐｍの
回転数、１分間当り３１の通気、温度３０℃の培養条件
下で９６時間通気攪拌培養した時培養液１４当り５２．
３■のＣ０ＱＩＯが生成し、Ｃ０Ｑ９の副生量は０．１
１ｎ９以下である。

なお、培養にあたっては、２４時間目に廃糖蜜を５ｇ／
ｄｌ（糖濃度換算）フィードする。

又、同じ条件で、アグロバクテリウム・ツメファシェン
スの野生株ＡＴＣＣ４４５２を培養した時のＣ０ＱＩＯ
の生産量は、２８．３■／ｌである。

発酵培地の組成：廃糖蜜５ｇ／ｄｌ（糖濃度換算）、硫
酸アンモニウム０．５ｇ／ｄｌ、リン酸−カリウム０．
０５ｇ／ｄｌ、リン酸二カリウム０．０５ ｉ／ｄｌ。

硫酸マグネシウム・７水塩０．０２５９／ｄｌ、コーン
・スチープ・リカー０．５ｇ／ｄｌ、ペプトン１ｊ；ｌ
／ｄ１１炭酸カルシウム２ｇ／ｄｌ、（ＰＨは殺菌前に
アンモニア水で７．２に調整する。

）ついで培養液２１を遠心分離し、乾燥重量として、７
３ｇに相当する湿菌体をうる。

これを２００−の水に懸濁し、メタノール４００ ｍｌ
、水酸化ナトリウム８０ｇ、ピロガロール１５ｇを加え
８５℃で４５分間還流ケン化後放冷し、ｌｌづつのｎ−
ヘキサンを加え２回抽出操作を行う。

ｎ−へキサン層を集めてこれを無水芒硝を加えて脱水後
減圧下で濃縮し残渣な４０１１Ｌｌのアセトンに溶解し
て、不溶物を沢別除去した後、再び濃縮し、残渣を１０
ＴｒＬｌのアセトンに溶解後シリカゲルカラムに流しベ
ンゼンにて溶出する。

ＣｏＱ１０を含む両分を集めて濃縮し残渣を５ＴＬｌの
エタノールに溶解後冷却することにより黄色のＣｏＱｔ
ｏの粗結晶４９■を得た。

本市から更にエタノールで再結して得た結晶は、逆相薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値、高速液体クロマトグラ
フィーのリテンションタイム、融点、ＮＭＲスペクトル
、元素分析値、赤外吸収スペクトル、紫外部吸収スペク
トル曲線が、Ｃ０ＱＩＯの標品と一致する。

実施例 ２ 種菌として、アグロバクテリウム・ツメファシェンスＫ
Ｙ８５８５（微工研菌寄第４５０２号）（抗癌物質であ
るアクチノマイシンーＤに抵抗性の変異株）、アグロバ
クテリウム・ツメファシエ峯辛ンスＫＹ８５８３（微工
研菌寄第４５０１号）（グルコース抵抗性変異株）を用
いるほかは、実施例１と同様に実施した場合のＣｏＱ１
０の生産量を第１表に示す。

実施例 ３ 種菌として、アグロバクテリウム・ツメファシェンスＫ
Ｙ８５８６（微工研菌寄第４５０３号）（ブリリアント
・クレジル・ブルーおよびメチレンブルーに感受性の変
異株）を用いるほかは、実施例１と同様に実施した場合
、５２．６■／ｌのＣ０ＧＩＯを生産する。

又、同様にアクロバクテリウム・ツメファシェンスＡＴ
ＣＣ４４５２（ｆｉ株（野生株）〕を培養した時のＣ０
ＱＩＯの生産量は２８．０Ｔｔ）９／ｌである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アグロバクテリウム属に属し、コエンチームＱ工。 生産能を有する微生物の抗癌・抗生物質、コエンチーム
   Ｑアナログ、糖類の各種薬剤の少なくとも１種に対する
   抵抗性変異株あるいは、オキサジン系、チアジン系色素
   に感受性の変異株を栄養培地に培養し、培養液中にコエ
   ンチームＱ１ｏを生成蓄積せしめ、該培養液より、コエ
   ンチームＱ□。 を採取することを特徴とする発酵法によるコエンチーム
   ＱＩＯの製造法。