JPS637757B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるマイトマイシンＡの新規
製造法に関する。更に詳しくは、本発明はストレ
プトミセス属に属し、マイトマイシンＡ生産能を
有し、かつ(i)マイトマイシンＣ生産能欠失性およ
び(ii)トリプトフアンアナログ耐性の少なくとも１
つの性質を有する微生物を用いる発酵法によるマ
イトマイシンＡの製造法に関する。 マイトマイシンＡおよびマイトマイシンＡの誘
導体は抗腫瘍性物質として知られ医薬品として期
待されている化合物である。 従来発酵法によりマイトマイシンＡを製造する
方法が知られている（特公昭34−7597、特公昭３
−19746）がこの方法では併産する他のマイトマ
イシン類、たとえばマイトマイシンＢ、Ｃ、Ｆな
どの方が多く生産されるので、マイトマイシンＡ
の生産高が低く、より高収率にマイトマイシンＡ
を生産する方法の開発が望まれていた。 本発明者らは、マイトマイシンＡの工業的生産
法について研究を行なつた結果、ストレプトミセ
ス属微生物のある種の変異株を使用した場合マイ
トマイシンＣが培養物中に生成せず、マイトマイ
シンＡの蓄積が顕著に増大することを見出し本発
明を完成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明によれば、ストレプトミセス属に属し、
マイトマイシンＡ生産能を有し、かつマイトマイ
シンＣ生産能欠失性およびトリプトフアンアナロ
グ耐性の少なくとも１つの性質を有する菌株を培
地に培養することによりマイトマイシンＡを培養
物中に著量蓄積せしめ、これを採取することによ
り、高収率にマイトマイシンＡを製造することが
できる。ここでマイトマイシンＣ生産能欠失性と
は、菌体および培地中にマイトマイシンＣが全く
生産されない場合および実質的に生産されない場
合のいずれをも含む。 本発明に用いる菌株としては、ストレプトミセ
ス属に属し、マイトマイシンＡ生産性を有し、か
つマイトマイシンＣ生産能欠失性およびトリプト
フアンアナログ耐性の少なくとも１つの性質を有
する菌株であれば、いずれも用いることができ
る。具体的に好適な菌株の一例としてはストレプ
トミセス・ケスピトーズス（Streptomyces
Caespitosus）AN―９（NRRL／12513）および
ストレプトミセス・ケスピトーズスＴ―17―135
（NRRL 12508）があげられる。これらの菌株は
ストレプトミセス・ケスピトーズスATCC27422
を変異誘導することによつて得られた変異株であ
る。具体的変異方法について以下に示す。 完全培地（グルコース１ｇdl、ペプトン0.2
ｇ／dl、肉エキス0.1ｇ／dl、酵母エキス0.1ｇ／
dl、寒天２ｇ／dl、PH7.2）上で28℃５日間生育
させたストレプトミセス・ケスピトーズス
ATCC27422の胞子をＮ―メチル―N′―ニトロ―
Ｎ―ニトロソグアニジン（以下NTGという）
200γ／mlを含むトリス―マレート緩衝液（PH6.0）
中に懸濁し室温に１〜３時間放置する。胞子を分
離洗滌し完全培地寒天上に塗布して28℃、３日間
培養する。出現した集落を完全培地液体に28℃で
３日間培養し、生産されるマイトマイシン類を薄
層クロマトグラフイーにより分離したのちクロマ
トスキヤナー分析装置による分別定量を行う。分
別定量の結果マイトマイシンＣの生産が認められ
ない菌株を選び出す。 その菌株の１つが前記ストレプトミセス・ケス
ピトーズスAN―９（NRRL12513）である。 この菌株をさらに前記と同様にNTG処理を施
し、得られる胞子をトリプトフアンアナログ
100γ／mlを含有する完全培地に塗布し、28℃で
５日間培養を行なう。出現した集落をトリプトフ
アンアナログ耐性変異株として分離する。このよ
うにして得られたトリプトフアンアナログ耐性の
変異株の１つがストレプトミセス・ケスピトーズ
スＴ―17―135（NRRL12508）である。 本発明に使用する微生物の培養培地としては、
炭素源、窒素源、無機物、その他栄養物を程よく
含有する培地ならば、合成培地、天然培地のいず
れもが使用できる。すなわち炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、シユークロース、廃糖
密、でんぷん、グリセリン、大豆油など、窒素源
としては、大豆粉、酵母、コーンスチープリカ
ー、ペプトン、肉エキス、大豆粕などを使用する
ことできる。 培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条
件下でおこなわれる。培養中のPHは５〜８が好適
であり調整剤としては、水酸化ナトリウム、炭酸
カルシウムなどが用いられる。培養は通常25〜35
℃で３〜４日間行う。培養液中からのマイトマイ
シンＡの単離は、吸着剤による吸着、溶媒抽出等
常法による操作によつておこなうことができる。
以下に実施例を示す。 実施例 １ グルコース1.5ｇ／dl、酵母１ｇ／dl、デンプ
ン0.5ｇ／dl、食塩0.5ｇ／dl、炭酸カルシウム0.3
ｇ／dlの組成よりなるPH7.2の種培地300mlを２
容三角フラスコに入れ殺菌する。これにストレプ
トミセス・ケスピトーズスＴ―17―135を接種し、
28℃、３日間振盪培養する。一方発酵培地とし
て、シユークロース２ｇ／dl、デンプン１ｇ／
dl、大豆粉４ｇ／dl、食塩0.5ｇ／dl、炭酸カル
シウム0.3ｇ／dlからなるPH7.2の培地３を５
容ジヤーフアーメンターに入れ殺菌する。これに
種培養液300mlを接種し、30℃400r.p.m.3／min
通気の条件下で３日間培養した。同時に親株であ
るストレプトミセス・ケスピトーズス
ATCC27422についても同一条件下で培養した。
このときのマイトマイシン類の生成量は表―１に
示すとおりである。トリプトフアンアナログ耐性
かつマイトマイシンＣ生産能欠失性変異株は親株
に比し、マイトマイシンＡ生成量は約６倍であ
り、マイトマイシンＣは全く生成せず、マイトマ
イシン類中のマイトマイシンＡ生成比率は親株に
比し約５倍に向上し、マイトマイシンＡの工業的
生産が可能になつたことがわかる。

【表】 生成比率

上記マイトマイシンＡ，Ｂ，Ｃは菌体除去した
培養液を50倍に濃縮し、シリカゲル薄層クロマト
（シリカゲル Merck 5721，10μスポツト）を
行い、酢酸エチル、アセトン（３：２容量比）に
展開し、クロマトスキヤンナーにより分別定量を
行なうことにより検出した。尚、この検出方法に
よる検出限濃度は1γ／mlである。 実施例 ２ 実施例１の方法で得られたストレプトミセス・
ケスピトーズスＴ―17―135の培養終了発酵液３
を直ちに遠心分離し菌体を除去する。液に20
ｇの活性炭を加え、マイトマイシンを吸着させ
る、この活性炭を分離後アセトン80mlを加えPH６
程度で撹拌抽出し、50℃以下で濃縮する。この濃
縮液をアルミナ柱に通過させ、メタノール濃度を
かえたクロロホルム溶液にてマイトマイシンをク
ロマト溶出する。マイトマイシンＡの区分をさら
にアルミナ柱に通過させ、酢酸エチルにて抽出す
る。これを50℃以下で減圧濃縮してマイトマイシ
ンＡの結晶36mgを得る。 実施例 ３ グルコース１ｇ／dl、酵母１ｇ／dl、デンプン
0.5ｇ／dl、食塩0.5ｇ／dl、炭酸カルシウム0.3
ｇ／dlからなるPH7.2の培地500mlを２容三角フ
ラスコに入れ殺菌する。これにストレプトミセ
ス・ケスピトーズスAN―９（NRRL／12513）を
接種し、28℃、３日間振盪培養する。 一方発酵培地として、フラクトース２ｇ／dl、
デンプン１ｇ／dl大豆粉４ｇ／dl、食塩0.5ｇ／
dl、炭酸カルシウム0.5ｇ／dlからなるPH7.2の培
地30を50容ジヤーフアーメンターに入れ殺菌
する。これに種培養液300mlを接種し、30℃、
300r.p.m、15／min通気条件下で３日間培養す
る。また同時に親株であるストレプトミセス・ケ
スピトーズスATCC27422についても同一条件下
で培養する。このときのマイトマイシンＡの生成
量は、親株ATCC27422の場合10γ／mlに対し、
変異株AN―９株の場合、18γ／mlと約２倍のマ
イトマイシンＡ生成量であつた。 また親株ATCC27422はマイトマイシンＣを
19γ／mlを副生したが、変異株AN―９株はマイ
トマイシンＣを全く副生しなかつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属し、マイトマイシン
   Ａ生産能を有し、かつ(i)マイトマイシンＣ生産能
   欠失性および(ii)トリプトフアンアナログ耐性の少
   なくとも１つの性質を有する微生物を培地に培養
   し、培養物中にマイトマイシンＡを生成蓄積さ
   せ、該培養物からマイトマイシンＡを採取するこ
   とを特徴とする発酵法によるマイトマイシンＡの
   製造法。