JPS6229992A - ムコン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ムコン酸の製造方法に関する。

（従来の技術） 従来、安息香酸より、″：Ｉリネバクテリウム属に属す
る変異株を用いてムコン酸を産生ずる方法が知られてい
る（醗酵工学筒ｊ！巻第λ号。

りｊ−２７，／り７７）。また、アルスロバクタ−ｅｐ
、（Ｄ８Ｍコｏ４！λ７）を用いる方法も知られている
（アーカイプズ　オブ　マイクロバイオロジー（ムｒｃ
ｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）、　／１０　、コｊ３
−２１ｔ　）。

本発明者らは、安息香酸を炭素源とし、さらに産生量の
向上したムコン酸の製造法を得るべく種々検討した結果
、アルスロバクタ−属に属する特定の微生物が安息香酸
をムコン酸に高収率で変換する能力を有することを見出
し、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、ムコン酸を生産する能力を
有するアルスロバクターｓｐ、Ｔ８６２６またはその突
然変異株を、炭素源として安息香酸を使用して培養し、
培養物からムコン酸を得ることを特徴とするムコン酸の
製造方法にある。

（発明の構成） 以下、本発明の詳細な説明する。

まず１本発明において使用される微生物は。

アルスロバクタ−属に属し、ムコン酸を生産する能力を
有するものであり、たとえば、アルスロバクタ−（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｏｔｅｒ）ｓｐ、ＴｒＡ、２ｔ（微工研菌
寄第７２！λ号）およびその変異株アルスロバクタ−（
Ａｒｔｈｒｏｂａｏｔｅｒ）ｓｐ、ＴｒｔＪｔ−１１（
微工研菌寄第７２ｊ３号）が挙げられる。

アルスロバクタ−ｓｐ、Ｔｌｒ＆、２４菌は本発明者等
により土壌から分離された細菌であり、その細菌学的性
状は次の通りである。

イ　顕微鏡的特徴 普通寒天培地上、３０℃、１週間の培養的性質（コロニ
ーの特徴）。

■　外　　　形　　：　　円形 ■大きさ　：、２〜≠論 ■　表面の隆起：　凸状 ■　表面の形状：　平滑 ■　光　　沢　：　鈍光 ■　色　　調　：　はじめ灰白色、のちに黄色を呈する
。

■　透明度　：　不透明 ■　周　　　縁　　：　　金縁 普通寒天培地上、３０℃、３時間〜２４を時間培養中の
形態的性質 ■　細胞形態　：　培養後３時間位まで、細胞は不均一
に伸長し、長い桿状〜梶棒状になる。その後、中央部に
隔壁が形成され、細胞は湾曲状に曲り、漸次分裂をくり
返す。に時間〜ｒ時間位までこの補力状態（Ｂｅｎｄｉ
ｎｇ）か進み、７．２時間以降は、はとんどの細胞力性
桿菌〜双球状、ビーズ状に連鎖した球状を呈し、整一な
状態になる。

■　多形性　：　有する。比較的短かい糸状〜短桿状〜
球状に変化する。

■　分裂様式　：　Ｂｏｎｄｉｎｇ　ｔｙｐｅ■　運動
性　：　無 ■　胞子形成　：　無 ■　グラム染色　：　培養開始後８時間位までは弱い陽
性を呈し、１２時間以後は陰性を示す。

■　抗酸性　：　陰性 口　生理的性質 ■　嫌気条件下での生育：　− ■　空気中での生育　　：　十 ■　カタラーゼ　　　　：　十 ■　オキシダーゼ　　　；　− ■　Ｏ’Ｆテスト　　　　：　− ■　硝酸塩の還元　　　二　十 ■　ゼラチンの加水分解：　± ■　カゼインの加水分解二　− ■　デンプンの加水分解：　士 ■　ウレアーゼ　　　　　　＋ ■　３チＭａｉｌ　　での生育二　十 ０１０％Ｍａｉｌでの生育二　− ０生育温度域 ＋　　℃　　　　　　　　　　　　　−ｉｏ　　℃　　
　　　　　　　　　　±λＯ℃廿 、２６℃丑 ３ｏ　　℃　　　　　　　　　　　　　（−ｔ＋３７　
℃　　　　　　　　　　　　　４汁グ一℃士 ■　糖類の資化性（酸の生成）：　結果は表１に示す。

■　有機酸の資化性　　：　結果は表コに示す。

ハ　生化学的性質 ■　ＤＮＡの塩基組成　： ＧＣ含量　６６．８％ ■　細胞壁の主要彦アミノ酸組成：　リジン■　クリコ
ヒート・テスト：　アシル型■　ペプチドグリカン・タ
イプ： Ｌｙｓ　−Ａｌａ型 二　分類学的考察 高次の分類学上の位置について、 本菌株Ｔ−４ｔ２ｔは、セルサイクル（Ｃθ１１ｃｙａ
１ｅ　）の一時期にコリネ型形態を持つ、分裂様式はＢ
ｅｎｄｉｎｇｔｙｐｅ　を示す、わずかに分岐した多形
性を有する。ダラム陽性の細菌であること、ＤＮＡのＧ
Ｏ含量が７０ｑ６の高い値を示すことから、コリネバク
テリウム科（０ｏｒｙｎａｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　
）、ミコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａａ
ｅａｅ　）　、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃ＋
θａθ）に帰属する細菌と思われる。

これらの科の中で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｏｅａｅ
　　とＮｏｃａｒｃｉｉａｃｅａｅ　は、細胞壁の主要
なアミノ酸組成としてＤＬ−ジアミノピメリン酸を持つ
こと、ペプチドグルカン糖鎖部はグリコリル型を示すこ
とによつて特徴づけられている。

一方、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅｃａは、細胞
壁組成に多様性がみられ、ＤＬ−、ＬＬ−ジアミノピメ
リン酸、リジン、オルニチン、ジアミノ酪酸等を主要な
アミノ酸組成に持つ群が含まれている。ペプチドグルカ
ンのタイプもグリコ１リル型またはアシル型に圧する群
が含１れている。

本菌株Ｔ♂乙、２乙について、細胞壁のアミノ酸組成の
分析およびグリコレート・テストを実施した結果、その
細胞壁の主要組成はリジンであり、ペプチドグルカンの
糖鎖部はアシル型であること翅判った。これらの事実か
ら、本菌株ＴＪ’＆、２！：はコリネ型細菌群、０ｏｒ
ｙｎｅ−ｂａｃｔθｒｉａｃθａｅ　　に帰属すること
が判明した。

属レベルの同定 コリネ型細菌に含まれている細菌群は、不安定な要素・
微細な性状によって、属・種が識別されているために、
その分類・同定は難かしく、従来多くの論議のあるとこ
ろである。

近年、山田・駒形等（ｌり乙ター／？７．２）はコリネ
型細菌に関する一連の分類学的研究を行ないこの群の新
しい分類システムを提案している。彼らは、細胞壁のア
ミノ酸組成、ＤＮＡのＧＣ含量、糖類・有機酸の資化性
パターンおよび細胞の分裂様式をコリネ型細胞の属レベ
ルの文例形質としてとり挙げ、この郡を７属に分類して
いる。（コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　）　、アルスロバクタ−（人ｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　）　＊　　クルトバクテリウム（Ｏｕｒ
ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　、セルロモナス（０ｅｌ
ｌｕ’ｌｏ−ｍｏｎａｓ　）　、　　ビメロバクター（
Ｐｉｍｅｌｏｂａａｔｅｒ　）、未知分類群） 本菌株Ｔ−１ｒｔ−ｔ　は、表１及び−に示したように
、各種糖類から酸を生成しないこと。

比較的巾広く有機酸を利用すること％細胞壁の主要なア
ばノ酸組成としてリジンを有す、る、。

こと、また細胞分裂様式方Ｂｅｎｄｉｎｇであることか
らアルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）　
１に帰属するものと思われる。

種レベルの同定 アルスロバクタ−属の種は、今日せでに約５ｔｆ４が報
告されている。これらの鍾類は各種の生理的性質、生化
学的性質によって識別されている方、とくに、細胞壁の
架橋ペプチド構造（ペプチドグリカン・タイプ）は種を
同定する重要な特徴と見做されている （Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ　＆　Ｋａｎｄｌｅｒ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、ｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ、　３６　、
　ｕ０７−！７７（ｌり７．２）；　　ドイツ微生物株
保存機関（ＤＳＭ　）カタログ、　０１ａｕｓ＆Ｓｃｈ
ａａｂ　−Ｅｎｇｅｌｓ　　（ｅｄ、）、ＪｎｄＥｔａ
、、ｔり７７）。

本菌株（Ｔ−４１２Ｊ）　　のペプチドグリカン・タイ
プはＬｙＢ−Ａｌａ型であることから、アルスロハクタ
ークリスタロボイエテス（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃｔｅｒ
　ｃｒｙｅｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）近縁菌と推定さ
れた。

アルスロバクタークリスタロボイエテスの原著者等（Ｊ
、Ｏ，Ｅｎｓｉｇｎ　＆　Ｓ、Ｏ，Ｒｌｔｔｅｎｂｅｒ
ｇ、　／り６３）によると、本種は、λ−ハイドロキシ
ピリジンを唯一の０源にし穴培地で培養すると、培地中
に緑色色素の結晶を産生ずる特徴を持つ。

そこで、アルスロバクタークリスタロボイエテスの基準
菌株ＪＯＭ　、２ｓ、２ｓ株を取得して、本菌株と比較
検討した。アルスロバクタークリスタロボイエテス（Ｊ
ｏＭＪ、−コ）はコーハイドロキシビリジンを唯一のＯ
源とした培地中に緑色色素の結晶を形成した。−力、本
菌株は同一の培地上で培養しても色素の雄牛は検出され
々かった。さらに下記表３に示し之ように、他の生理的
性質・生化学的性質においても、両画はいくつかの差異
がみられた。

よって１本菌株Ｔ−ｒ≦２ｔＭはアルスロバフター属の
新菌種と推定されるが、正式々種の命名は、今後多類の
類似菌株を発見した上で報告する。現段階では本菌株（
Ｔ−Ｉｒ７．２＆）をアルスロバクタ−ｓｐ、と同定し
た。

表３ アスロバクターｓｐ、　（Ｔ−１６２Ａ）とＡ、クリス
タロボイエテス（ＪＯＭ　、２．ｔ、２．２）の生理・
生化学的性質の比較また、変異株アルスロバクターｓｐ
．Ｔ８６２６−１１は、上記ｓｐ．Ｔ８６２６より参考
例１に示す方法によって取得されたものである。

本発明において使用される培地としては、主炭素源とし
て安息香酸を含むものであれば、特に制限され彦い。

炭素源としては、安息香酸以外に、種々の炭水化物、有
機酸等をさらに添加してもよく、窒素源としては、有機
アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、尿素等を用いる
ことができる。

また、必要に応じ、無機物として各狸リン酸塩、硫酸塩
等を使用することができ、必要に応じ各種有機栄養物を
添加することもできる。

培養は、通常１２時間〜１０日間程度、好気的条件下に
行なわれる。

培地のｐＨは４−１０，温度は、２０−４０℃程度から
選ばれる。

ムコン酸の生産に際しては、増殖菌体、休止菌体のいず
れをも用いることができる。

培養物からムコン酸の採取、精製に際しては、一般に有
機化合物の採取、精製に用いられている方法を採用する
ことができる。

得られたムコン酸は、水添してアジピン酸とすることが
でき、また、１，４−ジカルボン酸誘導体等の原料とし
て、さらには機能性樹脂原料として有用である。

（発明の効果） 本発明方法によねば、安息香酸よりムコン酸を高収率で
得ることかできる。

（実施例） 以下、実施例により、本発明をさらに説明する。

なお、実施例における物質の同定は方スクロマトグラ々
−質蓋分析等により標品と比較して行々つた。

実施例１ Ｉｔの水に、ペプトンｉｏｙ、イーストエキスｊ９％Ｎ
ａ１ｌ　１０１および安息香酸ナトリウムｊ１を溶解し
、　ｐＨ７，０に調整した培地を作製した。この！ｒ０
１ｔＬｇを２００−容コルベンに分注し、１２０℃で１
０分間殺菌した。

一方、安息香酸含有斜面培地にアルスロバクタ−ｓｐ、
　Ｔ♂乙、２Ｊ菌′ｆ、３０℃で３日間培養し、そのコ
ルベンにその一白金耳を接種し３０℃往復振盪機で１１
２回／分の回転数で種培養を２日行った。その種培養よ
り上記培地で安息香酸ナトリウムを３％に変更した培地
５０ｍｌを含むコルベンに８％をを接種し、３０℃、往
復振盪機で上記回転数にて培養を２−３日間行ったとこ
ろその培養液中に５０ｍｇのシス、シス−ムコン酸が生
成していた（１ｇ／ｌ）。

参考例１ 普通ブイヨン培地による液体振盪培養において対数増殖
期にあるアルスロバ／ｐ−ａｐ、Ｔｒｔ、ｚｔを集菌、
クエン酸緩衝液（ｐＨ７，１１７）　Ｋて洗浄した。

続いて、常法により、この菌体に紫外線照射処理を施し
た後、普通ブイヨン培地による中間培養をｌ夜行った。

この培養物を普通寒天培地をマスタープレートとして、
安息香酸を唯一炭素源とした培地にレプリカブレーティ
ングを行い、レプリカ培地での非生育突然変異菌を検索
した。

さらに得られた変異菌における安息香酸からムコン酸へ
の変換能を確認し、ムコン酸生産変異菌２株を見出した
。

実施例２ あらかじめ１．２０℃１．２０分の蒸気滅菌を施してお
いた５００ｍｌ容三角フラスコ中の４５ｍｌ普通ブイヨ
ン培地に、参考例１で得られた１株であり、普通寒天斜
面培地にて生育させたムコン酸蓄積変異株アルスロバク
ターｓｐ．Ｔ８６２６−１１を植菌し、３０℃で２４時
間液体振盪培養を行った後、別途滅菌処理を施した安息
香酸ナトリウム水溶液（５０ｇ／ｌ）を５ｍｌ添加し、
さらに同一条件で培養を続けた。

得られた培養液中のムコン酸含量を分析すると、培養液
／７あたり先ｔｒであつ７１ｃ（対安息香酸モル収率：
２１％）。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ムコン酸を生産する能力を有するアルスロバクタ
   ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．Ｔ８６２６また
   はその突然変異株を、炭素源として安息香酸を使用して
   培養し、培養物からムコン酸を得ることを特徴とするム
   コン酸の製造方法。