JPH104991A

JPH104991A - 新規３−ヒドロキシ酪酸オリゴマー、およびそれらの製造法

Info

Publication number: JPH104991A
Application number: JP8285083A
Authority: JP
Inventors: Kojiro Kikuchi; 浩次郎菊地; Yoshitaka Chin; 兆隆陳; Takahide Takadera; 貴秀高寺; Miyuki Nishijima; 美由紀西島; Yoshio Araki; 美穂荒木; Kyoko Adachi; 恭子足立; Hiroshi Sano; 浩佐野
Original assignee: KAIYO BIO TECH LAB; KAIYO BIO TECHNOL KENKYUSHO KK
Current assignee: KAIYO BIO TECH LAB; KAIYO BIO TECHNOL KENKYUSHO KK
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 1998-01-13

Abstract

(57)【要約】【解決手段】下記の式（Ｉ）【化１】（式中、ｎは０から４の整数）で示される３−ヒドロキ
シ酪酸オリゴマー、ビブリオ属に属する微生物を利用し
て前記化合物を製造する方法。【効果】生分解性プラスチックの原料や、コバクチン
Ｔなどの有用物質の合成原料となる新規な化合物を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生分解性プラスチ
ックの原料として有用な新規化合物、および微生物を用
いたその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、生分解性プラスチックの原料とし
て３ーヒドロキシ酪酸メチルが報告されている[生分解
性プラスチックハンドブック、土肥義治著 (株)エヌ.
ティー.エス、1995年、295]。また、コバクチンＴの合
成原料として３ーヒドロキシ酪酸が報告されている[Tet
rahedron Lett., 36(36), 6379-82; 1995]。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】近年の環境問題を反映
して、生分解性プラスチック原料の開発が緊急の課題と
なっており、その原料となる３ーヒドロキシ酪酸系化合
物の開発が求められている。本発明はこのような化合物
を提供することを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ビブリオ属
に属する菌株の培養物中より得られた一群の化合物が、
従来全く知られていない新規な化合物であることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、下記の式、
（Ｉ）

【０００５】

【化２】

【０００６】（式中、ｎは０から４の整数）で示される
３−ヒドロキシ酪酸オリゴマーである。また、本発明
は、ビブリオ属に属し、上記記載の化合物を生産する能
力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に上記記載
の化合物を生成蓄積させ、該培養物から上記記載の化合
物を採取することを特徴とする上記記載の化合物の製造
法である。以下に本発明を詳細に説明する。本発明の化
合物は、下記の式（Ｉ）

【０００７】

【化３】

【０００８】（式中、ｎは０から４の整数）で示され
る。この化合物の例としては、以下の４種類の化合物を
挙げることができる。第一は、下記の式（II）

【０００９】

【化４】

【００１０】で示される3-O-シス-2-ブテノイル-3-ヒド
ロキシ酪酸 (3-O-cis-2-butenoyl-3-hydroxybutyric ac
id）である。第二は、下記の式（III ）

【００１１】

【化５】

【００１２】で示される3-O-(3'-O-(3''-O-シス-2-ブテ
ノイル-3''-ヒドロキシブチリル)-3'-ヒドロキシブチリ
ル)-3-ヒドロキシ酪酸（3-O-(3'-O-(3''-O-cis-2-buten
oyl-3''-hydroxybutyryl)-3'-hydroxybutyryl)-3-hydro
xybutyric acid）である。第三は、下記の式（IV）

【００１３】

【化６】

【００１４】で示される3-O-(3'-O-(3''-O-(3'''-O-シ
ス-2-ブテノイル-3'''-ヒドロキシブチリル)-3''-ヒド
ロキシブチリル)-3'-ヒドロキシブチリル)-3-ヒドロキ
シ酪酸（3-O-(3'-O-(3''-O-(3'''-O-cis-2-butenoyl-
3'''-hydroxybutyryl)-3''-hydroxybutyryl)-3'-hydrox
ybutyryl)-3-hydroxybutyric acid）である。第四は、
下記の式（Ｖ）

【００１５】

【化７】

【００１６】で示される3-O-(3'-O-(3''-O-(3'''-O-
(3''''-O-シス-2-ブテノイル-3''''-ヒドロキシブチリ
ル)-3'''-ヒドロキシブチリル)-3''-ヒドロキシブチリ
ル)-3'-ヒドロキシブチリル)-3-ヒドロキシ酪酸（3-O-
(3'-O-(3''-O-(3'''-O-(3''''-O-cis-2-butenoyl-3''''
-hydroxybutyryl)-3'''-hydroxybutyryl)-3''-hydroxyb
utyryl)-3'-hydroxybutyryl)-3-hydroxybutyric acid）
である。これら４種の化合物は以下のような理化学的性
質を有する。

【００１７】3-O-シス-2-ブテノイル-3-ヒドロキシ酪酸
（式（II）の化合物）の理化学的性質は下記の通りであ
る。 (1) 物質の色：無色 (2) 物質の形状：油状 (3) 分子量：１７２ (4) 分子式：Ｃ₈Ｈ₁₂Ｏ₄ (5) 質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ実測値 173.0815
[Ｍ＋Ｈ]⁺ 計算値 173.0814 (C₈H₁₃O₄)

【００１８】(6) 比旋光度：[α]_D ²⁵-1.9° (c 0.07
5、クロロホルム中) (7) 紫外線吸収スペクトル (エタノール中)：λ_max2
10nm (logε 4.09) (8) 赤外線吸収スペクトル (KBr) ν_max 3522, 2928, 1721, 1647, 1406, 1296, 1187,
1139 cm^-1 (9)¹Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、500MHz） δppm 1.36（d, J=6.5Hz, 3H), 2.13（dd, J=7.0, 2.0
Hz, 3Ｈ),2.58（dd, J=15.8, 5.8Hz, 1Ｈ),2.74（dd, J
=15.8, 7.3Hz, 1Ｈ),5.32（m, 1Ｈ), 5.76（dq, J=11.
5, 2.0Hz, 1Ｈ),6.33（dq, J=11.5, 7.0Hz, 1Ｈ)

【００１９】(10)¹³C−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測
定、125MHz） δppm 15.4 (q), 19.9 (q), 40.4 (t), 66.4 (d), 12
0.6 (d), 145.4 (d),165.6 (s), 174.9 (s) (11)溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢
酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶 (12)高速液体クロマトグラフィー：Develosil 充填カラ
ムODS-HG-5 20mmφ、25cm、野村化学社製、0.1%トリフ
ルオロ酢酸含有20%アセトニトリル、流速10ml/minでの
保持時間は３０分。

【００２０】3-O-(3'-O-(3''-O-シス-2-ブテノイル-3''
-ヒドロキシブチリル)-3'-ヒドロキシブチリル)-3-ヒド
ロキシ酪酸（式（III）の化合物）の理化学的性質は下
記の通りである。 (1) 物質の色：無色 (2) 物質の形状：油状 (3) 分子量：３４４ (4) 分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₄Ｏ₈ (5) 質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ実測値 345.1554
[Ｍ＋Ｈ]⁺ 計算値 345.1549 (C₁₆H₂₅O₈) (6) 比旋光度：[α]_D ²⁶ -3.7° (c 0.004、クロロ
ホルム中)

【００２１】(7) 紫外線吸収スペクトル (エタノール
中)：λ_max207nm (logε 4.15) (8) 赤外線吸収スペクトル (KBr) ν_max 3448, 2934, 1738, 1649, 1386, 1305, 1189 cm
^-1 (9)¹Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、400MHz） δppm 1.28（m, 9H), 2.11（dd, J=7.3, 1.8Hz, 3Ｈ),
2.42-2.70（m, 6Ｈ), 5.18-5.37（m, 3Ｈ),5.74（dq, J
=11.5, 1.8Hz,1Ｈ),6.34（dq, J=11.5, 7.2Hz, 1Ｈ)

【００２２】(10)¹³C−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測
定、125MHz） δppm 15.4 (q), 19.8 (q), 20.0 (q), 40.8 (t), 41.
3 (t), 67.3 (d),67.7 (d), 120.5 (d), 146.0 (d), 16
6.2 (s), 169.2 (s),169.4 (s), 172.8 (s) (11)溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢
酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶 (12)高速液体クロマトグラフィー：Develosil 充填カラ
ムODS-HG-5 20mmφ、25cm、野村化学社製、アセトニト
リル：水（０〜１５分：２０％アセトニトリル、１６〜
８０分：３２％アセトニトリル）、流速10ml/minでの保
持時間は７４分。

【００２３】3-O-(3'-O-(3''-O-(3'''-O-シス-2-ブテノ
イル-3'''-ヒドロキシブチリル)-3''-ヒドロキシブチリ
ル)-3'-ヒドロキシブチリル)-3-ヒドロキシ酪酸（式（I
V）の化合物）の理化学的性質は下記の通りである。 (1) 物質の色：無色 (2) 物質の形状：油状 (3) 分子量：４３０ (4) 分子式：Ｃ₂₀Ｈ₃₀Ｏ₁₀ (5) 質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ実測値 431.1909
[Ｍ＋Ｈ]⁺ 計算値 431.1917 (C₂₀H₃₁O₁₀) (6) 比旋光度：[α]_D ²⁵ -5.8° (c 0.019、クロロ
ホルム中)

【００２４】(7) 紫外線吸収スペクトル (エタノール
中)： λ_max207nm (logε 4.11) (8) 赤外線吸収スペクトル (KBr) ν_max 3450, 2926, 2858, 1742, 1462, 1379, 1189 cm
^-1 (9)¹Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、400MHz） δppm 1.26（m, 12H), 2.10（dd, J=7.3, 1.7Hz, 3
Ｈ),2.38-2.65（m, 8Ｈ),5.17-5.33（m, 4Ｈ),5.72（d
q, J=11.5, 1.7Hz,1Ｈ),6.31（dq, J=11.5, 7.3Hz, 1
Ｈ),

【００２５】(10)¹³C−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測
定、100MHz） δppm 15.4 (q), 19.6 (q), 19.8 (q), 20.0 (q), 40.
8 (t), 40.9 (t),41.2 (t), 66.8 (d), 67.8 (d), 68.0
(d), 120.6 (d), 145.5 (d),165.8 (s), 169.2 (s), 1
69.5 (s), 169.9 (s), 173.0 (s) (11)溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢
酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶 (12)高速液体クロマトグラフィー：Develosil 充填カラ
ムODS-HG-5 20mmφ、25cm、野村化学社製、アセトニト
リル：水（０〜１５分：２０％アセトニトリル、１６〜
８０分：３２％アセトニトリル、８１〜１１０分：４４
％アセトニトリル）、流速10ml/minでの保持時間は９９
分。

【００２６】3-O-(3'-O-(3''-O-(3'''-O-(3''''-O-シス
-2-ブテノイル-3''''-ヒドロキシブチリル)-3'''-ヒド
ロキシブチリル)-3''-ヒドロキシブチリル)-3'-ヒドロ
キシブチリル)-3-ヒドロキシ酪酸（式（Ｖ）の化合物）
の理化学的性質は下記の通りである。

【００２７】(1) 物質の色：無色 (2) 物質の形状：油状 (3) 分子量：５１６ (4) 分子式：Ｃ₂₄Ｈ₃₆Ｏ₁₂ (5) 質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ実測値 517.2280
[Ｍ＋Ｈ]⁺ 計算値 517.2285 (C₂₄H₃₇O₁₂)

【００２８】(6) 比旋光度：[α]_D ²⁶ -1.9° (c 0.
011、クロロホルム中) (7) 紫外線吸収スペクトル (エタノール中)：λ_max2
08nm (logε 4.04) (8) 赤外線吸収スペクトル (KBr) ν_max 3452, 2988, 2938, 1742, 1647, 1458, 1386, 1
189 cm^-1 (9)¹Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、400MHz） δppm 1.26（m, 15H), 2.10（dd, J=7.3, 1.7Hz, 3
Ｈ),2.39-2.65（m, 10Ｈ), 5.16-5.34（m, 5Ｈ),5.72
（dq, J=11.5, 1.7Hz,1Ｈ),6.30（dq, J=11.5, 7.3Hz,
1Ｈ)

【００２９】(10)¹³C−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測
定、100MHz） δppm 15.7 (q), 19.7 (q), 19.9 (q), 40.4 (t), 40.
8 (t), 40.9 (t),41.1 (t), 66.72 (d), 67.6 (d), 67.
7 (d), 68.0 (d), 120.6 (d),145.4 (d), 165.7 (s), 1
69.1 (s), 169.3 (s), 169.5 (s),169.7 (s), 173.2
(s) (11)溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢
酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶 (12)高速液体クロマトグラフィー：Develosil 充填カラ
ムODS-HG-5 20mmφ、25cm、野村化学社製、アセトニト
リル：水（０〜１５分：２０％アセトニトリル、１６〜
８０分：３２％アセトニトリル、８１〜１１０分：４４
％アセトニトリル、１１１〜１３０分：６５％アセトニ
トリル）、流速10ml/minでの保持時間は１１７分。

【００３０】式（Ｉ）で表わされる化合物の生産に用い
る微生物としては、ビブリオ属に属し、これらの化合物
の生産能を有する微生物であれば特に限定されず、例え
ば、ビブリオ sp. C-984株を使用することができる。ビ
ブリオ sp. C-984株は自然界から新たに単離した株であ
り、その細菌学的性質については以下の通りである。

【００３１】なお、形態観察は、培地にビブリオ sp. C
-984株を植菌し、30℃で24〜48時間培養したのちに光学
顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて行った。培地は、
マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216, Difco社製）
あるいはマリンブロス（BactoMarine Broth 2216, Difc
o社製）を用いた。また、本菌株は培地中の塩化ナトリ
ウム濃度が１％以下では菌の生育が認められないことか
ら、生化学的性状の試験は75％人工海水を用いて培地を
作製するか、あるいは培地中に3％塩化ナトリウムを添
加することによって行った。

【００３２】ａ. 形態 1）細胞の形および大きさ：桿菌、0.7-2.5×0.1-0.8
μｍ 2）細胞の多形性の有無：無し 3）運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極毛、固
体培地で培養した場合、菌体周辺に鞭毛が観察される。 4）胞子の有無：無し 5）グラム染色性：陰性 6）抗酸性の有無：無し

【００３３】ｂ. 各培地における生育状態 1) マリンアガー平板培養：良好に生育，コロニー
は円形，凸円状，全縁，湿光，乳白色 2) マリンアガー斜面培養：良好に生育，糸状，乳
白色 3) マリンブロス培養：良好に生育，均質に濁
る。 4) マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する。 5) リトマスミルク：消化する。

【００３４】ｃ. 生理学的性質 1）硝酸塩の還元：還元する。 2） MRテスト：陽性 3）ＶＰ反応：陰性 4）インドールの生成：生成しない。 5）硫化水素の生成：生成しない。 6）でんぷんの加水分解：分解する。

【００３５】7）クエン酸の利用：Simmons 培地：利
用する。：Cristensen：利用する。 8）無機窒素源の利用：利用する。 9）色素の生成：無し 10）ウレアーゼ活性：陰性 11）オキシダーゼ活性：陽性 12）カタラーゼ活性：陽性

【００３６】13）生育の範囲（温度、ｐＨ）：温度13
〜37℃、20〜30℃で最も良好に発育ｐＨ2〜10 、最適
生育ｐＨ範囲 5〜10 14）酸素に対する態度：通性嫌気性 15） OF試験：発酵的にブドウ糖を分解する。 16）糖類からの酸およびガスの生成の有無基礎培地はBaumannのＢＭ培地を使用 25℃ ３週
間培養後

【００３７】酸の生成ガスの生成Ｌ-アラビノース − − Ｄ-キシロース − − Ｄ-グルコース＋ − Ｄ-マンノース＋ − Ｄ-フラクトース＋ − Ｄ-ガラクトース＋ − 麦芽糖＋ − ショ糖＋ − 乳糖 − − トレハロース＋ − Ｄ-ソルビット − − Ｄ-マンニット＋ − イノシット＋ − グリセリン＋ − でんぷん＋ − −生成しない＋生成する

【００３８】17）エスクリンの分解：分解する。 18）アルギニンの分解：分解しない。 19）ＤＮＡの分解：分解する。 20）好塩性：有り生育塩濃度範囲 1〜7％ 21） β-ガラクトシダーゼ：陽性 22）ＧＣ含量（モル％）：46.8 23）イソプレノイドキノン：ユビキノンＱ−８

【００３９】以上の菌学的性質からバージーズ・マニュ
アル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第
８版の分類基準に従って公知の菌種と比較した。本菌株
は通性嫌気性グラム陰性桿菌で極鞭毛を有するが、寒天
培地上で培養したものでは周鞭毛も観察された。ブドウ
糖を発酵的に分解し、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性
であることからビブリオ属に所属すると考えられ、ビブ
リオスピーシーズ（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．）と同定し
た。そして、この菌株をビブリオスピーシーズ（Vibr
iosp.)Ｃ-984とし、平成8年2月13日付けで工業技術院生
命工学工業技術研究所にFERM P-15434として寄託し
た。

【００４０】次に、本発明に使用する微生物の培養法に
ついて述べる。本発明の培養においては通常の微生物の
培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な
炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物
質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地い
ずれでも使用可能である。

【００４１】炭素源としてはグルコース、澱粉、デキス
トリン、マンノース、フラクトース、シュクロース、ラ
クトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、
糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。さら
に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有
機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス乾燥酵
母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸な
どが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必
要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭
酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウ
ム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛などの無機塩類を加える。さらに使用菌の生育や本
発明の化合物の生産を促進する微量成分を適当に添加す
ることができる。

【００４２】培養法としては、液体培養法が最も適して
いる。培養温度３０〜３５℃が適当であり、培養中の培
地のｐＨは７〜８に維持することが望ましい。液体培養
で通常３日間培養を行うと、目的物質が培養液中に生成
蓄積される。培養物中の生成量が最大に達した時に培養
を停止する。

【００４３】培養物から本発明の化合物の単離精製は、
微生物代謝産物をその培養物から単離精製するために常
用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾過や
遠心分離により培養瀘液と菌体に分け、菌体を含水メタ
ノール、含水エタノールなどで抽出する。ついで、抽出
液と培養瀘液とを合わせて濃縮し、シリカゲルによるカ
ラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマト
グラフィーなどにより、本発明の化合物を得る。なお、
培養、精製操作中の本発明の化合物の動向は、高速液体
クロマトグラフィーによる紫外線吸収を指標として追跡
することができる。

【００４４】

【発明の実施の形態】以下に本発明を実施例により具体
的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりそ
の技術的範囲が限定されるものではない。

【００４５】

【実施例】ビブリオsp. C-984 株を、２００ｍｌの昆布
茶液体培地（昆布茶：１０g、グルコース：３．０g、ブ
イヨン：１．０g、炭酸カルシウム：２．０g、ろ過海
水：５００ｍｌ、蒸留水：５００ml、pＨ＝７．４）を
入れた１Ｌ三角フラスコ中で、３０℃、３日間振盪（10
0 rpm）培養した。培養中、培地のｐＨは特に制御しな
かった。

【００４６】このようにして得られた培養液７Ｌを遠心
分離した。遠心分離によって得られた上澄み液を、酢酸
エチル（１４Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出部を４０
℃以下で減圧濃縮し、得られた濃縮液を逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（Develosil 充填カラムODS-HG-5 20
mmφ、25cm、野村化学社製、水：アセトニトリル＝８
０：２０〜３５：６５へ段階的に変化させた）により分
画し、前記式（III）、（IV）および（Ｖ）で示される
本発明の化合物をそれぞれ 3.1mg, 15.7mg, 14.9mg を
得た。

【００４７】また、同条件で得られた培養液3.4 Lを遠
心分離し、得られた上澄み液を酢酸エチルで洗浄後、水
層部分を１規定塩酸によりpH２〜３に調整した。これを
クロロホルム（７L）で抽出し、抽出物を逆相高速液体
クロマトグラフィー（Develosil 充填カラムODS-HG-5
20mmφ、25cm、野村化学社製、0.1%トリフルオロ酢酸含
有20%アセトニトリル）により分画し、前記式（II）で
示される本発明の化合物160mgを得た。ここで得た式（I
I）、（III）、（IV）及び（Ｖ）で表わされる化合物
は、前記した理化学的性質および生物学的性質を示し
た。

【００４８】

【発明の効果】本発明は、式（Ｉ）で表わされる一群の
新規な化合物を提供する。この化合物は、生分解性プラ
スチックの原料や、コバクチンＴなどの有用物質の合成
原料となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者西島美由紀静岡県清水市袖師町1900番地株式会社海洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者荒木美穂静岡県清水市袖師町1900番地株式会社海洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者足立恭子静岡県清水市袖師町1900番地株式会社海洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者佐野浩静岡県清水市袖師町1900番地株式会社海洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式（Ｉ）【化１】（式中、ｎは０から４の整数）で示される３−ヒドロキ
シ酪酸オリゴマー。
【請求項２】ビブリオ属に属し、請求項１記載の化合
物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養
物中に請求項１記載の化合物を生成蓄積させ、該培養物
から請求項１記載の化合物を採取することを特徴とする
請求項１記載の化合物の製造法。