JPH07236472A - 新規微生物およびそれを使用した３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法 - Google Patents
新規微生物およびそれを使用した３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法Info
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- JPH07236472A JPH07236472A JP2776494A JP2776494A JPH07236472A JP H07236472 A JPH07236472 A JP H07236472A JP 2776494 A JP2776494 A JP 2776494A JP 2776494 A JP2776494 A JP 2776494A JP H07236472 A JPH07236472 A JP H07236472A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ロドコッカス属に属し３、４−ジヒドロキシ
安息香酸を休止菌体法にて生産する能力を有する新規微
生物、および該微生物ヲ、イソフタル酸を主たる炭素源
とする培地で培養し、得られた培養物から３，４−ジヒ
ドロキシ安息香酸を採取する３，４−ジヒドロキシ安息
香酸の製造方法。 【効果】 常温常圧下で微生物酵素反応を利用して効率
よく３、４−ジヒドロキシ安息香酸を製造できる。さら
に本菌は休止菌体法を行えるため、当物質の工業生産の
実用化には極めて有用な微生物である。
安息香酸を休止菌体法にて生産する能力を有する新規微
生物、および該微生物ヲ、イソフタル酸を主たる炭素源
とする培地で培養し、得られた培養物から３，４−ジヒ
ドロキシ安息香酸を採取する３，４−ジヒドロキシ安息
香酸の製造方法。 【効果】 常温常圧下で微生物酵素反応を利用して効率
よく３、４−ジヒドロキシ安息香酸を製造できる。さら
に本菌は休止菌体法を行えるため、当物質の工業生産の
実用化には極めて有用な微生物である。
Description
【０００１】本発明は、３、４−ジヒドロキシ安息香酸
を休止菌体法で生産する、ロドコッカス属に属する新規
な微生物に関する。従来、３、４−ジヒドロキシ安息香
酸の製造方法としては、有機合成反応によるものと、高
い選択特異性を有する微生物の酵素反応によるものとが
ある。これらのうち、微生物の酵素反応による発酵法
は、有機合成反応による方法に比べ、反応が常温常圧近
辺の穏和な条件下でも進むこと、有害な触媒を使用しな
いこと、及び副生成物が少ないことから、省エネルギ−
・省資源であり、公害も起こりにくい安全性の高い、低
コスト、高収率の、効率の良い製造方法である。そして
従来、３、４−ジヒドロキシ安息香酸を発酵法により生
産する方法としては、ブレビバクテリア属菌の変異株あ
るいはコリネバクテリウム属菌の変異株を、グルコ−ス
を主炭素源とする培地で培養して得る方法が知られてい
る（特開昭５０−８９５９２号公報及び特開昭６０−９
８９８９号公報）。しかしながらグルコ−スを主炭素源
とするこれらの方法では、グルコ−スを高濃度で使用し
なければならず、また、グルコ−スを高濃度で使用して
も収率が低く、結果として、３、４−ジヒドロキシ安息
香酸の製造コストが高くなるという欠点があった。フタ
ル酸から３、４−ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法
として、シュ−ドモナス属の変異株を用いたものもある
（特開平２−１００６８７号公報）が、これも収率が低
く、コスト高になるという傾向があった。
を休止菌体法で生産する、ロドコッカス属に属する新規
な微生物に関する。従来、３、４−ジヒドロキシ安息香
酸の製造方法としては、有機合成反応によるものと、高
い選択特異性を有する微生物の酵素反応によるものとが
ある。これらのうち、微生物の酵素反応による発酵法
は、有機合成反応による方法に比べ、反応が常温常圧近
辺の穏和な条件下でも進むこと、有害な触媒を使用しな
いこと、及び副生成物が少ないことから、省エネルギ−
・省資源であり、公害も起こりにくい安全性の高い、低
コスト、高収率の、効率の良い製造方法である。そして
従来、３、４−ジヒドロキシ安息香酸を発酵法により生
産する方法としては、ブレビバクテリア属菌の変異株あ
るいはコリネバクテリウム属菌の変異株を、グルコ−ス
を主炭素源とする培地で培養して得る方法が知られてい
る（特開昭５０−８９５９２号公報及び特開昭６０−９
８９８９号公報）。しかしながらグルコ−スを主炭素源
とするこれらの方法では、グルコ−スを高濃度で使用し
なければならず、また、グルコ−スを高濃度で使用して
も収率が低く、結果として、３、４−ジヒドロキシ安息
香酸の製造コストが高くなるという欠点があった。フタ
ル酸から３、４−ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法
として、シュ−ドモナス属の変異株を用いたものもある
（特開平２−１００６８７号公報）が、これも収率が低
く、コスト高になるという傾向があった。
【０００２】本菌株の親株を用いた方法は高収量の３、
４−ジヒドロキシ安息香酸が得られる（特開平２−２３
４６８２号公報）が、休止菌体法が行えないため、工業
的生産を行うには問題があった。休止菌体法は、微生物
の増殖を伴わずに物質生産が可能であるため、樹脂など
への菌の固定化により、微生物を酵素物質として用いる
ことが出来るため、工業化を進めていく面において非常
に効率的となり得る。かかる現状において、本発明者ら
は休止菌体法にて３、４−ジヒドロキシ安息香酸を効率
よくイソフタル酸から製造する方法を開発すべく研究を
した結果、目的とする能力を有する菌を見いだし、本発
明を完成した。すなわち、本発明はロドコッカス属に属
し、休止菌体法にてイソフタル酸を３、４−ジヒドロキ
シ安息香酸に変換する能力を有する微生物に関する。つ
ぎに、本発明者らが分離した本菌株の菌学的性質を詳述
する。
４−ジヒドロキシ安息香酸が得られる（特開平２−２３
４６８２号公報）が、休止菌体法が行えないため、工業
的生産を行うには問題があった。休止菌体法は、微生物
の増殖を伴わずに物質生産が可能であるため、樹脂など
への菌の固定化により、微生物を酵素物質として用いる
ことが出来るため、工業化を進めていく面において非常
に効率的となり得る。かかる現状において、本発明者ら
は休止菌体法にて３、４−ジヒドロキシ安息香酸を効率
よくイソフタル酸から製造する方法を開発すべく研究を
した結果、目的とする能力を有する菌を見いだし、本発
明を完成した。すなわち、本発明はロドコッカス属に属
し、休止菌体法にてイソフタル酸を３、４−ジヒドロキ
シ安息香酸に変換する能力を有する微生物に関する。つ
ぎに、本発明者らが分離した本菌株の菌学的性質を詳述
する。
【０００３】本菌株の菌学的性質は以下に示すとおりで
ある。 １．形態学的性質 （１）菌形：かん菌 （２）大きさ：１．０〜１．６×０．３〜０．５μｍ （３）多形性：３０℃で培養すると１〜２日で菌糸を形
成し、その後、フラグメンテ−ションをおこし、かん菌
となる。気菌糸は形成しない。 （４）運動性：なし （５）鞭毛：なし （６）胞子：なし
ある。 １．形態学的性質 （１）菌形：かん菌 （２）大きさ：１．０〜１．６×０．３〜０．５μｍ （３）多形性：３０℃で培養すると１〜２日で菌糸を形
成し、その後、フラグメンテ−ションをおこし、かん菌
となる。気菌糸は形成しない。 （４）運動性：なし （５）鞭毛：なし （６）胞子：なし
【０００４】２．培養的性質 （１）肉汁寒天平板培養：生育良好。コロニ−の形は花
形で表面はしわ状、隆起状態は偏平で周縁部は繊毛状。
乳白色で鈍い光沢あり。 （２）肉汁寒天斜面培養：生育良好。コロニ−の形は糸
状で表面は平滑。隆起状態は偏平で乳白色。鈍い光沢あ
り。 （３）肉汁液体培養：生育良好。表面の被膜形成なし。
均一に混濁。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。 （５）リトマスミルク：リトマスを還元し、凝固・ペプ
トン化しない。
形で表面はしわ状、隆起状態は偏平で周縁部は繊毛状。
乳白色で鈍い光沢あり。 （２）肉汁寒天斜面培養：生育良好。コロニ−の形は糸
状で表面は平滑。隆起状態は偏平で乳白色。鈍い光沢あ
り。 （３）肉汁液体培養：生育良好。表面の被膜形成なし。
均一に混濁。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。 （５）リトマスミルク：リトマスを還元し、凝固・ペプ
トン化しない。
【０００５】３．生理学的性質 （１）グラム染色性：陽性 （２）硝酸塩の還元：陰性 （３）脱窒反応：陰性 （４）ＭＲテスト：陰性 （５）ＶＰテスト：陰性 （６）インド−ルの生成：陰性 （７）硫化水素の生成：陽性 （８）デンプンの加水分解：陰性 （９）クエン酸の利用 コ−ザ−の培地：陽性 クリステンセンの培地：陰性 （１０）無機窒素源の利用 硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陽性 （１１）色素の生成：陰性 （１２）ウレア−ゼ クリステンセンの培地：陽性 ＳＳＲ培地：陽性 （１３）オキシダ−ゼ：陰性 （１４）カタラ−ゼ：陽性 （１５）生育の範囲 ｐＨ５．０〜１０．０（最適
５．０〜８．０） １５〜３３℃（最適 ２０〜３１℃） （１６）酸素に対する態度：好気的
５．０〜８．０） １５〜３３℃（最適 ２０〜３１℃） （１６）酸素に対する態度：好気的
【０００６】（１７）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉ
ｆｓｏｎ法）：陰性 （１８）糖類からの酸及びガスの生成 ： 酸 ガス Ｌ−アラビノ−ス 陰性 陰性 Ｄ−キシロ−ス 陰性 陰性 Ｄ−グルコ−ス 陰性 陰性 Ｄ−マンノ−ス 陰性 陰性 Ｄ−フラクト−ス 陽性 陰性 Ｄ−ガラクト−ス 陰性 陰性 マルト−ス 陰性 陰性 シュ−クロ−ス 陰性 陰性 ラクト−ス 陰性 陰性 トレハロ−ス 陰性 陰性 Ｄ−ソルビト−ル 陰性 陰性 Ｄ−マンニト−ル 陰性 陰性 イノシト−ル 陽性 陰性 グリセリン 陽性 陰性 デンプン 陰性 陰性 （１９）セルロ−スの分解：陰性 （２０）キチンの分解：陰性 （２１）細胞壁のジアミノピメリン酸異性体：ｍｅｓｏ
−ＤＡＰ （２２）細胞壁アシル型（グリコリル試験）：グリコリ
ル基が存在 （２３）ミコ−ル酸：存在
ｆｓｏｎ法）：陰性 （１８）糖類からの酸及びガスの生成 ： 酸 ガス Ｌ−アラビノ−ス 陰性 陰性 Ｄ−キシロ−ス 陰性 陰性 Ｄ−グルコ−ス 陰性 陰性 Ｄ−マンノ−ス 陰性 陰性 Ｄ−フラクト−ス 陽性 陰性 Ｄ−ガラクト−ス 陰性 陰性 マルト−ス 陰性 陰性 シュ−クロ−ス 陰性 陰性 ラクト−ス 陰性 陰性 トレハロ−ス 陰性 陰性 Ｄ−ソルビト−ル 陰性 陰性 Ｄ−マンニト−ル 陰性 陰性 イノシト−ル 陽性 陰性 グリセリン 陽性 陰性 デンプン 陰性 陰性 （１９）セルロ−スの分解：陰性 （２０）キチンの分解：陰性 （２１）細胞壁のジアミノピメリン酸異性体：ｍｅｓｏ
−ＤＡＰ （２２）細胞壁アシル型（グリコリル試験）：グリコリ
ル基が存在 （２３）ミコ−ル酸：存在
【０００７】以上の菌学的性質を有する菌について、バ
−ジェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systemati
c Bacterology, Volume 2)により同定を行なうと、本菌
株はロドコッカス（Rhodococcus）属に属すると認めら
れ、ロドコッカス ｓｐ．Ｌ−１ Ｅ−１０８Ｂ（Rhod
ococcus sp. L-1 E-108B）と命名した。本菌株は工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６２
３として寄託されている。
−ジェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systemati
c Bacterology, Volume 2)により同定を行なうと、本菌
株はロドコッカス（Rhodococcus）属に属すると認めら
れ、ロドコッカス ｓｐ．Ｌ−１ Ｅ−１０８Ｂ（Rhod
ococcus sp. L-1 E-108B）と命名した。本菌株は工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６２
３として寄託されている。
【０００８】本発明は、さらに、上記微生物を、イソフ
タル酸を主たる炭素源とする培地で培養し、得られた培
養物から３，４−ジヒドロキシ安息香酸を採取すること
を特徴とする３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法
である。
タル酸を主たる炭素源とする培地で培養し、得られた培
養物から３，４−ジヒドロキシ安息香酸を採取すること
を特徴とする３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法
である。
【０００９】本菌株の培養に使用する培地の組成は、使
用する菌株が良好に生育し、イソフタル酸からの３、４
−ジヒドロキシ安息香酸の生産を順調に行なわしめるた
めに適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養物、無機塩
等からなる。すなわち、主炭素源としてイソフタル酸、
窒素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養因子を適宜
含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用
できる。窒素源としては硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウムなどの無機窒素源、ペプトン、肉エキス、コ
ンスティ−プリカ−、酵母エキス、カザミノ酸、大豆粉
などを単独または組み合わせて用いられる。無機塩類と
してリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリ
ブデン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウムな
どを加えてもよい。これらのほか、生育に必要な栄養因
子としてはビタミン類、アミノ酸、核酸及びその塩類な
どが例示される。また、ペプトン、肉エキス、コンステ
ィプリカ−、酵母エキス、カザミノ酸などの上記栄養因
子を含有する天然有機栄養物を適宜添加することもでき
る。前述の各培地成分を適当量混合して、３、４−ジヒ
ドロキシ安息香酸の生産に適当な条件を決定して用いら
れる。
用する菌株が良好に生育し、イソフタル酸からの３、４
−ジヒドロキシ安息香酸の生産を順調に行なわしめるた
めに適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養物、無機塩
等からなる。すなわち、主炭素源としてイソフタル酸、
窒素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養因子を適宜
含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用
できる。窒素源としては硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウムなどの無機窒素源、ペプトン、肉エキス、コ
ンスティ−プリカ−、酵母エキス、カザミノ酸、大豆粉
などを単独または組み合わせて用いられる。無機塩類と
してリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリ
ブデン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウムな
どを加えてもよい。これらのほか、生育に必要な栄養因
子としてはビタミン類、アミノ酸、核酸及びその塩類な
どが例示される。また、ペプトン、肉エキス、コンステ
ィプリカ−、酵母エキス、カザミノ酸などの上記栄養因
子を含有する天然有機栄養物を適宜添加することもでき
る。前述の各培地成分を適当量混合して、３、４−ジヒ
ドロキシ安息香酸の生産に適当な条件を決定して用いら
れる。
【００１０】培養は、培地を加熱等により殺菌後、菌を
接種し、２５〜３０℃で３〜５日振盪または通気撹拌す
ればよい。ｐＨは５．０〜８．０程度に調節すると良い
結果が得られる。培地中のイソフタル酸の濃度は通常
０．１〜１０％、好ましくは０．５〜３．０％が好適で
ある。上記のごとく得られた培養物は、そのまま酵素源
として用いることもできるが、菌体を培養液から分離す
る場合は、通常の固液分離手段が用いられる。このよう
に分離された生菌体及びその処理物（凍結乾燥菌体な
ど）も酵素源として用いることが出来る。
接種し、２５〜３０℃で３〜５日振盪または通気撹拌す
ればよい。ｐＨは５．０〜８．０程度に調節すると良い
結果が得られる。培地中のイソフタル酸の濃度は通常
０．１〜１０％、好ましくは０．５〜３．０％が好適で
ある。上記のごとく得られた培養物は、そのまま酵素源
として用いることもできるが、菌体を培養液から分離す
る場合は、通常の固液分離手段が用いられる。このよう
に分離された生菌体及びその処理物（凍結乾燥菌体な
ど）も酵素源として用いることが出来る。
【００１１】培養物からの３、４−ジヒドロキシ安息香
酸の分離は、一般の天然有機化合物の採取及び精製の手
段に準じて行うことが出来る。例えば菌体除去後の培養
液を酸性にし、含塩素、含酸素、または炭化水素系の有
機溶媒等で抽出する。この抽出物をカラムクロマトグラ
フィ−或は再結晶等の方法を用いて３、４−ジヒドロキ
シ安息香酸を単離することが出来る。
酸の分離は、一般の天然有機化合物の採取及び精製の手
段に準じて行うことが出来る。例えば菌体除去後の培養
液を酸性にし、含塩素、含酸素、または炭化水素系の有
機溶媒等で抽出する。この抽出物をカラムクロマトグラ
フィ−或は再結晶等の方法を用いて３、４−ジヒドロキ
シ安息香酸を単離することが出来る。
【００１２】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれら実施例によりなんら制限されるも
のではない。 参考例 １ 菌体の変異誘導処理と特定変異株の分離 （１）下記組成の培地（以下、「培地Ａ」という）２０
ｍｌにロドコッカスｓｐ．Ｌ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１
０６１４）を一白金耳接種し、３０℃で４８時間振盪培
養を行った。 イソフタル酸 ２０．０ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２．０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １．５ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １．５ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ ＮａＣｌ ０．１ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０２ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２．０ｍｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０ｍｇ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ２．０ｍｇ 蒸留水 １リットル（ｐＨ７．２） （２）工程（１）で得られた培養液０．１ｍｌを培地Ａ
２０ｍｌに添加し、３０℃で４８時間振盪培養を行っ
た。 （３）工程（２）の培養液の遠心分離によりＬ−１を集
菌し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、
同溶液に懸濁した。 （４）上記懸濁液に紫外線ランプ（波長２５４及び３６
６ｎｍ）を２５ｃｍの距離から６０分間照射した。 （５）紫外線を照射した懸濁液を適当に希釈して下記組
成の２％寒天平板培地（以下、「培地Ｂ」という）に塗
抹し、３０℃で培養を行った。 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ ８ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 蒸留水 １リットル （６）工程（５）で培養して得られた増殖コロニ−を培
地Ａの２％寒天培地にレプリカし、３０℃で４８時間培
養を行った。 （７）得られたコロニ−を培地Ａに一白金耳接種し、３
０℃で７２時間培養を行った。 （８）工程（７）の培養液の遠心分離により集められた
菌体を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．
６）で２回洗浄を行った後、イソフタル酸を含む５０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．６）に再懸濁し
た。その後、回転振盪を行いながら、３０℃で２４時間
休止菌体法を行い、３、４−ジヒドロキシ安息香酸を高
濃度に産生する変異株を選抜した。
るが、本発明はこれら実施例によりなんら制限されるも
のではない。 参考例 １ 菌体の変異誘導処理と特定変異株の分離 （１）下記組成の培地（以下、「培地Ａ」という）２０
ｍｌにロドコッカスｓｐ．Ｌ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１
０６１４）を一白金耳接種し、３０℃で４８時間振盪培
養を行った。 イソフタル酸 ２０．０ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２．０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １．５ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １．５ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ ＮａＣｌ ０．１ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０２ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２．０ｍｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０ｍｇ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ２．０ｍｇ 蒸留水 １リットル（ｐＨ７．２） （２）工程（１）で得られた培養液０．１ｍｌを培地Ａ
２０ｍｌに添加し、３０℃で４８時間振盪培養を行っ
た。 （３）工程（２）の培養液の遠心分離によりＬ−１を集
菌し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、
同溶液に懸濁した。 （４）上記懸濁液に紫外線ランプ（波長２５４及び３６
６ｎｍ）を２５ｃｍの距離から６０分間照射した。 （５）紫外線を照射した懸濁液を適当に希釈して下記組
成の２％寒天平板培地（以下、「培地Ｂ」という）に塗
抹し、３０℃で培養を行った。 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ ８ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 蒸留水 １リットル （６）工程（５）で培養して得られた増殖コロニ−を培
地Ａの２％寒天培地にレプリカし、３０℃で４８時間培
養を行った。 （７）得られたコロニ−を培地Ａに一白金耳接種し、３
０℃で７２時間培養を行った。 （８）工程（７）の培養液の遠心分離により集められた
菌体を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．
６）で２回洗浄を行った後、イソフタル酸を含む５０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．６）に再懸濁し
た。その後、回転振盪を行いながら、３０℃で２４時間
休止菌体法を行い、３、４−ジヒドロキシ安息香酸を高
濃度に産生する変異株を選抜した。
【００１３】上記で選抜された菌体コロニ−の一白金耳
を滅菌水で適当に希釈し、この希釈液を培地Ｂの２％寒
天培地に塗抹し、３０℃にて培養し、生じた複数のコロ
ニ−が相互間に相違しないことを肉眼的及び顕微鏡的に
確認する。上記コロニ−のうち、１０個のコロニ−をそ
れぞれ培地Ｂと同組成の斜面寒天培地に接種し、３０℃
で培養し、１０本の斜面培地上の菌株が肉眼的及び顕微
鏡的に同一菌株であることを確認し、また、これら１０
菌株の各培地上の正常及び生理学的性質が同一であるこ
とを確認した。上記菌株の各培地上の性状及び生理学的
性質は前述したとおりである。上記試験の結果、各１０
本の培養菌はすべて単一菌株であることが判る。次い
で、培地Ｂを１００ミリリットル容三角フラスコに４０
ミリリットル分注したものに上記で純粋培養された斜面
培地上の菌株一白金耳を接種し、３０℃で２４時間培養
したものに滅菌したグリセリン溶液またはＤＭＳＯ溶液
を加え、１５％（グリセリン）または１０％（ＤＭＳ
Ｏ）濃度に調節し、−８０℃にて凍結保存する。かくし
て３ヶ月凍結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一
白金耳を培地Ｂの２％寒天培地に蘇生後、前記と同条件
下に各培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果、
凍結前とは変化が認められなかった。また、上記凍結及
び解凍を１ヶ月毎に５度繰り返した菌株について同様
に、各培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果変
化は認められなかった。次いで、本菌株を利用して３、
４−ジヒドロキシ安息香酸を製造した例を挙げる。
を滅菌水で適当に希釈し、この希釈液を培地Ｂの２％寒
天培地に塗抹し、３０℃にて培養し、生じた複数のコロ
ニ−が相互間に相違しないことを肉眼的及び顕微鏡的に
確認する。上記コロニ−のうち、１０個のコロニ−をそ
れぞれ培地Ｂと同組成の斜面寒天培地に接種し、３０℃
で培養し、１０本の斜面培地上の菌株が肉眼的及び顕微
鏡的に同一菌株であることを確認し、また、これら１０
菌株の各培地上の正常及び生理学的性質が同一であるこ
とを確認した。上記菌株の各培地上の性状及び生理学的
性質は前述したとおりである。上記試験の結果、各１０
本の培養菌はすべて単一菌株であることが判る。次い
で、培地Ｂを１００ミリリットル容三角フラスコに４０
ミリリットル分注したものに上記で純粋培養された斜面
培地上の菌株一白金耳を接種し、３０℃で２４時間培養
したものに滅菌したグリセリン溶液またはＤＭＳＯ溶液
を加え、１５％（グリセリン）または１０％（ＤＭＳ
Ｏ）濃度に調節し、−８０℃にて凍結保存する。かくし
て３ヶ月凍結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一
白金耳を培地Ｂの２％寒天培地に蘇生後、前記と同条件
下に各培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果、
凍結前とは変化が認められなかった。また、上記凍結及
び解凍を１ヶ月毎に５度繰り返した菌株について同様
に、各培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果変
化は認められなかった。次いで、本菌株を利用して３、
４−ジヒドロキシ安息香酸を製造した例を挙げる。
【００１４】実施例１ 培地Ａを１００ミリリットル容三角フラスコに４０ミリ
リットル分注したものにロドコッカス・エスピ−・Ｌ−
１ Ｅ−１０８Ｂ（Rhodococcus sp. L-1 E-108B、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３６２３）を一白金耳接種し、３０℃で３
日間振盪培養した。得られた培養物について遠心分離で
除菌した後、ＨＰＬＣで３、４−ジヒドロキシ安息香酸
生成量を分取し、ＧＣ−ＭＳ、及びＦＤ−ＭＳを用いて
３、４−ジヒドロキシ安息香酸であることを確認した。
また、本物質の定量にはＨＰＬＣを用いたところ、１リ
ットルの培養液から１１ｇの３、４−ジヒドロキシ安息
香酸を得た。
リットル分注したものにロドコッカス・エスピ−・Ｌ−
１ Ｅ−１０８Ｂ（Rhodococcus sp. L-1 E-108B、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３６２３）を一白金耳接種し、３０℃で３
日間振盪培養した。得られた培養物について遠心分離で
除菌した後、ＨＰＬＣで３、４−ジヒドロキシ安息香酸
生成量を分取し、ＧＣ−ＭＳ、及びＦＤ−ＭＳを用いて
３、４−ジヒドロキシ安息香酸であることを確認した。
また、本物質の定量にはＨＰＬＣを用いたところ、１リ
ットルの培養液から１１ｇの３、４−ジヒドロキシ安息
香酸を得た。
【００１５】実施例２ 培地Ａを１００ミリリットル容三角フラスコに４０ミリ
リットル分注したものにロドコッカス・エスピ−・Ｌ−
１ Ｅ−１０８Ｂ（Rhodococcus sp. L-1 E-108B、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３６２３）を一白金耳接種し、３０℃で３
日間前培養したものを新たな培地４０ミリリットルに
０．２ミリリットル量接種した。３０℃で３日間振盪培
養を行い、培養液の遠心分離により得られた集められた
菌体を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．
６）で２回洗浄を行った後、０．５％イソフタル酸を含
む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．６）に再
懸濁した。その後、回転振盪を行いながら、３０℃で７
時間休止菌体法を行ったところ、モル変換率７０％で
３、４−ジヒドロキシ安息香酸を得た。
リットル分注したものにロドコッカス・エスピ−・Ｌ−
１ Ｅ−１０８Ｂ（Rhodococcus sp. L-1 E-108B、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３６２３）を一白金耳接種し、３０℃で３
日間前培養したものを新たな培地４０ミリリットルに
０．２ミリリットル量接種した。３０℃で３日間振盪培
養を行い、培養液の遠心分離により得られた集められた
菌体を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．
６）で２回洗浄を行った後、０．５％イソフタル酸を含
む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．６）に再
懸濁した。その後、回転振盪を行いながら、３０℃で７
時間休止菌体法を行ったところ、モル変換率７０％で
３、４−ジヒドロキシ安息香酸を得た。
【００１６】
【発明の効果】本発明の菌体は、休止菌体法にて３、４
−ジヒドロキシ安息香酸の生産を行えることから、工業
化する上で非常に効率的で低コスト化に寄与する。
−ジヒドロキシ安息香酸の生産を行えることから、工業
化する上で非常に効率的で低コスト化に寄与する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の性質を有するＦＥＲＭ Ｐ−１３
６２３号として寄託された新規なロドコッカス ｓｐ．
Ｌ−１ Ｅ−１０８Ｂ株。 １．形態学的性質 （１）菌形：かん菌 （２）大きさ：１．０〜１．６×０．３〜０．５μｍ （３）多形性：３０℃で培養すると１〜２日で菌糸を形
成し、その後、フラグメンテ−ションをおこし、かん菌
となる。気菌糸は形成しない。 （４）運動性：なし （５）鞭毛：なし （６）胞子：なし ２．培養的性質 （１）肉汁寒天平板培養：生育良好。コロニ−の形は花
形で表面はしわ状、隆起状態は偏平で周縁部は繊毛状。
乳白色で鈍い光沢あり。 （２）肉汁寒天斜面培養：生育良好。コロニ−の形は糸
状で表面は平滑。隆起状態は偏平で乳白色。鈍い光沢あ
り。 （３）肉汁液体培養：生育良好。表面の被膜形成なし。
均一に混濁。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。 （５）リトマスミルク：リトマスを還元し、凝固・ペプ
トン化しない。 ３．生理学的性質 （１）グラム染色性：陽性 （２）硝酸塩の還元：陰性 （３）脱窒反応：陰性 （４）ＭＲテスト：陰性 （５）ＶＰテスト：陰性 （６）インド−ルの生成：陰性 （７）硫化水素の生成：陽性 （８）デンプンの加水分解：陰性 （９）クエン酸の利用 コ−ザ−の培地：陽性 クリステンセンの培地：陰性 （１０）無機窒素源の利用 硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陽性 （１１）色素の生成：陰性 （１２）ウレア−ゼ クリステンセンの培地：陽性 ＳＳＲ培地：陽性 （１３）オキシダ−ゼ：陰性 （１４）カタラ−ゼ：陽性 （１５）生育の範囲 ｐＨ５．０〜１０．０（最適
５．０〜８．０） １５〜３３℃（最適 ２０〜３１℃） （１６）酸素に対する態度：好気的 （１７）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆｓｏｎ
法）：陰性 （１８）糖類からの酸及びガスの生成 ： 酸 ガス Ｌ−アラビノ−ス 陰性 陰性 Ｄ−キシロ−ス 陰性 陰性 Ｄ−グルコ−ス 陰性 陰性 Ｄ−マンノ−ス 陰性 陰性 Ｄ−フラクト−ス 陽性 陰性 Ｄ−ガラクト−ス 陰性 陰性 マルト−ス 陰性 陰性 シュ−クロ−ス 陰性 陰性 ラクト−ス 陰性 陰性 トレハロ−ス 陰性 陰性 Ｄ−ソルビト−ル 陰性 陰性 Ｄ−マンニト−ル 陰性 陰性 イノシト−ル 陽性 陰性 グリセリン 陽性 陰性 デンプン 陰性 陰性 （１９）セルロ−スの分解：陰性 （２０）キチンの分解：陰性 （２１）細胞壁のジアミノピメリン酸異性体：ｍｅｓｏ
−ＤＡＰ （２２）細胞壁アシル型（グリコリル試験）：グリコリ
ル基が存在 （２３）ミコ−ル酸：存在 - 【請求項２】 請求項１の微生物を、イソフタル酸を主
たる炭素源とする培地で培養し、得られた培養物から
３，４−ジヒドロキシ安息香酸を採取することを特徴と
する３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2776494A JPH07236472A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | 新規微生物およびそれを使用した３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2776494A JPH07236472A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | 新規微生物およびそれを使用した３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236472A true JPH07236472A (ja) | 1995-09-12 |
Family
ID=12230072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2776494A Pending JPH07236472A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | 新規微生物およびそれを使用した３，４−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07236472A (ja) |
-
1994
- 1994-02-25 JP JP2776494A patent/JPH07236472A/ja active Pending
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