JPH01296994A - Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−グルタミン酸の！Ｉ！Ｉ這法に関ずろ。 従って本発明は、食品、医薬品の産業分野において有用
である。 従来の技術 従来、コリ木型グルタミン酸生産菌を用いる１゜−グル
タミン酸の製造法としては種々の方法が知られている。 本発明にかかわるものとしては、イソシトレートリアー
ゼ活性の低下したプレビバクデリウ！・属の変異株を用
いる方法（特開昭５Ｅニー９２７！１５）や、！、−グ
ルタミンまたは！、−グルタミン酸を唯一の炭素源とし
て生育する能力の欠失または著しく低下した変異株を用
いる方法（特開昭５７−１３８３９５）などが知られて
いる。 発明が解決しようとする課題 近年１４−グルタミン酸の需要は増大しておＬＬ−グル
タミン酸の生産性を向４−させるために、Ｌ−グルタミ
ン酸の！Ｊ造法の改善は常に望まれている。 課題を解決するだめの手段 本発明者は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、α−
リドグルタル酸脱水素酵素の活性が著しく低ドしたａ５
’ｅ株、イソシトレートリアーセとα−ケトグルタル酸
脱水素酵累の両方の活性が著しく低ドした変異株および
該変異株にさらにブ

【］リンアナτ】グに対する耐性を
付与した変異株を用いることによりＬ−グルタミン酸の
生産性が向上することを見出し本発明を完成した。 以下に本発明の詳細な説明する。 本発明は、コリネ」１４ノグルタミン酸生産菌に属し、
α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性、またはイソシトレ
ートリアーゼ活性とα−ケトグルタル酸脱水素酵ぶ活性
の両方が著しく低１ζし、かつＬ−グルタミン酸生産能
をイ「する微生物、または該微生物にさらにプロリンア
ナログに対する耐性を付Ｌ７゜した微生物を培地に培養
し、培養物中に１．−グルタミン酸を生成蓄積させ、該
培養物からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とす
るし一グルタミン酸の製造法を促供する。　本明細書に
おいて、−１り不望グルタミン酸生産菌とは、コリネバ
タテリウム属、プレビバクテリウ！−属、ミタτ］バク
テリウムｌ１ｉｉに属する一Ｉｆｆのグルタミン酸生産
菌４いう（「発酵と工業」、第４０巻、　　Ｉｏ２ｒｔ
、　　＋：＋ｇ２年）。 本発明に使用する微生物としては、コリネＩＬＪグルタ
ミン酸生産菌に属し、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活
性、またはイソシトレー）　ＩＪアーゼ活性とα−ケト
グルタル酸脱水素酵素活性の両方が著しく低下した微生
物、または該微生物にさらにプロリンアナ［１グに対す
る耐性を付与した微生物であればいずれでも使用できる
。ブ［］リンアアナ】グとしては、３．４−テ゛ヒト「
】プロリン、４−チオブ［１リン、アゼチジンカルボン
酸などがあげられる。さらにこれらの微生物は、これら
の性質に加えて他の性質、例えば名種栄養要求性、桑剤
耐性。 薬剤感受性、薬剤依存性などを併せて持っていてもよい
。 このような微生物は、通常の変異処理法、例えば紫外線
照射またはＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ＝ニトロソグ
アニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸などの化学処理を施した細
胞群の中から常法により得ることができる。また、この
ような性質を持つ微生物は、池の遺伝的手法、例えば遺
伝１組換え法。 形質導入法、細胞融合法などによっても誘導することが
できる。 イソシトレートリアーゼ活性の低下した変）′１ｊ株は
、グルコースは資化するが、酢酸は資化しない変異株か
ら容易に分離することができる。さらに、イソシトレー
トリアーゼ活性の低下に加えてα＝ケトグルタル酸脱水
素酵素活性の低下した変５＾株は、１−述のインシトレ
ートリアーゼ活性の低ドした変異株を親株として変異処
理を行い、グルコースは資化するが、クエン酸は資化し
ない変異株から容易に分離することができる。 さらに、プロリンアナログに対する耐性を有ずろ変異株
は、上記の変異株を親株とし°Ｃ変異処理を行い、親株
が生育できない濃度のブ［］リンアナＴＪグを含む最少
寒天培地で生育できる変異株から容易に分離することが
できる。 以下に、本発明の使用菌株の代表例であるコリネバクテ
リウド・グルタミクムＧ−４１（イソシトレートリアー
ゼ活性欠失−α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性欠失性
斐異様）の具体的な誘導法について述べろ。 コリネバクテリウｌ、・グルタミクムＢ−１５（微工研
菌寄第７９８２号、以下！３−１５と称す）の細胞を（
］、　Ｉ　ＢＪ定のトリスマレイン酸緩（÷［液（１１
１６、０＞中に１０′１個／　ｍ　ｌになるようにＱ、
Ｅｒした。 これに、Ｎ　Ｔ　Ｇを最終濃度ｔ）、２ｍｇ／ｍｌにな
るように添加し、室温で３０分間放置後グルコースを唯
一・の炭素源とする最少寒天培地〔グルコース（）、５
ｇ／ａ、　　ＫｔＬＰｏ、　０．１５　ｇ／ｄＲ，Ｋ２
ｔｌ　Ｐｏ。 ０．０５ｇ／ａ、ＮａＣ１Ｏ，０１ｇ／ｄ、Ｍｇ５Ｏ，
−７１−ＬＯＯ，０５ｇ／Ｊ、ＣａＣＲ２・２■Ｉ２０
１μｇ／ｍ１．Ｆｅ５Ｏｎ・７Ｈ２０１０μｇ／ｍｌ。 ＭｎＣＲｚ’　４Ｈａ０　７ｕｇ／ｍｌ、チアミン−１
１ＣＩ！。 ［１，Ｉ　μｇ／ｍｌ、　（Ｎ　Ｈ＜）２Ｓ　０．０．
１５　ｇ／ａ、ビスチン３０　μｇ　／　ａ’　、寒天
１．５　ｇ／ｄｉ！　（Ｎａ０１１でｐ　１１７．２に
調整）〕の表面に９抹し、３０℃で３０間静置ｊΔ養し
た。 ついで、コロニー状に生育した細胞を、上述の最少寒天
培地と、酢酸を唯一の炭素源とする最少寒天培地（上述
のグルコース培地からグル：ノースを除き、０．５ｇ／
ａの酢酸を添加した培地）にレプリカ法で転写して、３
０℃で３日間静置培養を行った。その結果、グルコース
を炭素源とする最少培地では生育するが酢酸を炭素源と
する最少培地では生育しない変異株を多数（）だ。 これらの変異株をグルコース右よび酢酸を炭素源とする
液体培地〔グルコース３％、酢酸アンモニウム２％、　
　（Ｎ＋−１，）２Ｓｏ、　０．１％、　Ｋ　ａｌ−１
ｔ’　Ｏ−０，２％、Ｍｇ　５０４　　・７ＨａＯ（１
，０５％、ビオチン５００μｇ／β、チアミン・ＨＣｌ
　５００μｇ／β、パントテン酸カルシウム５００．ｚ
！。 −”−、ｌＪチン酸アミド５００ｔｔｇ／Ｒ，ＣａＣ０
：＋　２％。 （ｐ　Ｈ７，２）　］　５０ｍｌを含んだ３００ｍ１容
三角フラスコで２１　Ｏｒｐｍの振盪条件下で好気的に
培養した。得られた菌体を集めて、これを超音波菌体破
砕機にかけて菌体を破砕し、これを１２．００Ｏｒｐｍ
の回転数の遠心分離機で遠心分離した。得られた」−澄
液中のイソシトレートリアーゼ活性をメンラド・インー
ｘンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）。 第１：（巻、１６３頁（＋９６９＞記載の方法に従って
ｄｌ１１定し、活性の著しく低下した変異株としてＧ　
−４０を選択した。 こうして得られたＧ−４０を上述と同様にＮ　ｉ’　Ｇ
処理をして、グルコースを炭素源とする最少培地に塗抹
し、生育したコロニーを、上述のグル：ノースを炭素源
とする最少寒天培地とクエン酸を炭素源とする最少寒天
培地（上述のグルコースを炭素源とする最少寒天培地か
らグルコースを除き、クエン酸ナトリウム０．５ｇ／ａ
を添加した培地〉の両方に塗抹し、グルコース培地では
生育するがクエン酸培地では生育しない変異株を多数分
離した。 これらの変異株を、上述のイソシトレートリ゛ｒ　−ゼ
活性の測定の場合と全く同様に、液体培養して集菌し菌
体破砕して菌体抽出物をｉ）、各々についてα−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素活性をアグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリイ（＾ｇｒｉｃ、　Ｒｉ
ａ！、　［：ｈｅｍ、　）第４４巻（１９８０）に記載
の方法に従って測定した結果、α−ケトグルタル酸脱水
素酵素活性の低下した株としてＧ−４１株を選択した。 上記のようにして４１）られたイソシトレートリアーゼ
活性およびα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性の両方が
著しく低下したＧ−４１株は、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＧ　　４１　　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６５２
＞として、昭和６３年１月１４日付で工業技術院微生物
工業技術研究所（微工研）に寄託されている。 さらに、上記で得られたコリネバクテリウム・グルタミ
クムＧ−４１株を親株として、プロリンアナログ〈３，
４−デヒドロプロリン）に対する耐性を有する変異株を
、以下のようにして誘導した。 ブイヨン寒天スラント培地で一夜生育させたＧ−４１株
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６５２）の細胞を、■０９個／ｍ
ｌになるように１／１５！Ｊ　）リス−マレイン酸緩衝
液に懸濁し、これにＮＴＧを２５０μｇ／ｍｌの濃度に
なるように添加して、室温で３０分間放置した。 細胞を遠心分離で集め、」−記と同じ容量の１／１５Ｍ
トリスーマレイン酸緩衝液に再懸濁して、この０．１ｍ
ｌを５０ｍｇ／ｄ１の３．４−デヒドロプロリンを含む
最少寒天培地〔グルコース０．５ｇ／！１！。 （Ｎｌ＋４＞２３Ｏ４０，１５ｇ／ｄｉ、　Ｋｌｌ□Ｐ
Ｏ４０，１５ｇ　／　ａ。 ＫＪｒ’Ｏｎ　　０．０　５　　ｇ／ｄ１．　　Ｎａ１
Ｊ　　４．６　　ｇ／ａ、　　！ＪｇＳ口、・７１１２
０　　（］、０５ｇ／ｄ１．　［ａｌＪ２”２１１ＪＯ
ｌμｇ／ｍｌ。 ＦｃＳ口ａ　　・　７１１２０　１　０　μｇ／＋ｔ＋
ｌ、　　１ＪｎｌＪ　２　・　４Ｌ０　７　μｇ／ｎ＋
Ｉ。 チアミン・１ｌｔＪＯ，ｌμｇ／１Ｔｌｌ、ビオチン３
０μｇ／Ｉｔ。 寒天１．５　ｇ　／　ｃ／ｊ！　（Ｎａ０ｌｌでｐＨ７
，２に調整）〕の表面に塗抹し、３０℃で３日間静置培
養した。３．４−デヒド（ＩＩプｒＪＩＪンを添加した
培地の表面には、３．４−デヒドロプロリン耐性株が約
２５０個のコロニーとして生育した。これに対し、３，
４−デヒドロプロリン無添加の対照培地では、菌は培地
の全表面に生育した。生育した３、４−デヒドロプロリ
ン耐性株のうち１００株を釣菌し、後述の実施例１の方
法でし一グルタミン酸生産試験を行った結末、Ｌ−グル
タミン酸生産性の優れた菌としてＧ−４２株を選択した
。 上記のようにして得られた３、４−デヒドロプロリンに
対して耐性を有するＧ−４２株は、コリネバクテリウム
・グルタミクムＧ　−４２（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１８４５
　）古して、昭和６３年５１１１１ｒＪ付で微工研に寄
託されている。 十、記の微生物を培養する」？１地としては、炭素源。 窒素源、無機塩類、生育因ｆなどを含有する栄養培地ま
たは合成培地が用いられる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース。 シュークロース、　糖蜜、デンプン、デンプン加水分解
物、果汁などの炭水化物、エタノール、メタノール、ブ
「１パノールなどのアルコール類が使用できる。 窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム
、塩化アンモニノ・、リン酸アンモニウト。 ＭＩ’ｉ１２アンモニウ１１．尿素、アンモニア、アミ
ン類。 ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・
リカー、カゼイン加水分解物、各種発酵菌体およびその
消化物が使用できる。 ｊｌｉｔ　６１塩としては、リン酸−カリウｌ４．リン
酸二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシラ！
・、塩化す）　ＩＪウド、硫酸第一鉄、硫酸マンガン。 炭酸力ルシウｌ、などが使用できる。 栄養便求性を示す変異株を使用する場合には、栄４％物
を枕品もしくはそれを含有する天然物として添加するこ
とができる。 培ｎ条件としては、通気攪拌などの好気的条件下で、培
養温度は２４〜３７℃、培養［］数は２〜７０間である
。培養液のｐＨは５〜９の範囲に維持する。ｐＩ−（の
１栗整には尿素、炭酸カルシウド。 アンモニアガス、アンモニア水、リン酸マグ不シウノ４
．炭酸アンモニウトなどが用いられる。 培養終了後、培養液からＬ−グルタミン酸をｊｐ−離す
る方法としては公知の方法、例えばイオン交換樹脂法、
溶媒抽出法などが用いられる。 以下に実施例をあげて本発明を具体的に示す。 実施例１ 種菌としてコリ不バタテリウム・グルタミン酸Ｇ　−４
１（Ｆ［ｉＲＭ　［］］Ｐ−１６５２を用いた。Ｇ−４
１株を、グルコース４０ｇ／ＩＩ！、ペプトン１０ｇ／
Ｌ肉エキス５ｇ／Ｊ、酵母エキス５ｇ／ｌ。 Ｋｌ（２ＰＯ，Ｉｇ／β、　Ｋ２ＨＰ　Ｏ４１ｇ／　ｊ
！。 Ｍｇ５０４　・ＴＩＩｔＯＯ，５ｇ／　Ｒ，Ｆ　ｅ　Ｓ
Ｏ＊・７１１Ｊ０　　２　（１ｍｇ／　Ｉｔ、Ｍｎ　Ｓ
ｏ−・　４　Ｏ２０２０ｍｇ／１２．尿素５　ｇ／　Ｒ
，（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／　ｊ’からなる種Ｊ８地（
ｐｉ−（７，２）　２０ｍｌを含んだ３００ｍ１容三角
フラスコに接種し、３０℃で２４時間培養した。この種
培養液７ｍｌを生産培地〔グルコース７７ｇ／Ｌ尿素７
．７　ｇ／Ｒ，（ＮＩｌ、）、Ｓｏ。 ３ｇ／！！、Ｋｌ［２ＰＯａ　１．５ｇ／β、に２ｌ−
（ＰＯ。 １．５ｇ／ｊ’、Ｍｎ５Ｏ＋・４１−１，０　３０ｍｇ
／Ｌビオチン７７μｇ／Ｌ　バントデン酸カルシウｌ、
７７０メｚｇ／β、ニコチン酸アミド７７ｆｂ１ｇ／ｊ
’。 チアミン・ｌＩＣ１３００ｑ／ｊ！　（ｐｌＩ７．２）
］１１３ｍを含んだ３００ｍ１容三角フラスコに接種し
、さらにペニシリンＧを最終潰度５単位／　ｍ　ｌにな
るように添加して３４℃で振盪培養した。培養中、培養
液のｐＨを６．５から８．０に保つように、殺菌したＩ
　０％尿素溶液０．５ｍｌを添加しながら３０時間培養
した。培養終ｒ後、培養液中の［４−グルタミン酸生成
量を測定したところ、培養液中に２７，２ｍｇ　／　ｍ
　Ｉの１、−グルタミン酸が蓄積していた。対照として
親株であるＢ−１５株を前記と同様にして培養した結果
２４．　：３　ｍｇ／　ｍｌのし一グルタミン酸が生成
していた。 実施例２ 下記の組成の生産培地２０ｍ１を含んだバッフル板付の
３００ｍ１容三角フラスコに、実施例１と同様にして得
たＧ−４１株またはＧ　−４２（ｐｔ：＋＋＋Ｊ［ＩＰ
−１８７５）株の種培養液１ｍｌをそれぞれ接種して、
３０℃で４０時間、２１１）　ｒｐｍの振盪条件ドで振
盪培養した結果、（、−４１株はｌ　［１，２ｍｇ／　
ｍｌの１、−グルタミン酸を、Ｇ−４２株は４９　ｍｇ
／　ｍｌ□、）　Ｌ。 −グルタミン酸をそれぞれ培養液中に蓄積していた。対
照とした親株Ｂ−１５株およびＧ−４０株の場合の【７
−グルタミン酸の蓄積−ｎは０．１　ｍｇ／ｍ１以下で
あった。 生産培地の組成：廃糖蜜１００ｇ／Ｊ！　（グルコース
換算）、（ＮＨ，＞２５０．２０ｇ／Ｒ。 Ｋ１１２ＰＯ４０，５ｇ／Ｌ　Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈ３００
、５ｇ　／　ｌ　、尿素３ｇ／１．Ｆｅ５０＊・７）ｈ
。 １０＋ｎｇ／ｉ’、チアミン４（Ｃｊ！　　２．５ｍｇ
／Ｊ、ビオチン５００ｕｇ／　Ｊ！、　Ｃａ　ＣＯｚ　
３０　ｇ／　Ｉ！ｐ　Ｈ７，２ 発明の効果 本発明によれば、Ｌ−グルタミン酸を収率よく安価に製
造することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、α−ケトグ
   ルタル酸脱水素酵素活性が著しく低下し、かつＬ−グル
   タミン酸生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
   中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ
   −グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタ
   ミン酸の製造法。
2. （２）該微生物が、さらにイソシトレートリアーゼ活性
   が著しく低下した微生物である請求項１記載の製造法。
3. （３）該微生物が、さらにプロリンアナログに対して耐
   性を有する微生物である請求項１〜２記載の製造法。