KR900005531B1 - 지베렐라 푸지쿠로이 hb 901 및 이를 이용한 지베렐린의 제조방법 - Google Patents

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Description

지베렐라 푸지쿠로이 HB 901 및 이를 이용한 지베렐린의 제조방법

본 발명의 지베렐라 푸지쿠로이(Gibberella fujikuroi) HP 901(기탁번호 : KFCC-10642) 및 그 배양액으로부터 식물성장조절물질인 지베렐린(Gibberelin)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

지금까지 알려진 바에 의하면 지베렐린은 식물 생장조절물질로서 재배작물의 생장을 촉진하고, 과수작물의 단위 결과를 유도하여 씨없는 과실의 생산을 가능케하며, 작물의 개화 생리에 필요한 저온이나, 단일 요구성을 대체시킬 수 있는 효과도 있어서 이를 이용하면 개화 및 결실기를 인위적으로 조절할 수 있다.

따라서, 화훼 재배 및 종자 산업에는 필수적인 물질임과 동시에 종자의 휴면을 타파시키는 효과도 커서, 파종시기의 조절은 물론 발아 상태를 호전시킬 수 있는 유용한 물질로 알려져 있다. (Jefferys, E.G., Adv. in Appl. Microbiol, 13,283,1970., 일본 특허 53-143555, 일본 특허 53-92261, 일본 특허 53-7451, 일본 특허 51-124579).

종래, 미생물의 발효에 의한 지베렐린의 생산 방법으로는 토마토즙 10 부피%, 초산 0.²부피%, 제1인산 칼륨 0.¹²중량%, 제2인산칼륨 0.¹⁸중량%, 황산암모늄 0.05중량%, 염화칼슘·2수화물 0.²⁴⁸중량%, 효모추출물 0.²⁵중량%, 그리고 미량의 바이오톤을 함유하는 배지에서 이를 30℃의 온도로 2일간 배양하여 종배약액을 제조하고 이어서 세레로스 7중량%, 면실분 4중량%, 제1인산칼륨 0.⁵중량%, 황산암모늄 0.⁷중량%, 무코닉산 0.¹중량%를 함유하는 배지에다 상기 종 배양액의 10%를 접종한 후, 통기량 0.²V.V.M, 교반속도 1,700rpm의 조건으로 27℃에서 116시간 배양하여, 1,100mg/l의 목적물을 수득하는 방법이 보고되어 있다(미국 특허 제3,681,196호). 그러나 상기 방법은 배양시간이 5일 정도로 짧아 균주가 이용하는 탄소원의 농도가 상대적으로 낮고, 또 배지내에 고가의 무코닉산을 0.1중량%를 첨가해야 하기 때문에, 발효적인 면에서 경제성있는 방법이 되지 못하는 단점이 있었다.

한편, 발효배양액에 축적된 지베렐린의 분리 및 정제에 대한 기술로는 첫째, 발효배양액을 pH조정하에서, 물에 안 섞이는 용매(Water-immiscibel Solvent)와 염 형태의 수용액으로 반복 추출하여 얻어진 용매나 수용액 층을 농축하여 재결정시키는 방법(영국 특허 제819,110호, 제821,733호, 제1,292,869호)

둘째, 발효배양액을 활성탄, 알카리 금속 바아카아보네이트염(Alkali metal bicarbonate salt) 혹은 강염 기성 음이온 교환수지(Strongly basic anion exchange resin)에 흡착시킨 후 용출시키는 방법(미국 특허 제2,980,700호, 영국 특허 제847,435호)등이 보고 되어 있다.

그러나 전자의 경우에는 휘발성 용매를 사용하기 때문에 공정상의 안전에 항상 위험이 따르고, 용매의 가격이 고가이기 때문에 상대적으로 경제성이 떨어지는 단점이 있다. 그리고 후자의 경우는 강염기성 이온 교환수지의 가격도 약염기성 이온 교환수지에 비해서는 가격이 고가인 점과 재생율이 저조하다는 단점이 있었다.

이에 본 발명은 종래에 사용되어온 균주에 비하여 탄소원에 대한 이용도가 훨씬 높고, 지베렐린의 생산능력이 더욱 우수한 새로운 변이주를 제공하는데 목적이 있는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 변이주를 이용하여 지베렐린을 제조하는데 있어서 보다 저렴한 비용으로 높은 생산수율을 얻을 수 있는 새로운 배지조건을 확립하고, 보다 안전하고 간편한 정제 및 분리공정을 사용하여 지베렐린을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따르는 신균주인 지베렐린푸지쿠로이 HB901은 지베렐라푸지쿠로이 ATCC 12616의 변이주로서, 다음과 같은 방법으로 제조된다.

즉, 지베렐라푸지쿠로이 ATCC 12616의 포자를 TM완충용액(Tris-Maleic acid Buffer, pH 8.0-8.2)에 녹인 후, 엔,티,지(N.T.G)0.1-1.0mg/ml의 농도로 20-60분간 처리하여 얻는 균주를 포도당 2%, 가용성전분 4%, 대두분 1%, 대두유 1%, 제1인산칼륨 0.5%, 황산마그네슘 0.1% 그리고 미량의 무기염류 등을 포함한 배지에서 5-9일간 진탕배양하여 생산성이 높은 우수균주를 선별한후, 여기에 다시 하이드록신아민을 0.1-1.0M로 농도로 20-60분간 처리하여, 위에 상술한 방법으로 우수한 균주를 재선별하였고, 이렇게 하여 얻은 변이주를 지베렐라푸지쿠로이 HB901로 명명하고, 이 균주는 1988년 9월 2일자로 한국종균협회에 기탁번호 KFCC 1642호로 기탁되었다.

본 발명의 지베렐라푸지쿠로이 HB901는 다음과 같은 미생물학적 특성을 갖는다.

(1) 당분 이용 특성

본 발명에 따른 신균주인 상기 지베렐라푸지쿠로이 HB901에 대한 당 이용성은 다음 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 포도당, 맥아당, 자당, 유당, 글리세롤, 이노시톨, 아라비노즈, 람도오즈 등에서 친균주인 ATCC 12616RH과 큰 차이를 보이지는 않으나 전분이용에 있어서는 친균주보다 월등한 특징으로 나타낸다. 이 전분이용성의 차이는 실시예 1에 나타나 있으며, 이와 같이 고농도의 전분을 이용하기 때문에 지베렐린의 생산성이 높아지는 것으로 생각된다.

(2) 배양학적 특성

또한, 변이주와 친균주는 펩톤아가배지, YEME아가배지, 트립톤아가배지, NA배지, 콘밀아가배지, 벤네트아가배지에서는 큰 차이점이 없었으나, 전분아가배지, 글리세롤 아스파라긴아가배지, PDA(Potato dextrose Agar)배지에서는 차이점을 나타내고 있으며 그 결과는 다음 표 2와 같다.

[표 1]

[표 2]

한편, 본 발명에 따른 변이주인 HB901의 발효조건을 확립하는데 있어서는 8-15%의 고농도 전분 이용 능력을 갖는 변이주에 적당한 배지 및 배양조건을 선택함으로써 지베렐린의 생산성을 높였다.

즉, 배지는 탄소원으로 전분, 포도당, 대두유, 세레로스 등을 8-15중량%, 질소원으로 대두박, 글라이신, 황산암모늄, 면실분, 질산암모늄 등을 0.¹³-2중량%사용하였고 미량의 무기염류를 첨가하였으며 배양시 0.⁷-1.⁵V.V.M의 통기량과 400-1,000rpm의 교반속도, 3-5의 초기 pH, 바람직하게는 4-5의 초기 pH로 20-30℃에서 6-10일간 배양하였는바, 이 방법으로 지베렐린의 생산성을 1270mg/l로 높일 수 있었다.

[표 6참조]

본 발명에서는 상기와 같은 배지조성과 배양조건을 기초로하되 경우에 따라서는 배양 2-4일 후에 배양온도를 28-30℃에서 20-24℃로 낮추고, 그 이후는 일정하게 유지시키는 방법을 사용할 수도 있는 바 이렇게 한 결과 생산성이 1380mg/l로 높아졌다.

이와같이 생산성이 향상된 이유는 배양초기에는 28-30℃로 균의 생장에 적합한 조건을 유지시켜 왕성한 균생장을 유도하다가 균의 생장이 최고에 달했을 때 부터는 2차 대사산물인 지베렐린이 많이 생성될 수 있는 조건이 20-24℃로 낮추어 줌으로써 지베렐린의 생산에 적합한 조건을 만들어 준데 기인하는 것으로 판단된다.(표 7참조)

또 다른 방법으로는 2-4일 후에 상기 배양온도를 20-24℃로 유지하면서 10-20%의 멸균수를 첨가하여 배양하는 방법을 사용할 수도 있는데 이렇게 한 결과 배양 7일만에 지베렐린의 생산성을 1510mg/l로 높일 수 있었다.

그 이유는 배양후 2-4일이 되면 균의 생장이 최고에 달하여 배양액의 점도가 높아져서 원활한 산소공급이 이루어질 수 없는바, 멸균수를 첨가하여 배양액의 점도를 낮추어 줌으로써 산소공급을 용이하게 해 줄수 있기 때문에 결과적으로 높은 생산성을 얻을 수 있었다.

이때, 종배양액은 상기와 동일한 탄소원, 질소원 그리고 무기염류등을 포함한 배지를 사용하여 2-4일간 배양하여 제조하였으며, 접종량은 본 배양액의 5-10%가 되도록 하였다. 지베렐린의 생산성은 에탄올과 염산의 혼합된 용액에 지베렐린이 함유된 용액을 진탕 교반한 후 20℃에서 75분간 반응시켜 254nm에서 흡광도를 측정함으로써 검정하였다.(Hollbrook, A.H. et al. Adv. Chem. Series, 28,159,1959).

한편, 발효 배양액에 축적된 지베렐린의 분리 및 정제방법으로는 먼저 발효 배양액을 원심분리하여 상층액을 얻고 한외여과장치(Ultra-filtration System)로 여과한 후 역삼투압장치(Reverse Osmosis System)나 진공회전 농축기(Evaporator)로 농축하여 얻는 농축액에 알콜을 첨가하여 침전물을 제거한 뒤 이를 다시 농축시켜 결정을 얻는 방법이 있고, 또 다른 한가지 방법으로는 약 염기성 음이온 교환수지(Weakly basic anion exchange resin)를 이용하여 지베렐린를 흡착시키는 정제방법이 있는데, 본 발명에서는 상기의 두 정제과정을 병행 또는 반복 수행할 수도 있다.

발효 배양액으로부터 균체 및 고체물질을 제거하기 위해서는 원심분리기 및 여과장치를 이용하고, 이로부터 얻은 발효액의 pH를 3-6으로 조정한 후 단백질 및 불순물을 제거하기 위해 한외여과장치를 이용한다. 이때의 한외여과막은 평균 분획 분자량이 3,000-300,000인 폴리썰폰(Polysulfone)으로 이루어진 막으로써 발효 배양액을 직접 여과할 수있다. 한외여과막을 통과한 여과액을 진공회전 농축기가 역삼투압장치를 이용하여 5-20배농축시키며, 이때 역삼투막은 평균 분획 분자량이 100인 폴리썰폰으로 이루어진 막을 사용하는 것이 지베렐린의 농축에 적합하다.

또한, 지베렐린의 회수방법은 농축된 발효액에 0.2-5배의 에탄올 혹은 메탄올을 첨가하여 교반시킨 후, 당류를 포함하는 불순물을 침전시키고 상등액을 진공회전 농축기로 농축시킨 후, 불순물이 제거될 때 까지 이 과정을 반복하여 저온에서 지베렐린을 결정화시킬 수 있다.

상기 정제과정 중에는 pH가 2-8사이로 되도록 하는 것이 좋고, 이때 지베렐린의 정제 수율은 70%이상 이며 순도는 85%이상이다. 본 발명에서는 상기와 같은 방법을 사용하는 것은 알콜에 대한 지베렐린의 용해도가 높다는 사실과 용액속에 고체물질의 농도(고체질량/용액질량)가 10%이상일 때 알콜에 의한 응집, 혹은 침전이 생긴다는 사실에 기초를 두고 있다.

한편 약염기성 음이온 교환수지를 이용한 지베렐린의 정제방법은 발효여과액은 물론 여러 정제과정중 생기는 지베렐린을 포함한 용액을 처리할 수 있으며 pH2-7, 온도 15-40℃의 조건하에서 지베렐린의 흡착(Adsorption)을 이용한 방법이다. 약염기성 음이온 교환수지는 스틸렌-다이비닐벤젠 기반(Styrene-divinyl benzene matirx)에 1차, 2차 혹은 3차 아민기(Amine group)를 가진 것으로서 입자 크기는 20-100 메쉬가 적당하며 장치는 칼럼식과 회분식이 가능하나 칼럼식이 효율적이다.

흡착된 지베렐린은 에탄올 혹은 메탄올로 용출하고 유효성분을 모아 농축하여 저온에서 결정화시키며, 이때, 정제수율은 75% 이상 순도는 90%이상이다. 약염기성 음이온 교환수지가 강염기성 음이온 교환수지보다 유리한 점은 흡착된 유효성분을 약염기성 음이온 교환수지의 특징인 약한 흡착력을 이용하여 보다 쉽게 용출할 수 있으며, 수지의 재생도 더 용이한 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

* 사용군주 : 지베렐린 푸지쿠로이 ATCC 12616 및 HB901

* 종배양 및 본배양 배지

상기와 같이 배지를 조성한 후 염산으로 pH를 4.0으로 맞춘다.

미량원소는 다음 표 3과 같은 조성을 포함한다.

[표 3]

상기 배지 100ml을 500ml 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 가압 멸균후, PDA한천 사면배지에서 3-5일간 배양한 균주 한 백금니를 접종하여, 120시간 배양함으로써 종 배양액을 제조하였다. 본 배양은 총 용량 13.7ℓ의 발효조에 상기 배지 10ℓ를 넣고 121℃에서 20분간 가압멸균후, 종배양 500ml을 접종하여 통기량 I V.V.M. 교반속도 500rpm의 조건으로 28℃에서 7일간 배양하였다. 배양일수에 따른 두균주의 pH, 건조균체량, 잔존 전분량 및 지베렐린 생산량은 다음 표 4와 같다.

[표 4]

[실시예 2]

사용균주 : 지베렐라푸지쿠로이 HB901

한천 사면 배지에 배양한 변이주 HB901 한 백금니를 가압 멸균된 종배양 배지에서 접종 후 72시간 배양하여 종 배양액을 제조하였다.

다음 표 5에 기술한 본 배양 배지들을 가압 멸균후 거기에 종배양액을 5% 부피 비율로 접종하여 통기량 I V.V.M., 교반속도 500rpm의 조건으로 28℃에서 7일간 배양하였다. 그후 각각의 배양액을 회수하여 지베렐린의 생산성을 측정한 결과는 다음 표 6과 같다.

[표 5]

배지 조성 1은 본 발명에서 조합된 배지이며, 배지조성 2와 3은 각각 영국특허 838,032호와 미국특허 3,681,196호에 나타난 배지조성을 사용한 것이다.

[표 6]

상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 배지 조성에서는 종래의 배지 조성에 비해 지베렐린의 생산량이 월등히 우수하다.

[실시예 3]

사용균주 : 지베렐라푸지쿠로이 HB901

종배양 배지 및 본배양 배지의 조성은 실시예 2의 배지 조성 1과 같다. 발효조 2대에 본배양 배지를 각각 10ℓ식 넣어 가압 멸균후, 종배양액 500ml을 접종하여, 통기량 I V.V.M,, 교반속도 500rmp, 초기 pH 4로 7일간 배양하되 1대의 발효조는 배양 3일후부터 배양온도를 30℃에서 20℃로 낮춘후 배양이 끝날 때까지 온도를 20℃로 일정하게 유지시켰다. 다른 1대의 발효조는 배양 초기부터 온도를 28℃로 일정하게 유지시키면서 7일간 배양하였다.

상기 두 발효조에서 회수한 배양액의 배양일수에 따른 지베렐린의 생산성은 다음 표 7과 같다.

[표 7]

[실시예 4]

사용균주 : 지베렐라푸지쿠로이 HB901

종배양 배지 및 본배양 배지의 조성은 실시예 2의 배지 조성과 같다.

발효조 2대에 본배양 배지를 각각 10ℓ씩 넣어 가압 멸균후 종배양액 500ml을 접종하여 통기량 I V.V.M,, 교반속도 500rmp, 초기 pH 4. 배양온도는 초기에 30℃로 3일간 배양후 잔여 4일을 20℃로 배양하되, 1대의 발효조는 배양 3일후 멸균수를 15%부피 비율로 첨가한후 잔여 4일을 배양하였다. 다른 1대의 발효조는 멸균수를 첨가하지 않았다.

상기 두 발효조에서 회수한 배양액의 배양일수에 따른 지베렐린의 생산성은 다음 표 8과 같다.

[표 8]

[실시예 5]

실시예 4의 멸균수를 첨가한 경우로부터 회수한 배양액(생산성 1510mg/ℓ) 12ℓ를 취하여, 원심분리(8000g, 30분)하여 상등액을 회수한 후, pH를 3.0으로 조정하고 한외여과장치(표본 분획 분자량 10,000)를 이용, 10ℓ의 여과액을 얻었다. 이중 5ℓ의 발효여과액을 진공회전 농축기로 농축하여 500ml의 농축액을 얻고 500ml의 에탄올을 첨가하여 교반하였다.

이 용액을 원심분리(5,000g, 20분)하여 800ml의 상등액을 얻은 후 감압 농축하여 200ml의 농축액을 얻었다. 이 농축액에 200ml의 에탄올을 첨가, 교반후, 원심분리하여 다시 상등액을 취하고 농축하여 50ml의 용액을 얻었다. 상기 용액을 4℃에서 1일간 방치하여 백색의 결정을 얻었다. 나머지 5ℓ의 발효여과액은 영국특허 제819,110호에 의한 방법으로 정제를 실시하였다. 5ℓ의 여과액에 2.5ℓ의 에틸아세테이트를 첨가한 후, 500rpm으로 10분동안 교반하고 원심분리(5,000g, 20분)하여 용매층을 회수하였다. 나머지 수용액 중에 다시 2.5ℓ의 에틸아세테이트를 첨가하여 재추출하여 같은 방법으로 용매층을 회수하였다. 상기의 용매층을 무수 황산나트륨으로 탈수시켜 4.8ℓ의 용매층을 회수하고, 이를 감압 농축시켜 20ml의 농축액을 얻었다. 이 용액을 4℃에서 결정화시켜 백색의 결정을 얻었다. 다음 표 9와 같이 상기의 두가지 정제방법으로 회수한 결정들을 60℃에서 건조시킨 후 흡광도 측정법으로 그 순도를 결정하고 결정을 칭량하여 정제수율을 계산하였다.

[표 9]

[실시예 6]

실시예 3의 온도를 조절한 경우로부터 회수한 배양액(생산량 1380mg/ℓ) 10ℓ를 취하여 원심분리하여 상등액을 회수한 후 pH를 3.5로 조정하고 환외여과장치를 이용, 8.5ℓ의 발효여과액을 얻었다.

이중 4ℓ의 발효여과액을 약 염기성 음이온 교환수지인 WA 30(삼양 다이아 이온의 상품명)에 흡착시키고, 0.1% 개미산으로 충분히 세척한 후 20%의 메탄올로 유효성분을 용출시켰다.

지베렐린의 활성분획을 모은 3.2ℓ의 용액을 분무 건조기로 건조시켜 분말을 얻었다. 나머지 발효액중 4ℓ는 영국특허 제847,435호에 의한 방법으로 정제를 실시하였다.

발효여과액을 강 염기성 음이온 교환수지인 Dowex-1×4(다우 케미칼의 상품명)에 흡착시키고, 0.1%의 개미산과 20%의 에탄올로 충분히 세척한 후 50%의 에탄올로 유효성분을 용출시켰다. 지베렐린의 활성분획을 모은 4.6ℓ의 용액을 분무건조기로 건조시켜 분말을 얻었다.

상기 두가지 방법으로 정제한 분말들을 회수하여 실시예 5와 동일한 방법으로 순도 및 정제수율을 측정하였다.

[표 10]

[실시예 7]

실시예 4의 멸균수를 첨가한 경우로부터 회수한 배양액(생산성 1510mg/ℓ) 12ℓ를 취하여 실시예 5와 같이 원심분리 및 한외 여과하여 10ℓ의 발효여과액을 얻었다.

상기 여과액을 역삼투압장치(평균분획분자량 100)를 이용, 1ℓ로 농축한 후 실시예 6과 같이 약 염기성 음이온 교환수지에 흡착시켜 메탄올로 유효성분이 들어있는 1.5ℓ의 용출액을 얻었다. 이 용출액을 200ml로 농축하고 실시예 5와 같이 에탄올을 첨가, 상등액을 다시 회수한 후 50ml로 농축하였다. 이후 4℃에서 결정화시켜 1일 후에 순도 94%, 결정량 13g, 정제수율 81%인 결정을 얻을 수 있다.

Claims (8)

1. 지베렐라푸지쿠로이 ATCC 12616의 변이주로서 전분 이용도가 8-15중량%인 것을 특징으로 하는 지베렐라푸지쿠로이 HB901(기탁번호 : KFCC-10642).
2. 지베렐라푸지쿠로이 HB901(KFCC-10642)을 옥수수전분 8-15중량%, 포도당 2중량%, 대두유 1부피%, 대두분 1.1중량%, 질산암모늄 0.03중량%, 제1인산칼륨 0.5중량%, 황산마그네슘·7수화물 0.1중량%, 미량무기염 0.2부피%, pH 4.0의 배지에 5% 부피비율로 접종후, 통기량 0.7-1.5 V.V.M., 교반속도 500rpm의 조건으로 20˚-30℃에서 7일간 배양하여 배양액내에 지베렐린을 축전시킨 다음 이를 분리정제하여서 이루어지는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 배양기간 7일중 초기 3일은 30℃에서 배양하고, 잔여 4일은 20℃로 낮추어 배양하여 배양액내에 지베렐린을 축적시키는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 초기 배양 3일후에 배양온도를 20℃로 낮추어 배양하고 동시에 배양액의 15부피% 멸균수를 배양액에 첨가하여 잔여 4일을 배양하므로서 지베렐린을 배양액내에 축적시키는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.
5. 제2항에 있어서, 분리정제 과정에서는 발효배양액을 한외 여과장치로 여과하고, 역삼투압장치로 농축한 후 여기에 알콜을 첨가하여 불순물을 제거하여 다시 농축함을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 한외 여과막은 표준 분획분자량이 3,000-300,000이고 역삼투압은 표준분획분자량이 100인 폴리 썰폰으로 이루어진 막을 사용하며, 알콜은 에탄올과 메탄올을 사용하고, 정제과정중 pH는 2-8, 농축비는 5-20배, 알콜첨가량은 0.2-5배인 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.
7. 제2항에 있어서, 분리 정제과정에서는 지베렐린 발효액이나 혹은 지베렐린을 포함하는 용액을 약 염기성 음이온 교환수지에 흡착시키고, 이를 알콜로 용출시키는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 약염기성 음이온 교환수지는 스틸렌-다이비닐벤젠기반에 1차, 2차 혹은 3차 아민기를 가지며, 정제과정중 pH는 2-7, 온도는 15-40℃를 유지시키며, 구배에 사용되는 물질은 에탄올과 메탄올인 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법.