DE2241091A1 - Verfahren zur herstellung von cephalexin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von cephalexinInfo
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Description
Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Wei er. mann,
Dipl.-Injg. H.Weickmann, Dipl.-1'hy.». Dr.K. Fincke
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
I MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820
<983921/22>
CASE; KP-4725
TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA 632-1, Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun,
Shizuoka-ken / JAPAN
Verfahren zur Herstellung von Cephalexin.
Die Erfindimg betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalexin 7-(D-o£-Aminophenylacetamid)-desacetoxy-cephalosporarisäurel
durch enzymatische Acylierung von 7-Aminodesacetoxy-cephalcsporansäure
(nachfolgend als 7-ADCA be- . zeichnet)."Sie betrifft insbesondere das enzymatische Verfahren
zur Herstellung von Cephalexin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß 7-ADCA mit D-Phenylglyein oder einem Derivat
davon in Anwesenheit des acylierenden Enzympräparates,
das von einem Mikroorganismenstamm stammt, der ein die Aminogruppe
acylierendes Enzym für 7-ADCA erzeugt und ausgewählt v/ird unter Genus Alcaü igenes, Genus Achromobacter, Genus
Plavobacterium, Genua Bacillus oder Genua Be:ieckeo.f in einem
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BAD ORIGINAL·
wässrigen Medium umgesetzt wird. Kit den acylierenden Enzympräparat
en sind nachfolgend Kulturbrühen, Bakterienzellen, "behandelte Bakterienzellen, Enzyinextrakte, feste Enzympräparat
e oder unlösliche Enzympräparate der Mikroorganismen oder dergleichen gemeint.
Bisher wurde Cephalexin durch Deacetoxylierung von 7(D-tfC-AminophenylacetamicQ-cephalosporansäure
durch katalytische Hydrierung (vgl. Holländisches Paoent Nr. 67 04294); Ringerveiterung
von 6-(D-tfC-siilDstituierterAniino-phenylacetamid)penicillanßäure-sulphoxydester
durch Erhitzen in Anwesenheit eines Katalysators und von Xylol (vgl. Holländisches Patent Nr.
67 04294); und Acylierung von 7-ADCA durch D-o(~substituierte
Aminophenylessigsäure und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppe
(Holländisches Patent ITr. 69 05073) hergestellt.
Dieser Stand der Technik hat jedoch Nachteile. Beispielsvieise
muß das chemische Acylierungsverfahren von 7-ADCA unter Verwendung des Aminogruppen-geschützten Phenylglycins durchgeführt
werden, außerdem wäre diese Schutzgruppe zu entfernen. Diese Nachteile machen das Verfahren unwirtschaftlich.
Γ.ε.3 Acylierungsverfahren zur direkten Herstellung von Cephalexin
aus 7-Phenylacetamid-3-methyl-A -cephem-4-carbonsäure,
die ein Ringerweiterungsprodukt von Penicillin G ist, unter Verwendung eines Snsympräparates, das vom Bacillus Ilegaterium
stammt, ist bereits beschrieben worden, vgl. Deutsche Patentanmeldung P 22 14 444; dieses Verfahren ist jedoch v.-egen der
niedrigen Cephalexinausbeute nicht immer industriell vorteilhaft
gevesen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung
eines enzymatisehen Verfahrens zur Herstellung von chemotherapeutisch
brauchbarem Cephalexin aus 7-ADCA, dazu gehört auch die Schaffung einen industriellen Verfahrens zur Her-
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stellung von Cephalexin sowie die Schaffung eines Verfahrens,
"bei dem ein festes Enzympräparat zur Herstellung von Cephalexin verwendet wird.
Im Verlaufe einer Untersuchung über Acylierungsenzym erzeugende
Bakterien, die eine Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe
in 7-ADCA einführen, wurde jetzt ein Mikroorganismus gefunden, der zur Gattung Achromobacter gehört und nachfolgend
als B-402-2 "bezeichnet wird, und es wurden Mikroorganismen
der Gattung Alcaligenes, der Gattung Flavobacterium, der Gattung Bacillus und der- Gattung Beneckea gefunden, die eine
starke acylierende Wirksamkeit für die Aminogruppe in 7-ADCA haben und die Cephalexin nahezu quantitativ aus 7-ADCA und
Phenylglycinester bilden.
Es folgt eine taxonomische Beschreibung des obigen Stammes B-402-2.
a) Beobachtungen auf Bouillonagar-Schrägkultur bei 30° C
24 Stunden lang.
1) Gestalt und Größe der Bakterienzellen: Kurze Stäbchen, runöeRänder. 0,5 - 0,8 · 2,0 - 2,5/1
2) Zellenform: Beinahe Einzelzellen, schwach kettig, keine
Membran.
5) Mobilität: Keine.
4) Sporen: Keine.
5) Gram1sehe Färbung: Negativ.
6) Säurefestigkeit: Negativ.
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b) Wachstum auf verschiedenen Medien:
1) Bouillon-Plattenagar (bei 30° C, 24 Stunden): Gutes
Wachstum, erhebt sich konvex, keine Ausbreitung, weiß oder hellgelb, glänzend, weich, feucht t semitransparent,
keine Änderung der Farbe des Mediums.
2) Bouillon-Schrügaßar (bei 30° C, 24 Stunden): Gutes
Wachstum, glatte Oberfläche, keine Ausbreitung, glänzend, feucht, milchig weiße Kolonie, semitransparent,
keine Änderung der Farbe des Kodiums.
3) Bouillonbrühe, (bei 30° C, 2 Tage): Gutes Wachstum,
gleichmäßig trübe, keine Ausfällung, keine Membranbildung, keine Pigmentierung.
4) Bouillongelatine-Einstich: Oberflächenwelle turn entlang
der Stichlinie bis zur halben Tiefe, keine Verflüssigung der Gelatine.
5) Sojabohnen-Schrägagar (30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum,
weiße oder hellgelbe Kolonie, glatte und weiche Oberfläche, semi transparent, keine Änderung eier Farbe
des Mediums.
6) Kartoffelagar (30° C, 5 Tage): Gutes Wachstum, milchig
wcißeKolonie, glatte und v/eiche Oberfläche, konvexe Erhebung,
keine Änderung der Faxbe des Mediums.
7) Lackrrjsn.i] oh: Sauer, Peptoniniorung«
c) Physiologische Eigenschafter:
1) Nitratreduktion: Negativ.
2) Denitrierun.'^reaktior.: ITegativ.
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3) MR-Test: Negativ.
4) VP-Test: Negativ.
5) Indolbildung: Schv/ache Bildung.
6) Hydrogensulfatbildung: Positiv.
7) Stärke-Hydrolyse: Positiv.
8) Zitratverwertung: Positiv (stark).
9) Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: Nitrat-
und Aimnoniümsalzverwertung.
10) Pigmenfbildung: Keine.
11) Urease: Positiv (schwach).
12) Oxydase: Positiv.
13) Katalase: Positiv.
14) Bereich des Wachstums: Wachstums-pH: 5 - 9» optimaler·
Wachstums-pH: 7-8; Wachstumstemperatur: 7 - 40° C;
optimale Temperatur: 24 - 30 G.
15) Aerob oder anaerob: Aerob.
16) O-P-Test: O-Typ.
17) Kohlenhydra.tfermentation:
Säurobildung Gasbildung
L-Arabinoae
IJ-XyIo üe . -
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D-Mannose
D-Fructose D-Galactose
Kaitose Saccharose Lactose Trehalose
D-Sorbit Inosit Glyzerin Stärke Rhamnooe
Ribose Ceroliose Rafflnose Melezitose
Inulin Saricin Glueit
Säurebildung
Gasbildung
Nach Bergey'8 Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage,
wird der taxonomische Standort des obigen Stammes B-402-2 bestimmt
und gehört demnach zur Gattung Achromobacter, da er Agar nicht zersetzt, kein Pigment bildet und auf Lackmu3-milch
sauer reagiert. Außerdem ähnelt er Achromobacter par-Tulus
v/eil er keine Mobilität zeigt und keine Säurebildung aus Glukose. Er unterscheidet sich jedoch in den folgenden
Punkten:
Stamm B-402-2
Indolbildung Stärkehydrolyse Nitratreduktion
schv/ache Bildung positiv negativ
Achromobacter parvulus
keine Bildung negativ positiv
Bei dem Stamm B-402-2 kann eo oich daher um eine andersartige
Spezies von Ac"hromobacter parvulus handeln und Achronobacter
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B-402-2 wird daher als neue Spezies geführt. Dieser Stamm
ist imlrlnstitut for Micorbiological Industriy and Technology,
Agency of Industrial Science and Technology" hinterlegt worden und trägt die Kinterlegungsbezeichnung FBRM-P ITr. 1095.
Dieser Stamm ist auch im US-Department of Agriculture, Agricultural Research Service, unter der Bezeichnung NRRl-B-5393
hinterlegt worden.
Weitere Mikroorganismenspezies, die für die erfindungsgemäße
Herstellung von Cephalexin verwendet werden können, sind z. B.:
Alcaligenes faecalis ATCC 8750
Achromobacter aceris IFO 3320 [NRRL B-5391] Achromobacter liquidum IFO 3084 [mRL B-5392] Flavobacterium aquatile IFO 3772 ;[NRRL B-5394] Flavobacterium capsulatum IFO 12533 [ATCC 14666] Beneckea hiperotica ATCC 15803
Achromobacter aceris IFO 3320 [NRRL B-5391] Achromobacter liquidum IFO 3084 [mRL B-5392] Flavobacterium aquatile IFO 3772 ;[NRRL B-5394] Flavobacterium capsulatum IFO 12533 [ATCC 14666] Beneckea hiperotica ATCC 15803
Die oben beschriebenen Mikroorganismenstämme oder deren Enzym-Präparate
haben eine spezifische Wirkung auf Cephalexin und die Fähigkeit nahezu quantitativ Cephalexin aus 7-ADCA und
D-Phenylglycin zu bilden.
Gemäß den angewendeten Bedingungen haben die Enzympräparate
die Wirksamkeit, die Amidbindung in Cephalexin zu spalten
und 7-ADCA zu bilden, sie haben jedoch nahezu keine Wirkung auf D-Phenylacetamid-desacetoxy-cephaloGporansäure. Es war
nicht bekannt, daß das acylierende Enzym die spezifische
Aktivität in Bezug auf die Acylierung der Arninogruppe in 7-ADCA hat.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete 7-ADCA wird nach
Verfahren hergestellt, die dem Stand der Technik angehören, vgl. z. B. die Herstellung aus Cephalosporin-C (vgl. US-Patentschrift
3 124 576), Verfahren zur Herstellung aus
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7-Aminocephalosporansäure (vgl. US Patentschrift 3 124 576), Herstellung nach dem Verfahren aus 7-Phenoxyacetamid- oder
7-Phenylacetanid-desacetoxy-cephalosporansäureester (vgl.
US Patentschrift 3 275 626, Belgisches Patent 696 026, Holländisches Patent 68 06532, Belgisches Patent 745 845,
Britisches Patent 1 204 394, Belgisches Patent 746 860 und Belgisches Patent 747 118-747 120) oder die enzymatische
Deacylierung von 7-Acylamino-desacetoxy-cephalo3poransäure (vgl. Deutsche Patentanmeldung P 22 12 276.5).
Um die Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe in 7-ADCA
einzuführen verwendet man D-Phenylglyein oder ein Derivat
davon. Beispiele für diese Derivate sind D-Phenylglycinaraid,
D-Phenylglycylglyein, D-Phenylglycylleucin, D-Phenylglycylalanin,
D-Phenylglycinmethylester, D-Pheynlglycinäthylester
oder ähnliche. Von diesen Derivaten können vorzugsweise D-Phenylglycinmethj^lester, D-Phenylglycinäthylester
oder ähnliche verwendet v/erden, das bevorzugteste Derivat ist ein D-Phenylglycinmethylester. Falls ea sich um ein
wasserunlösliches Derivat handelt, kann das wasserlösliche
Saureadditionssalz verwendet v/erden, das die acylierende
Enzymreaktion nicht ."behindert.
Der das Acylierungsenzym erzeugende Mikroorganismus der
vorliegenden Erfindung kann durch aerobe Kultivierung mit einem Nährmedium, das organische oder anorganische Stlckctoffquellen,
wie Pepton, Fleischextrakt,, Mais-3inweichbrühe,
Hefeextrakt, trockene Hefe, Sojabohnenprotein-Hydrolycate,
Soja/bohnenextrakt, llitrat, Ammoniumsalz oder dergleichen,
eine Kohlenstoff quelle, v/ie Melasse, Glukose,
Stärkehydrolysat oder dergleichen und anorganischem Salz, gewünschtenfalls auch andere geeignete Wachstumsetimulierende
wichtige Substanzen enthält, bei 20 - 35° Cf 12-48 Stunden
lang, hergestellt werden.
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Für eine industrielle Produktion wird im allgemeinen die submerse aerobe Kultivierung angev/endet.
Das acylierende Enzym für die Aminogruppe in 7-ADCA kann im allgemeinen als Endo-Enzym vorliegen. Als Ensympräparate
können Mikroorganismenlculturen, nach der Kultivierung isolierte
native Bakterienzellen oder Suspensionen davon, in einer Ensymreaktion verwendet v/erden. Außerdem können chemisch
oder physikalisch behandelte Milcro Organismenzellen,
beispielsweise Aceton, Methanol oder Äthanol getrocknete
Zellen; sprühgetrocknete Zellen, zerriebene- oder beschallte
Zellen; durch Pufferlösung oder -Cetylpyridiniumchlorid hergestellte
Zell-Lysate; gereinigte Enzyme, erhalten nach bekannten
Trennungs- und Reinigungsverfahren, wie z. B. Aussalzen, fraktionierte Ausfällung, Dialyse, Absorptionschromatographie,
Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration
zerriebener Zellen oder von Zell-Lysaten; und die festen
Enzympräparate oder unlöslich,gemachtes Enzym, hergestellt durch Absorption des Acylierungsenzyms oder der erzeugenden
Mikroorganismen auf einem inerten Träger, der gegenüber den Substraten nicht aktiv ist und die Aktivität des acylierenden
Enzyms nicht inaktiviert, im Verfahren der vorliegenden Erfindung
angewendet werden, sofern die acylierende Enzymaktivität erhalten bleibt.
Die Acylierung kann im allgemeinen durch Umsetzung von 7-ADCA
und Phenylglycin oder einem Derivat davon mit.den acylierenden
Enzympräparaten erfolgen. Gewöhnlich wird eine freie Säure von 7-ADCA in einer Konzentration von 0,1 bi3 20 mg/ml, vorzugsweise
2-5 mg/ml, verwendet. D-Phenylglycin wirkt nicht
als Substrat in seiner freien Säureform, man kann daher ein aktives Derivat davon, wie. das Säureamid oder ein Ester einen
niedrigen Alkohols, vorzugsweise den Methylester, verwenden. Daß Phenylglycinderivat wird im allgemeinen in einem 2-20
molaren Überschuß für 7-ADCA verwendet, dieses Molverhältnio
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kann jedoch je nach der Konzentration von 7-ADCA in der
Reaktionomischung geändert werden, die bevorzugteste Ilenge
13t ein 6-10 molarer Überschuß. Die Reaktionstemperatur kann optimalen Bedingungen angepaßt v/erden, im allgemeinen
liegt die Temperatur bei 20-45 C, vorzugsweise bei 30 - 37° C. Man kann eine stationäre, geschüttelte oder
gerührte Kultur verwenden.. Der pH der Reaktionsrnischung kann bei pH 5,5 - 7,5, ara günstigsten bei 6,0 bis 6,5 gehalten
werden. Die Reaktionszeit kann je nach den Reaktionsbedingungen 0,5-3 Stunden betragen und die Umsetzung
kann beendet werden, wenn die stärkste Cephalexinbildung
erreicht ist.
Im Falle der Acylierung mit einem festen Enzympräparat wird zuerst das acylierende Enzym oder der erzeugende Mikroorganismus
auf dem Träger absorbiert. Wenn es sich um Exo-Enzym handelt, kann das Acylierungsenzym absorbiert werden, in
dem man das Kulturfiltrat des das Acylierungsenzym erzeugenden Stammes auf den Träger gibt. Im Falle von Endo-Enzym
werden native Mikroorganismenzellen aus der Kultur des daß
Acylierungsenzym erzeugenden Mikroorganismus isoliert und auf dem Träger absorbiert oder es werden mit Azeton oder
Äthanol getrocknete Zellen auf dem Träger absorbiert; oder eine Lösung des acylierenden Enzyma, extrahiert aus Mikroorganiomenzellen,
wird auf dem Träger absorbiert.
Die in der vorliegenden" Erfindung verv/endeten Träger, die je
nach der Art des Mikroorganismus oder je nach der Herstellung dea Acylierungsenzyms oder der Mikroorganismenzellen variiert
werden sollten, müssen unter Berücksichtigung der Eigenschaften der das Enzym oder die Mikroorganismenzellen absorbierenden
Träger ausgewählt werden, bo daß sie die Aktivität des Acylierungaenzyms
nicht inaktivieren; dabei massen die Träger so beschaffen sein, daß das absorbierte Enzym oder die Mikroorgani:*.Tienzellen
nicht durch V/aschen entfernt werden; sie
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sollen gegenüber jedem Substrat inaktiv sein und das entstehende Cephalexinprodukt nicht absorbieren. Beispiele
für Träger, die vorteilhafterweise für die Absorption einer wässrigen Enzymlösung verwendet werden, sind aktives
Aluminiumoxyd, Diatomeeneräe, saurer Ton, aktiver Ton,
Kaolin, Kalziumphosphat, Hydroxyapatit oder ähnliche. Zur
Absorption der Mikroorganismenzellen verwendet man vorteilhafterv/eise
CM-Cellulose, CM-Sephadex, DEAE-Cellulose,
TEAE-Cellulose, Diatomeenerde oder ähnliches Material.
Es empfiehlt sich, den pH vorher so zu regeln, daß das acylierende
Enzym bei der Absoprtion auf dem Träger einen stabilen pH hat. Die Absorption kann ansatzweise oder in Kolonnen
durchgeführt v/erden. Die Kolonnenabsorption verv/endet man vorzugsweise für die kontinuierliche Enzymreaktion. Die
Trägermenge kann je nach der Menge der Mikroorganismenzellen,
dem Volumen der KuItürfiltrate, dem Enzymgehalt oder dem Absorptionsverhältnis
des Trägers schwanken. Im allgemeinen kann bei einer ansatzweise durchgeführten Absorption die
Trägerinenge 5-15 Gev/.leile/Vol. für KuIturfiltrat, oder
5-20 Voluminaüberschuß für native Zellen betragen» Bei der Absorption auf Kolonnen wird eine Kolonne mit einem Träger
gefüllt, mit Yiasser oder Pufferlösung befeuchtet, wobei die
gleiche Pufferlösung verv/endet wird, die für die Einstellung des optimalen pH-Wertes des Enzymes verwendet wird, dann
wird die Kulturbrühe oder Enzymlösung hindurchgeschickt, die Kolonne mit Wasser oder Pufferlösung nachgev/aschen, so daß
man ein Enzympräparat auf fester Phase erhält. Bei der Absorption Mikroorganismenzellen auf dem Träger wird eine Zellsuspension
in Wasser oder Pufferlösung mit dem Träger vereinigt, dabei berücksichtige man den Effekt des pH-Wertes,
da die Absorption stark von der Ionenstärke beeinflußt wird.
Der Träger, der das acylierende Enzym oder die Mikroorganismenzellen
absorbiert hat, das ist das Enzympräparat auf
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fester Phase, kann der Gefahr einer Denaturierung oder eines Aktivitätsverlustes unterliegen, es sollte daher im feuchten 1
Zustand gehalten werden. (
7-ADCA vird mit Phenylglycin oder einem Derivat davon in An- '
v;esenheit des festphasigen Enzympräparates umgesetzt. Obv/ohl f
die Konzentration des Substrates in Abhängigkeit von der I
Enzymstärke oder der Ausfließrate aus der Kolonne schwanken \
kann, sollte sie vorzugsweise so festgelegt v/erden, daß eine ι
"bestimmte Menge an nicht umgesetztem 7-ADCA und Phenylglycin ·
im Abstrom nicht erhöht wird. Im allgemeinen beträgt die »%.
Konzentration an 7-ADCA 0,1-2 Gew./Vol.$, vorzugsweise ^s
0,2-1 Gew./Vol.?» und das Phenylglycin oder das Derivat /
davon wird in 2 - 10 molarem Überschuß gegenüber dem 7-ADCA J
verwendet. Die Acylierungsreaktion sollte bei dem für die Enzymaktivität günstigsten pH und der günstigsten temperatur *
durchgeführt werden. Die Reaktionszeit kann im Falle der Um- j Setzung in einer Kolonne durch Änderung des Substrat-Abflußvolumens
geregelt werden. Üblicherweise kann die Umsetzung beim Durchgang durch die Kolonne au3 festphasigem Enzym- |
präparat durchgeführt werden und kontinuierlicher Betrieb |
kann leicht durch kontinuierliche Zugabe der Substrate er- \
reicht werden. Venn jedoch die Substrate im Abstrom gefunden j
werden, wird die Abfließrate verringert oder der Abstrom in | die Kolonne zurückgeführt. Sobald die Enzymaktivität ab- /
nimmt oder verlorengeht eollte natürlich die Operation beendet
werden. Das so hergestellte Cephalexin wird nach bekannten Ieolierungsverfahren abgetrennt. Beispielsweise v/ird
die Reaktionsmiochung durch ein Anionenaustauscherharz oder
durch Aktivkohle geschickt, mit wässriger saurer Lösung oder organischem Lösun^smittel/V/asser-Gemisch danach eluiert, das
das Cephalexin enthaltende Eluat eingeengt und isoelektrisch
ausgefällt. Oder die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von
Trifluoressigsäure auf pH = 1 eingestellt, danach mit organischem
Lösungsmittel, wie Kethylisotutylketon, extrahiert,
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wodurch nach Auflösen in saurem Wasser isoelektrisch aus-.
gefällt wird. Außerdem wird die Reaktionsmischung mit Anidnenaüstauscherharz in,, Anwesenheit eines mit V/asser nicht
mischbaren organischen Lösungsmittels behandelt und die wässrige Schicht konzentriert oder der Gefriertrocknung unterworfen,
um das Cephalexin als freie Säure zu isolieren.
Prüfung auf Cephalexin: ·
Eine Testlösung, die Cephalexin enthält, wird mikrobiologisch nach der Papierscheibenmethode oder nach der Schalenmethode
mit Bacillus subtilis PCI-2'19 16 Stunden lang bei 37° C geprüft.
Die sich ergebende Inhibierungszone wird gemessen, daraus läßt sich die Cephalexinstärke mit Hilfe der Standard-Cephalexinkurve
berechnen.
100 ml wässriges Medium (pH 7,0), das 3$ Glukose, 1$ Hefeextrakt,
0,1$ K2HPO4, OrO5# MgSO4 · 7H2P, 0,05$ KCl und
0,001$ PeSO4 enthält, werden bei 120° C 20 Minuten lang
sterilisiert.
Man impft mit Achromobaeter B-402-2, NRRL B-^5393 an und
schüttelt die Kultur bei 26° C 72 Stunden lang hin und her.
Bas Kulturmedium wird auf pH 6,5 eingestellt/dann gibt man
100 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 6,5), der 2 mg/ml 7-AiCA und
20 mg/ml D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid enthält, hinzu,
danach v/ird 3 Stunden lang bei 37° C enzymatisch umgesetzt. Man findet 100$ Cephalexin im Piltrat der Reaktionsmischung. Das Filtrat wird auf eine Kieselgel-Dünnschicht-Chromatographieplatte
aufgetüpfelt, die fluoreszierendes Material enthält und mit Hilfe eines lösungsmittelsystemes
aus n-Butanol : Essigsäure :'Wasser (3 ί 1 : 1) entwickelt.
Die Untersuchung mit Hilfe von UV-licht von 2536'A zeigt
einen purpurroten Fleck in der Nähe von Rf = 0,50, der auch
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mit dem biologisch geprüften Muster einer authertisehen Probe
identisch ist.
Man wiederholt Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß die in der folgenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen anstelle von
Achromobacter B-402-2, HRRL B-5393, zur Erzielung der unten beschriebenen Ergebnisse verwendet werden.
Stamm Cephalexin gebildet
Alcaligenee faecalis ATCC 8750 15
Flavabacterium aquatile KRRL B 5394 24
Beneckea hiperoptica ATCC 15003 100
1,3 1 eines Mediums (pH 7,0) das aus 3$ Glukooe, Yj» Hefeextrakt,
0,1* K2HPO4, 0,055* MgSO. . 7H2O, 0,055* KCl und 0,001$ PeSO4
besteht, werden bei 120° C 20 Minuten lang sterilisiert,
aseptisch in jeweils 100 ml Portionen unterteilt und in 500 ml
Kolben gegeben, mit einem Stamm von Achromobacter B 402-2 angeimpft
und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung gezüchtet.
1 1 der Kulturbrühe wird zentrifugiert und die so erhaltenen feuchten nativen Zellen werden zweimal mit physiologischer
Salzlösung gewaschen und in 1,2 1 einer 0,1 m Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man
400 ml wässrige Lösung, die 5 mg/ml 7-ADCA und 50 mg/ml D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid
enthält und stellt die Mischung bei 37° C 2 Stunden lang in den Brutschrank. Man stellt
fest, daß in der Reaktionsmiachung 98,8>
Cephalexin gebildet worden sind.
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Man wiederholt Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß die nachfolgend
angegebenen Mikroorganismen anstelle von Achromobacter B 402-2, KRRL B-5393, zur Erzielung der in der nachfolgenden
Tabelle angegebenen Ergebnisse verwendet werden.
Stamm Cephalexin gebildet (#)
Alcaligenes faecalis ATCC 8750 15
Flavabacterium aquatile IJRRL B-5394 23
Beneckea hiperoptica ATCC 15803 · 99 - :
Bin wässriges Medium (pH 7,0), das % Glukose, 1$ Hefeextrakt,
0,153 K2HPO4, 0,05^ HgSO. . 7H2O, 0,05 KCl und OtÖO1$S PeSO4
enthält, v/ird mit einem Stamm Beneckea hiperoptica ATCC 15803 angeimpft und "bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung
kultiviert. 11 der Kulturbrühe wird zentrifugiert und die isolierten nativen feuchten Zellen werden zweimal
mit physiologischer Salzlösung gewaschen, danach zentrifugiert und in 1 1 destilliertem Wasser suspendiert. Man gibt 8 1
Aseton hinzu und erhält dabei durch Azeton gepulverte Zellen. 165 mg des Azetonpulvers werden in 5 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers
(pH 6,5) suspendiert, dazu gibt man eine wässrige Lösung von 2 ml 7-ADCA"(5 mg/ml) und 2ml D-Phenj-lglycinraethylester-hydrochlorid
(50 mg/ml) und 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,5), so daß sich eine Reaktionsmischung von 100 nl ergibt;
diese Reaktionsniischung wird, bei 37° C 90 Hinuten lang
in den Brutschrank gestellt. Das in der erhaltenen Reaktionsmicchung
gebildete Cephalexin v/ird quantitativ bestimmt, man findet 90,5£.
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500 mg mit Azeton gepulverte Zellen von Achromobacter B-402-2,
IiRIiL B-5393, erhalten nach dem in Beispiel 5 beschriebenen
Verfahren, v/erden in 100 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man
50 ml wässrige 7-ADCA-Lösung (4 mg/ml) und 50 ml wässrige D-Phenylglycinjnethylester-Lösung (20 mg/ml). Nach zweistündigem
Bebrüten bei 37 C wird die Reaktionsmischung zentrifugiert
und man erhält einen Überstand der 1260y/ml Cephalexin
enthält, Acylierungsausbeute 80,3$. -
Der überstand wird auf eine Kolonne (2 · 20 cm) eines Anionenaustauscherharzes,
Dov/ex 2 (Acetatform), (Produkt der Dov/ Chemical Co., USA.) nach dem Waschen mit Wasser, .gegeben,
400 ml der durchgelaufenen Lösung v/erden auf pH 8,0 eingestellt und erneut in eine Kolonne (2 · 15 cm) mit einem Anionenaustauscherharc Dowex 2 (Acetatform) gegeben und anschließend
mit 0,05 m Essigsäure eluiert. Jede Fraktion (etwa 15 ml)
wird dünnschichtehromatographisch geprüft,die cephalexinhaltigen Traktionen werden aufgefangen und man erhält 490 mg
Cephalexinpulver aus der Gefriertrocknung. Die UV-spektroehcnleche Untersuchung zeigt, daß das Pulver 60$£ige Reinheit
besitzt. Dieses getrocknete Pulver v/ird durch ieoelektrische
Ausfällung gereinigt, man erhält 294 mg weißes Pulver (Aus beute 90?ä, Reinheit 98$, Gesamtausbeute 88$).
A. 20 1 irässrises Medium (pH 7,0), das % Glukuse,
1£ Hefeextrakt, 0,15S KpHPO4, 0,05# MgSO4 · 7H2O, 0,055^ KCl
und 0t00i5ö PeSO. enthält, gibt man in ein 30 1 Permentationsgefäfl,
steriliniert 20 Minuten lang bei 120° C und gibt daau
aseptisch 400 ml Saatkultur, die zuvor im gleichen Hediun
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gezüchtet worden ist, von Achromobacter B-402-2, MRL 3-5393
(FERM-PNo. 1095) und kultiviert unter aeroben Bedingungen
"bei einer Belüftung von 20 l/min., einer Rührung von 300 Upm
72 Stunden lang bei 26° C. Nach der Fermentation werden die
Bakterienzellen durch Zentrifugieren isoliert, zweimal mit
physiologischer Salzlösung gewaschen, wobei man 170 g feuchte
native Zellen erhält.
B. 3 g der oben in A erhaltenen nativen Zellen werden
in 100 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) suspendiert.
Dieser Suspension gibt man unter Rühren ZU'18Q; g
DEAE-Cellulose in 1,5 1 einer 0,1 m Acetatpufferlößung bei
O0C. Nach 6-stündigem Stehen gewinnt man das Enzympräparat
auf fester Phase.
Das Enzympräparat wird in eine Kolonne (3,5 ♦ 47,5 cm) gefüllt,
danach mit 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen,
dann werden 12 1 einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0), die
0,1$ 7-ADCA und 0,5$ D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid
enthält, innerhalb 24 Stunden hindurchgeschickt. '
Die so erhaltenen 12 1 Eluat schickt mandurch „eine Kolonne _
mit 120 g Aktivkohle (7»2 · 15 cm)t um dae Cephalexin asu absorbieren,
dann wäscht man mit Wasser und elüiert^ mit einem
Löaungsinittelgemiech aus Azeton/0,5 n-Essigeäure (1 : 1).
1 1. cephalexinhaltige aktive Fraktionen wird im Vakuum eingeengt
xxn§ der Rückstand wird mit einer Mischung aus Wasser
und Acetonitril umkristallisiert, um das Cephalexin, abzutrennen,
das mit warmem Wasser gewaschen und dann getrocknet wird, w obei man 12,3 g Kristalle erhält, Ausbeute 6O|£,
Das Produkt zeigt einen einzigen Fleck bei einer dünnschichtchromatographischen
Prüfung auf Kieselgel, Das NMR-Spektrum
zeigt die Identität der beiden Verbindungen, Reinheit: 90$ aufgrund
der Bioa\itographie und UV-Absorption.
309811/1111
40 g native Zellen, erhalten im Verfahren dea Beispieles 7 A,
v/erden in 30 ml destilliertem V/asser suspendiert und zu
1 1 Azeton gegeben, v/obei man durch Filtration 10 g azetongetrockneter
Zellen erhält.
160 mg der getrockneten Zellen von Achromobacter B-402-2,
KRRI B-5393 (FHiIl-P Hr. 1095) suspendiert man in 4 ml einer
0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) und gibt Die unter Rühren
zu 10 g DEAE-Cellulose in 20 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung
(pH 6,0). Nach 6-stündigem Stehen wird der Träger, der die Hikroorganismenzellen absorbiert hat, das heißt
das Enzympräparat auf fester Pnase, in eine Kolonne (1 · 26 cm) gefüllt, mit 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen,
dann schickt man 100 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0), die 0,1$ 7-ADOA und 0,5# D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid
enthält, innerhalb 5 Stunden hindurch. Die Acylierung, geprüft als Cephalexin im Eluat, beträgt 855».
Man wiederholt Beispiel 8, mit der Ausnahme, daß die folgen· den Träger anstelle von DEAB-Cellulose für die Herstellung
▼on Cephalexin verwendet werden.
Träger Gebildetes Cephalexin
CM-Cellulose | 40 |
TEAE-Cellulose | 80 |
Beispiel 10 |
Zu einer Suspension von 4 g getrockneter ΖβΤΓβη von Achroiaobacter
B-402-2, PERH-P Nr. 1095, erhalten in Beispiel 8, in
500 ml einer 0^1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gibt man 50 mg
309811/1111
Lyeozym, inkubiert 60 Stunden lang bei 37° C und gibt 2 mg Desoxyribonuelease hinzu und inkubiert weitere 10 Minuten
lang.
Die Reaktionsmischung wird zentrifugiert, man gibt 10 g Hydroxyapatit zu 200 ml des Überstandes und läßt danach
eine Stunde lang stehen.
Das Enzympräparat auf fester Phase wird in eine Kolonne
gefüllt und die Enzymreaktion wird wie in Beispiel 8 durchgeführt, wobei man 90$ Cephalexinbildung findet. · =
Beispiel 11 ·
1,3 1 wässriges Medium (pH 7,0), daß 1$ Polypepton, 1$
Fleischextrakt und 0,5$ NaCl enthält, sterilisiert 20 Minuten
lang bei 120° C, v/erden in jeweils 100 ml Portionen unterteilt
und in 500 ml Kolben gegeben. Jedes Medium wird mit dem Stamm Bacillus megaterium IHlRL B-5385 angeimpft und bei
30° C 48 Stunden lang kultiviert, flach der Kultivierung
werden die Bakterienzellen entfernt und 1 1 des Filtrates vriid auf pH 6 eingestellt. Man gibt 10 g Gelite (ein Produkt
der JohnB-Manville Sales Co., USA.) hinzu und rührt etv/a
30 Minuten lang.
Das Enzympräparat wird*in eine Kolonne (1 cm Durchmesser)
gefüllt, mit 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, dann schickt man 100 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung
(pH 7,0), die 0,1$ 7-ADCA und 1^ D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid
enthält, innerhalb 5 Stunden hindurch. Die er-, haltenen 100 ml Eluat zeigen 80$ Cephalexinbildung.
Jeweils 100 ml wässriges Medium, das yß>
Glukose, 1$ Hefeesttrakt, , 0,05'/° MgSO4 - 7H2O, 0,05# KCl ünd_ O,
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enthält, ν/er den 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert.
Nach dem Abkühlen v/erden die Medien mit Alcaligenes faecalis
ATCC 8750, Flavabacterium aquatile IiRKL D 5394 bzw. Beneckea
hipercptica ATCG 15803 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden
lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. Jede Kulturbrühe wird auf pH 6,5 eingestellt, die !Bakterien seil en
v/erden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 isoliert, wobei man jeweils 200 mg trockene Zellen erhält. Dann
werden die in Beispiel 8 verwendeten getrockneten Mikroorganismen Achromobacter B-402-2, UlHlL B-5393, durch jeweils
200 mg der oben erhaltenen getrockneten ilikroorganicraenzellen
ersetzt, um mit ihnen das Cephalexin herzustellen; man erhält folgende Ergebnisse:
Stamm Gebildetes Cephalexin (</£)
Alcaligenes faecslis ATCC 8750 18
Plavabacterium aquatile NKRL B-5393 25
Beneckea hiperoptica ATCC 15803 80
600 1 eine3 Mediums (pH 7,0), das 4# Glukose, 1,2$ Hefeextrakt,
0,153* K2HrO4, 0,05$ MgSO4 · 7H2O, 0,05# KCl und 0,001/' FeSO4
enthält, werden mit 30 1 Achromobacter B-402-2, 101RL B-5393
Saatkultur angeicipft \ind submers kultiviert, wobei man 72 Stunden
lang bei 26 C belüftet. Nach der Fermentierung v/erden die Bakterienζeil cn durch Abzentrifugieren aus 570 1 Brühe
isoliert. Die nätiven, fexichten i'tjllen, die 970 3 trockenen
Zellen entsprechen, 'werden in 27 1 einer 0,1 m Acetat pufferlösung
(pH 6,5) suspendiert, dann gibt man 1,18 kg 7-ADCA (Reinheit 84,8·/) und 30 kg D-Phery^glycinmethylester-hydrohlorid
hinzu und gibt schließlich 0,1 m Acetatpuffer (pH 6,5) hinzu/biü das Volumen der Reakticru;mir.ehung 200 1 betrugt.
Die Reaktionsininchung wird Voi ?7"") C ? Stunden lang unter
3 0 9 811/1111
Rühren "bebrütet. In der Reaktionsmischmiß v/erden 1,28 kg
Cephalexin aufgrund des UV-A.bsorption£ spektrums ermittelt
(Acylierung 80?ί). Die Lösung wird zentrifugiert und filtriert.
Zur klaren Lösung gibt man 4 kg Aktivkohle und nach der
Filtration wird die wässrige Schicht im Vakuum eingeengt, wobei man 1,03 kg Cephalexin erhält (Ausbeute 64/*, Reinheit
98%).
309811/1111
Claims (8)
- CASS: KP-4725PATENTANSPRÜCHEYerfaliren zur Herstellung von Cephalexin 7-(D-oC-Aminophenylacetcunid)-(le3acetoxy-cephalo3poriü:säiireJ , dadurch gekennzeichnet, daß 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure mit D—Fhenylglycin oder einem Derivat davon in einem wässrigen Medium in Anwesenheit eines aeylierenden Enzymes, das von
einem Mikroorganisinua des Genus Alcaligeneß, Genus Achromobaeter, Genus rlavabacterlum, Genua Bacillus oder Genus
Beneckea stammt, umgesetzt wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Stamm von Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter B-402-2, NRRL B-5393, Flavabacterium aquatile KRRL B-5394, Bacillus megaterium NRRL B-5305 oder Beneckea hiperoptica ATCC 15ΘΟ3 verwendet wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aeylierende Enzym in Form von Mikroorganismenseilen eines Stammes von Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter B-402-2, IJRRI B-5393, Flavabacteriura aquatile IiRRL
B-5394, Bacillus megaterium IJRRL B-5385 oder Beneckea
hiperoptica ATCC 15803, in Form der KulturbrUhe dieser St&maie, in Form von behandelten Zellen oder als daraus extrahiertes Enzym verv/endet v/ird.309811/1111 - 4. Verfachen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als D-Phenylglycinderivat P-Phenylglyciri-methylester, D-Phenylglycin-äthylester, D-Phenylglycinamid, D-Phenylglycylglycin oder D-Phenylglycyl-leucin verwendet wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als acylierendes Enzym ein unlöslich gemachtes Enzympräparat verwendet v/ird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem unlöslich gemachten Enzympräparat' um einen Träger handelt, der KuI tür "brühe der Mikroorganismen Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter 15-402-2,, IiRRL B-5393, Flavabacterium äquatile KRRL B-5394, Bacillus megaterium IIRRL B-5383 oder Beneckea hiperoptica ATCC 15803, Mikroorganismenzellen dieser Stämme oder daraus hergestelltes Enzym absorbiert enthält.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Diatomeenerde, saurer Ton, aktiver Ton, Aluminiumoxyd, Kaolin, Kalziumphosphat, Hydroxyapatit, GM-Cellulose, DEAE-Cellulose, TEAE-Cellulose oder Carboxymethyl-vernetztes Dextran verwendet wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei 20 - 45° C, vorzugsv/eise 30 - 37° C, bei pH 5,5 - 7,5, vorzugsweise bei 6,0 - 6,5, 0,5 bis 3 Stunden lang durchgeführt wird, wobei die Konzentration an 7-Aminocephalosporanaäure 0,1 — 20 mg/ml, vorzugsv/eise 2-10 mg/ml beträgt und D-Phenylglycinester in 2 - 20 molarem Überschuß gegenüber 7-Arainocephtxlonporansä.urc, vorztigsweise in 2 - 10 molarem Überschuß,verwendet wird.309811/1111
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