AT239441B - Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure 
Die 6-Aminopenicillansäure ist bekannt. 



   Ihre Existenz wurde erstmals von T. Kato vermutet (J. Antibiotics, Series A, 6,130, 184   [1953])   und dann von S. Murao (J. Agric. Chem. Soc. Japan,   29, 400-07,   Juni 1955) beobachtet. Der letztgenannte Autor arbeitete in der Weise, dass er   Penicillinamidase   aus Penicillium Chrysogenum Q 176 auf Penicillin-GNatrium einwirken liess. Hiebei wurde Phenylessigsäure abgespalten. Die Vorbereitung des Stammes Penicillium Chrysogenum Q 176 zur Penicillinamidasebildung geschah durch vorherige Einwirkung von Sulfathiazol auf den Mikroorganismus. Dieses Verfahren ist jedoch schwierig durchzuführen und gestattet praktisch nicht, die 6-Aminopenicillansäure herzustellen. 



   Ein anderes Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure ist aus der belgischen Patentschrift Nr.   569 728   bekannt. Nach diesem Verfahren wird Penicillium Chrysogenum in den üblichen Nährlösungen und unter den üblichen Kulturbedingungen kultiviert, jedoch unter Fortlassung des Precursors, wie Phenylessigsäure oder Phenoxyessigsäure. Nach diesem Verfahren werden relativ geringe Ausbeuten erhalten, deren Aufarbeitung ausserdem grosse technische Schwierigkeiten bereitet. Somit ist auch dieses Verfahren für die Anwendung im industriellen Massstabe nicht geeignet. 



   Nach einem nicht zum Stand der Technik gehörenden Vorschlag kann man 6-Aminopenicillansäure in sehr guten Ausbeuten dadurch erhalten, dass man auf Penicilline bestimmte Bakterien, die bei Einwirkung auf Penicillinlösungen die antibiotische Aktivität dieser Lösungen weitgehend aufheben, jedoch durch Zusatz von Phenylacetylchlorid wiederherstellbar belassen, oder Mutanten dieser Bakterien und bzw. oder Suspensionen und bzw. oder Extrakte und bzw. oder Enzympräparate derselben einwirken lässt, wobei im wesentlichen nur die Amidbindung in 6-Stellung des Penicillinmoleküls gespalten wird, und anschliessend das erhaltene Endprodukt isoliert. 



   Die Eignung ausgewählter Bakterien zur Durchführung der Spaltung kann unter Verwendung einer zum Stand der Technik gehörenden Nachweismethode auf folgende einfache Weise überprüft werden. 
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100 cm3 Nährbouillon werden für eine Reinkultur des zu prüfenden Bakteriums beimpft und auf der Schüttelmaschine 18 h bei   28-32   C   kultiviert. Danach werden die Bakterien abzentrifugiert, in 40 cm3 
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Nach der 5stündigen Einwirkung der Bakterienzellen auf das Penicillin G wird in der zellfrei geschleuderten Lösung mikrobiologisch der verbliebene Penicillingehalt ermittelt. 



   Bei verschiedenen Bakterienstämmen wird hiebei gefunden :
1. Die Lösung enthält die volle Anfangsaktivität. In diesem Falle haben die Bakterienzellen keine enzymatische Wirkung gegenüber dem Penicillin G entfaltet. Die Bakterien sind daher zur Herstellung penicillinspaltender Enzyme ungeeignet. 



   2. Die Lösung ist inaktiv oder hat eine stark verminderte Aktivität. In diesem Falle lässt man unter Eiskühlung und gleichzeitiger Zugabe von Natriumbicarbonat 500 mg Phenylacetylchlorid auf die Lösung einwirken. Sie wird nun erneut getestet. Findet man bei diesem Test a) gegenüber der nicht acylierten Lösung keine Erhöhung der Aktivität, so ist daraus zu schliessen, dass das Penicillin durch Penicillinase oder ähnliche Enzyme irreversibel abgebaut wurde ; b) eine volle Reaktivierung der Penicillinwirkung auf 10000 i. E./cm3 Lösung, so geht aus dem Versuch hervor, dass das Penicillin G durch Enzymeinwirkung so gespalten wurde, dass   6-Aminopenicillinansäure   und Phenylessigsäure entstand.

   Die in diesem Experiment ermittelten Bakterien eignen sich hervorragend zur enzymatischen Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillin ; c) eine nur partielle Reaktivierung der ursprünglichen Penicillinaktivität von 10000 i.   E. jcm3   Lösung, so geht aus dem Versuch hervor, dass neben dem Phenylessigsäure abspaltenden Enzym Penicillinase in den Bakterien vorhanden war. Solche Bakterien sind nur dann zur Herstellung von   6-Amino-penicillansäure   

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 geeignet, wenn die vorliegende Penicillinase nur einen geringen Teil des Penicillins inaktiviert oder wenn es gelingt, die Penicillinaseaktivität selektiv weitgehend auszuschalten. 



   Der beschriebene Test kann auch in abgeänderter Weise durchgeführt werden, indem man die enzymatische Aktivität gegenüber Penicillin G in zellfreien Kulturfiltraten untersucht. 



   Nach diesem nicht zum Stande der Technik gehörenden Vorschlag eignen sich besonders Suspensionen oder Extrakte von grammnegativen Bakterien, z. B. von Escherichia coli, Proteus, Aerobacter aerogenes,   Salmonella- und Shigella-Arten.    



   Bei der Weiterentwicklung des vorerwähnten Vorschlages wurde nun gefunden, dass der ArthrobacterStamm K NRRL B-2743 oder Mutanten dieses Stammes und/oder Extrakte besonders geeignet sind, Penicilline in 6-Aminopenicillansäure überzuführen. 



   An Stelle der Bakterienextrakte oder-Suspensionen können auch aus diesen gewonnene zellfreie Enzyme oder Enzymanreicherungen verwendet werden. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren wird zweckmässig in der Weise durchgeführt, dass man Suspensionen des genannten Stammes oder auch von Mutanten dieses Stammes in Gegenwart von Toluol, Chloroform oder einem andern bei Enzymarbeiten gebräuchlichen Konservierungsmittel auf Penicilline einwirken lässt. Man legt dabei das Penicillin in Konzentrationen von 5000 bis 600000 E und mehr pro   cm   vor. 



  Das Verfahren wird gewöhnlich bei Temperaturen von 0 bis 40  C durchgeführt, wobei jedoch solche von 20 bis 40   C, vor allem um 37   C, bevorzugt sind. Das Verfahren wird bei pH-Werten von 5 bis 9, vorzugsweise 6, 5-8, durchgeführt. Die Zeit der Umsetzung hängt von der Menge der verwendeten Penicilline und Enzyme ab und kann zwischen 15 min und 24 h betragen. Es ist jedoch zweckmässig, die Menge der Reaktionsteilnehmer so zu wählen, dass die Umsetzungszeit etwa 5 h beträgt. 



   Unter Einhaltung dieser Versuchsbedingungen werden die Penicilline praktisch quantitativ in 6-Aminopenicillansäure übergeführt. 



   Beispiel :
Einer dichten Suspension von gewaschenen Zellen des Stammes Arthrobacter NRRL B-2743 in Phos- 
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   57, 5 1 des Enzymansatzes werden mit Aceton auf 30 1 aufgefüllt. Die hiebei auftretende Ausfällung wird abzentrifugiert. Die Lösung wird dann im Vakuum auf   3, 881   eingeengt, wobei eine Ausscheidung auftritt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 2, 6 wird mit 2 l Butylacetat extrahiert. Der Extrakt wird verworfen und der wässerige Rückstand mit einer Natriumhydrogencarbonatlösung auf pH 4, 3 eingestellt und nach Klärung über ein Seitz-K3-Filter i. V. auf 300 cm3 eingeengt. Hiebei tritt spontan Kristallisation ein. Die Kristalle werden abgeschleudert und portionsweise mit 300 cm3 eiskaltem Wasser und 150 cm3 Aceton gewaschen und getrocknet. Aus der Mutterlauge kann eine weitere, etwas unreinere Fraktion von   6-Amino-penicillansäure   gewonnen werden. 



     Schmelzpunkt : 208" C   unter Zersetzung. 



   Ninhydrin-Probe einer verdünnten wässerigen Lösung : orange bis braunrote Färbung. 



   Der Nachweis der 6-Aminopenicillansäure erfolgt zweckmässig in der Weise, dass man die Lösung ohne weitere Vorbehandlung gegen einen der üblichen penicillinempfindlichen Organismen testet. Die   6-Aminopenicillansäure   selbst zeigt in diesem Versuch eine äusserst geringe bakteriostatische Aktivität. 



  Eine andere Probe von 6-Aminopenicillansäure wird unter Eiskühlung vorsichtig mit einem Überschuss an Phenylacetylchlorid und Natriumbicarbonat umgesetzt. Hiebei tritt Phenylacetylierung an der freien Aminogruppe ein. Man erhält dabei Penicillin-G praktisch in der Menge zurück, die ursprünglich vorgelegt war.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Spaltung von Penicillin G mit Hilfe von Mikroorganismen oder aus diesen gebildeten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von reiner, nicht hygroskopischer, bei etwa 208 C schmelzender 6-Aminopenicillansäure, die sich durch Phenylacetylchlorid praktisch quantitativ zu Penicillin G reaktivieren lässt, zur Spaltung im wesentlichen nur der Amidbindung in 6-Stellung des Penicillinmoleküls der Arthrobacter-Stamm K NRRL B-2743 oder Mutanten dieses Stammes und/oder Extrakte und/oder als Enzymrohlösungen daraus gebildete Enzympräparate verwendet werden.