Verfahren zur Oxydation von Steroiden. t legenstand der vörliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Oxydation von Steroiden.
1:s ist bereits bekannt, auf biologischem Wege in in 11- und 12-Stellung unsubsti- tuierte Steroide direkt eine Oxygruppe in 11- Stellung einzuführen mittels Perfusion durch überlebende Nebennieren. Für eine technische Durchführung kommt jedoch dieses Verfahren kaum in Frage.
Es wurde nun gefunden, dass man in ein- faeher Weise in 11- und 12-Stellung unsub- stituierte Steroide in die entsprechenden 11- Oxy-steroide überführen kann, wenn man sie in Ge-enwart von Enzymen mit Sauerstoff behandelt. und die gebildeten 11-Oxy-steroide isoliert.
Man kann von gesättigten oder zum Bei- -;piel von in 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11-, 16- und/oder 1.7-Stellung Doppelbindungen auf weisenden Steroiden ausgehen.
Insbesondere kommen Steroide der Androstan-, Pregnan.-, Sterin- oder Sapogeninreihe in Betracht, die zum Beispiel in 3-, 14-, 16-, 17-, 20- und 21- Stellung substituiert sind, beispielsweise durch freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen, wie durch Aeyloxy-, zum Beispiel Acetoxy-, Propionyloxy-,
Ben- zoyloxy- oder Tosyloxygruppen, durch Alk oxy-, zum Beispiel Methoxy- oder -Lithoxy- gruppen, durch enolisierte oder acetalisierte Oxogruppen, durch freie oder funktionell ab gewandelte Carboxyl-, wie Nitril- oder ver esterte Carboxylgruppen, durch Epoxygrup- pen oder durch Halogenatome.
Die Aus- gangsstoffe können von beliebiger sterischer Konfiguration sein. Besonders wertvoll sind zum Beispiel 44-3,20-Diketo-21-oxy-pregnene, d4-3,20 - Diketo-17,21-dioxy - pregnene, 3f,5a- oder -5fü=Androsterone bzw.
ihre Ester und Äther, Cholesterin oder Diosgenin. Falls er forderlich, werden in den Steroiden vorhan dene Doppelbindungen während der Oxyda tion in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Absättigung mit Halogenwasserstoff oder durch Überführung in pentacyclische Iso- steroide, intermediär geschützt.
Zur Behandlung mit Sauerstoff wird zum Beispiel Sauerstoff über oder durch das Re aktionsgemisch geleitet. An Stelle des Sauer stoffes können auch :Sauerstoff abgebende Mit tel verwendet werden, zum Beispiel Was serstoffsuperoxyd oder Wasserstoffsuperoxyd bildende Verbindungen, zum Beispiel in Ge genwart von Katalase.
Die Enzyme werden besonders in Form von Organpräparaten, wie zerkleinerten Or ganen, Organschnitten, Organhomogenisaten von enzymreichen Organen, beispielsweise von Nebennieren, Nieren oder Lebern oder Mi schungen derselben, verwendet.
Die Enzyme sind natürlich durch Zugabe geeigneter Substrate und Innehaltung entspre chender ylilieubedingungen funktionstüchtig zu erhalten. Als Substrate kommen insbeson dere diejenigen des von D. E. Green (Journal, of Biological Chemistry, Vol. <B>172,</B> Seite 389 [1948]) als Cyelophorase-System bezeich neten Enzymsystems und bzw. oder beim Kohlehy dratstoffwechsel entstehende Säuren des Krebssehen Zitronensä.urezyklus (vgl. zum Beispiel R.
Ammon und W. Dirsclrerl Fermente, Hormone, Vitamine, 1918, S. 173) oder unter den Reaktionsbedinb xngen in solche überführbare Verbindungen in Anwendung, zum Beispiel Zitronensäure, Aeonitsäure, Iso- ztronensäure, Oxalbernsteinsä.ure, a-Ketoglu- tarsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Äpfel- säure, Brenztraubensäure,
Oxalessigsäure, aber auch hlalonsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Asparagin, Alanin, Glvkokoll, Serin, ferner Ascorbin säure, Milchsäure, Dioxy weinsäure, Prolin, Tyrosin, Tryptophan bzw. Gemische der selben.
Zur Innehaltung entsprechender Milieu bedingungen arbeitet man am besten in wäs serigem Medium, dem vorteilhaft Bestand teile physiologischer Lösungen, wie Kohle hydrate, anorganische und bzw. oder orga nische Salze, beispielsweise Natriumphosphat, Alkalichloride, 1llagnesirxmsulfat oder Na- triLxmacetat zugefügt, werden. Mit den Salz zusätzen sollen insbesondere das pH und die Jonenstärke der Reaktionslösung während der Reaktion im optimalen Bereich gehalten wer den.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei einem pH von 6,5 bis 9,0 und einer Salzkon zentration von 0,5 bis 0,01 molar durch1e- führt. Dementsprechend lässt sich als Reak tionsmedium a.neh eine physiologische Flüssig keit, zum Beispiel Plasma, verwenden. In diesem Fall wird vorteilhaft, ein Konservie- rungsmittel, beispielsweise Penicillin, zuge fügt.
Dem Reaktionsmedium kann man auch Lösungsvermittler, wie Äthy lenglykol, Propy- lenglykol, oder Dispersionsmittel, zum Bei spiel Phospholipoide, zusetzen.
Die Isolierung der 11-Oxy-steroide aus dem Oxydationsgemisch kann, je nach den verwen deten Ausgangsstoffen bzw. Reaktionsmedien, gemäss an sich bekannten Methoden, zum Bei spiel unter Durchführung von Entmischungs- verfahren, Chromatographie, Umkristallisa tion und dergleichen, erfolgen.
In den folgenden Beispielen besteht zwi schen Gewichtsteil und Volumteil die gleiche Beziehung wie zwischen Gramnx und Kubilz- zentimeter. Die Temperaturen sind in Celsius graden angegeben.
<I>Beispiel. 1:</I> Eine Lösung von 1 Gewichtsteil Desoxy- cort-icosterorx in 20 Volumteilen Ä thylenglykol wird zu 980 Volumteilen einer Mischung aus 900 Volumteilen Rinderplasma, welches die dem Cyeloplrorase-Systein angehörenden Ver bindungen enthält und welchem zuvor Zitro nensäure und Penicillin zugesetzt worden war, 80 Volumteilen ith@-lenglykol und 1 Ge- wiclxtsteil Ascorbinsäure gegeben.
Das ZEH die ser Lösung wird mit. 0,1.n-Natronlauge auf das ursprüngliche pH des Citratplasmas vor dem Aseorbinsäurezusatz zurüekgestellt. 900 Vo- lumteile der obigen Mischung werden im Thermostaten auf 37 C erwärmt.
Dazu gibt man 60 Gewiehtsteile friselx hergestellter Ne bennierenschnitten ans Nebennieren von frisch geschlachteten Rindern. überdies werden 60 Gewichtsteile Rindernebennieren in kleine Stücke geschnitten und mit 80 Volumteilen der obigen Desoxvcortieosteron-Plasxnalösung in einem Homogenisator 2 Minuten homo genisiert. Der entstehende Brei wird zu der bereits mit Schnitten versehenen Lösung im Thermostaten gegeben und mit 20 Volumteilen Plasma nachgespült.
Die Mischung hält man 1/2 Stunde unter schwacher Be wegung bei 37 C. Nachdem die Temperatur ausgeglichen ist, werden 100 Volumteile einer wässerigen 1,03prozentigen Wasserstoffsuper- oxydlösung, welche 10% Äthylenglykol ent- hält, innert 2 Stunden zugegeben.
Nach wei teren. 21/2 Stunden wird auf Zimmertempera tur abgekühlt und hierauf das Reaktions gemisch durch einen Tuchfilter abgepresst. Die trübe durchlaufende Lösung wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 2000 Touren geklärt. Den durch Zentrifugieren erhaltenen Rückstand vereixxigt man mit dem Rückstaxrd im Tuchfilter.
Die Plasmalösung und der hauptsächlich aus den Organteilen bestehende Filterrück stand werden einzeln mit organischen Lö sungsmitteln behandelt. Die Plasmalösung wird mit Essigester extrahiert, bis der Essig ester farblos erscheint. Diese Extraktions lösungen werden zur klaren Schichtentrennung bei 2000 Touren 1/2 Stunde zentrifugiert und die Essigesterschichten jeweils abgehebert. Es werden auf diese Weise 3,9 Gewichtsteile Ex trakt gewonnen, welcher durch stufenweise Verteilung zwischen Methanol und Heptan fraktioniert wird.
Die Methanolfraktionen, enthaltend die Steroide, werden nochmals zwi- sehen Heptan und Methanol verteilt und dann in Pyridin mit Aeetanhydrid bei Zimmer temperatur acetyliert. Das so erhaltene Pro dukt zeigt bei der papierchromatographischen Untersuchung ein Gemisch von Desoxycorti- costeron- und Cortieosteron-acetat an.
Zwecks Auftrennung chromatographiert man das Ge misch an Silicagel. Die Benzol-Äther-Eluate enthalten zur Hauptsache unverändertes Des oxveorticosteron. Das Oxydationsprodukt wird dagegen erst mit. Äther-Essigester-Gemischen aus der Chromatogramm-Säule abgelöst.
Nach Verseifung mittels Natriumbicarbonat in wäs- serigalkoholischer Lösung erhält man daraus Kristalle, die bei 179 bis 181 C (nach Sintern) schmelzen, die optische Drehung lall) = -I- 200 (in Alkohol) aufweisen und mit konzentrierter Schwefelsäure die für Corti- eUsteron charakteristische Parbreaktion (grün- (Yelbe Fluoreszenz) zeigen.
Die aus dem Reaktionsgemiseh durch Abtrennen und Zentrifugieren gewonnenen Organriiekstände werden 40 Stunden mit Aceton extrahiert.. Die Acetonlösung, welche das in den Organen und dem anhaftenden Plasma befindliche Wasser enthält, wird im Wasserstrahlvakuum von Aceton befreit. Der wässerige Rückstand wird mit Äther mehr fach ausgeschüttelt. Es werden nach dem Ab dampfen des Äthers 4,3 Gewichtsteile Äther extrakt gewonnen. Dieser wird analog wie der Essigesterextralz-t des Plasmas weiterbehandelt. Zunächst folgt eine stufenweise, wiederholte Verteilung zwischen Heptan und Methanol.
Die Methanolfraktionen werden wieder mit Acetanhydrid in Pyridin acetyliert und das Aeetylierungsgemisch, nach dem vollständigen Entfernen des Pyridins und überschüssigen Acetanhydrids durch Chromatographie an Silicagel getrennt. Durch Verseifung der Äther-Essigester-Eluate und Umkristallisation erhält man dieselbe Verbindung wie bei der Aufarbeitung des Plasmaextraktes.
<I>Beispiel 2:</I> 159 Gewichtsteile feingeschnittener Rinder nebennieren werden in einem Homogenisator mit 900 Volumteilen einer wässerigen Lösung 5 Minuten homogenisiert. Die 900 Volumteile der wässerigen Lösung enthalten 6,4 Gewichts teile Natriumfumarat, 36 Gewichtsteile Glu cose, 7,24 'Gewichtsteile Natriumchlorid, 3,72 Gewichtsteile Kaliumchlorid, 7,14 Gewichts teile sekundäres Natriumphosphat und 1,98 Gewichtsteile Magnesiumsulfat,
Zu diesem Homogenisat gibt man 1 Gewichtsteil Des- oxycorticosteron und homogenisiert nochmals 2 Minuten auf höchster Tourenzahl. Der ent standene Brei wird mit 20 Volumteilen ln Salzsäure auf PH 6,62 gebracht (pH-Bestim- mung mit Glaselektrode) und nochmals 2 Mi nuten homogenisiert. Das Reaktionsgemisch wird in ein mit Rührer versehenes Gefäss ge leert und mit 100 Volumteilen Wasser nach gespült.
Das PH der Emulsion wird mit 20 Vo- lumteilen In-Salzsäure auf 6,62 gebracht (pH- Bestimmung mit Glaselektrode). Das Reak tionsgemisch wird auf 37 C gehalten, und unter ständigem Umrühren werden 150 Vo- lumteile einer 15prozentigen Wasserstoffsuper oxydlösung im Verlaufe von 21/2 Stunden zu gegeben.
Im Verlaufe der nächsten Stunde werden noch 15 Volumteile einer 30prozenti gen Wasserstoffsuperoxydiösung zugetropft. Wenn die Sauerstoffentwicklung nachlässt, werden nach jeder Stunde 0,05 Gewichtsteile eines handelsüblichen Katalasepräparates zu gegeben, um nach 4 Stunden die Zersetzung eventuell noch vorhandenen Wasserstoffsuper oxyds sicherzustellen.
Die Lösung wird nach einer Totalreaktionszeit von 4 Stunden mit 30 Volumteilen ln-Salzsäure versetzt, das pH der mit starker Eiweissfällung versehenen Mischung beträgt nun 5,10. Nun wird das Reaktionsgemisch mit 800 Volumteilen Essig ester versetzt und bei 37 C 1 Stunde gut i gerührt.
Dann wird die Mischung zent.ritu- giert. Die überstehende Essigesterschicht wird abgehebert und die wässerige Phase und der Niederschlag über Nacht in gleicher Weise mit 500 Voluniteilen Essigester behandelt. Diese Extraktion wird noch dreimal während je ? Stunden. wiederholt, bis die Essigester- schieht farblos ist.
Die vereinigten Essigester lösungen werden über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und die filtrierte Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft. Das zurück bleibende halbfeste Produkt wird in mit Heptan gesättigtem Methanol aufgenommen und in 6 Stufen zwischen einer Mischung von je 100 Volunteilen Heptan und -100 Volum- teilen Methanol verteilt.
Die llet.hanollösnn- gen der Stufen 1 bis 5 werden vereinigt; es werden daraus 5,82 Gewichtsteile einer halb festen, gelbbraunen Masse erhalten. Die pa: pierehromatographische Analyse dieses Roh extraktes zeigt neben unumgewandeltem Des oxv corticosteron auch Corticosteron an.
Zur Isolierung des Oxydationsproduktes wird der Rohextrakt in bekannter Weise an Silica-el chromatographiert. Die Äther- und Chloro- forineluate enthalten Desoxvcorticosteron und die Eluate mit Cliloroform-Essinester und Essigester das Corticosteron, welch letzteres leicht mit der Schwefelsäurereaktion (grün gelbe Fluoreszenz) zu erkennen ist.
Diese Corticosteronfraktion wird in Pvridin mit Acetanhydrid acetyliert und nach dem Um- kristallisieren aus Aceton-Äther das Corti- costeronacetat vom F. = 113 bis 119 C ge wonnen.
Dieses Acetat wird mittels Kalium- bicarbonat. verseift und schliesslich durch Um- kristallisieren das Coilicosteron vom F. = 179 bis 182 C und der spezifischen Drehung [ccIn = ??:; (in Alkohol) in feinen Kri-- stallen erhalten.
<I>Beispiel 3:</I> 113 Gewichtsteile feingeschnittener Rinder nebennieren werden in einem Honiogenisator mit. 250 Volumteilen einer wässerigen Lösun- 5 Minuten homogenisiert. Die 250 Volumteile der wässeriäen Lösung enthalten 0,574 Ge wichtsteil Fumarsäure, -1,5 Gewichtsteile GrIu- eose, 0,97. (rewielitsteile Natritunehlorid, 0,
4 CTe- wichtsteile Iialiumclilorid, 0,91 Gewichtsteile sekundäres Natriumphosphat, 0,25 Gewichts-, teile l@a@@aiesiumsulfat und 25 Voluniteile 0,1n- Natronlauge. Zii diesem Iloniogenisat wird 1 Gewiehtsteil. Desoxvcorticosteron gegeben und nochmals ' Minuten homogenisiert. Das.
1),i dieser Emulsion beträgt 6,78. Sie wird ; in ein mit. Rührer und Gaseinleitungsrohr ver sehenes Gefäss umgeleert und unter Rühren und Einleiten von Sauerstoff 5 Stunden bei 37 C belassen.
Mit 50 Volumteilen Wasser wird der Homogenisator ausgespült. Die Re- , aktionsflüssibkeit wird in 1500 Volumteile Aceton -e-eben und mit je 200 Volumteilen Aceton zweimal nachgespült, Die vereinigten Acetonlösun-en werden durch Abnutschen vom Niedeaschl:
a- -etrennt. Der Rückstand wird dreimal mit je 200 Volunrteilen heissere Aceton ausgewaschen. Die vereinigten Aceton- lösun--en werden im Wasserstrahlvakuum von Aceton befreit.
Die zurückbleibende wässerige Lösung wird mit dein beim Abdampfen des Acetons ausgefallenen Niederschlag und aus- sesehiedenem <B>01</B> mit -100 Volumteilen Chloro form in ein Extraktionsgefäss bespült. Die Ex traktion der wässeri;-en Schicht wird mit je 100 Volumteilen Chloroform viermal wieder holt.
Die letzten Chloroforn)extrakte sind fast farblos, während die ersten beiden stark gelb braun "efärbt sind. Die Chloroformextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und die filtrierte Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft.
Als Ein- dampfunbsrüekstand verbleiben 1.1,5 Gewichts teile eines dunkelbraunen Produktes. Die pa- pierehromatographiselie Analyse zeigt neben unverändertem Desoxveortieosteron das in 11- Stellung oxydierte Produkt, das Corticosteron, an.
Der Rohextrakt wird in 250 Volumteilen Äther gelöst und diese Lösung reit je 200 Vo- l.umteilen einer gesättigten Lösung von Na triumbica.rbonat arusgesehüttelt. Die gelbe, klaretherlösun \@ wird sofort mit.
50 Volum- teilen O,ln-Salzsäure versetzt. und mit je 50 Vol.umteilen Wasser zweimal bewaschen. Die dabei entstehenden Emulsionen werden durch Zugabe von 5i Voluinteilen Methanol gebrochen und die Ätherschicht zur Trockne verdampft. Als 'Trocl@enrückstand werden 4,2 Gewichtsteile eines gelbbraunen Breies erhal ten.
Dieser wird in bekannter Weise an Sili- cagel chromatographiert. Die Äther- und Chloroformeluate bestehen aus unumgewan- deltem Desoxyeorticosteron. Die Chl.oroform- F.ssigsäureextrakte liefern nach der papier chromatischen Analyse eine Mischung von Desoxy eorticosteron und Corticosteron, wäh rend die Essigestereluate Corticosteron und ein gelb gefärbtes Produkt enthalten.
Die Corticosteron enthaltenden Fraktionen, wer den vereinigt und nochmals an Silicagel chromatographiert. Nach dem Umkristalli- sieren wird Corticosteron vom F. 175 gewonnen. Dieses Produkt wird wie im Beispiel 2 acetyl'iert und das Aeetylie- rnngsprodukt durch mehrfaches Umkristalli- sieren gereinigt.
Die Kristalle zeigen den F. - 140 bis 146 C, die spezifische Drehung [a1D = 219 (in Alkohol) und die bekannte Farbreaktion mit konzentrierter Schwefel säure. Bei der papierchromatographischen Analyse erweist sieh das Produkt. einheitlich als Cortieosteronacetat.
Beispiel 53 Gewichtsteile (eingeschnittener schlacht frischer Rindernebennieren werden in einem Homogenisator mit 100 Volumteilen einer wässerigen Lösung 3 Minuten homogenisiert.
Die 100 Volumteile der wässerigen Lösung enthalten 0,232 Gewichtsteile Fumarsäure, 1,8 (lewiehtsteile Glucose, 0,362 Gewichtsteile Natriumchlorid, 0,186 Gewichtsteile Kalium ehlorid, 0,356 Gewichtsteile sekundäres Na triumphosphat und 0,099 Gewichtsteile Ma gnesiumsulfat und sind mit 4 Volumteilen 2n-Natronlauge auf p$ 7,28 gestellt. Nach dem Homogenisieren wird das Homogenisat, des sen PH 6,73 beträgt, mit 0,5 Volumteilen 2n- Natronlauge auf PH 7,22 gebracht.
Zu dieser 3lischung werden 20 Volumteile Propylen- glykol gegeben, 1 Minute homogenisiert und 25 Volumteile Propylenglykol, welche 0,1 Ge wichtsteil Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21- dioxy-pregnen) gelöst enthalten, zugegeben, mit 5 Vo'lumteilen Propylengly kol nachge- waschen und noch 11/2 Minuten homogenisiert.
Die Emulsion wird in ein mit Rührer und Gaseinleitungsrohr versehenes Gefäss umge leert und im Thermostaten bei 37 C unter Rühren Sauerstoff durchgeleitet. Allzu starke Schaumentwicklung wird durch Drosselung der Sauerstoffzufuhr oder durch Zugabe we niger Tropfen Octanol vermieden. Nach 30 Mi nuten beträgt das p$ 7,27, nach 3 Stunden 7,20. Durch Zugabe von 12 Volumteilen ln Salzsäure wird das p$ auf 3,75 gestellt, wobei eine starke Eiweissfällung und Verfärbung der bis dahin rotbraun gefärbten. Lösung nach graubraun erfolgt.
Das Reaktionsgemisch wird in 2000 Volum- teile Aceton geleert und das Reaktionsgefäss mit je 100 Volumteilen Aceton dreimal aus gewaschen. Die vereinigten Acetonlösungen werden 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Fällung wird dann durch Abnutschen von der gelben Lösung getrennt und der Rückstand mit je 100 Volumteilen heissem Aceton dreimal gewaschen. Die verei nigten Acetonlösungen werden im Vakuum vollständig von Aceton befreit. Die zurück-.
bleibende wässerige Lösung und die während des Eindampfens ausgeschiedenen Nieder schläge und Öle werden mit 200 Volumteilen Essigester in ein Extraktionsgefäss transfe riert. Die wässerige Phase wird durch Zugabe von 25 Gewichtsteilen Kochsalz gesättigt und viermal mit je 100 Volumteilen Essigester ex trahiert. Die vereinigten Essigesterlösungen werden zweimal mit je 60 Volumteilen Wasser gewaschen und zweimal mit je 40 Volumteilen gesättigter Natriumbicarbonatlösung ausge schüttelt.
Das Waschwasser und die Bicar- bonatlösungen werden vereinigt und mit 100 Volumteilen Essigester extrahiert. Die vereinigten Essigesterlösungen werden mit 50 Volumteilen Wasser, dann mit 50 Volum- teilen 0,01n-Salzsäure und anschliessend zwei mal mit je 50 Volumteilen Wasser gewaschen. Die orangegelbe Essigesterlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, fil triert und im Vakuum zur Trockne verdampft.
Als Essigesterextrakt bleiben 3,4 Gewichtsteile eines dunkelbraunen, schmierigen Kristall- breies zurüek.
Die papierehromatographisclie Analyse die ses Rohextraktes zeigt neben unveränderter Substanz S die Substanz F (d-1-3,20-Diket.o- 17.ss1,17a,21=trioay-preglien) an. Der dunkel braune Kristallbrei wird in 10 Volumteilen einer Lösung von 50 Volumteilen Benzol und 50 Voluniteilen Äther gelöst, an Silicagel in bekannter Weise chromatographiert und mit Äther, Ätlier-Chloroformgemischen, Chloro form, Chloroform-Essigestergemischen,
Essig ester und Essigester-Methanolgemischen elu- iert.
Aus den Chloroformeluaten kristallisiert nach dem Eindampfen unveränderte Sub stanz S, und aus den Essigester- und Essig- ester-Methanoleluaten wird die Substanz F erhalten. Durch mehrfaches Umkristallisieren aus einem Gemisch von Äther-Aceton-Pentan und anschliessend aus Äther-Aceton wird aus den Fraktionen der Essigesterelution in (,e- ringer Menge ein begleitendes, die Kristallisa tion stark erschwerendes, gelbliches Öl abge trennt.
Das papierchromatographiseh-einheit- liche, kristallisierte Produkt schmilzt bei 200 bis 210 C lind zeigt in 21isehung mit analy - tisch reiner Substanz F keine Depression des Schmelzpunktes. Die Kristalle lassen sich auch auf Grund der Farbreaktion mit konzentrier ter Schwefelsäure als Substanz F identifizie ren und zeigen eine spezifische Drehung von fall) = + 15'6 (in Alkohol).
Die Chloro- form-Essigestereluate, welche neben Substanz F auch noch Substanz S enthalten, werden durch nochmalige chromatische Trennung an Silicagel in die Komponenten getrennt. Die übrigen Efuate der Silicagelchromatographie, in welchen Substanz F und Substanz S ge mischt vorliegen, werden mit.
den Mutterlau gen der oben genannten Umkristallisation ver einigt und in bekannter Weise mit Acetan- hydrid in Pyridin acetyliert. Die Acetylie- rungsprodukte werden an Silicagel ehromato- graphiert und die Acetate nach Eindampfen der Eluierungsmittel kristallin erhalten. Die mit konzentrierter Schwefelsäure grüngelb fluoreszierenden Kristalle stellen das reine F-aeetat vor.
Sie schmelzen bei 218 bis 225" r; und zeigen in Dioxan eine spezifische Drehung von f a] D = + 167 .
<I>Beispiele 5</I> his <I>31:</I> Beispiele <I>5</I> bis.?1: In genau gleicher Weise, wie im Beispiel .1 eingehend beschrieben, wird mit den in den folgenden Beispielen angege benen Substraten die Reaktion und die Auf arbeitung des Reaktionsgemisches durehge- führt. Als enzymhaltiges Organ werden Rin dernebennieren und als Ausgangsstoff für die Steroidoxydation je 0,
1 Gewichtsteile Sub stanz S (d-1-3,20-Dil,:eto-17a,21-dioxy-pregnell) verwendet. Das pH des Reaktionsgemisches wird, wenn nötig, durch Zugabe von 2n-Na- t-ronlauge oder 'n-Salzsäiire in gewissen Zeit- absehnitten auf das pli bei Versuchsbeginn 7u- rücktitriert.Als Lösungsvermittler werden je 50 Volumteile Propylenglykol in der im Bei spiel 4 näher
ausgeführten Weise zugefügt. In diesen Beispielen werden als Lösungsmittel je 100 Volumteile einer wässerigen Lösung verwendet, welche neben der Substratsubstanz noch folgende Zusätze enthalten: 1,8 Gewichts teile Glucose, 0,362 Gewiehtsteile Natrium- ehlorid, 0,356 Gewielitsteile sekundäres Na triumphosphat, 0,099 Gewichtsteile 3lagne- siumsuliat und so viel Natronlauge, als zur Titration auf ein pH von<B>7,5</B> notwendig ist.
Während der Reaktion wird immer Sauerstoff durchgeleitet.
<I>Beispiel</I> 25: Analog der in den Beispielen bis 21 beschriebenen Reaktionsfolgen und Aufarbeitungsmethoden werden in diesem Fall, als Lösungsvermittler an Stelle von Propylen- glykol 50 Volumteile Äthylenglykol. in genau gleicher Weise verwendet.
<I>Beispiele</I> 96<I>bis 31:</I> Unter sonst gleichen Versuchsbedingungen, wie sie in den Beispie len 4 bis 25 eingehalten werden, wird in den Beispielen 26 bis 31 auf die Verwendung eines Lösungsvermittlers verzichtet und dafür statt nur 100 Volumteile der glucosehaltigen Salz lösung 150 V olumteile als Lösungsmittel ver wendet. Je 0;1 Gewichtsteile der zu oxydieren den Substanz S (J-1-3,20-Diketo-17a,21-dioxy- pregnen) wird als feines Pulver direkt zum ioniogenisat gegeben und das Ganze noch mals 3 Minuten homogenisiert.
Dann wird gemäss dem im Beispiel -1 eingehend geschil derten Verfahren unter Einleitung von Sauer stoff reagieren gelassen -Lind das Reaktions- gemiseh analog aufgearbeitet. Schliesslich wird die gewünschte Substanz P (d4-2,20-Diketo- 11f,17a,21-trioxy-pregnen) kristallin erhalten und papierchromatographisch identifiziert.
In der folgenden Tabelle sind die für die Beispiele 5 bis 31 charakterisierten Versuchs- so daten zusammenfassend dargestellt. <I>Beispiele 5 bis</I> 3.1:
EMI0007.0013
<I>Oxydation <SEP> von <SEP> Substanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> Substanz <SEP> h'.</I>
<tb> Stunden
<tb> Beispiel <SEP> Gew.- <SEP> Gew.-Teile <SEP> ?@H <SEP> d. <SEP> Reaktionslösung <SEP> Total <SEP> Essigester Substrat <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> extrakt
<tb> Nr.
<SEP> Teile <SEP> Nebenniere <SEP> Beginn <SEP> Ende <SEP> Reaktions 30' <SEP> auf <SEP> <U>zeit</U> <SEP> Gew.-Teile
<tb> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 47 <SEP> 6,58 <SEP> 6,81 <SEP> 6,85 <SEP> 7,00 <SEP> 3 <SEP> 2,23
<tb> 6 <SEP> Bernsteinsäure <SEP> 0,236 <SEP> 51 <SEP> 6,58 <SEP> 6,90 <SEP> - <SEP> 6,71 <SEP> 2%z <SEP> 7,11
<tb> 7 <SEP> Funiarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 6,57 <SEP> 6,58 <SEP> - <SEP> 6,55 <SEP> 41/z <SEP> 1,43
<tb> 8 <SEP> <B><I>93</I></B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,02 <SEP> 7,10 <SEP> - <SEP> 7,08 <SEP> 3 <SEP> 3,l1
<tb> 9 <SEP> <B>31</B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,45 <SEP> 7,45 <SEP> 7,50 <SEP> 7,41 <SEP> 3 <SEP> 3,51
<tb> 10 <SEP> <B>39</B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,98 <SEP> 7,70 <SEP> 7,99 <SEP> 7,85 <SEP> 3 <SEP> 1,95
<tb> 11 <SEP> d,l <SEP> Äpfelsäiire <SEP> 0,356 <SEP> 51 <SEP> 6,50 <SEP> 6,52 <SEP> - <SEP> 6,
57 <SEP> 4i/2 <SEP> 1,2
<tb> 12 <SEP> Malonsäure <SEP> 0,208 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,20 <SEP> - <SEP> 7,10 <SEP> 3%2 <SEP> 1,88
<tb> 13 <SEP> Glütarsäure <SEP> 0,264 <SEP> 50 <SEP> 7,04 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,09 <SEP> 31/2 <SEP> 1,91
<tb> 14 <SEP> Adipinsäure <SEP> 0,292 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,l5 <SEP> - <SEP> 7,05 <SEP> 31/s <SEP> 1,80
<tb> 15 <SEP> cl,l-C?liitaminsä.ure <SEP> 0,584 <SEP> 54 <SEP> 7,14 <SEP> 7,01 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 3 <SEP> 2,71
<tb> 16 <SEP> d-Glutaminsäure <SEP> 0,584 <SEP> 35 <SEP> 7,28 <SEP> 7,12 <SEP> 7,18 <SEP> 7,18 <SEP> 21/z <SEP> 2,27
<tb> 17 <SEP> d,l-Asparaginsäure <SEP> 0,532 <SEP> 54 <SEP> <B>7,18</B> <SEP> 7,05 <SEP> - <SEP> 6,90 <SEP> 3 <SEP> 2,39
<tb> 18 <SEP> d,l-Asparagin <SEP> 0,528 <SEP> 54 <SEP> 7,22 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 6,95 <SEP> 3 <SEP> 2,90
<tb> 19 <SEP> d,l-Alanin <SEP> 0,356 <SEP> 54 <SEP> 6,
92 <SEP> 6,58 <SEP> 7,09 <SEP> 6,99 <SEP> 3 <SEP> l,92
<tb> 20 <SEP> Milchsäure <SEP> 0,180 <SEP> 50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,12 <SEP> - <SEP> 7,01 <SEP> 31/z <SEP> 2,29
<tb> 21 <SEP> Dioxyweinsäure <SEP> 0,364 <SEP> 51 <SEP> 7,04 <SEP> 7,02 <SEP> - <SEP> 6,96 <SEP> 31/z <SEP> 1,90
<tb> 22 <SEP> 1-Ascorbinsäure <SEP> 0,352 <SEP> 50 <SEP> 7,03 <SEP> 7,06 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 31/2 <SEP> 2,55
<tb> 23 <SEP> Brenztraubensäure <SEP> 0,l66 <SEP> 47 <SEP> 6,49 <SEP> 6,69 <SEP> - <SEP> 6,63 <SEP> 3 <SEP> 2,13
<tb> 24 <SEP> " <SEP> 0,l66 <SEP> 50 <SEP> 7,37 <SEP> 7,15 <SEP> 7,20 <SEP> 7,10 <SEP> 3 <SEP> 3,15
<tb> 25 <SEP> Funiarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> _ <SEP> 7,29 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 7,l1 <SEP> 21/z <SEP> 2,53
<tb> 26 <SEP> eis <SEP> Aconitsäure <SEP> 0,348 <SEP> 47,5 <SEP> 7,38 <SEP> 7,13 <SEP> 7,46 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 1,
30
<tb> 27 <SEP> a-hetoglutarsäure <SEP> 0,292 <SEP> 47,5 <SEP> 7,48 <SEP> 7,28 <SEP> 7,45 <SEP> 7,27 <SEP> 3 <SEP> 1,13
<tb> 28 <SEP> Glykokoll <SEP> 0,124 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,18 <SEP> 7,52 <SEP> 7,25 <SEP> 21/z <SEP> 1,29
<tb> 29 <SEP> d,l-Serin <SEP> 0,210 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,05 <SEP> 7,42 <SEP> 7,28 <SEP> 2i/2 <SEP> l,97
<tb> 30 <SEP> 1-Tryptophan <SEP> 0,408 <SEP> 41 <SEP> 7,50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 2 <SEP> 0,74
<tb> 31 <SEP> 1-Tyrosin <SEP> 0,362 <SEP> 41 <SEP> 7,62 <SEP> 7,23 <SEP> 7,60 <SEP> 7,35 <SEP> 2 <SEP> 1,27 <I>Beispiele 32 bis 35:
</I> In sonst genau gleicher Weise, wie in den Beispielen 4 bis 41 angegeben, werden in den Beispielen 32 bis 35 unter Verwendung von je 50 Volumteilen Propylenglvkol als Lö- sungsvermittler je 100 Volumteile gliicosefreie Salzlösung als Lösungsmittel verwendet und die Reaktionszeit gemäss den in der nach stehenden Tabelle angeführten Versuchsbedin gungen verändert.
Aneh unter der nachge- nannten Arbeitsweise lässt sich aus Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxi--pregnen) die Substanz F (d-1-3,20-Diketo-11ss,17a,21-trioxy- pregnen) kristallin gewinnen. Der Schmelz punkt nach einmaligem Umkristallisieren des Essigestereluates des an Silicagel ehromato- graphierten Rohextraktes liegt bei 185 bis 200 C.
Die papierchromatographische Analyse Lind die Farbreaktion mit konzentrierter Schwefelsäure beweisen die Identität dieser kristallisierten Fraktion mit der Substanz F. <I>Beispiele</I> 3,) <I>bis 35:</I>
EMI0008.0012
<I>Oxydation <SEP> von <SEP> Sltbstanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> SiAsta.nz <SEP> Z'.</I>
<tb> Neben- <SEP> Lösungsmittel <SEP> p<B>l,</B> <SEP> der <SEP> Reaktions- <SEP> Stunden <SEP> Essigester Beispiel <SEP> Substrat <SEP> Gew.- <SEP> Liiere <SEP> wie <SEP> in <SEP> den <SEP> vol.- <SEP> Lösung <SEP> Total <SEP> extrakt
<tb> No. <SEP> Teile <SEP> Gew.- <SEP> Beispielen <SEP> 5-31 <SEP> nach <SEP> Reakt.
Teile <SEP> jedoch <SEP> Teile <SEP> Beginn <SEP> 30, <SEP> Ende <SEP> Zeit <SEP> @ew.-Teile
<tb> 32 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 41/2 <SEP> 1,49
<tb> 33 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 7,35 <SEP> 7,25 <SEP> 7,48 <SEP> 21/2 <SEP> 3,14
<tb> 34 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 34 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 7,32 <SEP> 7,54 <SEP> 7,54 <SEP> 1 <SEP> 1,99
<tb> 35 <SEP> Fumarsäure <SEP> <B>0,232</B> <SEP> 53 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> <B>7,38 <SEP> 7,56</B> <SEP> 7.49 <SEP> 21/2 <SEP> 3,13
<tb> { <SEP> ohne <SEP> NgS04 <SEP> } <I>Beispiel 36:
</I> 121 Gewiehtsteile schlachtfrischer, zu Wür feln geschnittener Kalbslebern werden in einem Homogenisator mit. 100 Volumteilen einer wässerigen Lösung 3 Minuten homogeni siert. Die 100 Volumteile der wässerigen Lö sung .enthalten 0,232 Gewichtsteile Fuumar- säure, 1,8 Gewichtsteile Glucose, 0,362 Ge wichtsteile Natriumehlorid, 0,186 Gewiehtsteile Kaliumchlorid, 0,356 Gewiehtsteile sekundäres Natritumphosphat und 0,099 Gewichtsteile Ma gnesiumsulfat und sind mit 1,
2 Volumteilen Zn-Natronlauge auf PH 7,42 gestellt. Nach dem Homogenisieren wird das Homogenisat, dessen pH 6,74 beträgt, mit 1,2 Volumteilen '>n-Natronlauge auf PH 7,42 gebracht. Zu die ser Mischung wird 0,1 Gewichtsteil Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-pregnen) zugege ben. und noch 2 Minuten homogenisiert.
Die Emulsion wird in ein mit Rührer und Gasein- leitungsrohr versehenes Gefäss umgeleert und im Thermostaten bei 37 C unter Rühren Sauerstoff durchgeleitet. Allzustarke Scha.um- entwieklung wird durch Drosselung der Sauer stoffzufuhr oder durch Zugabe weniger Trop fen Octanol vermieden. Nach 30 Minuten be trägt das pH 7,10.
Mit 0,2 Volumteilen 'n- Natronlauge wird es auf 7,27 eingestellt; nach 120 Minuten werden zur Einstellung des pF3 von 7,12 nach 7,26 nochmals 0,2 Volumteile 2n-Natronlauge zugegeben. Nach 3 Stunden beträgt das pH 7,20. Durch Zugabe von 30 Vo- lumteilen ln-Salzsäure wird das pH auf 3,30 gebracht, wobei eine starke Eiweissfällung und Verfärbung der bis dahin braungefärbten Lö sung nach graubraun erfolgt.
Das Reaktionsgemisch wird in 3000 Vo- lumteile Aceton -eleert und das Reak tionsgefäss mit. je 250 Volumteilen Ace ton dreimal ausgewasehen. Die vereinig ten Acetonlösungen werden 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Fällung wird dann durch Abnutschen von der gelben Lösung getrennt und der Rück stand mit je 250 V olumteilen heissem Aceton dreimal gewasehen. Die vereinigten Aceton lösungen werden im Vakuum vollständig von Aceton befreit.
Die zurückbleibende wässerige Lösung und die während des Eindampfens ausgeschiedenen Niederschläge und Öle wer den mit 300 Volumteilen Essigester in ein Ex traktionsgefäss transferiert. Die wässerige Phase wird durch Zugabe von 25 Gewichts teilen Kochsalz gesättigt und viermal mit je 100 Volumteilen Essigester extrahiert. Die vereinigten Essigesterlösungen werden zweimal mit je 60 Volumteilen Wasser gewaschen und viermal mit je 50 Volumteilen gesättigter Natriumbicarbonatlösung ausgeschüttelt.
Das Waschwasser und die Bicarbonatlösungen werden vereinigt und mit 100 Volumteilen Essigester extrahiert. Die vereinigten Essig esterlösungen werden mit 50 Volumteilen Was ser, dann mit 50 Volumteilen 0,1n-Salzsäure und anschliessend noch dreimal mit je 50 Vo- lumteilenWasser gewaschen. Die orangegelbe Essigesterlösung wird über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet, filtriert und im Va kuum zur Trockne verdampft. Als Essig esterextrakt bleiben 3,03 Gewichtsteile einer hellbraunen Gallerte zurück, welche über Nacht. Kristalle ausscheidet.
Die papierchromatographische Analyse die ses Rohextraktes zeigt neben unveränderter Substanz S die Substanz F (44-3,20-Diketo- 1.1f,17a,21-trioxy-pregnen) an. Der hellbraune Kristallbrei wird in 10 Volumteilen einer Lösung von 75 Volumteilen Benzol und 2'5 Vo- liimteilen Äther gelöst und an Silicagel in be kannter Weise chromatographiert. Es wird mit Ä Hier, Äther-Chloroformgemischen, Chloro form, Chloroform-Essigestergemischen,
Essig ester und Essigester-Methanolgemischen elu- iert.
Aus den Essigester- und Essigester-Me- thanoleluaten kristallisiert die Substanz F. Durch mehrfaches Umkristallisieren aus einem Gemisch von Äther-Aceton-Pentan und an schliessend aus Äther-Aceton wird aus den Fraktionen der Essigesterelution das papier- ehromatographisch einheitliche, kristallisierte Produkt erhalten, welches bei 200 bis 210 C schmilzt.
Die Kristalle lassen sich auf Grund der Farbreaktion mit konzentrierter Schwefel säure als Substanz F (d4-3,20 - Diketo- 11ss,17a,21-trioxy-pregnen) identifizieren und zeigen die spezifische Drehung [a] D = +156 (in Alkohol).
Die Eluate der Silicagelchro- matographie, in welchen Substanz F und S gemischt vorliegen, werden mit den Mutter laugen der obgenannten Umkristallisation ver einigt und in bekannter Weise mit Acetan- hydrid in Pyridin aeetyliert. Die Acetylie- rungsprodukte werden an Silicagel chromato- graphiert und die Acetate nach Eindampfen der Eluierungsmittel kristallin erhalten.
Die mit konzentrierter Schwefelsäure grüngelb fluoreszierenden Kristalle schmelzen bei 2,18 bis 225 C und zeigen in Dioxan die spezi fische Drehung [a] D = + <B>1670.</B> Sie stellen somit, das Acetat der Substanz F vor.
<I>Beispiele 37 bis</I> 422: Analog zu den im Beispiel 36 näher be schriebenen Versuchsbedingungen wird in den Beispielen 3 7 bis 42 mit den in der nachfol genden Tabelle angeführten Substraten ge arbeitet, wobei im Beispiel 37 100 Völumteile und in den Beispielen 38 bis 42 je 150 Vo- lumteile der glucosehaltigen Salzlösung als Lösungsmittel verwendet werden.
Auch unter diesen Bedingungen gelingt die Einführung von Sauerstoff in 11-Stellung der Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-pregnen). Die ge mäss Beispiel 36 verwendete Aufarbeitungs- methode führt zur Isolierung der bei 200 bis 210 C schmelzenden Substanz F (d4-3,20-Di- keto-11ss,17a,21-trioxy-pregnen). Die Kristalle werden durch papierchromatographische Ana lyse und die Farbreaktion mit konzentrierter Schwefelsäure identifiziert und zeigen in Äthanol die spezifische Drehung [a] D = +156 . <I>Beispiel 37:
</I> Hier werden, wie im Beispiel 36, 121 Gewichtsteile Kalbsleber homogeni siert. <I>Beispiele 38 bis 40:</I> Als Enzymhaltiges Organ werden in diesen Versuchen je 55 Ge wichtsteile Kaninchenleber, in analoger Weise wie im Beispiel 36, eingesetzt.
<I>Beispiele 41 und 42:</I> Als Enzymquelle wer den in diesen Versuchen je 83 Gewichtsteile Kalbsnieren statt Lebern, unter sonst analogen Bedingungen wie im Beispiel 36, verwendet. Die den Beispielen 37 bis 42 zugrunde liegenden übrigen Versuchsdaten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
<I>Beispiele 37</I> his <I>42:</I>
EMI0010.0002
<I>Oxydation <SEP> von <SEP> Substanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> Substanz <SEP> F.</I>
<tb> pH <SEP> der <SEP> Reaktionslösung <SEP> Stunden <SEP> Essigester Beispiel <SEP> Substrat <SEP> Gew' <SEP> nach <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> Total <SEP> extrakt
<tb> Nr.
<SEP> Teile <SEP> Beginn <SEP> 20# <SEP> 40' <SEP> auf <SEP> 70' <SEP> auf <SEP> Ende <SEP> Reakt.- <SEP> Gew.-Teile
<tb> zeit
<tb> 37 <SEP> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 7,42 <SEP> 7,17 <SEP> 7,15 <SEP> 7,28 <SEP> 7,19 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 2,05
<tb> 38 <SEP> Funlarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 7,45 <SEP> 7,32 <SEP> 7,25 <SEP> 7,40 <SEP> 7,33 <SEP> 7,6<B>2</B> <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 1,47
<tb> 39 <SEP> Ascorbinsäure <SEP> 0,352 <SEP> 7,47 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 7,37 <SEP> 7,32 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 3 <SEP> 1,64
<tb> 40 <SEP> d,1-Glutaminsäure <SEP> 0,584 <SEP> 7,44 <SEP> 7,33 <SEP> 7,23 <SEP> 7,38 <SEP> 7,33 <SEP> 7,56 <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 2,65
<tb> 41 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 7,30 <SEP> 7,13 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,16 <SEP> - <SEP> 7,14 <SEP> 3 <SEP> 3,<B>1</B>8
<tb> 42 <SEP> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 7,39 <SEP> 7,
31 <SEP> 7,38 <SEP> - <SEP> 7,39 <SEP> - <SEP> 7,31 <SEP> 3 <SEP> 3,21