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PROCEDE POUR L'INTRODUCTION D'OXYGENE DANS LES STEROIDES.
La présente invention a pour objet un procédé pour l'introduction d'oxygène en position 11 de stéroideso
Les stéroides ayant un atome d'oxygène en position 11 sont des com- posés importants. Certaines hormones cortico-surrénales par exemple, possèdent un groupe de ce genre en position 11, telles que la corticostérone,la 11-déhy- dro-corticostérone, la 17 -oxycorticostérone et la 17 -oxy-11-déhydrocorticos- térone. Un procédé permettant de préparer les composés de ce genre a donc une grande importance.
Il est déjà connu qu'on peut préparer des stéroïdes ayant un atome d'oxygène en position 11. On part à cet effet habituellement de composés hydroxy- lés en position 12, scinde par exemple de l'eau de ces composés, puis addition- ne une molécule d'eau à la double liaison formée au moyen de réactions intermé- diaires appropriéeso Ce procédé est cependant très compliqué et ne donne en outre que des rendements peul' satisfaisants On a essayé récemment d'introduire directement de l'oxygène en position 11 de stéroides par voie biologique, par perfusion à travers des glandes surrénales maintenues en fonction vitale. Ce procédé n'entre cependant pour ainsi- dire pas en ligne de compte comme procédé industriel.
On a donc essayé de remplacer les glandes surrénales elles-mêmes par des glandes surrénales coupées en tranches ou transformées en une purée homogène. On a cependant pas pu obtenir par ce mode opératoire des produits d'oxydation cristallisés. La formation de composés 11-oxygénés n'a pu être dé- celée que par des essais biologiques.
Suivant la présente invention il est possible 4@introduire de l'o- xygène en position 11 de stéroïdes, de manière simple, en traitant des stéroi des non-substitués dans le noyau C avec de l'oxygène ou des agents capables de donner de l'oxygène, en présence d'enzymes et de substrats correspondants, puis en isolant les 11-oxystéroides.
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Les stéroldes qu'on emploiera comme produits initiaux pour le pro- cédé de la présente invention., non-substitués dans le noyau C, peuvent être saturés ou ils peuvent présenter des doubles liaisons, par exemple en position 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 16 et/ou en position 17.
On emploiera notamment des produits initiaux appartenant à la série de l'endrostane, du prégnane, des sté- rines ou des sapogénines, substitués par exemple en position 3, 14, 16, 17, 20 et 21, par exemple par des groupes hydroxyles ou oxo libres ou transformés en dérivés fonctionnels, tels que les groupes acyloxy, par exemple acétoxy, propio- nyloxy, benzoyloxy ou tosyloxy, ou tels que les groupes alcoxy, par exemple mé- thoxy ou éthoxy, ou tels que les groupes oxo énolisés ou acétalisés, ou substi- tués par des groupes carboxyliques libres ou transformés en dérivés fonctionnels, tels que les groupes nitriles ou les groupes carboxyliques estérifiés, ou enfin substitués par des groupes époxy ou par'des atomes d'halogène. La configuration stérique des composés initiaux peut être n'importe laquelle.
Des produits ini- tiaux particulièrement précieux sont par exemple le # 4-3,20-dicéto-21-oxy-pré- gnène, le # 4-3,20-dicéto-17,21-dioxy-prégnène, la 3ss,5a- ou la 3ss,5ss-androsté- rone, ses esters et ses ethers, la colestérine ou la diosgénine. Il y aura lieu, si cela est nécessaire, de protéger temporairement, pendant l'oxydation, les doubles liaisons présentes dans les stéroïdes, de manière habituelle, par exem- ple par saturation avec des hydracides halogénés ou par transformation en isos- téroides pentacycliques.
Le traitement avec l'oxygène sera effectué par exemple en faisant passer de l'oxygène sur ou à travers le mélange réactionnel. Comme agent pou- vant fournir de l'oxygène, on emploiera par exemple de l'eau oxygénée ou des composés pouvant former de l'eau oxygénée, par exemple en présente de catalase.
Les enzymes seront employées notamment sous forme de préparations d'organes, par exemple sous forme d'organes réduits en morceaux, d'organes en tranches,où. de purées d'organes, obtenus à partir d'organes riches en enzymes, par exemple à partir de glandes surrénales, de reins ou de foies ou de mélanges d'organes de ce genreo
Les enzymes doivent être maintenues en état d'activité fonctionnel par addition de substrats appropriés et en maintenant le milieu dans lequel on opère dans des conditions appropriéeso Comme substrats entrent notamment en ligne de compte ceux du système cyclophorase et/ou les composés du cycle de l'a- cide citrique ou les composés qui lui sont' voisins, par exemple les acides ci- trique, aconitrique, isocitrique, oxalosuccinique,#-cétoglutarique, succinique, fumarique,
malique, pyruvique, oxalacétique, ou d'autre part les acides maloni- que, glutarique, adipique, glutamique, aspartique, ainsi que l'asparagine, l'a- lanine, le glycocolle, la sérine,, et en outre l'acide ascorbique, l'acide lac- tique, l'acide dioxytartrique, la proline, la tyrosine, le tryptophane, ou des mélanges de ces composés.
Poux,,-maintenir des conditions favorables du milieu, on opérera en milieu aqueux auquel on ajoute avantageusement'des,composants de solutions phy- siologiques tels que les hydrates de carbone, les sels inorganiques et/ou orga- niques, par exemple le phosphate de sodium, les chlorures alcalins, le sulfate de magnésium ou l'acétate de sodium. A côté de ces additions, il y a lieu de maintenir notamment le pH et la concentration en ions de la solution réaction- belle, pendant la réaction, à leurs taux les plus favorables. La réaction est effectuée avantageusement à un pH égal à 6,5 - 9,0 et à une concentration sa- line moléculaire de 0,5 - 0,01. oh pourra donc aussi employer comme milieu réactionnel un liquide physiologique, par exemple du plasma sanguin.
Dans ce cas on ajoute avantageusement un agent de conservation, par exemple de la pé- nicilline. On peut aussi ajouter au milieu réactionnel des agents favorisant la dissolution, par exemple de l'éthylène-glycol, du propylène-glycol ou des agents dispersants, par exemple des phospholipoides.
Pour 'isoler les 11-oxystéroides du mélange d'oxydation, on opérera selon des méthodes en elles-mêwmes connues, appropriées aux produits initiaux ou aux milieux réactionnels employés, par exemple en effectuant des opérations de séparation telles que chromatographie, recristallisation, etc.
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Loexemples suivants illustrent la présente invention sans toute- fois la limiter. Le rapport entre les parties en poids et les parties en volume est le même qu'entre gramme et centimètre-cube. Lestempératures sont indiquées en degrés centigrades.
Exemple 1.
Une solution de 1 partie en poids de désoxycorticostérone dans 20 parties en volume d'éthylène='glycol est ajoutée à 980 parties en'volume d'un mélange obtenu à partir de 900 parties en volume d'un plasma de sang de bovin au citrate, contenant de la pénicilline, 80 parties en volume d'éthylène-glycol et une partie en poids d'acide ascorbique. On ramène le pH de cette solution, avec une solution 0,1 n d'hydroxyde de sodium au pH initial du plasma au citrate, avant l'addition d'acide ascorbique. On chauffe 900 parties en volume du mélan- ge ci-dessus, à 37 , dans un thermostato On ajoute à ce mélange 60 parties' en poids de glande cortico-surrénale fraichement coupées en tranches et retirées de bovins fraichement abattus.
D'autre part on coupe 60 parties en-poids de glande cortico-surrénale de bovins en petits morceaux, puis homogénéise pour transformer en une purée homogène, pendant 2 minutes, dans un homogénéiseur approprié, avec 80 parties en volume de la solution de plasma et de désoxy-cor- ticostérone ci-dessus. La bouillie ainsi obtenue est introduite dans la solu- tion contenant déjà les glandes surrénales en tranches, dans le thermostat, en rinçant avec 20 parties en volume de plasma. On maintient 'de mélange à 37 pen- dant 1/2 heure, en remuant légèrement de temps en temps. Lorsque la température est égale dans tout le-mélange, on introduit en 2 heures, 100 parties en volum d'une solution aqueuse à 1,03 % d'eau oxygénée, contenant 10% d'éthylène-glycol.
Après avoir maintenu encore pendant 2 1/2 heures à 37 , on refroidit à la tempé rature ordinaire, puis on presse le mélange réactionnel à travers un filtre d'étoffe de l'aineo La solution trouble qui passe est centrifugée pendant 1 heure à 2000 tours, pour la clarifier. Le résidu de cette centrifugation est réuni avec le résidu de la filtration à travers le filtre d'étoffe.
On traite séparément la solution de plasma et le résidu dé filtra- tion, formé principalement de parties d'organes, avec des solvants organiques.
On extrait la solution de plasma avec de l'éther acétique, jusqu'à ce que l'éther acétique soit incolore. On centrifuge ces solutions d'extractionà 2000 tours* pendant 1/2 heure, jusqu'à ce qu'il se produit une 'séparation claire des cou- ches, et on prélève chaque fois la couche d'éther acétique. Après évaporation de l'éther acétique, on obtient ainsi 3,9 parties én poids d'extrait qu'on fractionne par répartition entre du méthanol et de l'heptane. Les fractions méthanôliques contiennent les stéroïdes et sont réparties de nouveau entre de l'heptane et du méthanol, puis acétylées à température ordinaire dans de la pyridine, avec de l'anhydride acétique. Le produit ainsi obtenu montre par un essai: de chromatographie sur papier, qu'il est formé d'un mélange d'acétate de désoxycorticostérone et d'acétate de corticostérone.
Pour séparer ces deux com- posés, on chromatographie le mélange sur un gel de siliceo Les éluats de benzène- éther, contiennent surtout de la désoxycorticostérone non transformée,,' Le pro- duit de l'oxydation n'est 'Par contre élue qu'avec un mélange d'éther et d'éther acétique de la colonne du chromatogramme. Après saponification au moyen de bi- carbonate de sodium, en solution aqueuse alcoolique, on obtient des cristaux fondant à 179- 181 (après agglutination), d'un pouvoir rotatoire spécifique [# D = + 2200 (dans l'alcool), présentant la réaction colorée caractéristique de la corticostérone (fluorescence jaune-vert), avec de l'acide sulfurique con- centré.
.,.On extrait avec de l'acétone, pendant 40 heures, les résidus d'organes obtenus par filtration du mélange réactionnel et par centrifugation. De la so- lution acétonique qui contient l'eau liée aux organes et le plasma adhérant, on élimine l'acétone par évaporation dans le vide de la trompe à eau. On extrait plusieurs fois le résidu.aqueux avec de l'éther. Après évaporation de l'éther, il reste 4,3 parties en poids d'extrait. On traite cet extrait comme on a trai- té l'extrait du plasma à l'éther acétique. On effectue tout d'abord une répar- tition répétée entre l'heptane et le méthanol.
Les fractions méthanoliques sont de nouveau acétyléés dans la pyridine avec de l'anhydride acétique, puis le mé- lange d'acétylation, après élimination complète de la pyridine et de l'excès
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d'anhydride acetique, est séparé en ses composants par chromatographie à un gl de silice. Par saporificaton des éluats obtenus au moyen d'éther et d'éther acé- tique et par cristallisation, on obtient le même composé que celui qu'on a obtenu par traitement de l'extrait de plasma.
Exemple 2.
On homogénéise pendant 5 minutes 159 parties en poids de glandes surrénales de bovins finement coupées, dans un appareil approprié, avec 900 par- ties en volume d'une solution aqueuse contenant 6,4 parties en poids de fumarate de sodium, 36 parties en poids de glucose, 7,24 parties en poids de chlorure de sodium, 3,72 parties en poids de chlorure de potassium, 7,14 parties en poids de phosphate de sodium secondaire et 1,98 parties en poids de sulfate de magné- sium. A cette purée, on ajoute 1 partie en poids de désoxycorticostérone, puis homogénéise encore deux minutes au plus grand nombre de tours possible. On amène le pH de la bouillie à 6,62, en ajoutant 20 parties en volume d'une solution 1 n d'acide chlorhydrique (détermination du pH au moyen d'une électrode de verre) puis on homogénéise encore pendant 2 minutes.
On introduit le mélange réaction- nel dans un récipient muni d'un agitateur, en rinçant avec 100 parties en volume d'eau. Le pH de l'émulsion est amené à 6,62 au moyen de 20 parties en volume d'une solution 1 n d'acide chlorhydrique (détermination du pH au moyen d'une électrode de verre). On maintient le mélange réactionnel à 37 , puis introduit, en 2 1/2 heures, en remuant constamment, 150 parties en volume d'une solution à 15% d'eau oxygénée. On introduit encore, pendant l'heure suivante, 15 parties en volume d'aune solution à 30% d'eau oxygénée.
Lorsque.le dégagement d'oxygène diminue, on'ajoute au bout de chaque heure 0,05 partie en poids d'une préparation de ca talase du commerce, de façon qu'au bout de 4 heures l'eau oxygénée qui pour- rait encore être présente, soit sûrement détruite. A la solution maintenue en réaction pendant 4 heures au total, on ajoute 30 parties en volume d'une solu- tion 1 n d'acide chlorhydrique; le pH du mélange contenant un fort précipité d'albumine, est alors de 5,10. On ajoute au mélange réactionnel 800 parties en volume d'éther acétique et remue soigneusement pendant 1 heure à 37 . On centrifuge le mélange.
La couche d'éther acétique surnageante est prélevée et la phase aqueuse et le précipité sont de nouveau traités pendant la nuit de la même manière avec 500 parties en volume d'éther acétique. On effectue cette extraction encore 3. fois, chaque fois pendant 2 heures, jusqu'à ce que la couche d'éther acétique soit incolore. Les solutions d'éther acétique réu- nies sont séchées sur du sulfate de sodium anhydre et la solution filtrée est évaporée à sec dans le vide. On reprend le produit semi-solide restant dans du méthanol saturé d'heptane, et répartit en 6 opérations entre un mélange com- portant chaque fois 400 parties en volume d'heptane et 400 parties en volume de méthanol. Les solutions méthanoliques des opérations 1 - 5 sont réunies; on évapore le méthanol et obtient 5,82 parties en poids d'une masse semi-solide brun-jaune.
L'analyse chromatographique sur papier de cet extrait brut montrer qu'à côté de désoxycorticostérone non-transformée il contient aussi de la corti- costéroneo Pour isoler ce produit d'oxydation, l'extrait brut est chromatogra- phié de manière commue à un gel de silice. Les éluats obtenus au moyen d'éther et de chloroforme contiennent la désoxycorticostérone et les éluats au moyen de chloroforme-éther acétique et d'éther acétique, contiennent la corticostérone facilement identifiable à la réaction à l'acide sulfurique (fluorescence jaune- verdâtre). Cette fraction contenant la corticostérone est acétylée dans de la pyridine avec de 1?anhydride acétique, puis, après recristallisation au moyen d'acétone et d'éther, on obtient l'acétate de corticostérone fondant à 143 - 149 .
On saponifie cet acétate au moyen de bicarbonate de potassium et obtient enfin, par recristallisation, la corticostérone fondant à 179 - 182 , de pouvoir rotatoire spécifique [##D = 223 (dans l'alcool), en cristaux fins.
Exemple 3.
On homogénéise, pendant 5 minutes, 113 parties en poids de glandes surrénales'de bovins, finement coupées, dans un homogénéiseur, avec 250 parties en volume d'une solution aqueuse contenant 0,574 partie en poids d'acide fuma- rique, 4,5 parties en poids de glucose, 0,91 partie en poids de chlorure de so- dium, 0,4 partie en poids' de chlorure de potassium, 0,91 partie en poids de phos- phate de sodium 'Secondaire, 0,25 partie en poids de sulfate de magnésium et 25
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parties en vol me d'une solution 0,1 n d'hydroxyde de sodium. A cette purée, on ajoute 1 partie en .poids de désoxycorticostérone et homogénéise encore 2 minutes.
Le pH de cette émulsion est égalgà 6,780 On l'introduit dans un ré- cipient muni d'un agitateur et d'un tube d'introduction de gaz, en rinçant l'ho- @ogénéiseur avec 50 parties d'eau. On traite ce mélange pendant 5 heuresà 37 en introduisant de l'oxygène et en remuanto On introduit ensuite le liquide réactionnel dans 1500 parties en volume d'acétone, en rinçant 2 fois avec chaque fois 200 parties en volume d'acétone. On sépare par filtration le préci- pité qui se trouve dans les solutions acétoniques réunies. On lave trois fois le résidu avec chaque fois 200 parties en volume d'acétone chaud. 'On libère de l'acétone les solutions acétoniques réunies, par évaporation dans le vide de la trompe à eau.
La solution aqueuse restante est introduite dans un réci- pient d'extraction, ainsi que le précipité et l'huile qui se sont séparés lors de l'élimination de l'acétone, dans un récipient d'extraction, en rinçant avec 400 parties en volume de chloroforme. On effectue l'extraction de la couche aqueuse 4 fois avec chaque fois 400 parties en volume de chloroforme,., Les der- niers extraits au moyen de chloroforme sont pour ainsi dire incolores, tandis que les deux premiers sont très fortement colores en brun "?--j aune. On réunit les extraits chloroformiques, sèche sur du sulfate de'sodium anhydre et évapore la solution filtrée à sec, dans le video Il reste 14,5 parties en poids d'un produit brun foncé.
L'analyse chromatographique de ce produit.sur--papier mon- tre qu'à côté de désoxycorticostérone inchangée, il contient le composé oxydé en position 11, la corticostérone. On dissout'l'extrait brut dans 250 parties en volume d'éther et extrait cette solution plusieurs fois avec choque fois 200 parties en volume d'une solution saturée de bicarbonate de sodium. A la solution éthérée claire, jaune., on ajoute immédiatement 50 parties en volume d'une solution 0,1 n d'acide chlorhydrique et la lave deux fois, chaque fois avec 50 parties d'eau. Les émulsions ainsi obtenues sont rompues par addi- tion de 5 parties en volume de méthanol et la couche éthérée est évaporée à sec. Le résidu sec, 4,2 parties en poids, est une masse brun-Jaune.
On chromatographie ce produit de manière connue à un gel de silice. Les éluats obtenus au moyen d'éther et de chloroforme, sont formés de désoxycorticostérone non-transformée. Les extraits obtenus à partir de chloroforme et d'éther acé- tique contiennent, d'après l'analyse chromatographique sur papier, un mélange de désoxycorticostérone et de corticostérone, tandis que les éluats obtenus à partir d'éther acétique contiennent de la corticostérone et un produit de cou- leur jaune. On réunit les fractions contenant de la corticostérone et chroma- tographie encore une fois à un gel de silice. Après recristallisation, on ob- tient la corticostérone fondant à 175 o On acétyle de produit comme on l'a in- diqué à l'exemple 2, purifie le produit d'acétylation en le recristallisant plia- sieurs fois.
Les cristaux obtenus fondent à 140 - 146 ; leur pouvoir rotatoire spécifique [#]D = 219 (dans l'alcool); ils donnent la réaction de coloration connue avec l'acide sulfurique concentré. L'analyse chromatographique sur papier montre que ce produit est de l'acétate de corticostérone.
Exemple 4.
On transforme en purée homogène 53 parties en poids de glandes sur- rénales de bovins fraîchement abattus, finement coupées, dans un homogénéiseur approprié, pendant 3 minutes, avec 100 parties en volume d'une solution aqueuse contenant 0,232 partie en poids d'acide fumarique, 1,8 partie en poids de glycol, 0,362 partie en poids de chlorure de sodium, 0,186 partie en poids de chlorure de potassium, 0,356 partie en poids de phosphate de sodium secondaire, 0,099 partie en poids de sulfate de magnésium, le pH de cette solution étant amené à 7,28 par addition de 4 parties en volume d'une solution 2 n d'hydroxyde de sodium.
Après homogénéisation, le pH de la purée est de 6,73; on l'amène au pH 7,22 en ajoutant 0,5 partie en volume d'une solution 2 n d'hydroxyde de so- dium. A ce mélange on ajoute 2D parties en volume de propylène-glycol, homogé- néise une minute et ajoute 25 parties en volume de propylène-glycol contenant en solution 0,1 partie en poids de substance S (#4-3,20-dicéto-17#,21-dioxy-pré- gnène), rince avec 5 parties en volume de propylène-glycol et mélange encore pendant-1 1/2 minute. On introduit cette émulsion dans un récipient muni d'un agitateur et d'un tube pour l'introduction de gaz, puis on introduit de l'oxy-
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gène, en remuant, au thermostat à 37 .
Pour éviter une écume trop forte, on peut ralentir l'introduction d'oxygène ou ajouter quelques gouttes d'octanol.
Au bout de 30 minutes, le pH est de 7,27 et au bout de 3 heures de 7,20. En ajoutant 12 parties en volume d'une solution 1 n d'acide chlorhydrique, le pH est amené à 3,75; il se produit alors un fort précipité d'albumine et la co- loration de la solution qui était jusqu'alors brun-rouge, passe au brun-gris.
On introduit le mélange réactionnel dans 2000 parties en volume d'acétone et lave le récipient 3 fois avec chaque fois 5 parties en volume d'a- cétone. On abandonne les solutions acétoniques réunies à elles-mêmes, pendant 15 heures, à température ordinaire. On sépare le précipité formé, de la solu- tion jaune, par filtration, et lave le produit solide 3 fois, chaque fois avec 100 parties en volume d'acétone chaude. On évapore complètement l'acétone, dans le vide, des solutions acétoniques réunies. La solution aqueuse restante ainsi que le précipité et le produit huileux qui se sont séparés pendant la concentration, sont transférés dans un récipient d'extraction, avec 200 parties en volume d'éther acétique.
On sature la phase aqueuse de sel de .cuisine (25 parties en poids) et extrait 4 fois, en employant chaque fois 100 parties en volume d'éther acétiqueo On lave deux fois les solutions dans l'éther acétique réunies avec chaque fois 60 parties d'eau et les secoue deux fois avec chaque fois 40 parties en volume d'une solution saturée de bicarbonate de sodium. On- réunit les eaux de lavage et les solutions de bicarbonate et extrait avec 100 parties en volume d'éther acétique. Les solutions dans l'éther acétique réunies sont lavées avec 50 parties en volume d'eau, puis 50 parties en volume d'une solution 0,01 n d'acide chlorhydrique et 2 fois avec chaque fois 50 parties d'eau.
La solution dans l'éther acétique, jaune-orangé, est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, filtrée et évaporée à sec dans le vide. Il reste 3,4 parties en poids d'un extrait brun-foncé, bouillie cristalline visqueuse.
L'analyse chromatographique sur papier de cet extrait brut montre, à côté de substance S inchangée, la substance F (#4-3,20-dicéto-11ss,17#,21-trio- xyprégnène). On dissout la bouillie cristalline brun foncé dans 10 parties en volume d'une solution de 50 parties en volume de benzène et de 50 parties en volume d'éther,chromatographie de manière connue à un gel de'silice, puis élue avec de l'éther, des mélanges d'éther et de chloroforme,dû chloheformé, des mélanges de et de méthanol. d'éther acétique et de méthanol. @ que A partir des éluats de chloroforme, il cristallise, après évapora- tion,de la substance S inchangée et l'on obtient la substance F à partirrdes éluats dans l'éther acétique et dans les mélanges d'éther acétique et de métha- nol.
Par recristallisations répétées au moyen d'un mélange d'éther-acétone-pen- tane, puis d'éther-acétone, on sépare, des fractions de l'élution avec l'éther acétique, une faible quantité d'une huile jaunâtre qui rend la cristallisation difficile. Le produit cristallisé, homogène à l'analyse chromatographique sur papier, fond à 200 - 210 ; un mélange de ce produit avec la substance F suffi- samment pure pour l'analyse, ne montre pas d'abaissement du point de fusion.
On peut aussi identifier ces cristaux, par la réaction colorée qu'ils donnent avec l'acide sulfurique concentré, comme étant la substance F ; le pouvoir rota- toire spécifique de ce produit est [#] D = + 1560 (dans l'alcool) . Les éluats obtenus au moyen de chloroforme et d'éther acétique, qui contiennent encore de la substance S à côté de la substance F, sont séparés en leurs composants par une nouvelle séparation chromatographique à un gel de silice. Les autres éluats de la chromatographie au gel de silice, qui contiennent un mélange de substance F et de substance S, sont réunis aux eaux-mères de la cristallisation ci-dessus et acétylés de manière connue avec de l'anhydride acétique dans la pyridine.
Les produits d'acétylation sont chromatographiés à un gel de silice et on obtient les acétates à l'état cristallin, après évaporation de l'agent d'élution. Les cristaux donnant une fluorescence jaune-vert par dissolution dans l'acide sul- furique concentré, sont formés d'acétate de substance F pur. Ils fondent à 218- 225 et possèdent un pouvoir rotatoire spécifique, dans le dioxane, de [#]D = + 1670.
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Exemples 5 31. - Exemples 5 = 24 : On effectue exactement comme on l'a décrit en détail à l'exem- ple 4, la réaction et la séparation du mélange réactionnel, en employant les substrats mentionnés à ces exemples-ci (voir tableau). Comme organe contenant l'enzyme, on emploie des glandes surrénales de bovins, et comme produit initial pour l'oxydation, chaque fois 0,1 partie en poids de substance S (A4-3,20-dicéto-
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1?a,21dioxy prégnéne)o Si cela est nécessaire, le pH du mélange réactionnel est ramené, au bout d'un temps déterminé, au pH du mélange de réaction initial, par addition d'une solution 2 n d'hydroxyde de sodium, ou d'une solution 2 n d'acide chlorhydrique.
Comme agent favorisant la dissolution, on.ajoute chaque fois 50 parties en volume de propylène-glycol comme on l'a indique à l'exemple 4. Dans ces exemples, le dissolvant employé est chaque fois 100 parties en vo- lume d'une solution aqueuse qui, à côté du substrat, contient encore : 1,8 par- tie en poids de glucose, 0,362 partie en poids de chlorure de sodium, 0,356 par- tie en poids de phosphate de sodium secondaire, 0,099 partie en poids de sulfa- te de magnésium et une quantité suffisante d'hydroxyde de sodium pour ramener . la solution à un pH de 7,5.
On fait passer continuellement de l'oxygène pendant la réactiono Exemple 25 La suite des réactions et le procédé de séparation du mélange réac- tionnel a lieu de manière analogue à celle décrite dans les exemples 4-24, en employant dans ce cas-ci comme agent facilitant la dissolution, 50 parties en volume d'éthylène-glycol au lieu de propylène-glycol.
Exemples 26 = 1 g On opère comme on l'a indiqué aux exemples 4 - 25, en renon- gant toutefois dans ces exemples-ci à l'emploi d'un agent facilitant la disso- lution, mais par contre en employant 150 parties en volume de la solution de sel contenant du glucose comme dissolvant, au lieu de 100 parties en volume seulement. On ajoute chaque fois 0,1 partie en poids de la substance S à oxyder
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(A 3,2dicétoL7ac,21mdioxyprégnêne) sous forme de poudre fine, directement à la purée, puis on mélange le tout encore 3 minutes. On fait ensuite réagir, comme on 1'a indiqué en détail à l'exemple 4, en introduisant de l'oxygène, et isole le produit réactionnel du mélange de réaction d'une manière analogue à celle indiquée dans cet exemple.
On obtient enfin la substance F cherchée (#4-
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3,20mdicétom119 170e-21-dioxy-prégnène) à l'état cristallin et l'idenfie par chromatographie sur papier. Le tableau suivant donne en résumé les caractéris- tiques opératoires des exemples 5 - 310
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Oxydation de substance S en substance F
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Exemples 5 = 31 =======================================
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<tb> Exemple <SEP> Substrat <SEP> Parties <SEP> Parties <SEP> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> réactionnelle:
<tb>
<tb> N <SEP> en <SEP> poids <SEP> en <SEP> poids <SEP> début <SEP> au <SEP> bout <SEP> aug- <SEP> Temps <SEP> de <SEP> Extrait <SEP> à
<tb>
<tb> Glande <SEP> de <SEP> 30 <SEP> menté <SEP> fin <SEP> réaction <SEP> l'éther
<tb>
<tb> surréna- <SEP> minutes <SEP> à <SEP> total <SEP> acétique,
<tb>
<tb> le <SEP> heures <SEP> parties <SEP> en
<tb>
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¯¯¯####¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯- poids
EMI8.4
<tb> 5 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> citrique <SEP> 0,420 <SEP> 47 <SEP> 6,58 <SEP> 6,81 <SEP> 6,85 <SEP> 7,00 <SEP> 3 <SEP> 2,23
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> succinique <SEP> 0,236 <SEP> 51 <SEP> 6,58 <SEP> 6,90 <SEP> - <SEP> 6,71 <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> 7,11
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 6,57 <SEP> 6,58 <SEP> - <SEP> 6,55 <SEP> 4 <SEP> 1/2 <SEP> 1,
43
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,02 <SEP> 7,10 <SEP> - <SEP> 7,08 <SEP> 3 <SEP> 3,11
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,45 <SEP> 7,45 <SEP> 7,50 <SEP> 7,41 <SEP> 3 <SEP> 3,51
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,98 <SEP> 7,70 <SEP> 7,99 <SEP> 7,85 <SEP> 3 <SEP> 1,95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> d,l-malique <SEP> 0,356 <SEP> 51 <SEP> 6,50 <SEP> 6,52 <SEP> - <SEP> 6,57 <SEP> 4 <SEP> 1/2 <SEP> 1,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> malonique <SEP> 0,208 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,20 <SEP> - <SEP> 7,10 <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 1,
88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glutarique <SEP> 0,264 <SEP> 50 <SEP> 7,04 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,09 <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 1,91
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> adipique <SEP> 0,292 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,15 <SEP> - <SEP> 7,05 <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 1,80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'l-glutamique <SEP> 0,584 <SEP> 54 <SEP> 7,14 <SEP> 7,01 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 3 <SEP> 2,71
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 16 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d-glutamique <SEP> 0,584 <SEP> 35 <SEP> 7,28 <SEP> 7,12 <SEP> 7,18 <SEP> 7,18 <SEP> 2,1/2 <SEP> 2,27
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 17 <SEP> acide
<tb>
EMI8.5
d,1-aspartique 0,532 54 7,18 7,05 - 6,90 3 2,39
EMI8.6
<tb> 18 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> d,1-asparagine <SEP> 0,528 <SEP> 54 <SEP> 7,22 <SEP> 7,
11 <SEP> - <SEP> 6,95 <SEP> 3 <SEP> 2,90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> d'l-alanine <SEP> 0,356 <SEP> 54 <SEP> 6,92 <SEP> 6,58 <SEP> 7,09 <SEP> 6,99 <SEP> 3 <SEP> 1,92
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> lactique <SEP> 0,180 <SEP> 50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,12 <SEP> - <SEP> 7,01 <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 2,29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> dioxytartrique <SEP> 0,364 <SEP> 51 <SEP> 7,04 <SEP> 7,02 <SEP> - <SEP> 6,96 <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 1,90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 22 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1-ascorbique <SEP> 0,352 <SEP> 50 <SEP> 7,03 <SEP> 7,06 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> 2,55
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 23 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> pyruvique <SEP> 0,166 <SEP> 47 <SEP> 6,49 <SEP> 6, <SEP> 69 <SEP> - <SEP> 6,63 <SEP> 3 <SEP> 2,
13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 24 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> pyruvique <SEP> 0,166 <SEP> 50 <SEP> 7,37 <SEP> 7,15 <SEP> 7,20 <SEP> 7,10 <SEP> 3 <SEP> 3,15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> 7,29 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 7,11 <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> 2,53
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb> Exemple <SEP> Substrat <SEP> Parties <SEP> Parties <SEP> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> réactionnelle:
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> en <SEP> poids <SEP> en <SEP> poids <SEP> début <SEP> au <SEP> bout <SEP> aug- <SEP> Temps <SEP> de <SEP> Extrait <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb> Glande <SEP> de <SEP> 30 <SEP> menté <SEP> fin <SEP> réaction <SEP> l'éther
<tb>
<tb>
<tb> surréna- <SEP> minutes <SEP> à <SEP> total <SEP> acétiques
<tb>
<tb> le <SEP> heures <SEP> parties <SEP> en
<tb>
<tb> poids
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 26 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> cis-aconitrique <SEP> 0,348 <SEP> 47,5 <SEP> 7,38 <SEP> 7,13 <SEP> 7,46 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 1',30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 27 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> #-cétoglutarique <SEP> 0,292 <SEP> 47,5 <SEP> 7,48 <SEP> 7, <SEP> 28 <SEP> 7,45 <SEP> 7,27 <SEP> 3 <SEP> 1,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 28 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycocolle <SEP> 0,124 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,18 <SEP> 7,52 <SEP> 7, <SEP> 25 <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> 1,
<SEP> 29 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 29 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> d'l-sérine <SEP> 0,210 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,05 <SEP> 7,42 <SEP> 7,28 <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> 1,97
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 30acide
<tb>
<tb>
<tb> 1-tryptophane <SEP> 0,408 <SEP> 41 <SEP> 7,50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> '2 <SEP> 0,74
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb> 1-tyrosine <SEP> 0,362 <SEP> 41 <SEP> 7, <SEP> 62 <SEP> 7, <SEP> 23 <SEP> 7, <SEP> 60 <SEP> 7,35 <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 27 <SEP>
<tb>
Exemples 32 - 35.
En opérant sans cela de la même manière que dans les exemples 4 - 31, on emploie chaque fois, dans les exemples 32 - 35, 50 partiesren volume de propylène-glycol comme agent favorisant la dissolution, chaque fois 100 parties en volume de solution de sel exempt de glucose comme dissolvante en modifiant le temps réactionnel comme il est indiqué au tableau suivant des conditions réactionnelles.
On peut obtenir aussi ainsi la substance F (#4-3,20-dicéto- 11ss, 17#,21-trioxy-prégnène), à l'état cristallin., à partir de substance S (#4-3,20-dicéto-17#,21-dioxy-prégnène). Après une cristallisation de l'éluat obtenu au moyen d'éther acétique, du produit d'extraction brut chromatographié à un gel de silice, le point de fusion du produit obtenu est de 185 - 200 .
L'analyse chromatographique sur papier et la réaction de coloration avec l'acide sulfurique concentré prouvent l'identité de cette fraction cristalline avec la substance F.
<Desc/Clms Page number 10>
Oxydation de substance S en substance F
EMI10.1
Exemples 32 = 35 ---------------------------------------
EMI10.2
<tb> Exemple <SEP> Substrat <SEP> Partie <SEP> Glan- <SEP> Dissolvants <SEP> Parties <SEP> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> réactionnelle:
<tb>
<tb> N <SEP> en <SEP> des <SEP> comme <SEP> en <SEP> début <SEP> au <SEP> bout <SEP> fin <SEP> temps <SEP> Extrait
<tb>
<tb> poids <SEP> surré- <SEP> aux <SEP> exemples <SEP> volume <SEP> de <SEP> deré- <SEP> à <SEP> l'é-
<tb>
<tb> nales <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 31 <SEP> 30 <SEP> minu- <SEP> action <SEP> ther <SEP> a-
<tb>
<tb> Parties <SEP> cependant <SEP> :
<SEP> tes <SEP> total <SEP> cétique:
<tb>
<tb> en <SEP> en <SEP> parties
<tb>
<tb> poids <SEP> heures <SEP> en
<tb>
<tb> poids
<tb>
<tb> 32 <SEP> acide
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0232 <SEP> 51 <SEP> sans <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 4 <SEP> 1/2 <SEP> 1,49
<tb>
EMI10.3
-,3 id. - 0,232 53 If 11 100 7,35 7,25 7,48 2 1/2 3,14
EMI10.4
<tb> 34 <SEP> id. <SEP> 0,232 <SEP> 34 <SEP> " <SEP> " <SEP> 100 <SEP> 7,32 <SEP> 7,54 <SEP> 7,54 <SEP> 1 <SEP> 1,99
<tb>
<tb>
<tb> 35 <SEP> id. <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> /sans <SEP> glucosej <SEP> 100 <SEP> 7,38 <SEP> 7,56 <SEP> 7,49 <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> 3,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sans <SEP> MgSO <SEP> 4
<tb>
Exemple 36.
On homogénéise pendant 3 minutes 121 parties en poids de foie de veau fraichement abattu, coupé en morceaux, avec 100 parties en volume d'une solution aqueuse contenant 0,232 partie en poids d'acide fumarique, 1,8 partie en poids de glucose, 0,362 partie en poids de chlorure de sodium, 0,186 partie en poids de chlorure de potassium, 0,356 partie en poids de phosphate de sodium secondaire, 0,099 partie en poids de sulfate de magnésium, cette solution étant amenée à un pH de 7,42 avec 1,2 partie en volume d'une solution 2 n d'hydroxyde de sodium. Après homogénéisation, l'homogénéisat dont le pH est à 6,74 est ame- né à un pH de 7,42, par addition de 1,2 partie en volume d'une solution 2 n d'hy- droxyde de sodium.
A ce mélange, on ajoute 0,1 partie en poids de substance
EMI10.5
S (d 3,20mdicéto17a,21mdioxyprégnéne) et on homogénéise encore 2 minutes.
On introduit cette émulsion dans un récipient muni d'un agitateur et d'un tube pour l'introduction de gaz, puis on fait passer de l'oxygène en remuant, dans un thermostat, à 37 . Pour éviter qu'il ne se forme trop d'écume, on règle la rapidité de l'introduction de l'oxygène, au on ajoute quelques gouttes d'octanol.
Au bout de 30 minutes, le pH est à 7,la, On l'amène à 7,27 en ajoutant 0, 2 par- tie en volume d'une solution 2 n d'hydroxyde de sodium; au bout de 120 minutes, on ajoute 0,2 partie en volume d'une solution 2 n d'hydroxyde de sodium pour amener le pH de 7,12 à 7,26. Au bout de 3 heures le pH est à 7,20. On ajoute 30 parties en volume d'une solution 1 n d'acide chlorhydrique pour faire passer le pH à 3,30; il se produit alors une forte précipitation d'albumine et un chan- gement de coloration de la solution jusqu'alors brune, qui devient brun-gris.
On introduit le mélange réactionnel dans 3000 parties en volume d'acétone et rince le récipient 3 fois avec chaque fois 250 parties en volume d'acétone. On abandonne les solutions acétoniques réunies pendant 15 heures à température ordinaire. Le précipité est séparé en essorant la solution jaune et le produit solide est lavé 3 fois avec chaque fois 250 parties en volume d'a- cétone chaudo On débarrasse complètement de l'acétone, les solutions acétoniques réunies, en les traitant dans le vide.
La solution aqueuse qui reste, ainsi que le précipité et le produit huileux qui se sont séparés pendant l'évaporation, sont transférés dans un récipient d'extraction avec 300 parties en volume d'é- ther acétiqueo On sature la phase aqueuse avec du chlorure de sodium (25 parties en poids), et on l'extrait 4 fois, avec chaque fois 100 parties en volume d'éther acétiqueo On lave 2 fois les solutions dans l'éther acétique, en employant cha- que fois 60 parties d'eau, puis on les secoue 4 fois avec chaque fois 50 parties -en volume d'une solution saturée de bicarbonate de sodium.
On réunit l'eau de lavage et les solutions de bicarbonate et extrait avec 100 parties en volume d'éther acétiqueo On lave les solutions dans l'éther acétique réunies avec 50 parties en volume d'eau, puis avec 50 parties en volume d'une solution 0,1 n
<Desc/Clms Page number 11>
diacide chlorhydrique et enfin encore 3 fois, chaque fois avec 50 parties d'eau La solution jaune-orange dans l'éther acétique est séchée sur du sulfate de so- dium anhydre, filtrée et évaporée à sec dans le vide. Le résidu de cette solu- tiony 3,03 parties en poids, est une masse gélatineuse brun-clair, de laquelle se séparent des cristaux pendant la nuit.
L'analyse chromatographique sur papier de cet extrait brut, montre qu'il contient de la substance F (#4-3,20-dicéto-11ss,11#,21-trioxy-prégnène) à côté de substance S inchangée. On dissout la bouillie cristalline brun-clair dans 10 parties en volume d'une solution de 75 parties en volume de benzène et de 25 parties en volume d'éther et chromatographie à un gel de silice de manière usuelle. On élue avec de l'éther, des mélanges d'éther et de chloroforme, du chloroforme, des mélanges de chloroforme et d'éther acétique, de l'éther acétique, des mélanges d9éther acétique et de méthanol.
Des éluats éther-acétique et éther-acétique-méthanol cristallise la substance F. Par cristallisation répétée au moyen d'un mélange éther-acéto- ne-pentane, puis éther-acétone,on obtient,à partir des fractions d'élution au moyen d'éther acétique, le produit cristallin homogène à la chromatographie sur papier, fondant à 200 - 210 . Ces cristaux peuvent être identifiés par la réaction de coloration avec de l'acide sulfurique concentré comme.étant de la substance F (#4-3,20-dicéto- 11ss, 17#, 21-trioxy-prégnène), de pouvoir rotatoire spécifique[#]D = + 156 (dans l'alcool).
Les éluats de la chromatographie sur gel de silice dans lesquels la substance F et la substance S se trouvent en mé- lange, sont réunis avec les eaux-mères de la cristallisation ci-dessus et acé- tylés de manière connue avec de l'anhydride acétique dans la pyridine. On chro- matographie les produits d'acétylation à un gel de silice et obtient les acéta- tes à l'état cristallin,après évaporation de l'agent d'élution. Les cristaux à fluorescence jaune-vert dans l'acide sulfurique concentré fondent à 218 - 225 et présentent dans le dioxane le pouvoir rotatoire spécifique[#]D = + 167 .
Ces cristaux sont donc l'acétate de la substance F.
Exemples 37 - 42.
On opère de manière analogue à celle décrite en détail à l'exemple 36, avec les substrats mentionnés au tableau ci-dessus ; pour l'exemple 37, on emploie 100 parties en volume et pour les exemples 38 - 42, chaque fois 150 par- ties en volume de la solution de sel contenant du glucose, comme dissolvant.
De cette manière également, on réussit à introduire de l'oxygène à la position 11 de la substance S (#4-3,20-dicéto-17#,21-dioxy-prégnène). En isolant le produit de la réaction comme on l'a indiqué à l'exemple 36, on obtient la sub- stance F (#4-3,20-dicéto-11ss, 17#,21-trioxy-prégnène) fondant à 200 - 210 .
On identifie les cristaux par analyse chromatographique sur papier et par la réaction de coloration avec l'acide sulfurique concentré; dans l'éthanol la solution de ces cristaux présente un pouvoir rotatoire spécifique[#]D = + 156 .
Exemple 37 : On homogénéise ici, comme à l'exemple 36, 121 parties en poids de foie de veau.
Exemples38 - 40 : Comme organes contenant l'enzyme, on emploie dans ces exem- ples chaque fois 55 parties en poids de foie de lapin et on opère d'une manière analogue à celle décrite à l'exemple 360 Exemples 41 et 42 : Comme source d'enzyme, on emploie chaque fois 83 parties en poids de rein de veau, au lieu de foie, en opérant sans cela comme on l'a indiqué à 1?exemple 36.
Les autres conditions de ces exemples 37 - 42 sont résumées an tableau suivant @
<Desc/Clms Page number 12>
Oxydation de substance S en substance F.
Exemples 37 = 42
EMI12.1
<tb> Exemple <SEP> Substrat <SEP> Partie <SEP> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> réactionnelle
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> en <SEP> début <SEP> après <SEP> après <SEP> élevé <SEP> après <SEP> élevé <SEP> fin <SEP> Temps <SEP> Extrait
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> poids <SEP> 20 <SEP> 40 <SEP> à <SEP> 70 <SEP> à <SEP> deré- <SEP> à <SEP> l'é-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> minutes <SEP> minutes <SEP> minutes <SEP> action <SEP> ther,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> total <SEP> parties
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> en <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> heures <SEP> poids
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 37 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> citrique <SEP> 0,420 <SEP> 7,42 <SEP> 7,17 <SEP> 7,15 <SEP> 7,28 <SEP> 7,19 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 2,
05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3@ <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 7,45 <SEP> 7,32 <SEP> 7,25 <SEP> 7,40 <SEP> 7,33 <SEP> 7,62 <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 1,47
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 39 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ascorbique <SEP> 0,352 <SEP> 7,47 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 7,37 <SEP> 7,32 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 3 <SEP> 1,64
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 40 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d,l-glutami- <SEP> 0,584 <SEP> 7,44 <SEP> 7,33 <SEP> 7,23 <SEP> '7,38 <SEP> 7,33 <SEP> 7,56 <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 65 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> que
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 41 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumarique <SEP> 0,232 <SEP> 7,30 <SEP> 7,13 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,16 <SEP> - <SEP> 7,14 <SEP> 3 <SEP> 3,
18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 42 <SEP> acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> citrique <SEP> 0,420 <SEP> 7,39 <SEP> 7,31 <SEP> 7,38 <SEP> ' <SEP> -- <SEP> 7,39 <SEP> - <SEP> 7,31 <SEP> 3 <SEP> 3,21
<tb>
Revendications;
1) Un procédé pour l'introduction d'oxygène dans les stéroides, caractérisé par le fait qu'on traire des stéroides non substituées dans le noyau C par de l'oxygène ou des agents pouvant donner de l'oxygène, en présence d'en- zymes et de leurs substrats correspondants et qu'on isole les ll-oxystéroides.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.