Verfahren zur Oxydation von Steroiden. t legenstand der vörliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Oxydation von Steroiden.
1:s ist bereits bekannt, auf biologischem Wege in in 11- und 12-Stellung unsubsti- tuierte Steroide direkt eine Oxygruppe in 11- Stellung einzuführen mittels Perfusion durch überlebende Nebennieren. Für eine technische Durchführung kommt jedoch dieses Verfahren kaum in Frage.
Es wurde nun gefunden, dass man in ein- faeher Weise in 11- und 12-Stellung unsub- stituierte Steroide in die entsprechenden 11- Oxy-steroide überführen kann, wenn man sie in Ge-enwart von Enzymen mit Sauerstoff behandelt. und die gebildeten 11-Oxy-steroide isoliert.
Man kann von gesättigten oder zum Bei- -;piel von in 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11-, 16- und/oder 1.7-Stellung Doppelbindungen auf weisenden Steroiden ausgehen.
Insbesondere kommen Steroide der Androstan-, Pregnan.-, Sterin- oder Sapogeninreihe in Betracht, die zum Beispiel in 3-, 14-, 16-, 17-, 20- und 21- Stellung substituiert sind, beispielsweise durch freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen, wie durch Aeyloxy-, zum Beispiel Acetoxy-, Propionyloxy-,
Ben- zoyloxy- oder Tosyloxygruppen, durch Alk oxy-, zum Beispiel Methoxy- oder -Lithoxy- gruppen, durch enolisierte oder acetalisierte Oxogruppen, durch freie oder funktionell ab gewandelte Carboxyl-, wie Nitril- oder ver esterte Carboxylgruppen, durch Epoxygrup- pen oder durch Halogenatome.
Die Aus- gangsstoffe können von beliebiger sterischer Konfiguration sein. Besonders wertvoll sind zum Beispiel 44-3,20-Diketo-21-oxy-pregnene, d4-3,20 - Diketo-17,21-dioxy - pregnene, 3f,5a- oder -5fü=Androsterone bzw.
ihre Ester und Äther, Cholesterin oder Diosgenin. Falls er forderlich, werden in den Steroiden vorhan dene Doppelbindungen während der Oxyda tion in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Absättigung mit Halogenwasserstoff oder durch Überführung in pentacyclische Iso- steroide, intermediär geschützt.
Zur Behandlung mit Sauerstoff wird zum Beispiel Sauerstoff über oder durch das Re aktionsgemisch geleitet. An Stelle des Sauer stoffes können auch :Sauerstoff abgebende Mit tel verwendet werden, zum Beispiel Was serstoffsuperoxyd oder Wasserstoffsuperoxyd bildende Verbindungen, zum Beispiel in Ge genwart von Katalase.
Die Enzyme werden besonders in Form von Organpräparaten, wie zerkleinerten Or ganen, Organschnitten, Organhomogenisaten von enzymreichen Organen, beispielsweise von Nebennieren, Nieren oder Lebern oder Mi schungen derselben, verwendet.
Die Enzyme sind natürlich durch Zugabe geeigneter Substrate und Innehaltung entspre chender ylilieubedingungen funktionstüchtig zu erhalten. Als Substrate kommen insbeson dere diejenigen des von D. E. Green (Journal, of Biological Chemistry, Vol. <B>172,</B> Seite 389 [1948]) als Cyelophorase-System bezeich neten Enzymsystems und bzw. oder beim Kohlehy dratstoffwechsel entstehende Säuren des Krebssehen Zitronensä.urezyklus (vgl. zum Beispiel R.
Ammon und W. Dirsclrerl Fermente, Hormone, Vitamine, 1918, S. 173) oder unter den Reaktionsbedinb xngen in solche überführbare Verbindungen in Anwendung, zum Beispiel Zitronensäure, Aeonitsäure, Iso- ztronensäure, Oxalbernsteinsä.ure, a-Ketoglu- tarsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Äpfel- säure, Brenztraubensäure,
Oxalessigsäure, aber auch hlalonsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Asparagin, Alanin, Glvkokoll, Serin, ferner Ascorbin säure, Milchsäure, Dioxy weinsäure, Prolin, Tyrosin, Tryptophan bzw. Gemische der selben.
Zur Innehaltung entsprechender Milieu bedingungen arbeitet man am besten in wäs serigem Medium, dem vorteilhaft Bestand teile physiologischer Lösungen, wie Kohle hydrate, anorganische und bzw. oder orga nische Salze, beispielsweise Natriumphosphat, Alkalichloride, 1llagnesirxmsulfat oder Na- triLxmacetat zugefügt, werden. Mit den Salz zusätzen sollen insbesondere das pH und die Jonenstärke der Reaktionslösung während der Reaktion im optimalen Bereich gehalten wer den.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei einem pH von 6,5 bis 9,0 und einer Salzkon zentration von 0,5 bis 0,01 molar durch1e- führt. Dementsprechend lässt sich als Reak tionsmedium a.neh eine physiologische Flüssig keit, zum Beispiel Plasma, verwenden. In diesem Fall wird vorteilhaft, ein Konservie- rungsmittel, beispielsweise Penicillin, zuge fügt.
Dem Reaktionsmedium kann man auch Lösungsvermittler, wie Äthy lenglykol, Propy- lenglykol, oder Dispersionsmittel, zum Bei spiel Phospholipoide, zusetzen.
Die Isolierung der 11-Oxy-steroide aus dem Oxydationsgemisch kann, je nach den verwen deten Ausgangsstoffen bzw. Reaktionsmedien, gemäss an sich bekannten Methoden, zum Bei spiel unter Durchführung von Entmischungs- verfahren, Chromatographie, Umkristallisa tion und dergleichen, erfolgen.
In den folgenden Beispielen besteht zwi schen Gewichtsteil und Volumteil die gleiche Beziehung wie zwischen Gramnx und Kubilz- zentimeter. Die Temperaturen sind in Celsius graden angegeben.
<I>Beispiel. 1:</I> Eine Lösung von 1 Gewichtsteil Desoxy- cort-icosterorx in 20 Volumteilen Ä thylenglykol wird zu 980 Volumteilen einer Mischung aus 900 Volumteilen Rinderplasma, welches die dem Cyeloplrorase-Systein angehörenden Ver bindungen enthält und welchem zuvor Zitro nensäure und Penicillin zugesetzt worden war, 80 Volumteilen ith@-lenglykol und 1 Ge- wiclxtsteil Ascorbinsäure gegeben.
Das ZEH die ser Lösung wird mit. 0,1.n-Natronlauge auf das ursprüngliche pH des Citratplasmas vor dem Aseorbinsäurezusatz zurüekgestellt. 900 Vo- lumteile der obigen Mischung werden im Thermostaten auf 37 C erwärmt.
Dazu gibt man 60 Gewiehtsteile friselx hergestellter Ne bennierenschnitten ans Nebennieren von frisch geschlachteten Rindern. überdies werden 60 Gewichtsteile Rindernebennieren in kleine Stücke geschnitten und mit 80 Volumteilen der obigen Desoxvcortieosteron-Plasxnalösung in einem Homogenisator 2 Minuten homo genisiert. Der entstehende Brei wird zu der bereits mit Schnitten versehenen Lösung im Thermostaten gegeben und mit 20 Volumteilen Plasma nachgespült.
Die Mischung hält man 1/2 Stunde unter schwacher Be wegung bei 37 C. Nachdem die Temperatur ausgeglichen ist, werden 100 Volumteile einer wässerigen 1,03prozentigen Wasserstoffsuper- oxydlösung, welche 10% Äthylenglykol ent- hält, innert 2 Stunden zugegeben.
Nach wei teren. 21/2 Stunden wird auf Zimmertempera tur abgekühlt und hierauf das Reaktions gemisch durch einen Tuchfilter abgepresst. Die trübe durchlaufende Lösung wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 2000 Touren geklärt. Den durch Zentrifugieren erhaltenen Rückstand vereixxigt man mit dem Rückstaxrd im Tuchfilter.
Die Plasmalösung und der hauptsächlich aus den Organteilen bestehende Filterrück stand werden einzeln mit organischen Lö sungsmitteln behandelt. Die Plasmalösung wird mit Essigester extrahiert, bis der Essig ester farblos erscheint. Diese Extraktions lösungen werden zur klaren Schichtentrennung bei 2000 Touren 1/2 Stunde zentrifugiert und die Essigesterschichten jeweils abgehebert. Es werden auf diese Weise 3,9 Gewichtsteile Ex trakt gewonnen, welcher durch stufenweise Verteilung zwischen Methanol und Heptan fraktioniert wird.
Die Methanolfraktionen, enthaltend die Steroide, werden nochmals zwi- sehen Heptan und Methanol verteilt und dann in Pyridin mit Aeetanhydrid bei Zimmer temperatur acetyliert. Das so erhaltene Pro dukt zeigt bei der papierchromatographischen Untersuchung ein Gemisch von Desoxycorti- costeron- und Cortieosteron-acetat an.
Zwecks Auftrennung chromatographiert man das Ge misch an Silicagel. Die Benzol-Äther-Eluate enthalten zur Hauptsache unverändertes Des oxveorticosteron. Das Oxydationsprodukt wird dagegen erst mit. Äther-Essigester-Gemischen aus der Chromatogramm-Säule abgelöst.
Nach Verseifung mittels Natriumbicarbonat in wäs- serigalkoholischer Lösung erhält man daraus Kristalle, die bei 179 bis 181 C (nach Sintern) schmelzen, die optische Drehung lall) = -I- 200 (in Alkohol) aufweisen und mit konzentrierter Schwefelsäure die für Corti- eUsteron charakteristische Parbreaktion (grün- (Yelbe Fluoreszenz) zeigen.
Die aus dem Reaktionsgemiseh durch Abtrennen und Zentrifugieren gewonnenen Organriiekstände werden 40 Stunden mit Aceton extrahiert.. Die Acetonlösung, welche das in den Organen und dem anhaftenden Plasma befindliche Wasser enthält, wird im Wasserstrahlvakuum von Aceton befreit. Der wässerige Rückstand wird mit Äther mehr fach ausgeschüttelt. Es werden nach dem Ab dampfen des Äthers 4,3 Gewichtsteile Äther extrakt gewonnen. Dieser wird analog wie der Essigesterextralz-t des Plasmas weiterbehandelt. Zunächst folgt eine stufenweise, wiederholte Verteilung zwischen Heptan und Methanol.
Die Methanolfraktionen werden wieder mit Acetanhydrid in Pyridin acetyliert und das Aeetylierungsgemisch, nach dem vollständigen Entfernen des Pyridins und überschüssigen Acetanhydrids durch Chromatographie an Silicagel getrennt. Durch Verseifung der Äther-Essigester-Eluate und Umkristallisation erhält man dieselbe Verbindung wie bei der Aufarbeitung des Plasmaextraktes.
<I>Beispiel 2:</I> 159 Gewichtsteile feingeschnittener Rinder nebennieren werden in einem Homogenisator mit 900 Volumteilen einer wässerigen Lösung 5 Minuten homogenisiert. Die 900 Volumteile der wässerigen Lösung enthalten 6,4 Gewichts teile Natriumfumarat, 36 Gewichtsteile Glu cose, 7,24 'Gewichtsteile Natriumchlorid, 3,72 Gewichtsteile Kaliumchlorid, 7,14 Gewichts teile sekundäres Natriumphosphat und 1,98 Gewichtsteile Magnesiumsulfat,
Zu diesem Homogenisat gibt man 1 Gewichtsteil Des- oxycorticosteron und homogenisiert nochmals 2 Minuten auf höchster Tourenzahl. Der ent standene Brei wird mit 20 Volumteilen ln Salzsäure auf PH 6,62 gebracht (pH-Bestim- mung mit Glaselektrode) und nochmals 2 Mi nuten homogenisiert. Das Reaktionsgemisch wird in ein mit Rührer versehenes Gefäss ge leert und mit 100 Volumteilen Wasser nach gespült.
Das PH der Emulsion wird mit 20 Vo- lumteilen In-Salzsäure auf 6,62 gebracht (pH- Bestimmung mit Glaselektrode). Das Reak tionsgemisch wird auf 37 C gehalten, und unter ständigem Umrühren werden 150 Vo- lumteile einer 15prozentigen Wasserstoffsuper oxydlösung im Verlaufe von 21/2 Stunden zu gegeben.
Im Verlaufe der nächsten Stunde werden noch 15 Volumteile einer 30prozenti gen Wasserstoffsuperoxydiösung zugetropft. Wenn die Sauerstoffentwicklung nachlässt, werden nach jeder Stunde 0,05 Gewichtsteile eines handelsüblichen Katalasepräparates zu gegeben, um nach 4 Stunden die Zersetzung eventuell noch vorhandenen Wasserstoffsuper oxyds sicherzustellen.
Die Lösung wird nach einer Totalreaktionszeit von 4 Stunden mit 30 Volumteilen ln-Salzsäure versetzt, das pH der mit starker Eiweissfällung versehenen Mischung beträgt nun 5,10. Nun wird das Reaktionsgemisch mit 800 Volumteilen Essig ester versetzt und bei 37 C 1 Stunde gut i gerührt.
Dann wird die Mischung zent.ritu- giert. Die überstehende Essigesterschicht wird abgehebert und die wässerige Phase und der Niederschlag über Nacht in gleicher Weise mit 500 Voluniteilen Essigester behandelt. Diese Extraktion wird noch dreimal während je ? Stunden. wiederholt, bis die Essigester- schieht farblos ist.
Die vereinigten Essigester lösungen werden über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und die filtrierte Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft. Das zurück bleibende halbfeste Produkt wird in mit Heptan gesättigtem Methanol aufgenommen und in 6 Stufen zwischen einer Mischung von je 100 Volunteilen Heptan und -100 Volum- teilen Methanol verteilt.
Die llet.hanollösnn- gen der Stufen 1 bis 5 werden vereinigt; es werden daraus 5,82 Gewichtsteile einer halb festen, gelbbraunen Masse erhalten. Die pa: pierehromatographische Analyse dieses Roh extraktes zeigt neben unumgewandeltem Des oxv corticosteron auch Corticosteron an.
Zur Isolierung des Oxydationsproduktes wird der Rohextrakt in bekannter Weise an Silica-el chromatographiert. Die Äther- und Chloro- forineluate enthalten Desoxvcorticosteron und die Eluate mit Cliloroform-Essinester und Essigester das Corticosteron, welch letzteres leicht mit der Schwefelsäurereaktion (grün gelbe Fluoreszenz) zu erkennen ist.
Diese Corticosteronfraktion wird in Pvridin mit Acetanhydrid acetyliert und nach dem Um- kristallisieren aus Aceton-Äther das Corti- costeronacetat vom F. = 113 bis 119 C ge wonnen.
Dieses Acetat wird mittels Kalium- bicarbonat. verseift und schliesslich durch Um- kristallisieren das Coilicosteron vom F. = 179 bis 182 C und der spezifischen Drehung [ccIn = ??:; (in Alkohol) in feinen Kri-- stallen erhalten.
<I>Beispiel 3:</I> 113 Gewichtsteile feingeschnittener Rinder nebennieren werden in einem Honiogenisator mit. 250 Volumteilen einer wässerigen Lösun- 5 Minuten homogenisiert. Die 250 Volumteile der wässeriäen Lösung enthalten 0,574 Ge wichtsteil Fumarsäure, -1,5 Gewichtsteile GrIu- eose, 0,97. (rewielitsteile Natritunehlorid, 0,
4 CTe- wichtsteile Iialiumclilorid, 0,91 Gewichtsteile sekundäres Natriumphosphat, 0,25 Gewichts-, teile l@a@@aiesiumsulfat und 25 Voluniteile 0,1n- Natronlauge. Zii diesem Iloniogenisat wird 1 Gewiehtsteil. Desoxvcorticosteron gegeben und nochmals ' Minuten homogenisiert. Das.
1),i dieser Emulsion beträgt 6,78. Sie wird ; in ein mit. Rührer und Gaseinleitungsrohr ver sehenes Gefäss umgeleert und unter Rühren und Einleiten von Sauerstoff 5 Stunden bei 37 C belassen.
Mit 50 Volumteilen Wasser wird der Homogenisator ausgespült. Die Re- , aktionsflüssibkeit wird in 1500 Volumteile Aceton -e-eben und mit je 200 Volumteilen Aceton zweimal nachgespült, Die vereinigten Acetonlösun-en werden durch Abnutschen vom Niedeaschl:
a- -etrennt. Der Rückstand wird dreimal mit je 200 Volunrteilen heissere Aceton ausgewaschen. Die vereinigten Aceton- lösun--en werden im Wasserstrahlvakuum von Aceton befreit.
Die zurückbleibende wässerige Lösung wird mit dein beim Abdampfen des Acetons ausgefallenen Niederschlag und aus- sesehiedenem <B>01</B> mit -100 Volumteilen Chloro form in ein Extraktionsgefäss bespült. Die Ex traktion der wässeri;-en Schicht wird mit je 100 Volumteilen Chloroform viermal wieder holt.
Die letzten Chloroforn)extrakte sind fast farblos, während die ersten beiden stark gelb braun "efärbt sind. Die Chloroformextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und die filtrierte Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft.
Als Ein- dampfunbsrüekstand verbleiben 1.1,5 Gewichts teile eines dunkelbraunen Produktes. Die pa- pierehromatographiselie Analyse zeigt neben unverändertem Desoxveortieosteron das in 11- Stellung oxydierte Produkt, das Corticosteron, an.
Der Rohextrakt wird in 250 Volumteilen Äther gelöst und diese Lösung reit je 200 Vo- l.umteilen einer gesättigten Lösung von Na triumbica.rbonat arusgesehüttelt. Die gelbe, klaretherlösun \@ wird sofort mit.
50 Volum- teilen O,ln-Salzsäure versetzt. und mit je 50 Vol.umteilen Wasser zweimal bewaschen. Die dabei entstehenden Emulsionen werden durch Zugabe von 5i Voluinteilen Methanol gebrochen und die Ätherschicht zur Trockne verdampft. Als 'Trocl@enrückstand werden 4,2 Gewichtsteile eines gelbbraunen Breies erhal ten.
Dieser wird in bekannter Weise an Sili- cagel chromatographiert. Die Äther- und Chloroformeluate bestehen aus unumgewan- deltem Desoxyeorticosteron. Die Chl.oroform- F.ssigsäureextrakte liefern nach der papier chromatischen Analyse eine Mischung von Desoxy eorticosteron und Corticosteron, wäh rend die Essigestereluate Corticosteron und ein gelb gefärbtes Produkt enthalten.
Die Corticosteron enthaltenden Fraktionen, wer den vereinigt und nochmals an Silicagel chromatographiert. Nach dem Umkristalli- sieren wird Corticosteron vom F. 175 gewonnen. Dieses Produkt wird wie im Beispiel 2 acetyl'iert und das Aeetylie- rnngsprodukt durch mehrfaches Umkristalli- sieren gereinigt.
Die Kristalle zeigen den F. - 140 bis 146 C, die spezifische Drehung [a1D = 219 (in Alkohol) und die bekannte Farbreaktion mit konzentrierter Schwefel säure. Bei der papierchromatographischen Analyse erweist sieh das Produkt. einheitlich als Cortieosteronacetat.
Beispiel 53 Gewichtsteile (eingeschnittener schlacht frischer Rindernebennieren werden in einem Homogenisator mit 100 Volumteilen einer wässerigen Lösung 3 Minuten homogenisiert.
Die 100 Volumteile der wässerigen Lösung enthalten 0,232 Gewichtsteile Fumarsäure, 1,8 (lewiehtsteile Glucose, 0,362 Gewichtsteile Natriumchlorid, 0,186 Gewichtsteile Kalium ehlorid, 0,356 Gewichtsteile sekundäres Na triumphosphat und 0,099 Gewichtsteile Ma gnesiumsulfat und sind mit 4 Volumteilen 2n-Natronlauge auf p$ 7,28 gestellt. Nach dem Homogenisieren wird das Homogenisat, des sen PH 6,73 beträgt, mit 0,5 Volumteilen 2n- Natronlauge auf PH 7,22 gebracht.
Zu dieser 3lischung werden 20 Volumteile Propylen- glykol gegeben, 1 Minute homogenisiert und 25 Volumteile Propylenglykol, welche 0,1 Ge wichtsteil Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21- dioxy-pregnen) gelöst enthalten, zugegeben, mit 5 Vo'lumteilen Propylengly kol nachge- waschen und noch 11/2 Minuten homogenisiert.
Die Emulsion wird in ein mit Rührer und Gaseinleitungsrohr versehenes Gefäss umge leert und im Thermostaten bei 37 C unter Rühren Sauerstoff durchgeleitet. Allzu starke Schaumentwicklung wird durch Drosselung der Sauerstoffzufuhr oder durch Zugabe we niger Tropfen Octanol vermieden. Nach 30 Mi nuten beträgt das p$ 7,27, nach 3 Stunden 7,20. Durch Zugabe von 12 Volumteilen ln Salzsäure wird das p$ auf 3,75 gestellt, wobei eine starke Eiweissfällung und Verfärbung der bis dahin rotbraun gefärbten. Lösung nach graubraun erfolgt.
Das Reaktionsgemisch wird in 2000 Volum- teile Aceton geleert und das Reaktionsgefäss mit je 100 Volumteilen Aceton dreimal aus gewaschen. Die vereinigten Acetonlösungen werden 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Fällung wird dann durch Abnutschen von der gelben Lösung getrennt und der Rückstand mit je 100 Volumteilen heissem Aceton dreimal gewaschen. Die verei nigten Acetonlösungen werden im Vakuum vollständig von Aceton befreit. Die zurück-.
bleibende wässerige Lösung und die während des Eindampfens ausgeschiedenen Nieder schläge und Öle werden mit 200 Volumteilen Essigester in ein Extraktionsgefäss transfe riert. Die wässerige Phase wird durch Zugabe von 25 Gewichtsteilen Kochsalz gesättigt und viermal mit je 100 Volumteilen Essigester ex trahiert. Die vereinigten Essigesterlösungen werden zweimal mit je 60 Volumteilen Wasser gewaschen und zweimal mit je 40 Volumteilen gesättigter Natriumbicarbonatlösung ausge schüttelt.
Das Waschwasser und die Bicar- bonatlösungen werden vereinigt und mit 100 Volumteilen Essigester extrahiert. Die vereinigten Essigesterlösungen werden mit 50 Volumteilen Wasser, dann mit 50 Volum- teilen 0,01n-Salzsäure und anschliessend zwei mal mit je 50 Volumteilen Wasser gewaschen. Die orangegelbe Essigesterlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, fil triert und im Vakuum zur Trockne verdampft.
Als Essigesterextrakt bleiben 3,4 Gewichtsteile eines dunkelbraunen, schmierigen Kristall- breies zurüek.
Die papierehromatographisclie Analyse die ses Rohextraktes zeigt neben unveränderter Substanz S die Substanz F (d-1-3,20-Diket.o- 17.ss1,17a,21=trioay-preglien) an. Der dunkel braune Kristallbrei wird in 10 Volumteilen einer Lösung von 50 Volumteilen Benzol und 50 Voluniteilen Äther gelöst, an Silicagel in bekannter Weise chromatographiert und mit Äther, Ätlier-Chloroformgemischen, Chloro form, Chloroform-Essigestergemischen,
Essig ester und Essigester-Methanolgemischen elu- iert.
Aus den Chloroformeluaten kristallisiert nach dem Eindampfen unveränderte Sub stanz S, und aus den Essigester- und Essig- ester-Methanoleluaten wird die Substanz F erhalten. Durch mehrfaches Umkristallisieren aus einem Gemisch von Äther-Aceton-Pentan und anschliessend aus Äther-Aceton wird aus den Fraktionen der Essigesterelution in (,e- ringer Menge ein begleitendes, die Kristallisa tion stark erschwerendes, gelbliches Öl abge trennt.
Das papierchromatographiseh-einheit- liche, kristallisierte Produkt schmilzt bei 200 bis 210 C lind zeigt in 21isehung mit analy - tisch reiner Substanz F keine Depression des Schmelzpunktes. Die Kristalle lassen sich auch auf Grund der Farbreaktion mit konzentrier ter Schwefelsäure als Substanz F identifizie ren und zeigen eine spezifische Drehung von fall) = + 15'6 (in Alkohol).
Die Chloro- form-Essigestereluate, welche neben Substanz F auch noch Substanz S enthalten, werden durch nochmalige chromatische Trennung an Silicagel in die Komponenten getrennt. Die übrigen Efuate der Silicagelchromatographie, in welchen Substanz F und Substanz S ge mischt vorliegen, werden mit.
den Mutterlau gen der oben genannten Umkristallisation ver einigt und in bekannter Weise mit Acetan- hydrid in Pyridin acetyliert. Die Acetylie- rungsprodukte werden an Silicagel ehromato- graphiert und die Acetate nach Eindampfen der Eluierungsmittel kristallin erhalten. Die mit konzentrierter Schwefelsäure grüngelb fluoreszierenden Kristalle stellen das reine F-aeetat vor.
Sie schmelzen bei 218 bis 225" r; und zeigen in Dioxan eine spezifische Drehung von f a] D = + 167 .
<I>Beispiele 5</I> his <I>31:</I> Beispiele <I>5</I> bis.?1: In genau gleicher Weise, wie im Beispiel .1 eingehend beschrieben, wird mit den in den folgenden Beispielen angege benen Substraten die Reaktion und die Auf arbeitung des Reaktionsgemisches durehge- führt. Als enzymhaltiges Organ werden Rin dernebennieren und als Ausgangsstoff für die Steroidoxydation je 0,
1 Gewichtsteile Sub stanz S (d-1-3,20-Dil,:eto-17a,21-dioxy-pregnell) verwendet. Das pH des Reaktionsgemisches wird, wenn nötig, durch Zugabe von 2n-Na- t-ronlauge oder 'n-Salzsäiire in gewissen Zeit- absehnitten auf das pli bei Versuchsbeginn 7u- rücktitriert.Als Lösungsvermittler werden je 50 Volumteile Propylenglykol in der im Bei spiel 4 näher
ausgeführten Weise zugefügt. In diesen Beispielen werden als Lösungsmittel je 100 Volumteile einer wässerigen Lösung verwendet, welche neben der Substratsubstanz noch folgende Zusätze enthalten: 1,8 Gewichts teile Glucose, 0,362 Gewiehtsteile Natrium- ehlorid, 0,356 Gewielitsteile sekundäres Na triumphosphat, 0,099 Gewichtsteile 3lagne- siumsuliat und so viel Natronlauge, als zur Titration auf ein pH von<B>7,5</B> notwendig ist.
Während der Reaktion wird immer Sauerstoff durchgeleitet.
<I>Beispiel</I> 25: Analog der in den Beispielen bis 21 beschriebenen Reaktionsfolgen und Aufarbeitungsmethoden werden in diesem Fall, als Lösungsvermittler an Stelle von Propylen- glykol 50 Volumteile Äthylenglykol. in genau gleicher Weise verwendet.
<I>Beispiele</I> 96<I>bis 31:</I> Unter sonst gleichen Versuchsbedingungen, wie sie in den Beispie len 4 bis 25 eingehalten werden, wird in den Beispielen 26 bis 31 auf die Verwendung eines Lösungsvermittlers verzichtet und dafür statt nur 100 Volumteile der glucosehaltigen Salz lösung 150 V olumteile als Lösungsmittel ver wendet. Je 0;1 Gewichtsteile der zu oxydieren den Substanz S (J-1-3,20-Diketo-17a,21-dioxy- pregnen) wird als feines Pulver direkt zum ioniogenisat gegeben und das Ganze noch mals 3 Minuten homogenisiert.
Dann wird gemäss dem im Beispiel -1 eingehend geschil derten Verfahren unter Einleitung von Sauer stoff reagieren gelassen -Lind das Reaktions- gemiseh analog aufgearbeitet. Schliesslich wird die gewünschte Substanz P (d4-2,20-Diketo- 11f,17a,21-trioxy-pregnen) kristallin erhalten und papierchromatographisch identifiziert.
In der folgenden Tabelle sind die für die Beispiele 5 bis 31 charakterisierten Versuchs- so daten zusammenfassend dargestellt. <I>Beispiele 5 bis</I> 3.1:
EMI0007.0013
<I>Oxydation <SEP> von <SEP> Substanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> Substanz <SEP> h'.</I>
<tb> Stunden
<tb> Beispiel <SEP> Gew.- <SEP> Gew.-Teile <SEP> ?@H <SEP> d. <SEP> Reaktionslösung <SEP> Total <SEP> Essigester Substrat <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> extrakt
<tb> Nr.
<SEP> Teile <SEP> Nebenniere <SEP> Beginn <SEP> Ende <SEP> Reaktions 30' <SEP> auf <SEP> <U>zeit</U> <SEP> Gew.-Teile
<tb> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 47 <SEP> 6,58 <SEP> 6,81 <SEP> 6,85 <SEP> 7,00 <SEP> 3 <SEP> 2,23
<tb> 6 <SEP> Bernsteinsäure <SEP> 0,236 <SEP> 51 <SEP> 6,58 <SEP> 6,90 <SEP> - <SEP> 6,71 <SEP> 2%z <SEP> 7,11
<tb> 7 <SEP> Funiarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 6,57 <SEP> 6,58 <SEP> - <SEP> 6,55 <SEP> 41/z <SEP> 1,43
<tb> 8 <SEP> <B><I>93</I></B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,02 <SEP> 7,10 <SEP> - <SEP> 7,08 <SEP> 3 <SEP> 3,l1
<tb> 9 <SEP> <B>31</B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,45 <SEP> 7,45 <SEP> 7,50 <SEP> 7,41 <SEP> 3 <SEP> 3,51
<tb> 10 <SEP> <B>39</B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,98 <SEP> 7,70 <SEP> 7,99 <SEP> 7,85 <SEP> 3 <SEP> 1,95
<tb> 11 <SEP> d,l <SEP> Äpfelsäiire <SEP> 0,356 <SEP> 51 <SEP> 6,50 <SEP> 6,52 <SEP> - <SEP> 6,
57 <SEP> 4i/2 <SEP> 1,2
<tb> 12 <SEP> Malonsäure <SEP> 0,208 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,20 <SEP> - <SEP> 7,10 <SEP> 3%2 <SEP> 1,88
<tb> 13 <SEP> Glütarsäure <SEP> 0,264 <SEP> 50 <SEP> 7,04 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,09 <SEP> 31/2 <SEP> 1,91
<tb> 14 <SEP> Adipinsäure <SEP> 0,292 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,l5 <SEP> - <SEP> 7,05 <SEP> 31/s <SEP> 1,80
<tb> 15 <SEP> cl,l-C?liitaminsä.ure <SEP> 0,584 <SEP> 54 <SEP> 7,14 <SEP> 7,01 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 3 <SEP> 2,71
<tb> 16 <SEP> d-Glutaminsäure <SEP> 0,584 <SEP> 35 <SEP> 7,28 <SEP> 7,12 <SEP> 7,18 <SEP> 7,18 <SEP> 21/z <SEP> 2,27
<tb> 17 <SEP> d,l-Asparaginsäure <SEP> 0,532 <SEP> 54 <SEP> <B>7,18</B> <SEP> 7,05 <SEP> - <SEP> 6,90 <SEP> 3 <SEP> 2,39
<tb> 18 <SEP> d,l-Asparagin <SEP> 0,528 <SEP> 54 <SEP> 7,22 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 6,95 <SEP> 3 <SEP> 2,90
<tb> 19 <SEP> d,l-Alanin <SEP> 0,356 <SEP> 54 <SEP> 6,
92 <SEP> 6,58 <SEP> 7,09 <SEP> 6,99 <SEP> 3 <SEP> l,92
<tb> 20 <SEP> Milchsäure <SEP> 0,180 <SEP> 50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,12 <SEP> - <SEP> 7,01 <SEP> 31/z <SEP> 2,29
<tb> 21 <SEP> Dioxyweinsäure <SEP> 0,364 <SEP> 51 <SEP> 7,04 <SEP> 7,02 <SEP> - <SEP> 6,96 <SEP> 31/z <SEP> 1,90
<tb> 22 <SEP> 1-Ascorbinsäure <SEP> 0,352 <SEP> 50 <SEP> 7,03 <SEP> 7,06 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 31/2 <SEP> 2,55
<tb> 23 <SEP> Brenztraubensäure <SEP> 0,l66 <SEP> 47 <SEP> 6,49 <SEP> 6,69 <SEP> - <SEP> 6,63 <SEP> 3 <SEP> 2,13
<tb> 24 <SEP> " <SEP> 0,l66 <SEP> 50 <SEP> 7,37 <SEP> 7,15 <SEP> 7,20 <SEP> 7,10 <SEP> 3 <SEP> 3,15
<tb> 25 <SEP> Funiarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> _ <SEP> 7,29 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 7,l1 <SEP> 21/z <SEP> 2,53
<tb> 26 <SEP> eis <SEP> Aconitsäure <SEP> 0,348 <SEP> 47,5 <SEP> 7,38 <SEP> 7,13 <SEP> 7,46 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 1,
30
<tb> 27 <SEP> a-hetoglutarsäure <SEP> 0,292 <SEP> 47,5 <SEP> 7,48 <SEP> 7,28 <SEP> 7,45 <SEP> 7,27 <SEP> 3 <SEP> 1,13
<tb> 28 <SEP> Glykokoll <SEP> 0,124 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,18 <SEP> 7,52 <SEP> 7,25 <SEP> 21/z <SEP> 1,29
<tb> 29 <SEP> d,l-Serin <SEP> 0,210 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,05 <SEP> 7,42 <SEP> 7,28 <SEP> 2i/2 <SEP> l,97
<tb> 30 <SEP> 1-Tryptophan <SEP> 0,408 <SEP> 41 <SEP> 7,50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 2 <SEP> 0,74
<tb> 31 <SEP> 1-Tyrosin <SEP> 0,362 <SEP> 41 <SEP> 7,62 <SEP> 7,23 <SEP> 7,60 <SEP> 7,35 <SEP> 2 <SEP> 1,27 <I>Beispiele 32 bis 35:
</I> In sonst genau gleicher Weise, wie in den Beispielen 4 bis 41 angegeben, werden in den Beispielen 32 bis 35 unter Verwendung von je 50 Volumteilen Propylenglvkol als Lö- sungsvermittler je 100 Volumteile gliicosefreie Salzlösung als Lösungsmittel verwendet und die Reaktionszeit gemäss den in der nach stehenden Tabelle angeführten Versuchsbedin gungen verändert.
Aneh unter der nachge- nannten Arbeitsweise lässt sich aus Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxi--pregnen) die Substanz F (d-1-3,20-Diketo-11ss,17a,21-trioxy- pregnen) kristallin gewinnen. Der Schmelz punkt nach einmaligem Umkristallisieren des Essigestereluates des an Silicagel ehromato- graphierten Rohextraktes liegt bei 185 bis 200 C.
Die papierchromatographische Analyse Lind die Farbreaktion mit konzentrierter Schwefelsäure beweisen die Identität dieser kristallisierten Fraktion mit der Substanz F. <I>Beispiele</I> 3,) <I>bis 35:</I>
EMI0008.0012
<I>Oxydation <SEP> von <SEP> Sltbstanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> SiAsta.nz <SEP> Z'.</I>
<tb> Neben- <SEP> Lösungsmittel <SEP> p<B>l,</B> <SEP> der <SEP> Reaktions- <SEP> Stunden <SEP> Essigester Beispiel <SEP> Substrat <SEP> Gew.- <SEP> Liiere <SEP> wie <SEP> in <SEP> den <SEP> vol.- <SEP> Lösung <SEP> Total <SEP> extrakt
<tb> No. <SEP> Teile <SEP> Gew.- <SEP> Beispielen <SEP> 5-31 <SEP> nach <SEP> Reakt.
Teile <SEP> jedoch <SEP> Teile <SEP> Beginn <SEP> 30, <SEP> Ende <SEP> Zeit <SEP> @ew.-Teile
<tb> 32 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 41/2 <SEP> 1,49
<tb> 33 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 7,35 <SEP> 7,25 <SEP> 7,48 <SEP> 21/2 <SEP> 3,14
<tb> 34 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 34 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 7,32 <SEP> 7,54 <SEP> 7,54 <SEP> 1 <SEP> 1,99
<tb> 35 <SEP> Fumarsäure <SEP> <B>0,232</B> <SEP> 53 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> <B>7,38 <SEP> 7,56</B> <SEP> 7.49 <SEP> 21/2 <SEP> 3,13
<tb> { <SEP> ohne <SEP> NgS04 <SEP> } <I>Beispiel 36:
</I> 121 Gewiehtsteile schlachtfrischer, zu Wür feln geschnittener Kalbslebern werden in einem Homogenisator mit. 100 Volumteilen einer wässerigen Lösung 3 Minuten homogeni siert. Die 100 Volumteile der wässerigen Lö sung .enthalten 0,232 Gewichtsteile Fuumar- säure, 1,8 Gewichtsteile Glucose, 0,362 Ge wichtsteile Natriumehlorid, 0,186 Gewiehtsteile Kaliumchlorid, 0,356 Gewiehtsteile sekundäres Natritumphosphat und 0,099 Gewichtsteile Ma gnesiumsulfat und sind mit 1,
2 Volumteilen Zn-Natronlauge auf PH 7,42 gestellt. Nach dem Homogenisieren wird das Homogenisat, dessen pH 6,74 beträgt, mit 1,2 Volumteilen '>n-Natronlauge auf PH 7,42 gebracht. Zu die ser Mischung wird 0,1 Gewichtsteil Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-pregnen) zugege ben. und noch 2 Minuten homogenisiert.
Die Emulsion wird in ein mit Rührer und Gasein- leitungsrohr versehenes Gefäss umgeleert und im Thermostaten bei 37 C unter Rühren Sauerstoff durchgeleitet. Allzustarke Scha.um- entwieklung wird durch Drosselung der Sauer stoffzufuhr oder durch Zugabe weniger Trop fen Octanol vermieden. Nach 30 Minuten be trägt das pH 7,10.
Mit 0,2 Volumteilen 'n- Natronlauge wird es auf 7,27 eingestellt; nach 120 Minuten werden zur Einstellung des pF3 von 7,12 nach 7,26 nochmals 0,2 Volumteile 2n-Natronlauge zugegeben. Nach 3 Stunden beträgt das pH 7,20. Durch Zugabe von 30 Vo- lumteilen ln-Salzsäure wird das pH auf 3,30 gebracht, wobei eine starke Eiweissfällung und Verfärbung der bis dahin braungefärbten Lö sung nach graubraun erfolgt.
Das Reaktionsgemisch wird in 3000 Vo- lumteile Aceton -eleert und das Reak tionsgefäss mit. je 250 Volumteilen Ace ton dreimal ausgewasehen. Die vereinig ten Acetonlösungen werden 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Fällung wird dann durch Abnutschen von der gelben Lösung getrennt und der Rück stand mit je 250 V olumteilen heissem Aceton dreimal gewasehen. Die vereinigten Aceton lösungen werden im Vakuum vollständig von Aceton befreit.
Die zurückbleibende wässerige Lösung und die während des Eindampfens ausgeschiedenen Niederschläge und Öle wer den mit 300 Volumteilen Essigester in ein Ex traktionsgefäss transferiert. Die wässerige Phase wird durch Zugabe von 25 Gewichts teilen Kochsalz gesättigt und viermal mit je 100 Volumteilen Essigester extrahiert. Die vereinigten Essigesterlösungen werden zweimal mit je 60 Volumteilen Wasser gewaschen und viermal mit je 50 Volumteilen gesättigter Natriumbicarbonatlösung ausgeschüttelt.
Das Waschwasser und die Bicarbonatlösungen werden vereinigt und mit 100 Volumteilen Essigester extrahiert. Die vereinigten Essig esterlösungen werden mit 50 Volumteilen Was ser, dann mit 50 Volumteilen 0,1n-Salzsäure und anschliessend noch dreimal mit je 50 Vo- lumteilenWasser gewaschen. Die orangegelbe Essigesterlösung wird über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet, filtriert und im Va kuum zur Trockne verdampft. Als Essig esterextrakt bleiben 3,03 Gewichtsteile einer hellbraunen Gallerte zurück, welche über Nacht. Kristalle ausscheidet.
Die papierchromatographische Analyse die ses Rohextraktes zeigt neben unveränderter Substanz S die Substanz F (44-3,20-Diketo- 1.1f,17a,21-trioxy-pregnen) an. Der hellbraune Kristallbrei wird in 10 Volumteilen einer Lösung von 75 Volumteilen Benzol und 2'5 Vo- liimteilen Äther gelöst und an Silicagel in be kannter Weise chromatographiert. Es wird mit Ä Hier, Äther-Chloroformgemischen, Chloro form, Chloroform-Essigestergemischen,
Essig ester und Essigester-Methanolgemischen elu- iert.
Aus den Essigester- und Essigester-Me- thanoleluaten kristallisiert die Substanz F. Durch mehrfaches Umkristallisieren aus einem Gemisch von Äther-Aceton-Pentan und an schliessend aus Äther-Aceton wird aus den Fraktionen der Essigesterelution das papier- ehromatographisch einheitliche, kristallisierte Produkt erhalten, welches bei 200 bis 210 C schmilzt.
Die Kristalle lassen sich auf Grund der Farbreaktion mit konzentrierter Schwefel säure als Substanz F (d4-3,20 - Diketo- 11ss,17a,21-trioxy-pregnen) identifizieren und zeigen die spezifische Drehung [a] D = +156 (in Alkohol).
Die Eluate der Silicagelchro- matographie, in welchen Substanz F und S gemischt vorliegen, werden mit den Mutter laugen der obgenannten Umkristallisation ver einigt und in bekannter Weise mit Acetan- hydrid in Pyridin aeetyliert. Die Acetylie- rungsprodukte werden an Silicagel chromato- graphiert und die Acetate nach Eindampfen der Eluierungsmittel kristallin erhalten.
Die mit konzentrierter Schwefelsäure grüngelb fluoreszierenden Kristalle schmelzen bei 2,18 bis 225 C und zeigen in Dioxan die spezi fische Drehung [a] D = + <B>1670.</B> Sie stellen somit, das Acetat der Substanz F vor.
<I>Beispiele 37 bis</I> 422: Analog zu den im Beispiel 36 näher be schriebenen Versuchsbedingungen wird in den Beispielen 3 7 bis 42 mit den in der nachfol genden Tabelle angeführten Substraten ge arbeitet, wobei im Beispiel 37 100 Völumteile und in den Beispielen 38 bis 42 je 150 Vo- lumteile der glucosehaltigen Salzlösung als Lösungsmittel verwendet werden.
Auch unter diesen Bedingungen gelingt die Einführung von Sauerstoff in 11-Stellung der Substanz S (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-pregnen). Die ge mäss Beispiel 36 verwendete Aufarbeitungs- methode führt zur Isolierung der bei 200 bis 210 C schmelzenden Substanz F (d4-3,20-Di- keto-11ss,17a,21-trioxy-pregnen). Die Kristalle werden durch papierchromatographische Ana lyse und die Farbreaktion mit konzentrierter Schwefelsäure identifiziert und zeigen in Äthanol die spezifische Drehung [a] D = +156 . <I>Beispiel 37:
</I> Hier werden, wie im Beispiel 36, 121 Gewichtsteile Kalbsleber homogeni siert. <I>Beispiele 38 bis 40:</I> Als Enzymhaltiges Organ werden in diesen Versuchen je 55 Ge wichtsteile Kaninchenleber, in analoger Weise wie im Beispiel 36, eingesetzt.
<I>Beispiele 41 und 42:</I> Als Enzymquelle wer den in diesen Versuchen je 83 Gewichtsteile Kalbsnieren statt Lebern, unter sonst analogen Bedingungen wie im Beispiel 36, verwendet. Die den Beispielen 37 bis 42 zugrunde liegenden übrigen Versuchsdaten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
<I>Beispiele 37</I> his <I>42:</I>
EMI0010.0002
<I>Oxydation <SEP> von <SEP> Substanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> Substanz <SEP> F.</I>
<tb> pH <SEP> der <SEP> Reaktionslösung <SEP> Stunden <SEP> Essigester Beispiel <SEP> Substrat <SEP> Gew' <SEP> nach <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> Total <SEP> extrakt
<tb> Nr.
<SEP> Teile <SEP> Beginn <SEP> 20# <SEP> 40' <SEP> auf <SEP> 70' <SEP> auf <SEP> Ende <SEP> Reakt.- <SEP> Gew.-Teile
<tb> zeit
<tb> 37 <SEP> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 7,42 <SEP> 7,17 <SEP> 7,15 <SEP> 7,28 <SEP> 7,19 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 2,05
<tb> 38 <SEP> Funlarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 7,45 <SEP> 7,32 <SEP> 7,25 <SEP> 7,40 <SEP> 7,33 <SEP> 7,6<B>2</B> <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 1,47
<tb> 39 <SEP> Ascorbinsäure <SEP> 0,352 <SEP> 7,47 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 7,37 <SEP> 7,32 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 3 <SEP> 1,64
<tb> 40 <SEP> d,1-Glutaminsäure <SEP> 0,584 <SEP> 7,44 <SEP> 7,33 <SEP> 7,23 <SEP> 7,38 <SEP> 7,33 <SEP> 7,56 <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 2,65
<tb> 41 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 7,30 <SEP> 7,13 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,16 <SEP> - <SEP> 7,14 <SEP> 3 <SEP> 3,<B>1</B>8
<tb> 42 <SEP> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 7,39 <SEP> 7,
31 <SEP> 7,38 <SEP> - <SEP> 7,39 <SEP> - <SEP> 7,31 <SEP> 3 <SEP> 3,21
Process for the oxidation of steroids. The present invention relates to a method of oxidizing steroids.
1: It is already known that an oxy group in the 11-position can be introduced biologically into steroids unsubstituted in the 11- and 12-position by means of perfusion through surviving adrenal glands. However, this method is hardly an option for technical implementation.
It has now been found that steroids which are unsubstituted in the 11- and 12-position can be converted into the corresponding 11-oxy-steroids in a simple manner if they are treated with oxygen in the presence of enzymes. and the 11-oxy-steroids formed were isolated.
One can start with saturated or, for example, steroids in the 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11-, 16- and / or 1.7-position double bonds .
In particular, steroids of the androstane, pregnane, sterol or sapogenin series come into consideration, which are substituted, for example, in the 3-, 14-, 16-, 17-, 20- and 21-position, for example by free or functionally modified oxy - Or oxo groups, such as by aeyloxy, for example acetoxy, propionyloxy,
Benzoyloxy or tosyloxy groups, through alkoxy, for example methoxy or -lithoxy groups, through enolized or acetalized oxo groups, through free or functionally modified carboxyl groups, such as nitrile or esterified carboxyl groups, through epoxy groups or by halogen atoms.
The starting materials can be of any steric configuration. For example, 44-3,20-diketo-21-oxy-pregnene, d4-3,20 - diketo-17,21-dioxy - pregnene, 3f, 5a- or -5fü = androsterones or
their esters and ethers, cholesterol or diosgenin. If necessary, any double bonds in the steroids are intermediately protected during the oxidation in a manner known per se, for example by saturation with hydrogen halide or by conversion into pentacyclic isosteroids.
For treatment with oxygen, for example, oxygen is passed over or through the reaction mixture. Instead of oxygen, it is also possible to use: Oxygen-releasing agents, for example hydrogen peroxide or compounds which form hydrogen peroxide, for example in the presence of catalase.
The enzymes are especially used in the form of organ preparations, such as comminuted organs, organ sections, organ homogenates from enzyme-rich organs, for example from the adrenal glands, kidneys or livers or mixtures of the same.
The enzymes can of course be kept functional by adding suitable substrates and observing the appropriate ylilieubedbedingungen. As substrates come in particular those of DE Green (Journal, of Biological Chemistry, Vol. 172, Page 389 [1948]) called the cyelophorase system enzyme system and / or acids formed in the metabolism of carbon hydrates of the Krebssehen citric acid cycle (see for example R.
Ammon and W. Dirsclrerl Fermente, Hormone, Vitamine, 1918, p. 173) or under the reaction conditions in such convertible compounds in use, for example citric acid, aeonitic acid, isotronic acid, oxalsuccinic acid, α-ketogluoric acid, succinic acid , Fumaric acid, malic acid, pyruvic acid,
Oxaloacetic acid, but also halonic acid, glutaric acid, adipic acid, glutamic acid, aspartic acid, asparagine, alanine, glucocolla, serine, furthermore ascorbic acid, lactic acid, dioxy tartaric acid, proline, tyrosine, tryptophan or mixtures of the same.
To maintain the appropriate environmental conditions, it is best to work in an aqueous medium to which the advantageous components of physiological solutions such as carbohydrates, inorganic and / or organic salts, for example sodium phosphate, alkali chlorides, 1llagnesirxmsulfat or sodium triLxmacetat are added. With the salt additives in particular the pH and the ionic strength of the reaction solution should be kept in the optimal range during the reaction.
The reaction is preferably carried out at a pH of 6.5 to 9.0 and a salt concentration of 0.5 to 0.01 molar. Accordingly, a physiological liquid, for example plasma, can also be used as the reaction medium. In this case, it is advantageous to add a preservative, for example penicillin.
Solubilizers, such as ethylene glycol, propylene glycol, or dispersants, for example phospholipids, can also be added to the reaction medium.
The 11-oxy-steroids can be isolated from the oxidation mixture, depending on the starting materials or reaction media used, according to methods known per se, for example by carrying out demixing processes, chromatography, recrystallization and the like.
In the following examples the relationship between part by weight and part by volume is the same as that between gramnx and cubic centimeter. The temperatures are given in degrees Celsius.
<I> example. 1: </I> A solution of 1 part by weight of deoxycorticosterorx in 20 parts by volume of ethylene glycol is added to 980 parts by volume of a mixture of 900 parts by volume of bovine plasma, which contains the compounds belonging to the cyeloplrorase system and to which citric acid and penicillin are previously added 80 parts by volume of ith @ -lene glycol and 1 part by weight of ascorbic acid had been given.
The ZEH of this solution is with. 0.1.n sodium hydroxide solution to the original pH of the citrate plasma before the addition of aseorbic acid. 900 parts by volume of the above mixture are heated to 37 ° C. in the thermostat.
For this purpose, 60 parts by weight of friselx-made adrenal sections are added to the adrenal glands of freshly slaughtered cattle. In addition, 60 parts by weight of beef adrenal glands are cut into small pieces and homogenized for 2 minutes with 80 parts by volume of the above deoxycortieosterone plasma solution in a homogenizer. The resulting pulp is added to the solution already provided with cuts in the thermostat and rinsed with 20 parts by volume of plasma.
The mixture is kept at 37 ° C. for 1/2 hour with gentle agitation. After the temperature has equalized, 100 parts by volume of an aqueous 1.03 percent hydrogen peroxide solution containing 10% ethylene glycol are added within 2 hours.
After more. 21/2 hours is cooled to room tempera ture and then the reaction mixture is pressed through a cloth filter. The cloudy solution running through is clarified by centrifuging at 2000 rpm for one hour. The residue obtained by centrifugation is fixed in a cloth filter with the backstax.
The plasma solution and the filter residue, which mainly consists of the organ parts, are treated individually with organic solvents. The plasma solution is extracted with ethyl acetate until the ethyl acetate appears colorless. These extraction solutions are centrifuged at 2000 rpm for a clear separation of the layers and the ethyl acetate layers are siphoned off. There are 3.9 parts by weight of extract obtained in this way, which is fractionated by gradual distribution between methanol and heptane.
The methanol fractions, containing the steroids, are again distributed between heptane and methanol and then acetylated in pyridine with acetal anhydride at room temperature. The product obtained in this way shows a mixture of deoxycorticosterone and cortieosterone acetate on paper chromatographic analysis.
For the purpose of separation, the mixture is chromatographed on silica gel. The benzene ether eluates mainly contain unchanged deoxveorticosterone. The oxidation product, however, is only with. Ether-ethyl acetate mixtures removed from the chromatogram column.
After saponification using sodium bicarbonate in aqueous-alcoholic solution, crystals are obtained therefrom which melt at 179 to 181 C (after sintering), have the optical rotation Iall) = -I- 200 (in alcohol) and, with concentrated sulfuric acid, those for cortisee-urone show characteristic color reaction (green (yellow fluorescence).
The organic residues obtained from the reaction mixture by separating and centrifuging are extracted with acetone for 40 hours. The acetone solution, which contains the water in the organs and the adhering plasma, is freed from acetone in a water jet vacuum. The aqueous residue is extracted several times with ether. 4.3 parts by weight of ether extract are obtained after the ether has evaporated. This is further treated in the same way as the ethyl acetate extra salt of the plasma. First there is a gradual, repeated distribution between heptane and methanol.
The methanol fractions are again acetylated with acetic anhydride in pyridine and the acetylation mixture is separated by chromatography on silica gel after the pyridine and excess acetic anhydride have been completely removed. By saponifying the ether-ethyl acetate eluates and recrystallizing the same compound as when working up the plasma extract.
<I> Example 2 </I> 159 parts by weight of finely chopped cattle adrenal glands are homogenized in a homogenizer with 900 parts by volume of an aqueous solution for 5 minutes. The 900 parts by volume of the aqueous solution contain 6.4 parts by weight of sodium fumarate, 36 parts by weight of glucose, 7.24 parts by weight of sodium chloride, 3.72 parts by weight of potassium chloride, 7.14 parts by weight of secondary sodium phosphate and 1.98 parts by weight of magnesium sulfate,
1 part by weight of deoxycorticosterone is added to this homogenate and the mixture is homogenized for another 2 minutes at the highest number of revolutions. The resulting paste is brought to pH 6.62 with 20 parts by volume of hydrochloric acid (pH determination with glass electrode) and homogenized again for 2 minutes. The reaction mixture is emptied into a vessel equipped with a stirrer and rinsed with 100 parts by volume of water.
The pH of the emulsion is brought to 6.62 with 20 parts by volume of 1N hydrochloric acid (pH determination with glass electrode). The reaction mixture is kept at 37 ° C., and 150 parts by volume of a 15% hydrogen peroxide solution are added over the course of 21/2 hours, with constant stirring.
In the course of the next hour, 15 parts by volume of a 30 percent hydrogen peroxide solution are added dropwise. If the development of oxygen subsides, 0.05 parts by weight of a commercially available catalase preparation are added after every hour in order to ensure the decomposition of any hydrogen superoxide that may still be present after 4 hours.
After a total reaction time of 4 hours, 30 parts by volume of IN hydrochloric acid are added to the solution, and the pH of the mixture, which is provided with strong protein precipitation, is now 5.10. 800 parts by volume of ethyl acetate are then added to the reaction mixture and the mixture is stirred well at 37 ° C. for 1 hour.
Then the mixture is rated centrally. The supernatant ethyl acetate layer is siphoned off and the aqueous phase and the precipitate are treated in the same way overnight with 500 parts by volume of ethyl acetate. This extraction is done three more times while ever? Hours. repeatedly until the ethyl acetate is colorless.
The combined ethyl acetate solutions are dried over anhydrous sodium sulfate and the filtered solution is evaporated to dryness in vacuo. The semi-solid product that remains is taken up in methanol saturated with heptane and distributed in 6 stages between a mixture of 100 parts by volume of heptane and -100 parts by volume of methanol.
The ethanol solutions of stages 1 to 5 are combined; 5.82 parts by weight of a semi-solid, yellow-brown mass are obtained therefrom. The pa: pierehromatographic analysis of this raw extract shows not only unconverted Desoxv corticosterone but also corticosterone.
To isolate the oxidation product, the crude extract is chromatographed on silica-el in a known manner. The ether and chloroforin eluates contain deoxycorticosterone and the eluates with chloroform ethyl acetate and ethyl acetate contain corticosterone, the latter of which can be easily recognized by the sulfuric acid reaction (green-yellow fluorescence).
This corticosterone fraction is acetylated in pvridine with acetic anhydride and after recrystallization from acetone-ether the corticosterone acetate with a temperature of 113 to 119 ° C is obtained.
This acetate is made using potassium bicarbonate. saponified and finally, by recrystallization, the coilicosterone from F. = 179 to 182 C and the specific rotation [ccIn = ??:; Preserved (in alcohol) in fine crystals.
<I> Example 3: </I> 113 parts by weight of finely sliced bovine adrenal glands are used in a honey generator. 250 parts by volume of an aqueous solution homogenized for 5 minutes. The 250 parts by volume of the aqueous solution contain 0.574 parts by weight of fumaric acid, 1.5 parts by weight of greenose, 0.97. (rewielite parts of sodium chloride, 0,
4 parts by weight of sodium chloride, 0.91 parts by weight of secondary sodium phosphate, 0.25 parts by weight of aiesium sulfate and 25 parts by volume of 0.1N sodium hydroxide solution. 1 part by weight is added to this iloniogenisate. Desoxvcorticosterone given and homogenized again 'minutes. The.
1), i of this emulsion is 6.78. She will ; in a with. The stirrer and gas inlet pipe were emptied and left at 37 ° C. for 5 hours while stirring and passing in oxygen.
The homogenizer is rinsed out with 50 parts by volume of water. The reaction liquid is rinsed twice in 1500 parts by volume of acetone -e-even and with 200 parts by volume of acetone each time. The combined acetone solutions are filtered off with suction from the Niedeaschl:
a- separated. The residue is washed out three times with 200 parts by volume of hot acetone each time. The combined acetone solutions are freed from acetone in a water jet vacuum.
The remaining aqueous solution is rinsed into an extraction vessel with the precipitate that has precipitated out when the acetone is evaporated and the resulting 01 with -100 parts by volume of chloroform. The extraction of the aqueous layer is repeated four times with 100 parts by volume of chloroform each time.
The last chloroform extracts are almost colorless, while the first two are strongly yellow-brown in color. The chloroform extracts are combined, dried over anhydrous sodium sulfate and the filtered solution is evaporated to dryness in vacuo.
1.1.5 parts by weight of a dark brown product remain as evaporation residue. The paper chromatographic analysis shows, in addition to unchanged deoxveortieosterone, the product oxidized in the 11-position, corticosterone.
The crude extract is dissolved in 250 parts by volume of ether and this solution is shaken by shaking 200 parts by volume of a saturated solution of sodium bicarbonate. The yellow, clear ether solution is immediately with.
50 parts by volume of O, lN hydrochloric acid added. and washed twice with 50 volumes of water each time. The resulting emulsions are broken by adding 5 liters by volume of methanol and the ether layer is evaporated to dryness. 4.2 parts by weight of a yellow-brown pulp are obtained as the residue.
This is chromatographed on silica gel in a known manner. The ether and chloroform eluates consist of unconverted deoxyeorticosterone. According to paper chromatic analysis, the chloroform f. Acetic acid extracts yield a mixture of deoxy eorticosterone and corticosterone, while the ethyl acetate eluates contain corticosterone and a yellow product.
The fractions containing corticosterone, who combined and chromatographed again on silica gel. After recrystallization, corticosterone is obtained from F. 175. This product is acetylated as in Example 2 and the acetylation product is purified by repeated recrystallization.
The crystals show the temperature - 140 to 146 C, the specific rotation [a1D = 219 (in alcohol) and the well-known color reaction with concentrated sulfuric acid. Paper chromatographic analysis shows the product. uniformly as cortieosterone acetate.
Example 53 parts by weight (incised slaughter of fresh beef adrenal glands are homogenized in a homogenizer with 100 parts by volume of an aqueous solution for 3 minutes.
The 100 parts by volume of the aqueous solution contain 0.232 parts by weight of fumaric acid, 1.8 parts by weight of glucose, 0.362 parts by weight of sodium chloride, 0.186 parts by weight of potassium chloride, 0.356 parts by weight of secondary sodium phosphate and 0.099 parts by weight of magnesium sulfate and are 4 parts by volume of 2N sodium hydroxide solution to p $ 7, 28. After homogenization, the homogenate, whose pH is 6.73, is brought to pH 7.22 with 0.5 parts by volume of 2N sodium hydroxide solution.
20 parts by volume of propylene glycol are added to this mixture, the mixture is homogenized for 1 minute and 25 parts by volume of propylene glycol, which contains 0.1 part by weight of substance S (d4-3,20-diketo-17a, 21-dioxy-pregnene) in solution, are added Wash 5 parts by volume of propylene glycol and homogenize for a further 11/2 minutes.
The emulsion is poured into a vessel equipped with a stirrer and gas inlet tube and oxygen is passed through in the thermostat at 37 ° C. while stirring. Excessive foaming can be avoided by reducing the oxygen supply or adding a few drops of octanol. After 30 minutes the p $ 7.27, after 3 hours 7.20. By adding 12 parts by volume of ln hydrochloric acid, the p $ is set to 3.75, with strong protein precipitation and discoloration of the reddish-brown hitherto. Solution to gray-brown takes place.
The reaction mixture is poured into 2000 parts by volume of acetone and the reaction vessel is washed three times with 100 parts by volume of acetone each time. The combined acetone solutions are left to stand for 15 hours at room temperature. The precipitate is then separated from the yellow solution by suction filtration and the residue is washed three times with 100 parts by volume of hot acetone each time. The combined acetone solutions are completely freed from acetone in vacuo. The back.
The remaining aqueous solution and the precipitates and oils separated out during evaporation are transferred into an extraction vessel with 200 parts by volume of ethyl acetate. The aqueous phase is saturated by adding 25 parts by weight of sodium chloride and extracted four times with 100 parts by volume of ethyl acetate each time. The combined ethyl acetate solutions are washed twice with 60 parts by volume of water and shaken out twice with 40 parts by volume of saturated sodium bicarbonate solution each time.
The wash water and the bicarbonate solutions are combined and extracted with 100 parts by volume of ethyl acetate. The combined ethyl acetate solutions are washed with 50 parts by volume of water, then with 50 parts by volume of 0.01N hydrochloric acid and then twice with 50 parts by volume of water each time. The orange-yellow ethyl acetate solution is dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness in vacuo.
3.4 parts by weight of a dark brown, greasy crystal pulp remain as the ethyl acetate extract.
The paper chromatographic analysis of this crude extract shows, in addition to unchanged substance S, substance F (d-1-3,20-Diket.o- 17.ss1,17a, 21 = trioay-preglien). The dark brown crystal pulp is dissolved in 10 parts by volume of a solution of 50 parts by volume of benzene and 50 parts by volume of ether, chromatographed on silica gel in a known manner and treated with ether, ether-chloroform mixtures, chloroform, chloroform-ethyl acetate mixtures,
Ethyl acetate and ethyl acetate-methanol mixtures eluted.
After evaporation, unchanged substance S crystallizes from the chloroform eluates, and substance F is obtained from the ethyl acetate and ethyl acetate-methanol eluates. By repeated recrystallization from a mixture of ether-acetone-pentane and then from ether-acetone, an accompanying yellowish oil, which makes the crystallization very difficult, is separated from the fractions of the ethyl acetate elution in a small amount.
The crystallized product, which is uniform in terms of paper chromatography, melts at 200 to 210 C and, when compared with analytically pure substance F, shows no depression of the melting point. The crystals can also be identified as substance F on the basis of the color reaction with concentrated sulfuric acid and show a specific rotation of fall) = + 15'6 (in alcohol).
The chloroform ethyl acetate eluates, which in addition to substance F also contain substance S, are separated into their components by repeated chromatic separation on silica gel. The remaining efuates of the silica gel chromatography, in which substance F and substance S are mixed, are included.
the mother liquor from the recrystallization mentioned above is combined and acetylated in a known manner with acetane hydride in pyridine. The acetylation products are chromatographed on silica gel and the acetates are obtained in crystalline form after evaporation of the eluent. The green-yellow fluorescent crystals with concentrated sulfuric acid represent the pure F-acetate.
They melt at 218 to 225 "r; and show a specific rotation of f a] D = + 167 in dioxane.
<I> Examples 5 </I> his <I> 31: </I> Examples <I> 5 </I> to.?1: In exactly the same way as described in detail in example .1, the in the substrates given below, the reaction and the work-up of the reaction mixture carried out. As an enzyme-containing organ, cervical adrenal glands and as the starting material for steroid oxidation are each 0,
1 part by weight of substance S (d-1-3,20-Dil,: eto-17a, 21-dioxy-pregnell) is used. If necessary, the pH of the reaction mixture is back-titrated to the pli at the beginning of the experiment by adding 2N sodium hydroxide solution or n-hydrochloric acid. 50 parts by volume of propylene glycol are used as solubilizers in the example 4 closer
executed manner added. In these examples, 100 parts by volume of an aqueous solution are used as solvents, which in addition to the substrate substance also contain the following additives: 1.8 parts by weight of glucose, 0.362 parts by weight of sodium chloride, 0.356 parts by weight of secondary sodium phosphate, 0.099 part by weight of 3lagnesiumsuliat and so much Sodium hydroxide solution than is necessary for titration to a pH of <B> 7.5 </B>.
Oxygen is always passed through during the reaction.
<I> Example </I> 25: Analogously to the reaction sequences and work-up methods described in Examples to 21, in this case, instead of propylene glycol, 50 parts by volume of ethylene glycol are used as solubilizer. used in exactly the same way.
<I> Examples </I> 96 <I> to 31: </I> Under otherwise the same test conditions as those observed in Examples 4 to 25, the use of a solubilizer is dispensed with in Examples 26 to 31 Instead of just 100 parts by volume of the glucose-containing salt solution, 150 parts by volume are used as the solvent. Each 0.1 part by weight of the substance S to be oxidized (J-1-3,20-diketo-17a, 21-dioxy-pregnen) is added directly to the ionizer as a fine powder and the whole is homogenized for another 3 minutes.
Then, according to the method described in detail in Example -1, reacting with oxygen -ind the reaction mixture is worked up analogously. Finally, the desired substance P (d4-2,20-diketo-11f, 17a, 21-trioxy-pregnene) is obtained in crystalline form and identified by paper chromatography.
The following table summarizes the experimental data characterized for Examples 5 to 31. <I> Examples 5 to </I> 3.1:
EMI0007.0013
<I> Oxidation <SEP> from <SEP> substance <SEP> S <SEP> to <SEP> substance <SEP> h '. </I>
<tb> hours
<tb> Example <SEP> parts by weight <SEP> parts by weight <SEP>? @H <SEP> d. <SEP> reaction solution <SEP> total <SEP> ethyl acetate substrate <SEP> after <SEP> increased <SEP> extract
<tb> No.
<SEP> parts <SEP> adrenal gland <SEP> start <SEP> end <SEP> reaction 30 '<SEP> on <SEP> <U> time </U> <SEP> parts by weight
<tb> Citric Acid <SEP> 0.420 <SEP> 47 <SEP> 6.58 <SEP> 6.81 <SEP> 6.85 <SEP> 7.00 <SEP> 3 <SEP> 2.23
<tb> 6 <SEP> succinic acid <SEP> 0.236 <SEP> 51 <SEP> 6.58 <SEP> 6.90 <SEP> - <SEP> 6.71 <SEP> 2% z <SEP> 7.11
<tb> 7 <SEP> Funiaric acid <SEP> 0.232 <SEP> 51 <SEP> 6.57 <SEP> 6.58 <SEP> - <SEP> 6.55 <SEP> 41 / z <SEP> 1.43
<tb> 8 <SEP> <B><I>93</I> </B> <SEP> 0.232 <SEP> 51 <SEP> 7.02 <SEP> 7.10 <SEP> - <SEP> 7 , 08 <SEP> 3 <SEP> 3, l1
<tb> 9 <SEP> <B> 31 </B> <SEP> 0.232 <SEP> 51 <SEP> 7.45 <SEP> 7.45 <SEP> 7.50 <SEP> 7.41 <SEP> 3 <SEP> 3.51
<tb> 10 <SEP> <B> 39 </B> <SEP> 0.232 <SEP> 51 <SEP> 7.98 <SEP> 7.70 <SEP> 7.99 <SEP> 7.85 <SEP> 3 <SEP> 1.95
<tb> 11 <SEP> d, l <SEP> Apple acid <SEP> 0.356 <SEP> 51 <SEP> 6.50 <SEP> 6.52 <SEP> - <SEP> 6,
57 <SEP> 4i / 2 <SEP> 1,2
<tb> 12 <SEP> Malonic acid <SEP> 0.208 <SEP> 50 <SEP> 7.20 <SEP> 7.20 <SEP> - <SEP> 7.10 <SEP> 3% 2 <SEP> 1.88
<tb> 13 <SEP> Glütaric acid <SEP> 0.264 <SEP> 50 <SEP> 7.04 <SEP> 7.19 <SEP> - <SEP> 7.09 <SEP> 31/2 <SEP> 1.91
<tb> 14 <SEP> adipic acid <SEP> 0.292 <SEP> 50 <SEP> 7.20 <SEP> 7, l5 <SEP> - <SEP> 7.05 <SEP> 31 / s <SEP> 1.80
<tb> 15 <SEP> cl, lC? liitaminä.ure <SEP> 0.584 <SEP> 54 <SEP> 7.14 <SEP> 7.01 <SEP> - <SEP> 6.91 <SEP> 3 <SEP > 2.71
<tb> 16 <SEP> d-glutamic acid <SEP> 0.584 <SEP> 35 <SEP> 7.28 <SEP> 7.12 <SEP> 7.18 <SEP> 7.18 <SEP> 21 / z <SEP > 2.27
<tb> 17 <SEP> d, l-aspartic acid <SEP> 0.532 <SEP> 54 <SEP> <B> 7.18 </B> <SEP> 7.05 <SEP> - <SEP> 6.90 < SEP> 3 <SEP> 2.39
<tb> 18 <SEP> d, l-asparagine <SEP> 0.528 <SEP> 54 <SEP> 7.22 <SEP> 7.11 <SEP> - <SEP> 6.95 <SEP> 3 <SEP> 2 , 90
<tb> 19 <SEP> d, l-alanine <SEP> 0.356 <SEP> 54 <SEP> 6,
92 <SEP> 6.58 <SEP> 7.09 <SEP> 6.99 <SEP> 3 <SEP> l, 92
<tb> 20 <SEP> lactic acid <SEP> 0.180 <SEP> 50 <SEP> 7.17 <SEP> 7.12 <SEP> - <SEP> 7.01 <SEP> 31 / z <SEP> 2.29
<tb> 21 <SEP> Dioxytartaric acid <SEP> 0.364 <SEP> 51 <SEP> 7.04 <SEP> 7.02 <SEP> - <SEP> 6.96 <SEP> 31 / z <SEP> 1.90
<tb> 22 <SEP> 1-ascorbic acid <SEP> 0.352 <SEP> 50 <SEP> 7.03 <SEP> 7.06 <SEP> - <SEP> 6.91 <SEP> 31/2 <SEP> 2 , 55
<tb> 23 <SEP> Pyruvic Acid <SEP> 0.166 <SEP> 47 <SEP> 6.49 <SEP> 6.69 <SEP> - <SEP> 6.63 <SEP> 3 <SEP> 2.13
<tb> 24 <SEP> "<SEP> 0, l66 <SEP> 50 <SEP> 7.37 <SEP> 7.15 <SEP> 7.20 <SEP> 7.10 <SEP> 3 <SEP> 3 , 15
<tb> 25 <SEP> Funiaric acid <SEP> 0.232 <SEP> 53 <SEP> _ <SEP> 7.29 <SEP> 7.11 <SEP> - <SEP> 7, l1 <SEP> 21 / z <SEP > 2.53
<tb> 26 <SEP> ice <SEP> aconitic acid <SEP> 0.348 <SEP> 47.5 <SEP> 7.38 <SEP> 7.13 <SEP> 7.46 <SEP> 7.22 <SEP> 3 <SEP> 1,
30th
<tb> 27 <SEP> a-hetoglutaric acid <SEP> 0.292 <SEP> 47.5 <SEP> 7.48 <SEP> 7.28 <SEP> 7.45 <SEP> 7.27 <SEP> 3 <SEP > 1.13
<tb> 28 <SEP> glycocoll <SEP> 0.124 <SEP> 47.5 <SEP> 7.42 <SEP> 7.18 <SEP> 7.52 <SEP> 7.25 <SEP> 21 / z <SEP > 1.29
<tb> 29 <SEP> d, l-serine <SEP> 0.210 <SEP> 47.5 <SEP> 7.42 <SEP> 7.05 <SEP> 7.42 <SEP> 7.28 <SEP> 2i / 2 <SEP> 1.97
<tb> 30 <SEP> 1-tryptophan <SEP> 0.408 <SEP> 41 <SEP> 7.50 <SEP> 7.17 <SEP> 7.52 <SEP> 7.30 <SEP> 2 <SEP> 0 , 74
<tb> 31 <SEP> 1-Tyrosine <SEP> 0.362 <SEP> 41 <SEP> 7.62 <SEP> 7.23 <SEP> 7.60 <SEP> 7.35 <SEP> 2 <SEP> 1 , 27 <I> Examples 32 to 35:
In exactly the same way as in Examples 4 to 41, in Examples 32 to 35 using 50 parts by volume of propylene glycol as the solubilizer, 100 parts by volume of gliicose-free salt solution are used as the solvent and the reaction time according to Test conditions listed in the table below have been changed.
Using the method described below, substance S (d4-3,20-diketo-17a, 21-dioxi-pregnen) can be converted into substance F (d-1-3,20-diketo-11ss, 17a, 21- trioxy-pregnen) crystalline. The melting point after single recrystallization of the ethyl acetate eluate of the crude extract chromatographed on silica gel is 185 to 200 C.
The paper chromatographic analysis and the color reaction with concentrated sulfuric acid prove the identity of this crystallized fraction with the substance F. <I> Examples </I> 3,) <I> to 35: </I>
EMI0008.0012
<I> Oxidation <SEP> from <SEP> Sltbstanz <SEP> S <SEP> to <SEP> SiAsta.nz <SEP> Z '. </I>
<tb> Secondary <SEP> solvent <SEP> p <B> l, </B> <SEP> of the <SEP> reaction <SEP> hours <SEP> ethyl acetate example <SEP> substrate <SEP> wt. <SEP> Write <SEP> like <SEP> in <SEP> the <SEP> vol.- <SEP> solution <SEP> Total <SEP> extract
<tb> No. <SEP> parts <SEP> by weight <SEP> examples <SEP> 5-31 <SEP> after <SEP> react.
Parts <SEP> but <SEP> parts <SEP> start <SEP> 30, <SEP> end <SEP> time <SEP> @ new parts
<tb> 32 <SEP> fumaric acid <SEP> 0.232 <SEP> 51 <SEP> without <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> 6.78 <SEP> 6.78 <SEP> 6.78 <SEP> 41 / 2 <SEP> 1.49
<tb> 33 <SEP> fumaric acid <SEP> 0.232 <SEP> 53 <SEP> without <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> 7.35 <SEP> 7.25 <SEP> 7.48 <SEP> 21 / 2 <SEP> 3.14
<tb> 34 <SEP> fumaric acid <SEP> 0.232 <SEP> 34 <SEP> without <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> 7.32 <SEP> 7.54 <SEP> 7.54 <SEP> 1 <SEP> 1.99
<tb> 35 <SEP> fumaric acid <SEP> <B> 0.232 </B> <SEP> 53 <SEP> without <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> <B> 7.38 <SEP> 7.56 </B> <SEP> 7.49 <SEP> 21/2 <SEP> 3.13
<tb> {<SEP> without <SEP> NgS04 <SEP>} <I> Example 36:
</I> 121 parts by weight of freshly slaughtered veal livers cut into cubes are added to a homogenizer. 100 parts by volume of an aqueous solution homogenized for 3 minutes. The 100 parts by volume of the aqueous solution contain 0.232 part by weight of fuumaric acid, 1.8 parts by weight of glucose, 0.362 part by weight of sodium chloride, 0.186 part by weight of potassium chloride, 0.356 part by weight of secondary sodium phosphate and 0.099 part by weight of magnesium sulfate and are 1,
2 parts by volume of Zn sodium hydroxide solution set to pH 7.42. After the homogenization, the homogenate, the pH of which is 6.74, is brought to pH 7.42 with 1.2 parts by volume of sodium hydroxide solution. 0.1 part by weight of substance S (d4-3,20-diketo-17a, 21-dioxy-pregnen) is added to this mixture. and homogenized for another 2 minutes.
The emulsion is poured into a vessel equipped with a stirrer and gas inlet pipe and oxygen is passed through in the thermostat at 37 ° C. with stirring. Excessive changes can be avoided by reducing the oxygen supply or adding a few drops of octanol. After 30 minutes the pH is 7.10.
It is adjusted to 7.27 with 0.2 parts by volume of sodium hydroxide solution; after 120 minutes, a further 0.2 parts by volume of 2N sodium hydroxide solution are added to adjust the pF3 from 7.12 to 7.26. After 3 hours the pH is 7.20. The pH is brought to 3.30 by adding 30 parts by volume of ln hydrochloric acid, during which the protein precipitates heavily and the solution, which was previously brown, turns gray-brown.
The reaction mixture is emptied into 3000 parts by volume of acetone and the reaction vessel with it. Washed out 250 parts by volume of Ace ton three times. The combined acetone solutions are left to stand for 15 hours at room temperature. The precipitate is then separated from the yellow solution by suction filtration and the residue is washed three times with 250 parts by volume of hot acetone each time. The combined acetone solutions are completely freed from acetone in vacuo.
The remaining aqueous solution and the precipitates and oils that separated out during evaporation were transferred to an extraction vessel with 300 parts by volume of ethyl acetate. The aqueous phase is saturated by adding 25 parts by weight of sodium chloride and extracted four times with 100 parts by volume of ethyl acetate each time. The combined ethyl acetate solutions are washed twice with 60 parts by volume of water each time and extracted four times with 50 parts by volume of saturated sodium bicarbonate solution each time.
The washing water and the bicarbonate solutions are combined and extracted with 100 parts by volume of ethyl acetate. The combined ethyl acetate solutions are washed with 50 parts by volume of water, then with 50 parts by volume of 0.1N hydrochloric acid and then three times with 50 parts by volume of water each time. The orange-yellow ethyl acetate solution is dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness in a vacuum. The vinegar ester extract leaves 3.03 parts by weight of a light brown gelatin, which overnight. Crystals precipitate.
The paper chromatographic analysis of this crude extract shows, in addition to unchanged substance S, substance F (44-3,20-diketo-1.1f, 17a, 21-trioxy-pregnen). The light brown crystal pulp is dissolved in 10 parts by volume of a solution of 75 parts by volume of benzene and 2.5 parts by volume of ether and chromatographed on silica gel in a known manner. It is used with Ä here, ether-chloroform mixtures, chloroform, chloroform-ethyl acetate mixtures,
Ethyl acetate and ethyl acetate-methanol mixtures eluted.
Substance F crystallizes from the ethyl acetate and ethyl acetate-methanol eluates. Repeated recrystallization from a mixture of ether-acetone-pentane and then from ether-acetone gives the ethyl acetate elution fractions the crystallized product, which is uniform on paper, which melts at 200 to 210 C.
The crystals can be identified as substance F (d4-3.20 - diketo-11ss, 17a, 21-trioxy-pregnen) based on the color reaction with concentrated sulfuric acid and show the specific rotation [a] D = +156 (in alcohol ).
The eluates from the silica gel chromatography, in which substances F and S are mixed, are combined with the mother liquors from the above-mentioned recrystallization and aeetylated in a known manner with acetane hydride in pyridine. The acetylation products are chromatographed on silica gel and the acetates are obtained in crystalline form after evaporation of the eluent.
The green-yellow fluorescent crystals with concentrated sulfuric acid melt at 2.18 to 225 ° C and show the specific rotation [a] D = + 1670 in dioxane. Thus, they represent the acetate of substance F.
Examples 37 to 422: Analogously to the experimental conditions described in more detail in Example 36, the substrates listed in the table below are used in Examples 37 to 42, where in Example 37 100 parts by volume and in Examples 38 to 42 each use 150 parts by volume of the glucose-containing salt solution as the solvent.
Even under these conditions, the introduction of oxygen in the 11-position of the substance S succeeds (d4-3,20-diketo-17a, 21-dioxy-pregnen). The work-up method used according to Example 36 leads to the isolation of substance F (d4-3,20-diketo-11ss, 17a, 21-trioxy-pregnen) which melts at 200 to 210 ° C. The crystals are identified by paper chromatographic analysis and the color reaction with concentrated sulfuric acid and show the specific rotation [a] D = +156 in ethanol. <I> Example 37:
</I> Here, as in Example 36, 121 parts by weight of veal liver are homogenized. Examples 38 to 40: 55 parts by weight of rabbit liver are used as the enzyme-containing organ in these experiments, in a manner analogous to that in Example 36.
Examples 41 and 42: 83 parts by weight of calf kidneys instead of livers, under conditions otherwise analogous to those in example 36, are used as the enzyme source in these experiments. The other experimental data on which Examples 37 to 42 are based are compiled in the table below.
<I> Examples 37 </I> his <I> 42: </I>
EMI0010.0002
<I> Oxidation <SEP> from <SEP> substance <SEP> S <SEP> to <SEP> substance <SEP> F. </I>
<tb> pH <SEP> of the <SEP> reaction solution <SEP> hours <SEP> ethyl acetate example <SEP> substrate <SEP> weight '<SEP> after <SEP> after <SEP> increased <SEP> after <SEP> increased <SEP> Total <SEP> extract
<tb> No.
<SEP> parts <SEP> start <SEP> 20 # <SEP> 40 '<SEP> to <SEP> 70' <SEP> to <SEP> end <SEP> reaction - <SEP> parts by weight
<tb> time
<tb> 37 <SEP> citric acid <SEP> 0.420 <SEP> 7.42 <SEP> 7.17 <SEP> 7.15 <SEP> 7.28 <SEP> 7.19 <SEP> 7.30 <SEP > 7.22 <SEP> 3 <SEP> 2.05
<tb> 38 <SEP> funlar acid <SEP> 0.232 <SEP> 7.45 <SEP> 7.32 <SEP> 7.25 <SEP> 7.40 <SEP> 7.33 <SEP> 7.6 <B. > 2 </B> <SEP> 7.44 <SEP> 3 <SEP> 1.47
<tb> 39 <SEP> ascorbic acid <SEP> 0.352 <SEP> 7.47 <SEP> 7.30 <SEP> 7.22 <SEP> 7.37 <SEP> 7.32 <SEP> 7.52 <SEP > 7.30 <SEP> 3 <SEP> 1.64
<tb> 40 <SEP> d, 1-glutamic acid <SEP> 0.584 <SEP> 7.44 <SEP> 7.33 <SEP> 7.23 <SEP> 7.38 <SEP> 7.33 <SEP> 7 , 56 <SEP> 7.44 <SEP> 3 <SEP> 2.65
<tb> 41 <SEP> fumaric acid <SEP> 0.232 <SEP> 7.30 <SEP> 7.13 <SEP> 7.19 <SEP> - <SEP> 7.16 <SEP> - <SEP> 7.14 <SEP> 3 <SEP> 3, <B> 1 </B> 8
<tb> 42 <SEP> citric acid <SEP> 0.420 <SEP> 7.39 <SEP> 7,
31 <SEP> 7.38 <SEP> - <SEP> 7.39 <SEP> - <SEP> 7.31 <SEP> 3 <SEP> 3.21