DE2063069C3

DE2063069C3 - Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung

Info

Publication number: DE2063069C3
Application number: DE2063069A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. Bohn; Fritz Emmerich
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1970-12-22
Filing date: 1970-12-22
Publication date: 1975-05-07
Also published as: DK129386C; AU3708771A; BE777135A; AT310940B; NL7117364A; DE2063069B2; NL159583B; FR2119008B1; ES398015A1; BR7108491D0; FR2119008A1; SE388774B; DE2063069A1; DK129386B; IL38402A; CA1003332A; IL38402A0; GB1380270A; JPS5320566B1; CH575236A5

Description

Sedimentat.

Koeffizient

Molekulargewicht

Koblenhydrat-

gehalt in %

Hexosen

Fukose

Hexosamin

(N-Acetyl-)

Neuraminsäure
(N-Acetyl-) ....
Aminosäurereste
pro 100 Aminosäuren

Lysin

Histidin

Arginin

Asparaginsäure

Threonin

Serin

Glutaminsäure

Prolin

Glycin

Alanin

Vaün

Methionin

Isoleucin

Leucin

Tyrosin

Phenylalanin ..

1/2 Cystein ...

Fibrinstabilisierender Faktor

aus Plasma I Thrombozyten I Plazenta

8,4 S
300 000

4,9
1.9
0,2

1.6

1,2

6,3
2,5
5,5

10,4
7,2
7,2

12,7
5,7
7,9
4,1
7,5
2,0
4,8
7,3
5,0
3,9

7,4 S 150 000

bis 200 000

1,5 1.2 0,0

0,16 0,15

5,7 2,0 6,2

12,2 5,9 5,8

10,8 4,6 7,1 5,3 S\9 2,6 5,2 6,8 4,2 4,5 1,2

7,2 S 165 000

1,47 0,98 0,0

0,28 0,21

5,1 1,9 6,2

12,2 6,2 6,1

11.0 4,9 7.0 5,3 9,7 2,6 5,0 6,7 4,4 4,6 1.1

Die Aktivität des fibrinstabilisierenden Faktors wird durch einen Verdünnungstest (vgl. Thromb. diathes. haemorrh., 23, 455 [1970]) bestimmt. Man macht sich dabei die unterschiedliche Löslichkeit des vernetzten und (mangels fibrinstabilisierenden Faktors) nicht vernetzten Fibrins in l°/_oiger Chloressigsäure zunutze. Mit steigenden Verdünnungen der zu bestimmenden Lösung werden zunächst aus Faktor-XIII-freiem Fibrinogen mittels Thrombin Fibringerinnsel erzeugt und mit l°/oiger Chloressigsäure inkubiert. Danach wird diejenige Verdünnung, in der das Fibringerinnsel gerade noch erhalten bleibt, bestimmt. Diese ist die Faktor-XHI-Konzentration, die zur Vernetzung gerade ausreicht. In der nächsthöheren Verdünnung löst sich das Fibringerinnsel auf.

Als Bezugssubstanz dient normales menschliches Mischplasma. Die in 1 ml enthaltene Faktor-XIII-Aktivität ist als eine Einheit definiert. Die gesuchte fibrinstabilisierende Aktivität errechnet sich aus dem Verhältnis der Grenzwerte für die Verdünnung von Mischplasma und Testlösung.

Als Anwendung für das erfindungsgemäß erhaltene den Faktor XIII enthaltende Mittel kommen alle Faktor-XIII-Mangelzustände in Frage, wie bei angeborenem Mangel die sich daraus ergebenden haemorrhagischen Syndromen, Blutungen und Wundheilungsstorangen und bei vorübergehendem Faktor-XIII-Mangel, z. B. nach Operationen die daraus resultierende Wundheilungsverzögerung. Das den Faktor XIII enthaltende Mittel wird intravenös injiziert. Man geht zweckmäßig von einer Menge aus, die der Faktor-XIlI-Aktivität von 250 ml frischem Humanplasma emsp™chL Je nach Bedarf kann bis zur vierfachen Menge appliziert werden.

Die folgenden Beispiele illustrieren das erfindungsgemäße Verfahren:

Beispiel 1

1500 kg gefrorene Plazenten vom Menschen (diese

ίο Menge entspricht etwa 2400 Plazenten) werden fein zerkleinert und mit 1500 Liter einer 0,5^e/„igen Natriumchloridlösung verrührt. Das entstandene Gemisch wird auf 10⁰C trwärmt und zentrifugiert. Aus dem gewebefreien Überstand wird die fibrinstabilisierende Aktivität bei pH 6,0 mittels einer 3%igen Diaminoäthoxyacridinlactat-Lösung bis zu einer Konzentration von 8 %, Diaminoäthoxy-acridinlactat bezogen auf Eiweiß, gefällt und durch Zentrifugation isoliert.

Das Zentrifugat wird in 900 Liter Wasser bei

ao pH 7,0 suspendiert, gewaschen und wieder zentrifugiert. Der Rückstand wird in 800 Liter einer 2j5⁰/₀igen Natriumchloridlösung, die noch 0,125% Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält und auf pH 7,5 eingestellt wurde, aufgenommen, verrührt und nach

as 4 Stunden vom Unlöslichen separiert. Der Überstand wird mit Wasser auf 1500 Liter aufgefüllt. Diese Lösung wird mit 30 Liter einer 3°/_oigen N-Cetylpyridiniumchlorid-Lösung bei pH 7,0 versetzt. Dadurch werden Begleitproteine und Mucopolysaccharids ausgefällt. Sie werden durch Zentrifugation entfernt. Zu der überstehenden Lösung werden 75 Liter einer 3°/_oigen Diaminoäthoxy-acridinlactat-Lösung gegeben, wodurch die fibrinstabilisierende Aktivität ausgefällt wird. Nach Abheberung des

Überstandes wird die Diaminoäthoxy-acridinlactat-Fällung mit 100 Liter einer 5°/oig^en Natriumchloridlösung, die 250 g EDTA enthält und einen pH-Wert von 7,5 besitzt, durch 2stündiges Rühren zerlegt. Das abgeschiedene Diaminoäthoxy-acridinlactat-Chlorid trennt man durch Filtration ab. Aus dem Filtrat wird der fibrinstabilisierende Faktor durch Zugabe von 25% festem Ammonsulfat unter Rühren langsam ausgefällt.

Bis zu dieser Ammonsulfatfällung muß die Aufarbeitung der Plazenten möglichst rasch und bei Temperaturen zwischen 5 und 10⁰C erfolgen, um größere Aktivitätsverluste zu vermeiden. Der Niederschlag der Ammonsulfatfällung wird nach 4stündigem Stehen abzentrifugiert.

Zur Weiterreinigung werden 800 g der Ammonsulfatpaste mit 0,01molarer EDTA-Lösung (pH 7,0) zu einem Brei verrührt und bei 4°C gegen einen 0,005molaren Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-(Tris-HCl)-Puffer (pH 7,0), der 0.005 Mol EDTA/1 Puffer und 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Anschließend stellt man die Lösung auf pH 6,0 ein. Die dabei entstehende Fällung wird abgeschleudert und verworfen. Der Überstand wird auf 7,0 eingestellt und mitteis vernetztem Dextran, erhältlich unter dem geschützten Warenzeichen Sephadex gereinigt. Zur Elution dient eine 0,005molare Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,005 Mol EDTA/1 Puffer und 0,1% Natriumazid enthält. Die aktiven Fraktionen werden nach dem Durchlauf gesammelt, und der fibrinstabilisierende Faktor wird daraus mit Ammonsulfat gefällt, wozu 25 g pro 100 ml Eluat erforderlich sind. Der Niederschlag wird isoliert und in 0,005molarem Tris-EDTA-Puffer pH 7,0 gelöst.

Nach 20stündiger Dialyse gegen 0,005molarem Tris-EDTA-Puffer pH 7,0 wird der fibrinstabiüsierende Faktor durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 als Euglobulin ausgefällt. Den durch Zentrifugation entstandenen Rückstand löst man in .iOOml physiologischer Natriumchloridlösung, die 0,01 Mol EDTA/1 Lösung enthält und mit 0,2 n-Natnumhydroxid-Lösung auf pH 7,0 eingesteUt worden war. Nach Zugabe von 10 ml 20%igem Human-Albumin wird die Lösung durch ein bakteriendichtes Filter sterilfiltricrt und nacheinaijder gegen physiologische Natriumchlorid-Lösung und gegen physiologische Natriumchlorid-Lösung mit 0,5% Glukose dialysiert. Man bestimmt nun die fibrinstabiüsierende Aktivität der Lösung im Vergleich mit Humanplasma und verdünnt mit glukosehaltiger Natriumchlorid-Lösung so weit, daß die Aktivität von 4 ml Lösung der Aktivität von 250 bis 300 ml Mischplasma entspricht.

Pro 250 ml Verdünnungslösung setz» man außerdem noch 10 ml 20^e/oiges Human-Albumin zu. Nach Sterilfiltration wird in Portionen zu 4 ml abgefüllt und lyophilisiert.

Die gesamte aus 1500 kg Plazenten gewonnene fibrinstabiüsierende Aktivität liefert 2000 Abfüllungen mit je 250 ml Plasmaaktivität. Um die gleiche Menge an fibrinvernetzender Aktivität aus Plasma zu isolieren, wären etwa 4000 bis 6000 Liter Blut notwendig, was etwa 8 000 bis 12 000 Blutspenden a 500 ml Blut entspräche.

Beispiel 2

1500 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 1500 Liter einer 0,2%igen Natriumchloridlösung verrührt. Das entstandene Gemisch wird auf 10° C erwärmt und zentrifugiert. Aus dem gewebefreien Überstand wird die fibrinstabiüsierende Aktivität bei pH 7,5 mittels einer 3°/_oigen Diaminoäthoxy-acridinlactat-Lösung bis zu 10%, Diaminoäthoxy-acridinlactat bezogen auf Eiweiß, gefällt und durch Zentrifugation isoliert.

Das Zentrifugat wird in 900 Liter Wasser bei pH 7,0 suspendiert, gewaschen und wieder zentrifugiert. Der Rückstand wird in 800 Liter einer 2,5%igen Natriumchloridlösung, die noch 0,125% Nitrilotriessigsäure (NTE) enthält und auf pH 7,5 eingestellt wurde, aufgenommen, verrührt und nach 4 Stunden vom Unlöslichen separiert. Der Überstand wird mit Wasser auf 1500 Liter aufgefüllt. Diese Lösung wird mit 20 Liter einer 3%igen Äthyldimethyl-benzylammoniumchlorid-Lösung bei pH 6,0 versetzt. Dadurch werden Begleitproteine und Mucopolysaccharide ausgefällt. Sie werden durch Zentrifugation entfernt. Zu der überstehenden Lösung werden 100 Liter einer 3%igen Diaminoäthoxy-acridinlactat-Lösung gegeben, wodurch die fibrinstabilisierende Aktivität ausgefällt wird. Nach Abheberung des Ü berstendes wird die Diaminoäthoxy-acridinlactat-Fällung mit 100 Liter einer 5%igen Natriumchloridlösung, die 250 g NTE enthält und einen pH-Wert von 7,5 besitzt, durch 1 stündiges Rühren ierlegr. Das abgeschiedene Diaminoäthoxy-acridinlactat-Chiorid trennt man durch Filtration ab. Aus dem Filtrat wird der fibrinstabiüsierende Faktor durch Zugabe von 25% festem Ammcnsulfat unter Rühren langsam ausgefällt.

Der Niederschlag der Ammonsulfatfällung wird nach 3stündigem Stehen abzentrifugiert.

Zur Weiterreinigung werden 800 g der Ammonsulfatpaste mit 0,01molarer NTE-Lösung (pH 7,0) zu eine/u Brei verrührt und bei 4° C gegen einen 0,005molarenTris(hydroxymethyl)amino-methan-Salzsäure-(Tris-HCl)-Puner (pH 7,0), der 0,005 Mol NTE/1 Puffer und 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Anschließend stellt man die Lösung auf pH 6,0 ein. Die dabei entstehende Fällung wird abgeschleudert und verworfen. Der Überstand wird auf pH 7,0 eingestellt und mittels vernetztem Dextraugel gereinigt. Zur Elution dient eine 0,005molare Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,005 Mol NTEfI Puffer und 0,1% Natriumazid enthält. Die aktiven Fraktionen werden nach dem Durchlauf gesammelt, und der fibrinstabilisierende Faktor wird daraus mit Ammonsulfat gefällt, wozu 25 g pro 100 ml Eluat erforderlich sind. Der Niederschlag wird isoüert und in 0,005moiarem Tris-EDTA-Puffer pH 7,0 gelöst. Nach 20stündiger Dialyse gegen 0,005molarem Tris-EDTA-Puffer pH 7,0 wird der fibrinstabiüsierende Faktor durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 als Euglobulin ausgefällt. Den durch Zentrifugation entstandenen Rückstand löst man in 200 ml physiologischer Natriumchloridlösung, die 0,01 Mol N ΓΕ/1 Lösung enthält und mit 0,2 n-Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt worden war. Nach Zugabe von 10 ml 20%'gem Human-Albumin wird die Lösung durch ein bakteriendichtes Filter sterilfiltriert und nacheinander gegen physiologische Natriumchlorid-Lösung und gegen physiologische Natriumchlorid-Lösung mit 0,5% Glukose dialysiert. Man bestimmt nun die fibrinstabilisierende Aktivität der Lösung im Vergleich mit Humanplasma und verdünnt mit glukosehaltiger Natriumchlorid-Lösung so weit, daß die Aktivität von 4 ml Lösung der Aktivität von 250 bis 300 ml Mischplasma entspricht.

Pro 250 ml Verdünnungslösung setzt man außerdem noch 10 ml 20%iges Human-Albumin zu. Nach Sterilfiltration wird in Portionen zu 4 ml abgefüllt und lyophilisiert.

Beispiel 3

1500 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 1500 Liier einer l,0%igen Natriumchloridlösung verrührt. Das entstandene Gemisch wird auf 10⁰C erwärmt und zentrifugiert. Aus dem gewebefreien Überstand wird die fibrinstabilisierende Aktivität bei pH 5,6 mittels einer 3°/oig^en Diaminoäthoxy-acridinlactat-Lösung gefällt und durch Zentrifugation isoliert.

Das Zentrifugat wird in 900 Liter Wasser bei pH 7,0 suspendiert und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Kälte

a) einen mittels Natriumchlorid-Lösung aus menschlichen Plazenten hergestellten, von festen Verunreinigungen befreiten Extrakt bei pH 5,0 bis 7,5 mit einer Lösung von Diaminoäthoxy-acridinlactat versetzt,

b) den ausgefällten Niederschlag, gegebenenfalls nach mehrmaligem Waschen, in verdünnter Alkalichlorid-Lösung von pH 7,0 bis 8,0, die etwa 5% eines Komplexbildners (bezogen auf Alkalichlorid) enthält, aufnimmt,

c) aus der Lösung, nach Abtrennung unlöslicher Begleitstoffe und gegebenenfalls weiterer Verdünnung, mittels Zugabe einer quartären Ammoniumbase inaktive Begleitstoffe ausfällt,

d) aus dem Filtrat mittels Diaminoäthoxyacridinlactat eine weitere Fällung gewinnt,

c) die Fällung, nach Abtrennung des Überstandes durch Zugabe einer verdünnten Natriumchlorid-Lösung von pH 7,0 bis 8,0, die etwa 5% Komplexbildner (bezogen auf Natriumchlorid) enthält, zerlegt und den Rückstand abtrennt,

f) das Filtrat mit 20 bis 30% festem Ammonsulfat versetzt, den Niederschlag nach einigen Stunden abtrennt, mit verdünnter Komplexbildner-Lösung zu einem Brei verrührt und gegen Tris(hydroxymethyl)amino - methan-Salzsäurepuffer, der außerdem Komplexbildner und Natriumazid enthält, dialysiert,

g) das hinterbleibende Dialysat, nach Abtrennung von Verunreinigungen bei pH 6,0, bei neutralem pH gelfiltriert, aus den aktiven Fraktionen mittels festem Ammonsulfat einen Niederschlag ausfällt und den Miederschlag in neutralem Tris(hydroxymethyl)aminomethan - Äthylendiamintetraessigsäure-Puffer löst,

h) die Lösung gegen neutralen Tris(hydroKymethyl)aminomethan-Äthylendiamintetraessigsäure-Puffer dialysiert, aus der verbleibenden Lösung den Faktor XIIl bei pH etwa 5,0 als Euglobuün ausfällt,

i) den abgetrennten Niederschlag in physiologischer Natriumchlorid-Lösung, die eine geringe Menge Komplexbildner enthält, löst, die Lösung mit einem Stabilisator versetzt, sterilfiltriert, dialysiert, standardisiert und gegebenenfalls lyophilisiert.

Der fibrinstabilisierende Faktor — auch Faktor XIII genannt — spielt bei der Blutgerinnung eine wichtige Rolle. Fehlt er im Blut, so treten bei Verletzungen starke Nachblutungen auf, und die Wundheilung verzögert sich. Der Faktor-XIII-Mangel kann erblich bedingt sein oder als Folge von Krankheiten auftreten, so bei Leberciirhose, Karzinom, Leukämie und Verbrauchskoagulopathie. Diese Zustände können lebensbedrohliche Formen annehmen, besonders γιο Neugeborenen sowie bei Schwangeren, bei denen : Faktor-XIII-Mangel zu Fehlgeburten führt.

Durch Substitution können diese Mangelzustände behoben werden. Dabei hat man sich bisher damit geholfen, daß man Blut, Plasma oder Fibrinogen-

»5 Präparate verwendete. Hiervon muß jedoch jeweils ein größeres Volumen infundiert werden, was in vielen Fällen unerwünscht, zudem lästig und zeitraubend ist. Außerdem werden dem Patienten dabei zwangsläufig Begleitproteine und Blutgruppensubstanzen verab-

»o reicht, die zu Unverträglichkeiten führen können. Es ist daher ein Präparat erwünscht, das eine hohe fibrinstabilisierende Aktivität besitzt, weitgehend frei von Begleitproteinen ist und auch keine Blutgruppensubstanzen enthält.

»5 Es ist bekannt, daß der Faktor XIII im Blutplasma und in Thrombozyten enthalten ist und aus diesen Materialien gewonnen werden kann. Seine Darstellung erfolgte durch Fällung mittels Ammonsulfat, Erhitzen und DEAE-Cellulose-Chromatographie. Die Konzen-

tration des fibnnstabilisierenden Faktors in Plasma ist jedoch niedrig und die Ausbeute des bekannten Verfahrens daher gering. Die Erhitzung, bei der der Faktor XIIl vom Fibrinogen getrennt wird, ist nur mit kleineren Ansätzen durchführbar. Das Verfahren hat daher in die Technik keinen Eingang gefunden und keinerlei Bedeutung erlangt.

Auch ist Plasma als Ausgangsmaterial für die gewerbliche Gewinnung des Faktors XIII zu teuer. Aus dem gleichen Grunde sind auch Thrombozyten

keine Quelle für die industrielle Herstellung des Faktors XIII.

Es wurde nun gefunden, daß man den fibrinstabilisierenden Faktor in guten Ausbeuten aus menschlichen Plazenten isolieren und zu einem intravenös verträglichen Mittel aufarbeiten kann. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung, gekennzeichnet durch die im Patentanspruch wiedergegebenen Verfahrensschritte.

Als quartäre Ammoniumbase [vgl. c)] verwendet man vorzugsweise N-Cetyl-pyridiniumchlorid; außerdem kommen Alkyldimethylbenzyl-ammonium-chlorid und Dichiorbenzyldimethyl-alkylammoniumchlorid in Betracht. Geeignete Stabilisatoren [vgl. i)] sind z. B.

Humanalbumin oder hydrolytisch abgebaute, mittels Isocyanat quervernetzte Gelatine, wie sie unter dem

geschützten Warenzeichen Haemaccel* im Handel erhältlich ist.

Als Komplexbildner [vgl. b), e), f) und i)] kommt

insbesondere Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), außerdem Nitrilotriessigsäure in Frage.

Der im erfindungsgemäß erhältlichen Mittel erhaltene fibrinstabilisierende Faktor unterscheidet sich nicht charakteristisch von dem aus Thrombozyten isolierten, wohl aber von dem aus Plasma isolierten Faktor XIII. Die chemischen und physikalischchemischen Daten sind in folgender Tabelle zusammengestellt :