DE3330573A1 - Verfahren zur herstellung von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile gruppe(n) aufweisenden verbindungen und aktivierte polymere traeger - Google Patents
Verfahren zur herstellung von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile gruppe(n) aufweisenden verbindungen und aktivierte polymere traegerInfo
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Description
333057:
DR. STEPHAN G. BESZgDES ;-PATENTANWALT
VMR: 101265
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AUCH BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT
PROFESSIONAL REPRESENTATIVE ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
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Girozentrale. München)
P 1 793
zur Patentanmeldung
EEAJSAL FHTOMVEGXSZERGYAJR
Budapest, Ungarn
betreffend
Verfahren zur Herstellung von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden
Verbindungen und aktivierte polymere Träger
«=■■
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden
Verbindungen und aktivierte polymere Träger, geeignet zum Immobilisieren von 1 oder mehr nukleophile
Gruppe (n) aufweisenden Verbindung (en), zum Immobilisieren von 1 oder mehr nukleophile Gruppe (n) aufweisenden Verbindungen,
jeweils zum Beispiel Aminosäuren, Peptiden, Proteinen und Kohlehydraten.
' In den letzten Jahren wurden mehrere Verfahren zum Immobilisieren
von Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht und Biopolymeren, zum Beispiel Proteinen, auf einem festen
Träger ausgearbeitet (Zaborsky, 0. E. : Immobilized Enzymes [West E. C, ed.] [1973], CRC Press,'Cleveland Ohio;
Chibata, I.: Immobilized Enzymes [Chibata I., ed.} [1978],
Seiten 9 bis 107, Kodansha Ltd., Tokyo, Goldstein L., Manecke G.: Applied Biochemistry and Bioengineering
{Wingard, L. B., Katchalski-Katzir, E. und Goldstein, L.,
ed.] [1-979], Band 1, Seiten 23 bis 126, Academic Press,
Ine., Uew York).
Die allgemeinen Nachteile der bekannten Verfahren sind zusammengefaßt wie folgt:
A) Es sind spezielle ßeaktionsbedingungen erforderlich.
B) Bei einigen Verfahren wird die Bindung zwischen dem Träger und dem Liganden, unter Verwendung von
speziellen beziehungsweise schwer zugänglichen Kupplungsreagenzien gebildet.
- 7 COPY
C) Einige verwendete. Kupplungsreagenzien, zum Beispiel Thiophosgen, sind äußerst toxisch und machen
. die Anwendung von mit hohem Aufwand verbundenen getrennten Sicherheitsmaßnahmen erforderlich.
·. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren
"zur Herstellung von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindungen und aktivierte polymere
Träger, geeignet zum Immobilisieren von 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindungen), durch welche das
Immobilisieren unter Erzielung äiner kovalente Bindung unter einfachen Bedingungen, mittels weniger toxischer und leicht
zugänglicher Aktivierungsmittel und mit leicht zugänglichen, auch im Betriebsmaßstab herstellbaren, vorteilhafte Eigenschaften
aufweisenden Trägern durchgeführt werden kann, zu
schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung,
daß die Amidgruppen, vor allem Carbonsäureamidgruppen, aufweisenden
Polymere mit Chinonen unter Aktivierung ihrer . Amidgruppen, in Wechselwirkung treten und die so gebildeten
aktivierten Polymere zur Bindung von nukleophile Gruppen aufweisenden Verbindungen durch kovalente Bindungen in vorteilhafter
Weise fähig sind. Diese Peststellung ist um so mehr unerwartet, als die Carbonsäureamide bekanntlich nur
eine geringe Reaktionsfähigkeit aufweisen und auf Grund der
im Schrifttum offenbarten Kenntnisse der Fachmann nicht die Folgerung machen konnte, daß sie nifc Chinonen reagieren würden.
CÖPY - 6 -
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von immobiliserten 1 oder mehr nukleophile
Gruppe(n) aufweisenden Verbindungen durch Aktivieren von in Pufferlösungen eingesetzten polymeren Trägern mit in Lösung
eingesetzten Aktivierungs- beziehungsweise Kupplungsmitteln
und Behandeln der 1 oder mehr nukleophile Gruppe (n) aufweisenden Verbindungen mit den so aktivierten polymeren
Trägern sowie unter Anwendung von Trenn- und Wascharbeitsgängen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als polymerer
Träger ein Amidgruppen aufweisendes Polymer in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3 bis 11, die frei von
Amino-, Sulfhydryl- und/oder Hydroxygruppen aufweisenden
Substanzen ist, gequollen wird, danach die Lösung eines Chinones in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel
in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des Chinones 2 bis 100 Mi THmr/l/i beträgt, zugesetzt wird,
daraufhin die Mischung 0,5 bis 48 Stunden lang bei 273 bis
34-3°£ aktiviert wird, anschließend das nicht umgesetzte
Chinon durch Waschen mit einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und darauffolgend
mit destilliertem Wasser und/oder einer Pufferlösung entfernt wird, danach dem erhaltenen Gel des aktivierten '.
Amidgruppen aufweisenden Polymers eine 0,001 bis 1,0 m Pufferlösung mit einem" pH-Wert von 3 bis 11 der 1 oder mehr
nukleophile Gruppe (n) aufweisenden Verbindung (en) mit niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise eine Pufferlösung
der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden makromolekularen
Verbindung (en) mit einem pH-Wert von 3 bis 11 von einer Konzentration von 3 bis 100 mg/ml zugesetzt wird, die
erhaltene Suspension bei 260 bis 313°K 20 bis 30 Stunden lang
bebrütet wird und danach das Gel abgetrennt und die nicht gebundene
(n) 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisende(n)
Verb indung(en) durch Waschen abgetrennt wird beziehungsweise v/erden.
- 9 COPY
Es können "beliebige Amidgruppen aufweisende Polymere
lind "beliebige Pufferlösungen, im letzteren Fall sofern die
Bedingung erfüllt ist, daß sie keine Substanzen mit Ami no-,·
Sulfhydryl- und/oder Hydroxygruppen enthalten, verwendet
werden.
Der Ausdruck "Polymere" umfaßt auch Copolymere. Als
Amidgruppen aufweisende Polymere können vorteilhaft Acrylamidpolymere
beziehungsweise -copolymere wie Acrylamid/ΪΤ,ΙίΤ1-
-Methylen-bis-(acrylamid)-Copolymere, eingesetzt werden.
Vorzugsweise wird beziehungsweise werden als Pufferlösung(en) für das Amidgruppen aufweisende Polymer und/oder
die 1 oder mehr nukleophile Gruppe (n) aufweisende(n) Verbindung(en)
mit niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise makromolekulare(n) Verbindung(en) [eine] solche mit einem
pH-Wert von 6 bis 8 verwendet.
Vorteilhaft kann als Pufferlösung für das Amidgruppen aufweisende Polymer eine Kaliumphosphatpufferlösung eingesetzt
werden.
Vorteilhaft kann als Pufferlösung für die 1 oder mehr
nukleophile Gruppe(n) aufweisende(n) Verbindung(en) mit
niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise makromolekularein) Verbindung (en) eine Kalium/Natrium-phosphat-Puff erlösung,
Uatriumformiatpufferlösung oder Fatriumcarbonat/Entriumbicarbonat-PufferlÖ3ung
eingesetzt werden.
Es ist auch bevorzugt, als Chinon p-Benzochinon zu verwenden.
Als Lösungsmittel, in welchen das Chinon eingesetzt wird,
kann beziehungsweise können vorteilhaft, gegebenenfalls
COPY
- 10 -
-3-330b'/3
wäßrige, Alkenole mit 1 bis 3 Kohlenstoff atom (en) oder, gegebenenfalls
wäßriges, Dioxan oder Gemische von solchen verwendet werden.
Ferner ist es bevorzugt, die Lösung des Chinones in einer solchen Menge zu verwenden, daß dessen Endkonzentration
4-0 bis 60 Millimol/1 beträgt.
Weiterhin ist es bevorzugt, das Aktivieren der Mischung aus der Pufferlösung des als Träger dienenden Amidgruppen
aufweisenden Polymers und der Lösung- des Chinones bei 310
bis 33O°K durchzuführen.
Außerdem ist es bevorzugt, das Aktivieren der Mischung aus der Pufferlösung des als Träger dienenden Amidgruppen
aufweisenden Polymers und der Lösung des Chinones 20 bis 30 Stunden, insbesondere 2A Stunden, lang durchzuführen.
Vorteilhaft kann zum Waschen des als Träger dienenden aktivierten Amidgruppen aufweisenden Polymers als Gemisch
von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wäßriges Dioxan, insbesondere 20 vol.-%-iges
wäßiiges Dioxan, verwendet werden.
Vorteilhaft kann zum Waschen des als Träger dienenden aktivierten Amidgruppen aufweisenden Polymers als Pufferlösung
eine Phosphatpufferlösung verwendet werden.
Der als Träger dienende aktivierte Amidgruppen aufweisende Träger kann in feuchtem Zustand oder lyophilisiert
gelagert werden.
Zweckmäßig wird der pH-Wert der Lösung der 1 oder mehr
nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindung(en) mit
niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise makromolekularen Verbindung(en) nach deren Stabilität innerhalb des oben
festgeigten Bereiches gewählt.
- 11 - '
COPY
Vorteilhaft wird im Falle von 1 oder mehr nukleophile
Gruppe(n) aufweisenden Verbindung(en) mit niedrigem Molekulargewicht
eine solche Lösung derselben mit einer Konzentration von 0,005 "bis 0,05 Mol/l, insbesondere 0,01 Mol/l,
verwendet.
. Vorteilhaft wird im Falle von 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden makromolekularen Verbindung(en) eine
solche Lösung derselben mit einer Konzentration von 10 bis 30 mg/ml, insbesondere 20 mg/ml, verwendet.
Vorzugsweise wird das Bebrüten der erhaltenen Suspension der 1 oder mehr nukleophile Guppe(n) aufweisenden Verbindungen)
mit · niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise . makromolekularen Verbindung(en) und des als Träger dienenden
aktivierten Amidgruppen aufweisenden Polymers bei 260 bis
280°K durchgeführt.
Es ist auch bevorzugt, das Bebrüten der erhaltenen Suspension
der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindung(en) mit niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise
makromolekularen Verbindung(en) und des als Träger dienenden aktivierten Amidgruppen aufweisenden Polymers
22 bis 26 Stunden, insbesondere 24 Stunden, lang durchzuführen.
Vorteilhaft wird zum Waschen des erhaltenen Geles der
immobilisierten 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindung (en) eine, gegebenenfaLLc Natriumchlorid, -·
vorzugsweise in einer Menge von 0,8 bis 1,2 Mol/l, insbesondere 1,0 Mol/l, enthaltende, Pufferlösung, vorzugsweise
Natriumacetatpufferlösung, insbesondere mit einer Natriumacetatkonzentration
von 0,05 bis 0,15 Mol/l, ganz besonders 0,1 Mol/l, verwendet. Ferner ist es vorteilhaft, daran anschließend
mit einer Natriumbicarbonatlösuiig, vorzugsweise
mit einer Konzentration von 0,05 t>is 0,15 Hol/l, insbe-
COPY
- 12 sondere 0,1 Mol/l, zu waschen.
Gegenstand "der Erfindung sind auch aktivierte polymere
Träger geeignet zum Immobilisieren von 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbin dung(en), welche durch
Aktivieren von in Pufferlösungen eingesetzten polymeren
Trägern mit in Lösung eingesetzten Aktivierungs- beziehungsweise Kupplungsmitteln sowie unter Anwendung von Trenn- und
Wascharbeitsgängen erhalten worden sind und dadurch gekennzeichnet
sind, daß zu ihrer Herstellung als polymerer Träger ein Amidgruppen aufweisendes Polymer in einer Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 3 bis 11, die 'frei von Amino-, Sulfhydryl- und/oder Hydroxygruppen aufweisenden Substanzen
ist, gequollen worden ist, danach die Lösung eines Chinones in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel
in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des Chin ο nes
2 bis 100 Millimol/1 beträgt, zugesetzt worden ist,
daraufhin die Mischung 0,5 bis 48 Stunden lang bei 273 bis
34-3°K aktiviert und anschließend das nicht umgesetzte
Chinon durch Waschen mit einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und darauffolgend
mit destilliertem Wasser und/oder einer Pufferlösung entfernt worden ist.
Die obigen Bevorzugungen gelten, soweit sie die Herstellung der als Träger dienenden aktivierten 1 oder mehr
Amidgruppe(n) aufweisenden Polymere selbst betreffen, auch hier.
Die Erfindung bringt vor allem die folgenden Vorteile mit sich:
a) Die gebildete Bindung ist stabil.
b) Has erfindungsgemäße Verfahren kann unter Ver-
- 13 COPY
Wendung von leicht zugänglichen Substanzen durchgeführt
werden.
c) Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Anwendung
■■·. " .mit einem weiten Bereich von verschiedenen Trägern
geeignet.
. d) Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungs-
; gemäßen aktivierten polymeren Träger sind in einem weiten pH-Bereich anwendbar.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Es wurden 0,1 g eines Xerogeles eines Acrylamid/ΪΓ,ΪΓ-
-Methylen-bis(acrylamid)-Copolmers [Akrilex P-100 Xerogel,
Hersteller: Reanal Finomvegyszergyär, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert = o)
suspendiert, worauf 1,0 ml einer 0,25 m Lesung von p-Benzochirxn
in 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan zugesetzt und die Suspension
24 Stunden lang auf 32J0K gehalten wurde. Das gequollene
Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend mit 70 ml 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 70 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
Das aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter filtriert und es wurden ihm 2,0 ml einer 0,01 m Lösung von
cf-Aminobuttersäure in einer 0,1 m Kalium/Natrium-phosphat-
-Pufferlösung (pH-Wert = 7*5) zugesetzt. Die Suspension
wurde 24 Stunden lang bei 277°K bebrütet, das Gel wurde abgetrennt und die nicht gebundene (y-Aminobuttersäure wurde
durch aufeinanderfolgendes Waschen mit einer 1,0 Mol/l
COPY - 14 -
Natriumchlorid enthaltenden 0,1 ι Uatriumacetatpuff erlösung
(pH-Wert = 5,0) und einer 0,1 m Natriumbicarbonatlösung
(pH-Wert = 9,5) entfernt- Die Menge der gebundenen ^-Amino-"buttersäure
betrug 4-,O Mikromol, was einer Ausbeute von
20%, bezogen auf die in das Reaktionsgemisch eingeführte
ν-Aminobuttersäuremenge, entspricht.
Es wurde 0,1 g eines Xerogeles eines Acrylamid/UjIT1-
-Methylen-bis-(acrylamid)-Copolymers [Akrilex P-100 Xerogel,
Herstellen Reanal Einomvegyszergyär, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert =8,0) '
suspendiert, worauf 1,0 ml einer 0,25 m Lösung von p-Benzochinon in 20 vol.-%-igem Dioxan zugesetzt und die Suspension
24 Stunden lang bei 323°K stehengelassen wurde. Das gequollene
Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend mit 70 ml 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 70 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
Das aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter filtriert
und es wurden ihm 2,0 ml einer eine Konzentration von 20 mg/ml aufweisenden Lösung von Hinderserumalbumin in
einer 0,1 m Natriumformiatpufferlösung (pH-Wert = 3,0) zugesetzt.
Die Suspension wurde 24 Stunden lang bei'2770K "bebrütet..
Das Gel wurde abgetrennt und das nicht gebundene Rinderserumalbumin wurde durch aufeinanderfolgendes Waschen
mit einer 1,0 Hol/l Natriumchlorid enthaltenden 0,1 m ITatriumac
etatpuff erlösung (pH-V/ert = 5»0) und eine? 0,1 m Uatriumbicarbonatlösung
(pH-Wert =8,5) entfernt. Die Menge des gebundenen Rinderserumalbumines betrug 10 mg, was einer
Ausbeute 'von 25%, bezogen auf das dem Reaktionsgemisch zugesebzte
Rinderserumalbumin, entspricht.
- 15 - " COPY
Es wurde 0,1 g eines Xerogeles eines Acrylamid/Ιϊ,ϊΓ-
-Methylen-bis-(acrylamid)-Copolymers CAkrilex P-100 Xerogel,
Hersteller: Reanal Finomvegyszergyar, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert = = 8,0) suspendiert, vorauf 1,0 ml einer 0,25 m Lösung von
p-Benzochinon in 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan zugesetzt
wurde und die Suspension 24- Stunden lang auf 323°K gehalten
wurde. Das gequollene Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend mit 70 ml 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 70 ml
destilliertem Wasser gewaschen.
Das aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter filtriert und es wurden ihm 2,0 ml einer eine Konzentration
von 20 mg/ml aufweisenden Lösung von Rinderserumarbumin in
einer 0,1 m Kalium/Natrium-phosphat-Pufferlösung (pH-Wert =
= 6,0) zugesetzt. Die Suspension wurde 24- Stunden lang "bei
277 E "bebrütet. Das Gel wurde abgetrennt und das nicht' gebundene
Rinderserumalbumin wurde durch aufeinanderfolgendes
Waschen mit'einer 1,0 Mol/l ITatriumchloird enthaltenden
0,1 m ITatriumacetatpufferlösung (pH-Wert = 5*0) und
einer 0,1 m Natriumbicarbonatlösung (pH-Wert = 8,5) entfernt. Die Menge des gebundenen Rinderserumalbumines betrug
4,5 mg, was einer Ausbeute von 11,25%, bezogen auf die in das Reaktionsgemisch eingeführte Rinderserumalbuminmenge,
entspricht.
Es wurde 0,1 g eines Xerogelcs eines Acrylamid/ΙΤ,ΙΓ1 -Methylen-bis-(acrylnmid)-Copolymer
r, [Akrilox P-100 Xerogel,
COPY - 1'>
-
Hersteller: Reanal Finomvegyszergyar, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert = 8,0) suspendiert, worauf 1,0 ml einer 0,25 m Lösung von p-Benzochinon
in 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan zugesetzt und die Suspension 24 Stunden lang auf 323°K gehalten wurde. Das gequollene
Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend mit
70 ml 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 70 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
Das aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter filtriert und es wurden ihm 2,0 ml einer eine Konzentration von
20 mg/ml aufweisenden Lösung von Rinderserumarbumin in einer
0,1 m Natriumcarbonat/Fatriumbicarbonat-Pufferlösung
(pH-Wert = 9»0) zugesetzt. Die Suspension wurde 24 Stunden
lang bei 277°K bebrütet.. Das Gel wurde abgetrennt und das
nicht gebundene Rinderserumalbumin durch aufeinanderfolgendes
Waschen mit einer 1,0 Mol/l Natriumchlorid enthaltenden 0,1 m Natriumacetatpufferlösung (pH-Wert = 5»0) und. einer ,
0,1 m Natriumbicarbonatlösung (pH-Wert =8,5) entfernt. Die Henge des gebundenen Rinderserumalbumines betrug 5»0 mg,
was einer Ausbeute von 12,5%, bezogen auf die in das Reaktionsgemisch eingeführte Rinderserumalbuminmenge, entspricht.
Es wurde 0,1 g eines Xerogeles eines Acrylamid/ΙΤ,ΙίΓ-
-Methylen-bis-(acrylamid)-Copolymers [Akrilex P-100 Xerogel,
Hersteller: Reanal Firiomvegyszergyar, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert = = 8,0) suspendiert, worauf 1,0 ml eint.r 0,25 m Lösung von
p-Benzochinon in 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan zugesetzt
und die Suspension · 24 Stunden lang auf 323 2 gehalten wurde.
Das gequollene Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend
- 17 COPY
mit 70 ml , 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 70 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
Das aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter filtriert,
worauf ihm 2,0 ml einer eine Konzentration von ' 20 mg/ml aufweisenden Lösung von Glucoseoxydasein einer
0,1 m. Kalium/Natrium-phosphat-Pufferlösung (pH-Wert = 7-,5)
zugesetzt wurden. Die Suspension wurde 24 Stunden lang "bei
277°2 "bebrütet, .das Gel wurde abgetrennt und das nicht ge-
\bundene Protein wurde durch aufeinanderfolgendes Waschen mit einer 1,0 Mol/1 Natriumchlorid enthaltenden 0,1 m
Uatriumacetatpufferlösung (pH-Wert = 5>0) und. einer 0,1 m
Katriumbicarbonatlösung (pH-Wert =8,5) entfernt.
Die Menge des an das Gel gebundenen Proteines betrug 4,5 ms und- die Aktivität war 7,2 Einheiten/g Xerogel. Eine
solche Einheit entspricht der Enzymmenge, welche bei einem pH-Wert von 7*0 und einer Temperatur von 2980K die Oxyda-7
tion von 1,0 Mikromol ß-D-Glukose/Minute katalysiert. Die spezifische Aktivität des gebundenen Enzymes betrug 8% der
spezifischen Aktivität des gelösten Enzymes.
Es wurde 0,1 g eines Xerogeles eines Acrylamid/ΪΓ,Ιί'-
-Methylen-bis-(acrylamid)-Copolymers [Akrilex P-100 Xerogel,
Hersteller: Reanal Finomvegyszergyär, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert =
= 8,0) suspendiert, worauf 1,0 ml einer 0,25 m Lösung von p-Benzochinon in 20 vol-%-igem wäßrigem Dioxan zugesetzt
und die Suspension 24 Stunden lang auf 323°K gehalten wurde. Das gequollene Gel wurde ab£cbrennt und aufeinanderfolgend
mit 70 ml 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 70 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
COPY
W WU V^ / SJ
Das aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter filtriert
und es wurden ihm 2,0 ml einer eine Konzentration von 20 mg/ml aufweisenden Lösung von Katalase in einer 0,1 m
Kalium/Natrium-phosphat-Pufferlösung (pH-Wert = 7,5) zugesetzt.
Die Suspension wurde 2Ά- Stunden lang bei 277°& "bebrütet,
das Gel wurde abgetrennt und das nicht gebundene Protein wurde durch aufeinanderfolgendes Waschen mit einer
1,0 Mol/l Natriumchlorid enthaltenden 0,1 m Hatriumacetatpufferlösung
(pH-Wert = 5t0) und einer 0,1 m Natriumbicarbonatlösung
(pH-Wert = 8,5) entfernt.
Die Menge des an das Gel gebundenen Proteines betrug 5,3 mg und die Aktivität war 2 100 Einheiten/g Xerogel.
Eine solche Einheit entspricht der Enzymmenge, welche bei einer Temperatur von 2980K die Zersetzung von 1 Mikromol
Wasserstoffρeroxyd/Minute katalysiert. Die spezifische Aktivität
des gebundenen Enzymes betrug 2% der spezifischen Aktivität des gelösten Enzymes.
Es wurde 0,1 g eines Xerogeles eines Acryl amid/H", IT-.
-Methylen-bis-(acryla-mid)-Copolymers- CAkrilex P-100 Xerogel,
Hersteller: Eeanal Finomvegyszergyar, Budapest, Ungarn] in
4,0 ml einer 0,1 m Sörensen-Pufferlösung (pH-Wert =
= 8,0) suspendiert, worauf 1,0 ml einer 0,25 m Lösung von p-Benzochinon in 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan zugesetzt
und die Suspension 24 Stunden lang auf 3>23°K gehalten wurde.
Das gequollene Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend
mit 70 ml 20 vol.-%-igem wäßngem Dioxan und 70 ml destilliertem
Wasser gewaschen.
Daa aktivierte Gel wurde durch ein Vakuumfilter, fil-
CQPY
■ - 19 -
triert und es wurden ihm 2,0 ml einer 0,01 m Lösung von Glucose
in einer 0,1 m Kalium/Hatrium-phosphat-Pufferlösung
(pH-Wert = 7»5) zugesetzt. Die Suspension wurde 24 Stunden
lang "bei 277°K "bebrütet. Das Gel wurde abgetrennt und die
nicht gebundene Glucose wurde durch aufeinanderfolgendes
Vaschen mit einer 1,0 Mol/l Natriumchlorid enthaltenden 0,1 m ITa triumac etatpuff erlösung (pH-Wert = 5*0) und einer
0,1 m Hatriumbicarbonatlösung (pH-Wert = 8,5) entfernt. Di« Menge der gebundenen Glucose betrug 6 Mikromol, was einer
Ausbeute von 30%, bezogen auf die in das Eeaktionsgemisch
eingeführte Glucosemenge, entspricht.
Es wurden JO g eines Xerogeles eines Acrylamid/ΪΓ,ΙΓ-
-Methylen-bis-(acrylamid)-Copolymers [Akrilex P-100 Xerogel,
Hersteller: Keanal ITinomvegyszergyar, Budapest, Ungarn] in
1 200 ml einer 0,1 m Kaliumphosphatpufferlösurg oder Sörensen-
-Püfferlösung (jeweils pH-Wert = 8) suspendiert, worauf 300 ml einer
0,25 m Lösung von p-Bmzochiron in 20 vaL-%-igem. wäßrigen. Dioxan'zugesetzt
wurden und'd*iß Suspension 24 Stunden lang auf 323°& gehalten
wurde. Das gequollene Gel wurde abgetrennt und aufeinanderfolgend mit 3 1 20 vol.-%-igem wäßrigem Dioxan und 10 1 destilr
liertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde I70-philisiert.
So wurden 24,3 S aktivierter Träger erhalten.
COPY
Claims (14)
- Γ-Α·Λ*ϋPatentansprücheVerfahren zur Herstellung von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindungen durch Aktivieren von in Pufferlösungen eingesetzten polymeren Trägern mit in Lösung eingesetzten Aktivie-' ' rungs- beziehungsweise ·Kupplungsmitteln und Behandeln der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindungen mit den so aktivierten polymeren Trägern sowie unter Anwendung von Trenn- und Wascharbeitsgängen, dadurch gekennzeichnet, daß man als polymeren /Träger ein Amidgruppen aufweisendes Polymer in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3 "bis 11, die frei von Amino-, Sulfhydryl- und/oder Hydroxygruppen aufweisenden Substanzen ist, quellt, danach ob Lösung .eines Chinones in einem mit Wasser mischbaren or-• ganischen Lösungsmittel in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des Chinones 2 bis 100 MilUmoVl beträgt, zusetzt; daraufhin die Mischung 0,5 "bis 4-8 Stunden lang bei 273 bis 34-3°K aktiviert, anschließend das nicht umgesetzte Chinon durch Waschen mit einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und darauffolgend mit destilliertem Wasser und/oder einer Pufferlösung entfernt, danach dem erhaltenen Gel des'aktivierten Amidgruppen aufweisenden Polymers eine 0,001 bis 1,0 m Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3 bis 11 der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindungen) mit niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise eine Pufferlösung der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden makromolekularen Verbindung (en) mit einem pH-Wert von 3 bis 11 von einer Konzentration von 3 bis 100 ηg/ml zusetzt, die erhaltene Suspension bei 260 bis 313°K 20 bis 30 Stunden lang bebrütet und d.··; ach das Gel r-'obrennt und dieCOPY- A-nicht gebundene (η) 1 oder mehr nukleophile Gruppe (n) aufweisende(n) Verbindung(en) durch Waschen abtrennt.
- 2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pufferlösung(en) für das Amidgruppen aufweisende Polymer und/oder die 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisende(n) Verbindung(en) mit niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise makromolekulare(n) Verbindung(en) [eine] solche mit einem pH-Wert von 6 bis 8 .verwendet.
- 3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chinon p-Benzochinon verwendet.
- 4.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung des Chinones in einer solchen Menge verwendet, daß dessen Endkonzentration 40 bis 60 Millimol/1 beträgt.
- 5-) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Aktivieren der Mischung aus der Pufferlösung des als Träger dienenden Amidgruppen auf weisenden Polymers und der Lösung des Chinones bei 310 bis 33O0K durchführt.
- 6.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man das Aktivieren der Mischung aus der Pufferlösung des als Träger dienenden Amidgruppen aufweisenden Polymers und der Lösung des Chinones 20 bis JO Stunden lang durchführt.
- 7.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bebrüten der erhaltenen Suspension der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindung(cn) mit niedrigem MolekulargewichtCOPY. 3-beziehungsweise makromolekularen Verbindung(en) und des als Träger dienenden aktivierten Amidgruppen aufweisenden Polymers bei 260 bis 28O°K durchführt.
- 8.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bebrüten der erhaltenen Sus-. pension der 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindung (en) mit niedrigem Molekulargewicht beziehungsweise makromolekularen Verbindung(en) .und ■ des als Träger dienenden aktivierten Amidgruppen auf-■■·'■■ weisenden Polymers 22 bis 26 Stunden lang durchführt.
- 9.) Aktivierte polymere Träger, geeignet zum Immobilisieraa von 1 oder mehr nukleophile Gruppe(n) aufweisenden Verbindung(en), welche durch Aktivieren von in Pufferlösungen eingesetzten polymeren Trägern mit in Lösung eingesetzten Aktivierungs- beziehungsweise Kupplungsmitteln sowie unter Anwendung von Trenn- und Wascharbeitsgängen erhalten worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung als polymeren Träger ein Amidgruppen aufweisendes Polymer in einer Pufferlösüng mit einem pH-Wert von 3 bis 11, die frei von Amino-, Sulfhydryl- und/oder Hydroxygruppen aufweisenden Substanzen ist, gequollen worden ist, danach die Lösung eines Chinones in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des Chinones 2 bis • 100 MiUiscO/l beträgt, zugesetzt worden ist, daraufhin die Mischung 0,5 bis 48 Stunden lang bei 273 bis 3430K aktiviert und anschließend das nicht unbesetzte Chinon durch Waschen mit einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und darauffolgend mit destillierten Wasser' und/oder einer Pufferlösung entfernt worden ist.;■*.■-. COPY
- 10.) Träger nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß als Pufferlösung für das Amidgruppen aufweisende Polymer eine solche mit einem pH-Wert von 6 bis 8 verwendet worden ist.
- 11.) Träger nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Chinon p-Benzochinon verwendet worden ist.
- 12.) Träger nach Anspruch 9 "bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des Chinones in einer solchen Menge verwendet worden ist, daß dessen Endkonzentration 40 bis 60 Millimol/1 beträgt.
- 13·) Träger nach Anspruch 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Aktivieren der Mischung aus der Pufferlösung des als Träger dienenden Amidgruppen aufweisenden Polymers und der Lösung,des Chinones bei 310 bis 330 K durchgeführt worden ist.
- 14.) Träger nach Anspruch 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Aktivieren der Mischung aus der Pufferlösung des als Träger dienenden Amdigruppen aufweisenden Polymers und der Lösung des Chinones 20 bis 30 Stunden lang durchgeführt worden ist.Beschreibung
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Cited By (2)
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| AT395252B (de) * | 1989-04-04 | 1992-11-10 | Pittner Fritz | Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen an einem traeger |
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