JPS5998045A - 求核性基を含有する化合物の固定化方法 - Google Patents
求核性基を含有する化合物の固定化方法Info
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- JPS5998045A JPS5998045A JP58152572A JP15257283A JPS5998045A JP S5998045 A JPS5998045 A JP S5998045A JP 58152572 A JP58152572 A JP 58152572A JP 15257283 A JP15257283 A JP 15257283A JP S5998045 A JPS5998045 A JP S5998045A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
- C08F8/28—Condensation with aldehydes or ketones
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
- C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
- C08F8/32—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups by reaction with amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/087—Acrylic polymers
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
との発明は、求核性基を含有する化合物の固定化方法に
関する。さらに詳しくは、この発明は、求核性基、例え
ばアミノ酸、ペプチド、蛋白質。
関する。さらに詳しくは、この発明は、求核性基、例え
ばアミノ酸、ペプチド、蛋白質。
炭水化物等を含有する化合物の固定化方法に関する。
（従来技術）
従来、固相担体に低分子化合物又は生物重合体〔例えば
蛋白質〕を固定化するための方法が提案されている〔ツ
ァボルｘキ（Ｚａｂ’ｏｒｓｋｙ ００Ｒ９（１９７３
） 「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＥｎｚｙｍｅｓＪ
（ウェスト（Ｗｅｇｔ） Ｒ，Ｃ，編）、 ＣＲＣＰ
ｒｅｓｓ、 クレグランド、オヒオ；テハタ１．（１９
７８） 「Ｉｍｍｏ −ｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍ
ｅＪ （テハｊｌ １． 編） ＊ ９〜１０７貞、
講談社、東京；ゴールドスタイン（Ｇｏｌ ｄｓ ｔｅ
ｉｎ ） Ｌ、、 マネブＩｒ （Ｍａｎｅｃｋｅ
） Ｇ。
蛋白質〕を固定化するための方法が提案されている〔ツ
ァボルｘキ（Ｚａｂ’ｏｒｓｋｙ ００Ｒ９（１９７３
） 「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＥｎｚｙｍｅｓＪ
（ウェスト（Ｗｅｇｔ） Ｒ，Ｃ，編）、 ＣＲＣＰ
ｒｅｓｓ、 クレグランド、オヒオ；テハタ１．（１９
７８） 「Ｉｍｍｏ −ｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍ
ｅＪ （テハｊｌ １． 編） ＊ ９〜１０７貞、
講談社、東京；ゴールドスタイン（Ｇｏｌ ｄｓ ｔｅ
ｉｎ ） Ｌ、、 マネブＩｒ （Ｍａｎｅｃｋｅ
） Ｇ。
（１９７９） 「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｍｉ９
ｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪ ｒ）
＜ ｙガード（Ｗｉｎｇａｒｄ）Ｌ、Ｂ。、カツアルス
キーーカテｋ （Ｋａ ｔ ｈａ ］ ｓｌ（ｉ −Ｋ
ａｔｚｉｒ） Ｅ、及びゴールドスタインＬ、編、第１
巻、２３〜１２６頁、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ社。
ｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪ ｒ）
＜ ｙガード（Ｗｉｎｇａｒｄ）Ｌ、Ｂ。、カツアルス
キーーカテｋ （Ｋａ ｔ ｈａ ］ ｓｌ（ｉ −Ｋ
ａｔｚｉｒ） Ｅ、及びゴールドスタインＬ、編、第１
巻、２３〜１２６頁、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ社。
ニューヨーク〕。
これらの方法の一般的欠点を次のように要約することが
できる。
できる。
０ 特別の反応条件が必要である。
０ 幾つかの方法においては、担体とリガンドとの間の
反応が特別のカップリング剤により形成される。
反応が特別のカップリング剤により形成される。
０ カップリング剤の幾つかは毒性の高い化合物（例え
ばチオホスゲン〕であシ、従って特別な。
ばチオホスゲン〕であシ、従って特別な。
そして高価な安然性措置を構しなければならない。
（発明の目的）
この発明は、公知方法の欠点を克服することを目的とし
、そして実質上毒性を有しない活性化剤を用いて、求核
性基を含有する化合物を、工業的に製造し得る入手の容
易な有利な担体に共有結合を介して単純な条件下で固定
化するための容易に実施し得る方法を提供することを目
的とする。
、そして実質上毒性を有しない活性化剤を用いて、求核
性基を含有する化合物を、工業的に製造し得る入手の容
易な有利な担体に共有結合を介して単純な条件下で固定
化するための容易に実施し得る方法を提供することを目
的とする。
この発明は、アミド基を含有する重合体がキノンと相互
反応し、そしてこうして形成された活性化重合体は求核
性基を含有する化合物と共有結合によ多結合することが
できるという驚くべき知見に基礎を置いている。
反応し、そしてこうして形成された活性化重合体は求核
性基を含有する化合物と共有結合によ多結合することが
できるという驚くべき知見に基礎を置いている。
カルボン酸アミドはむしろ反応性に乏しい化合物である
として知られてお夛、そして従来技術の状態を基礎にす
れば当業者は前記化合物とキノンが反応することを予想
することはできなかったであろうから、上記の知見は全
く予想外のことである。
として知られてお夛、そして従来技術の状態を基礎にす
れば当業者は前記化合物とキノンが反応することを予想
することはできなかったであろうから、上記の知見は全
く予想外のことである。
この発明に従えば、求核性基含有化合物の固定化は１次
の２段階により行われる。
の２段階により行われる。
（１）アミド基含有重合体を、３〜１１のｐＨ値、好ま
しくは６〜８のｐＨ値を有する緩衝液中で膨潤せしめる
。この発明の方法においては任意の重合体を使用するこ
とができる。同様に、この発明のために任意の緩衝ｇを
用いることができる。但し、アミノ基、スルヒドリル基
及び／又はヒドロキシル基を含有する化合物を含んで成
る緩衝ｇは除かれる。次に、任意の適当な水混和性有機
溶剤と共に形成されるキノン溶ａｔ加える。キノンとし
てｐ−ベンゾキノンを使用し、有機溶剤としてエタノー
ル又はジオキサンを使用するのが好ましい。溶液中のｐ
−ベンゾキノンの最終濃度を２〜２００ミリモル、好ま
しくは４０〜６０ミリモルとする。活性化を２７３″に
−３４５″Ｋ （０℃〜７０℃）において行い、この反
応時間２０．５〜４８時間、好ましくは２４時間とする
。未反応の通剰ｐ−ベンゾキノンを、水と水混和性有機
溶剤との混合物、好ましくは２０％ジオキサンによ）洗
浄し、そして次に緩衝液によシ洗浄することによシ除去
する。活性化された相体は、湿潤形で又は凍結乾燥形で
貯蔵することができる。
しくは６〜８のｐＨ値を有する緩衝液中で膨潤せしめる
。この発明の方法においては任意の重合体を使用するこ
とができる。同様に、この発明のために任意の緩衝ｇを
用いることができる。但し、アミノ基、スルヒドリル基
及び／又はヒドロキシル基を含有する化合物を含んで成
る緩衝ｇは除かれる。次に、任意の適当な水混和性有機
溶剤と共に形成されるキノン溶ａｔ加える。キノンとし
てｐ−ベンゾキノンを使用し、有機溶剤としてエタノー
ル又はジオキサンを使用するのが好ましい。溶液中のｐ
−ベンゾキノンの最終濃度を２〜２００ミリモル、好ま
しくは４０〜６０ミリモルとする。活性化を２７３″に
−３４５″Ｋ （０℃〜７０℃）において行い、この反
応時間２０．５〜４８時間、好ましくは２４時間とする
。未反応の通剰ｐ−ベンゾキノンを、水と水混和性有機
溶剤との混合物、好ましくは２０％ジオキサンによ）洗
浄し、そして次に緩衝液によシ洗浄することによシ除去
する。活性化された相体は、湿潤形で又は凍結乾燥形で
貯蔵することができる。
（２）求核性基を含有する化合物の固定化を、化合物の
安定性に依存してｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ６〜８
において行う。求核性基を含有する化合物の溶液を活性
化されたゲルに加える。低分子化合物は（＋、ｏｏｉに
１．ｏモル、好ましくは０．０１モルの溶液の形で加え
、他方高分子化合物は３〜１０’Ｏｍ８／−１好ましく
は２０巧／−の濃度の溶液として加える。２７３’に〜
５１３°Ｋ（０’Ｃ〜４０℃）、好寸シクハ２６０’
Ｋ〜２８０°Ｋ（−１３℃〜７℃〕においてカップリン
グ反応を行う。反応時間を２４時間とする。
安定性に依存してｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ６〜８
において行う。求核性基を含有する化合物の溶液を活性
化されたゲルに加える。低分子化合物は（＋、ｏｏｉに
１．ｏモル、好ましくは０．０１モルの溶液の形で加え
、他方高分子化合物は３〜１０’Ｏｍ８／−１好ましく
は２０巧／−の濃度の溶液として加える。２７３’に〜
５１３°Ｋ（０’Ｃ〜４０℃）、好寸シクハ２６０’
Ｋ〜２８０°Ｋ（−１３℃〜７℃〕においてカップリン
グ反応を行う。反応時間を２４時間とする。
緩＠液及び１．０モルの塩化すｌラムを含有する緩衝液
によ勺それぞれ数回ずつ洗浄することによ勺求核性基含
有非結合化合物を除去する。
によ勺それぞれ数回ずつ洗浄することによ勺求核性基含
有非結合化合物を除去する。
この発明の方法は次のような利点を有する。
０ 安定な結合が形成される。
０ 容易に入手し得る物＠を用いて実施することができ
る。
る。
０ 広範囲の担体を使用することができる。
０ 広い岬範囲において実施することができる。
次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但し
、これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
、これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
例１
３０ＦのアクリレックスＰ−１００キセロゲル（Ａｋｒ
ｉｌｅｘ Ｐ−１００ｘｅｒｏｇｅｌ） （アクリルア
ミド−Ｎ、Ｎ／−メテレンービスーアクリルアミドオ貼
重合体）ｉ１２００＋＋＋６の０．１Ｍ燐酸カリウムナ
トリウム緩衝ｆｆ（ｐＨ＝８）中に懸濁し、次に２０％
ジオキサン中０．２５ＭＴ）−べ／ゾキノンの溶液（３
００ｍｇ）を加え、）腎濁液を３２３°Ｋ （５０℃）
にて２４時間置く。膨潤したゲルを回収し、そして２０
にジオキサン３を及び蒸留水ＩＣｌＡｔ用いて逐次洗浄
する。洗浄したゲル金凍結乾燥する。こうして２４．３
．ｇの活性化担体を得る。
ｉｌｅｘ Ｐ−１００ｘｅｒｏｇｅｌ） （アクリルア
ミド−Ｎ、Ｎ／−メテレンービスーアクリルアミドオ貼
重合体）ｉ１２００＋＋＋６の０．１Ｍ燐酸カリウムナ
トリウム緩衝ｆｆ（ｐＨ＝８）中に懸濁し、次に２０％
ジオキサン中０．２５ＭＴ）−べ／ゾキノンの溶液（３
００ｍｇ）を加え、）腎濁液を３２３°Ｋ （５０℃）
にて２４時間置く。膨潤したゲルを回収し、そして２０
にジオキサン３を及び蒸留水ＩＣｌＡｔ用いて逐次洗浄
する。洗浄したゲル金凍結乾燥する。こうして２４．３
．ｇの活性化担体を得る。
例２
０．１２のアクリレックスＰ−１００キセロゲル（アク
リルアミ；”−Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルア
ミド共重合体〕を、４．Ｏｔｒｔｌの０６１Ｍ燐酸緩衝
ｇ（ｐＨａＯ）に懸濁し、そして２０％ジオキサン中Ｑ
、２５Ｍｐ−ベンゾキノンの溶液（ＩＱ、ｄ）を加え、
そして懸濁液を３２３″Ｋ（５０℃）にて２４時間置く
。膨潤したゲルを分離し、そして２０にジオキサ７７０
ｍｌ及び蒸留水７０ｍ１ｆ用いて逐次洗浄する。活性
イヒされたゲルを真空濾過し、そして０．０１ Ｍγ−
アミノ酪酸溶液２ ｍｌをカロえる。
リルアミ；”−Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルア
ミド共重合体〕を、４．Ｏｔｒｔｌの０６１Ｍ燐酸緩衝
ｇ（ｐＨａＯ）に懸濁し、そして２０％ジオキサン中Ｑ
、２５Ｍｐ−ベンゾキノンの溶液（ＩＱ、ｄ）を加え、
そして懸濁液を３２３″Ｋ（５０℃）にて２４時間置く
。膨潤したゲルを分離し、そして２０にジオキサ７７０
ｍｌ及び蒸留水７０ｍ１ｆ用いて逐次洗浄する。活性
イヒされたゲルを真空濾過し、そして０．０１ Ｍγ−
アミノ酪酸溶液２ ｍｌをカロえる。
γ−アミノ酪酸の可溶化のために０．１Ｍ燐酸カリウム
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１５）を９口える。懸濁液を２
７７°Ｋ（４℃〕にて２４時間インキュベートし、そし
て１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝ＷＬ（ｐＨ５，０）、及び０．１Ｍ炭酸水素
ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）で結合する。この量は反
応混合物に加えたγ−アミノ酪酸の量の２０腎に相当す
る。
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１５）を９口える。懸濁液を２
７７°Ｋ（４℃〕にて２４時間インキュベートし、そし
て１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝ＷＬ（ｐＨ５，０）、及び０．１Ｍ炭酸水素
ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）で結合する。この量は反
応混合物に加えたγ−アミノ酪酸の量の２０腎に相当す
る。
創Ａ
０．１２のアクリレックスｐ−１ｏｏキセロゲル（アク
リルアミド−Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体〕を、４．０７！の０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に懸濁し、そして２０％ジオキサン中Ｑ、２
５Ｍｐ−ベンゾキノ／の溶液（ｉ、Ｏｍ／）を加え、そ
して符濁液を３２３’Ｋ（５０℃〕にて２４時間惹く。
リルアミド−Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体〕を、４．０７！の０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に懸濁し、そして２０％ジオキサン中Ｑ、２
５Ｍｐ−ベンゾキノ／の溶液（ｉ、Ｏｍ／）を加え、そ
して符濁液を３２３’Ｋ（５０℃〕にて２４時間惹く。
膨潤したゲルを分離し、そして２０πジオキサン７０ｍ
１、及び蒸留水７０嬬によシ逐次洗浄する。
１、及び蒸留水７０嬬によシ逐次洗浄する。
活性化されたゲルを真空濾過し、そして２．０艷の２０
η／づ牛血清アルブミン溶液を加える。牛血清アルブミ
ンの溶解を良好にするためにＱ、ＩＭナトリウムホルム
アミド緩衝ｆｉ（ｐＨ３，０）’ｒｒｍする。懸濁液を
２７７°Ｋ（４℃）にて２４時間インキ−ベートし、ゲ
ルを分離し、そして１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨｓ、Ｄ）、及び０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム溶ｇ（ｐＨ８，５）によシ洗浄するこ
とにより非結合血清アルブミン全除去する。こうして１
０ワの血清アルブミンが結合する。この結合量は反応混
合物に加えた血清アルブミンの量の２５πに相当する。
η／づ牛血清アルブミン溶液を加える。牛血清アルブミ
ンの溶解を良好にするためにＱ、ＩＭナトリウムホルム
アミド緩衝ｆｉ（ｐＨ３，０）’ｒｒｍする。懸濁液を
２７７°Ｋ（４℃）にて２４時間インキ−ベートし、ゲ
ルを分離し、そして１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨｓ、Ｄ）、及び０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム溶ｇ（ｐＨ８，５）によシ洗浄するこ
とにより非結合血清アルブミン全除去する。こうして１
０ワの血清アルブミンが結合する。この結合量は反応混
合物に加えた血清アルブミンの量の２５πに相当する。
例４
Ｑ、１１ＰのアクリレックスＰ−１００キセロゲル（ア
クリルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルア
ミド共重合体）を４． Ｏｖｔｌの０．１Ｍ燐酸緩衝１
（ｐＨ８，０）に懸濁し、次に２０蟹ジオキサｙ中０．
２５Ｍｐ−ベンゾキノンのｇｉ （１，０ｍｌ ） ｋ
加え、そして懸濁液を３２３°Ｋ （５０℃）にて２４
時間置く。膨潤したゲルを分離し、そして２０％ジオキ
サ７７０ｍ！、及び蒸留水７０−によシ逐次洗浄する。
クリルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルア
ミド共重合体）を４． Ｏｖｔｌの０．１Ｍ燐酸緩衝１
（ｐＨ８，０）に懸濁し、次に２０蟹ジオキサｙ中０．
２５Ｍｐ−ベンゾキノンのｇｉ （１，０ｍｌ ） ｋ
加え、そして懸濁液を３２３°Ｋ （５０℃）にて２４
時間置く。膨潤したゲルを分離し、そして２０％ジオキ
サ７７０ｍ！、及び蒸留水７０−によシ逐次洗浄する。
活性化されたゲルを真空濾過し１次に２０■／−の牛血
清アルブミン溶液２． Ｏｒｍ ｆｆ：加える。十血清
アルブミンの溶解を促進するために０．１Ｍ燐酸カリウ
ムナトリウム緩衝１ｃｐＨ６，ｏ）ｉ加える。
清アルブミン溶液２． Ｏｒｍ ｆｆ：加える。十血清
アルブミンの溶解を促進するために０．１Ｍ燐酸カリウ
ムナトリウム緩衝１ｃｐＨ６，ｏ）ｉ加える。
懸濁液を２７７’Ｋ（４℃）にて２４時間インキ為ベー
トシ、ゲルを分離し、そして１．０Ｍ塩化ナトリウムを
含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＩ（５，０
）、及び０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝？ｆ（ｐＨａ
５）で洗浄することにより非結合血清アルブミンを除去
する。こうして４．５■の牛血清アルブミンが結合する
。この結合量は反応混合物に加えた血清アルブミンのｉ
ｌ、ｚｓ％に相当する。
トシ、ゲルを分離し、そして１．０Ｍ塩化ナトリウムを
含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＩ（５，０
）、及び０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝？ｆ（ｐＨａ
５）で洗浄することにより非結合血清アルブミンを除去
する。こうして４．５■の牛血清アルブミンが結合する
。この結合量は反応混合物に加えた血清アルブミンのｉ
ｌ、ｚｓ％に相当する。
二
〇、１りのアクリレックスＰ−１００キセロゲル（アク
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体） ｋ ４．０ ｍｌｔの０．１Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ’ａＯ）中に懸濁し、・次に２０イジオキサン
中０．２５Ｍｐ−ベンゾキノ：／ ｆａｌＰｌ （１，
Ｏｍｌ ） ｋ加え、そして懸濁液を３２３’Ｋ（５０
℃）にて２４時間置く。膨潤したゲルを分離し、そして
２０πジオキサン７０７！、及び蒸留水７０−によシ逐
次洗浄する。
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体） ｋ ４．０ ｍｌｔの０．１Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ’ａＯ）中に懸濁し、・次に２０イジオキサン
中０．２５Ｍｐ−ベンゾキノ：／ ｆａｌＰｌ （１，
Ｏｍｌ ） ｋ加え、そして懸濁液を３２３’Ｋ（５０
℃）にて２４時間置く。膨潤したゲルを分離し、そして
２０πジオキサン７０７！、及び蒸留水７０−によシ逐
次洗浄する。
活性化されたゲルを真空濾過し、次に２０１り／屑ｅの
牛血清アルブミン溶液２．０ｍ／’に加える。牛血清ア
ルブミンの溶解を促進するために０．１Ｍ炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩＠！（ｐ）（９０）を使用す
る。懸濁液を２７７°Ｋ（４℃）にて２４時間インキ−
ベートし、ゲルを分離し。
牛血清アルブミン溶液２．０ｍ／’に加える。牛血清ア
ルブミンの溶解を促進するために０．１Ｍ炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩＠！（ｐ）（９０）を使用す
る。懸濁液を２７７°Ｋ（４℃）にて２４時間インキ−
ベートし、ゲルを分離し。
そして１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，’０ ）、及び０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム溶１（ｐ）（８，０）により洗浄する
ことによシ非結合血清アルブミンを除去する。
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，’０ ）、及び０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム溶１（ｐ）（８，０）により洗浄する
ことによシ非結合血清アルブミンを除去する。
こうしてｓ、 ｏ ｍｙの牛血清アルブミンが結合する
。
。
この結合量は反応混合物に加えた血清アルダぐンの１２
．５腎に相当する。
．５腎に相当する。
例６
０．１りのアクリレックスＰ−１００キセロゲル（アク
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体〕を４．０ ’ｒｎｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ８，０）に懸濁し、次に２０πジオキサン中０．
２５Ｍｐ−ベンゾキノンの溶液ヲ加え、そして懸濁液を
３２３°Ｋ 〔５０℃〕にて２４時間置く。膨潤したゲ
ルを分離し、そして２０％ジオキサ７７０ｍ１．及び蒸
留水７０ｍ１により逐次洗浄する。
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体〕を４．０ ’ｒｎｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ８，０）に懸濁し、次に２０πジオキサン中０．
２５Ｍｐ−ベンゾキノンの溶液ヲ加え、そして懸濁液を
３２３°Ｋ 〔５０℃〕にて２４時間置く。膨潤したゲ
ルを分離し、そして２０％ジオキサ７７０ｍ１．及び蒸
留水７０ｍ１により逐次洗浄する。
活性、１２されたゲルを真空濾過し、そして２０〜／
ｍｅのグルコオキシダーゼ溶液２．Ｏｍｌｔを加える。
ｍｅのグルコオキシダーゼ溶液２．Ｏｍｌｔを加える。
０．１λＩ燐酸カリウムナトリウム緩衝液（’Ｉ）Ｈ７
，５）によりグルコオキンダーゼの溶解を促進する。懸
濁液１２７７’Ｋ（４℃）にて２４時間インキュベート
し、ゲルを分離し、そして１．０Ｍ塩化ナトリウム含有
０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）。
，５）によりグルコオキンダーゼの溶解を促進する。懸
濁液１２７７’Ｋ（４℃）にて２４時間インキュベート
し、ゲルを分離し、そして１．０Ｍ塩化ナトリウム含有
０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）。
及び０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（、Ｈａ５）によ
り洗浄することによシ非結合蛋白質を除去する。
り洗浄することによシ非結合蛋白質を除去する。
ゲルに結合した蛋白質の竜は４．５■でｔりす、活性１
’ｉＺ２ユニツト／ｌキセロゲルである。１ユニ、トは
、ｐＨ７，０，２９８’Ｋ（２５℃）において、１分間
に１．０マイクロモルのβ−Ｄ−グルコースの酸化を触
媒することができる酵素の竜である。、結合した酵素の
比活性（は溶解した酵素のそれの８％である。
’ｉＺ２ユニツト／ｌキセロゲルである。１ユニ、トは
、ｐＨ７，０，２９８’Ｋ（２５℃）において、１分間
に１．０マイクロモルのβ−Ｄ−グルコースの酸化を触
媒することができる酵素の竜である。、結合した酵素の
比活性（は溶解した酵素のそれの８％である。
艶ヱ
０．１ｆのアクリレックスＰ−１００キセロゲル（アク
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体） ｋ ４．０ ｍｅの０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ１３，０）中に懸濁し、次に２０９（ジオキサン
中０．２５ Ｍ ｐ−ヘンソ牛） ンＩ）ｍｉｌｋ ３
２３’Ｋ（５０℃）において２４時間置く。膨潤したゲ
ルヲ分離し、２０にジオキサン７０ フｎｌ、及び蒸留
水７０ｍｅにより途次洗浄する口 活性化されたゲルを真空濾過し、そして２０■／ ｖｔ
ｌのカタラーゼ溶液２７！を加える。０． Ｉ Ｍｆ’
％ 酸カリウムナメリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を用い
ることによシカタラーゼの溶解を促進する。懸濁紛を２
７７′″Ｋ（４℃〕にて２４時間インキ島ベートし、ゲ
ルを分離し、そして１６０Ｍ塩イＰナトリウムを含有す
るＣＩ、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）、及
び０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）によ
シ洗浄することによシ非結合蛋白質を除去する。
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体） ｋ ４．０ ｍｅの０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ１３，０）中に懸濁し、次に２０９（ジオキサン
中０．２５ Ｍ ｐ−ヘンソ牛） ンＩ）ｍｉｌｋ ３
２３’Ｋ（５０℃）において２４時間置く。膨潤したゲ
ルヲ分離し、２０にジオキサン７０ フｎｌ、及び蒸留
水７０ｍｅにより途次洗浄する口 活性化されたゲルを真空濾過し、そして２０■／ ｖｔ
ｌのカタラーゼ溶液２７！を加える。０． Ｉ Ｍｆ’
％ 酸カリウムナメリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を用い
ることによシカタラーゼの溶解を促進する。懸濁紛を２
７７′″Ｋ（４℃〕にて２４時間インキ島ベートし、ゲ
ルを分離し、そして１６０Ｍ塩イＰナトリウムを含有す
るＣＩ、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）、及
び０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）によ
シ洗浄することによシ非結合蛋白質を除去する。
ゲルに結合し之蛋白質の量は５．３■であり、活性は２
１００ユニツト／ｌキセロゲルである。１ユニツトは、
２９８’Ｋ（２５℃）において１分間に１マイクロモル
の過酸化水素の生成を触媒する酵素の量に相当する。結
合した酵素の比活性は溶解した酵素のそれの２％である
。
１００ユニツト／ｌキセロゲルである。１ユニツトは、
２９８’Ｋ（２５℃）において１分間に１マイクロモル
の過酸化水素の生成を触媒する酵素の量に相当する。結
合した酵素の比活性は溶解した酵素のそれの２％である
。
西！
０．１９のアクリレックスＰ−１００キセロゲル（アク
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチノン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体）を４．０−の０．７Ｍ燐酸緩衝＃（ｐ）（
８，０）中に懸濁し、次に２０イジオキサン中Ｑ、２５
Ｍｐ−ベンゾキノンの溶液ヲ加え、そして懸濁液を３２
３°Ｋ （５０℃）にて２４時間置く。膨潤したゲルを
分離し、そして２０蟹ジオキサン７．０ｍｌ、及び蒸留
水７０−により逐次洗浄する。
リルアミド−Ｎ、Ｎ／−メチノン−ビス−アクリルアミ
ド共重合体）を４．０−の０．７Ｍ燐酸緩衝＃（ｐ）（
８，０）中に懸濁し、次に２０イジオキサン中Ｑ、２５
Ｍｐ−ベンゾキノンの溶液ヲ加え、そして懸濁液を３２
３°Ｋ （５０℃）にて２４時間置く。膨潤したゲルを
分離し、そして２０蟹ジオキサン７．０ｍｌ、及び蒸留
水７０−により逐次洗浄する。
活性４１ニされたゲルを真空濾過し、そして０．０１Ｍ
グルコース溶液２Ｄ−を加える。０．１Ｍ燐酸カリウム
ナトリウム緩衝Ｎ （ｐＨ７，５） ｋ用いること１ｃ
よシグルコースの尋問を促進する。懸濁液上２７７°Ｋ
（４℃）（にて２４時間インキ−ベートし、ゲル全分離
し、そして１．ｏＭ％ｆｉ化ナトリウムを含有する０、
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、及び０．１Ｍ炭酸水素ナト
リウム溶液（ｐＨａ、５）によシ逐次洗浄づ−ることに
よ少非結合グルコースを除去する。こうすることによシ
ロマイクロモルのグルコースが結合する。この結合＠は
反応混合物に加えたグルコースの量の３０９（に相当す
る。
グルコース溶液２Ｄ−を加える。０．１Ｍ燐酸カリウム
ナトリウム緩衝Ｎ （ｐＨ７，５） ｋ用いること１ｃ
よシグルコースの尋問を促進する。懸濁液上２７７°Ｋ
（４℃）（にて２４時間インキ−ベートし、ゲル全分離
し、そして１．ｏＭ％ｆｉ化ナトリウムを含有する０、
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、及び０．１Ｍ炭酸水素ナト
リウム溶液（ｐＨａ、５）によシ逐次洗浄づ−ることに
よ少非結合グルコースを除去する。こうすることによシ
ロマイクロモルのグルコースが結合する。この結合＠は
反応混合物に加えたグルコースの量の３０９（に相当す
る。
以下余白
レル・ウツツア４
ウフイ・ウツツア２６
＠発 明 者 ミクロス・カルマン
ハンガリー国セゲド・スイレリ
・ウツツア３９／アー
ツキイ・ウツツア５
０発 明 者 ベラ・サヤニ
ハンガリー国ブダペスト１１モリ
ツ・ジ・コルチル１２
Claims (1)
- １．３〜１１のｐＨ値、好ましくは６〜８のｐＨ値を有
しそしてアミノ塞、スルヒドリル基及び／又はヒドロキ
シル基を含有しない緩衝液中で、アミド基を含有する重
合体を膨潤せしめ；水混和性有機溶剤中キノン、好まし
くはｐ−ベンゾキノンの溶液を最終濃度が２〜１００ミ
リモル、好ましくは４０〜６０ミリモルとなるように加
え；混合物を０．５〜４８時間、好ましくは２４時間％
２７３’Ｋ 〜３４３’Ｋ（０℃〜７０℃）に−ｒ活性
化Ｌ；水及び水混和性有機溶剤の混合液により、そして
次に蒸留水及び／又は緩衝液によシ洗浄することによっ
て未反応キノンを除去し： ｐＨ３〜１１゜好ましくは
ｐＨ６〜８において、ゲルに、求核性基を含有する低分
子物質のｏ、ｏ ｏ ｉ〜１．０モル溶液ヌは求核性基
を含有する高分子物質の３〜１００■／−溶液を加え；
懸濁液を２７３°に〜３１３６Ｋ（０℃〜４０℃）、好
ましくは２６０”Ｋ〜２８０’ Ｋ（−１３℃〜７℃）
において２４時間インキ−ベートし、その後ゲルを分離
し、そして洗浄することにより求核性基を含有する非結
合化合物を分離することを含んで成る求核性基含有化合
物の固定化方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU822719A HU186566B (en) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | Process for immobilisation of combinations consisting nucleofil group |
| HU2719/82 | 1982-08-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5998045A true JPS5998045A (ja) | 1984-06-06 |
Family
ID=10960804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58152572A Pending JPS5998045A (ja) | 1982-08-24 | 1983-08-23 | 求核性基を含有する化合物の固定化方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670390A (ja) |
| JP (1) | JPS5998045A (ja) |
| DE (1) | DE3330573A1 (ja) |
| FR (1) | FR2532319B1 (ja) |
| HU (1) | HU186566B (ja) |
| SE (1) | SE463921B (ja) |
| SU (1) | SU1690544A3 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0214805B1 (en) * | 1985-08-29 | 1993-05-26 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Sensor using a field effect transistor and method of fabricating the same |
| AT395253B (de) * | 1989-05-10 | 1992-11-10 | Pittner Fritz | Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen, liganden an einem traeger |
| AT395252B (de) * | 1989-04-04 | 1992-11-10 | Pittner Fritz | Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen an einem traeger |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4913385A (ja) * | 1972-03-29 | 1974-02-05 | ||
| JPS49109580A (ja) * | 1973-02-05 | 1974-10-18 | ||
| JPS50102692A (ja) * | 1974-01-17 | 1975-08-14 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1392181A (en) * | 1971-04-16 | 1975-04-30 | Rech Et Dapplications Soc Gen | Fixation of nitrogenous materials |
| FR2334107A1 (fr) * | 1975-12-05 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Procede de couplage de substances biologiques par des liaisons covalentes |
| GB1560938A (en) * | 1976-09-10 | 1980-02-13 | Chaplin M | Polymer gels |
| US4208309A (en) * | 1977-05-20 | 1980-06-17 | Rohm Gmbh | Pearl polymer containing hollow pearls |
| FR2398762A1 (fr) * | 1977-07-28 | 1979-02-23 | Marpha Etudes Expl Marques | Gels aqueux actives de copolymeres a base de n-(tris(hydroxy-methyl)methyl)acrylamide ou de n-(tris(hydroxymethyl)methyl)methacrylamide leur preparation et leur emploi dans les techniques d'immobilisation des substances naturelles |
| DD144559A1 (de) * | 1979-06-28 | 1980-10-22 | Jens Fischer | Regenerierung von organischen enzymtraegermaterialien fuer die wiederverwendung als traeger |
| US4282343A (en) * | 1980-02-07 | 1981-08-04 | Chevron Research Company | Poly-(alpha-alkoxy)acrylamide and poly-(alpha-alkoxy)acrylamide complexes |
-
1982
- 1982-08-24 HU HU822719A patent/HU186566B/hu not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-08-23 SU SU833636515A patent/SU1690544A3/ru active
- 1983-08-23 SE SE8304572A patent/SE463921B/sv not_active IP Right Cessation
- 1983-08-23 JP JP58152572A patent/JPS5998045A/ja active Pending
- 1983-08-24 US US06/526,035 patent/US4670390A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-08-24 DE DE3330573A patent/DE3330573A1/de not_active Withdrawn
- 1983-08-24 FR FR8313673A patent/FR2532319B1/fr not_active Expired
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4913385A (ja) * | 1972-03-29 | 1974-02-05 | ||
| JPS49109580A (ja) * | 1973-02-05 | 1974-10-18 | ||
| JPS50102692A (ja) * | 1974-01-17 | 1975-08-14 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8304572D0 (sv) | 1983-08-23 |
| FR2532319A1 (fr) | 1984-03-02 |
| DE3330573A1 (de) | 1984-03-01 |
| SE463921B (sv) | 1991-02-11 |
| FR2532319B1 (fr) | 1988-06-24 |
| SU1690544A3 (ru) | 1991-11-07 |
| SE8304572L (sv) | 1984-02-25 |
| US4670390A (en) | 1987-06-02 |
| HU186566B (en) | 1985-08-28 |
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