AT395253B - Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen, liganden an einem traeger - Google Patents

Description

AT 395 253 B

DieErfmdungbeziehtsichaufein Verfahren zur Immobilisierung vonProteinen,Peptiden,Liganden (Coenzymen, Antigenen, Effektoren,....) an einem Trägermaterial, welches Hydroxy-, Mercapto- und Aminogruppen besitzt. Immobilisate dieses Typs werdet unter anderem als Enzymimmobilisate in Bioreaktoren oder im Bereich der Biosensorik verwendet Immobilisate des erwähnten Typs enthalten z. B. Lipasen, Esterasen, Oxidoreduktasen,.... 5 Der Einsatz dieser Immobilisate umfaßt Bereiche wie Abwasserreinigung, Lebensmitteltechnologie, biokatalysierte organische Synthesen, Bioanalytik und Medizintechnik. Bei den derzeit bekannten und verwendeten Immobilisierungsmethoden können Anzahl und räumliche Verteilung der zur Kopplung geeigneten reaktiven Gruppen nur in seltenen Fällen und nur unzureichend gesteuert werden. Auch ist es meist nicht möglich, Trägermaterialien mit Amino-, Mercapto- bzw. Hydroxylgruppen mit einem einzigen Verfahren zu aktivieren. Auch die 10 Lagerung des aktivierten Trägermaterials ist bei den meisten Verfahren (insbesondere in getrockneter Form) nicht möglich. Dieser Nachteil gilt derzeit vor allem auch für die meistverwendete Aktivierungsmethode mit Glutardial-dehyd.

Die Erfindung zielt darauf ab, ein Verfahren der oben beschriebenen Art zu schaffen, bei dem ein Träger, der Amino-, Mercapto-oder Hydroxylgruppen enthält, nach einer Aktivierung unmittelbar mitden zu immobilisierenden 1S Proteinen, Peptiden, Liganden etc. umgesetzt werden kann, im aktivierten Zustand ohne Aktivitätsverlust getrocknet werden kann, und mit welchem Monolayers mit hoher mechanischer Beanspruchbarkeit und chemischer Resistenz gewonnen werden können. Die Anzahl und räumliche Anordnung der reaktiven Gruppen kann im Rahmen des erfindungsmäßigen Verfahrens durch eine photochemische Reaktion gesteuert werden, wobei auch die gezielte Anordnung von unterschiedlichen Monolayerstrukturen auf einem Träger bzw.die gezielte Immobilisierung von 20 Multilayerschichten möglich ist. Um diese Aufgabe zu lösen besteht das erfindungsmäßige Verfahren darin den Träger mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zu derivatisieren. R2 25 XvA f x\ «o 30 Rl

In der Formel des allgemeinen Typs bedeuten die Substituenten X Halogen, RI bzw. R2 X, R, COR, COOR, worin R C j - C g-Alkyl ist, COOH, CN, CNS, NO2 oder N3. RI und R2 können dabei gleich oder ungleich sein. Das 35 umgesetzte Produktkann gewünschtenfalls getrocknet werden undkann in der vorliegenden Form zur Immobilisierung von Peptiden, Proteinen, Coenzymen, Effektoren verwendet werden. Dabei wird zuerst ein Substituent des Typs X mit Amino-, Mercapto- oder Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Nun kann der zweite Substituent X (aktiviert durch die erste Kopplung) mit Amino·, Hydroxy· bzw. Mercaptogruppen des zu immobilisierenden Reaktanden zur Reaktion gebracht werden, wobei eine besonders stabile kovalente Kupplung 40 erzielt wird. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dabei von der Art und Beschaffenheit der Substituenten abhängig.

Dabei ergibt sich für unterschiedliche Substituenten RI bzw. R2 folgende abnehmende Reaktivtät:

RI = R2 = F, CI, Br > J, N3, COOH, COR, COOR, N02 > CN, CNS, R 45 wobei R C j - Cg Alkyl bedeutet.

Die bevorzugten Substituenten X, RI, R2 sind dabei Fluor, Chlor und Brom.

Als Modellreaktion kann daher die Kopplung von 0 - Chloranil bzw. o - Bromanil mit einem Aminoträgermaterial (z. B. aminosililierte Metall- oder Glasoberflächen) angesehen werden.

Die Reaktivität des so aktivierten Trägermaterials ist für die Kopplung von Amino- und Mercaptogruppen 50 deutlich größer als jene für die Kopplung von Hydroxygruppen. Dann reagiert das zweite Halogen, das sich in para-

Stellung zu einer Carbonylgruppe befindet unter Ausbildung einer stabilen, kovalenten Bindung. Dabei können Monolayerstrukturen mit hoher mechanischer Belastbarkeit hergestellt werden.

Die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) für die Immobilisierung von Proteinen, Peptiden, Coenzymen, Liganden,... an einen Träger bietet darüber hinaus den Vorteil, daß die Verbindung der allgemeinen 55 Formel (I) in besonders einfacher Weise über bestimmte Bereiche der Oberfläche des Trägers desaktiviert worden kann. Die Desaktivierung kann durch photochemische Reaktionen oder durch Umsetzung mit Basen durchgeführt werden, wobei es insbesondere bei selektiver photochemischer Desaktivierung möglich ist, überaus kleine Bauteile -2-

AT 395 253 B mit da1 gewünschten Kopplungsaktivität zu erhalten. Derartige kleine Bauteile eignen sich in der Folge beispielsweise auch für den Einsatz als Biosensoren, aber auch für chemische und biochemische Detektionssysteme auf Teststreifenbasis, etc. Für die Herstellung von Immobilisaten können die üblichen Träger Verwendung finden, wobei insbesondere für 5 die Verwendung als elektrochemische Biosensoren leitfähige Schichten oder Träg» aus Metall, wie beispielsweise oberflächenmodifiziertes Gold, Platin Palladium, Rhodium oder Kohlenstoff in Betracht kommen.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in besonders vorteilhaft» Weise für die Immobilisierung als Verbindung der Formel (I) 3,4,5,6-Tetrachlorcyclohexadien-l,2-dion bzw. 10 3,4,5,6-Tetrabromcyclohexadien-l,2-dion verwendet w»den. Die zusätzlichen Substituenten wie weitere Halogenatome, COOH, COR, COOR, CN, N02, CNS, od» N3 (als desaktivierende Substituenten bei der elektrophilen Substitution von Aromaten bekannt) wirken aktivi»end für die Kupplungsreaktion zwischen Träger und den zu bindenden Proteinen, Peptiden, Coenzymen, Liganden,.... 15 In besond»s einfacher Weise kann die Umsetzung des Trägers mit Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in wasserfreien organischen Lösungsmitteln vorgenommen werden.

Temperaturerhöhungen zur Beschleunigung der Reaktion sind möglich, wobei Temp»aturen zwischen dem Gefrierpunkt und dem Siedepunkt der meisten organischen Lösungsmittel möglich sind. Vorteilhaft sind dabei Temperaturen im Bereich von 20 - 70 Grad Celsius. Für die Immobilisierung von Proteinen, Peptiden, etc. muß 20 naturgemäß die Temperatur in der Weise beschränkt werden, daß die zu immobilisierenden Substanzen keine da mische Denaturierung erleiden.

Der Einsatz dieser Immobilisate kann in den Bereichen Bioanalytik und Biotechnologie erfolgen.

Im Bereich der Biosensorik können als Proteine im Rahmen des erfindungsmäßigen Verfahrens besonders Redox-enzyme, wie beispielsweise Glukoseoxidase, Xanthinoxidase, Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, Uricase 25 oder ß-Galaktoseoxidase u. a. eingesetzt werden. Derartige Redoxenzyme sind besonders für die Herstellung von Biosensoren geeignet, wobei die entsprechende enzymkatalysierte Redoxreaktion über Folgeprodukte · z. B. H202 - elektrochemisch gemessen werden kann. Auf diese Weise sind miniaturisierte Biosensoren für die Blutzuckerbestimmung unter Verwendung von Glukoseoxidase herstellbar. Mit Biosensoren auf der Basis von Xanthinoxidase kann in besonders einfacher Weise die Frische von Lebensmitteln, wie z. B. Fischen bestimmt weiden. Analoge 30 Biosensoren lassen sich mit einer Reihe derartiger Redoxenzyme hersteilen, wobei für die Herstellung derartig» Biosensoren als besonderer Vorteil der Verwendung der Verbindung d» allgemeinen Formel (I) der Umstand hinzu kommt, daß sich Teilbereiche der Trägeroberfläche nach Umsetzung mit d» Verbindung der allgemeinen Formel (I) photochemisch desakti vieren lassen. Auf diese Weise sind exakt definierte reaktive Oberflächen »zeugbar. Auch mehrschichtige miniaturisierte Biosensoien sind so herstellbar, bei welchen Teilen d» Oberfläche unterschiedlich» 35 Funktionen unterschiedlich selektive Empfindlichkeit zukommt. Dabei kann in folgender Weise vorgegangen werden: Die Oberfläche des Umsetzungsproduktes mit der V»bindung der allgemeinen Formel (I) kann teilweise durch photochemische Reaktion oder durch Anwendung alkalischer Reagentien desaktiviert werden. Hierauf kann die Umsetzung mit den Peptiden, Proteinen, Coenzymen, Liganden,____mit den verbleibenden Teilen d» aktivierten

Oberfläche vorgenommen werden. Zur Erzielung eines mehrschichtigen od» multifunktionalen Biosensors kann 40 dabei in einfacher Weise so vorgegangen werden, daß das Immobilisat neuerlich mit einer Verbindung d» allgemeinen Formel (I) umgesetzt wird. Nun können gegebenenfalls nach teilweiser Desaktivierung der Oberfläche neu»lich Proteine, Peptide,... immobilisiert werden. Für dieHerstellung eines Biosensors erfolgt die Immobilisierung mit Vorteil auf einem mit Elektroden versehenen Träger. Zur weiteren Erhöhung d» mechanischen Belastbarkeit kann das Immobilisat für die Verwendung als Biosensor mit ein» physiologisch verträglichen Deckschicht, 45 insbesonders mit einer negativ geladenen Außenseite, versehen w»den, welche den Vorteil bietet, die Bestimmung beeinträchtigenden Nebenreaktionen hintanzuhalten. Als Beispiel kann die Störung der Glukosebestimmung mit Glukoseoxidase durch Ascorbat und Citrat angeführt werden. Diese Störung kann durch eine negative Ladung d» Deckschicht verhindert werden. o-Chinone sind auch durch ihre Redoxaktivität für den Elektronentransf»zwischen Redoxenzymen und der Elektrodenoberfläche einsetzbar. Weiters kann die o-Chinonstruktur mit aromatischen 0-50 DiaminenzuPhenazinstrukturengekoppeltwerden,diesichebenfallsalsRedoxmediatorenfürdenElektronentransfer zwischen Elektrode und Cofaktoren eignen.

Auf Grund der besonderen mechanischen und chemischen Stabilität der Immobilisate bieten sich als weitere Anwendungsgebiete für die erfindungsgemäß hergestellten Immobilisate die Verwendung für diagnostische Zwecke (Teststreifen, Immunsensoren,...) und in der Biotechnologie (Bioreaktoren, Fermentoren, bioorganische Synthesen, 55 Abwass»- und Umwelttechnologie,...) an.

Es ist auch möglich, die Reihenfolge der Aktivierungsschritte umzukehren und zu»st die Proteine, Peptide, Liganden, Effektoren,... welche Amino-, Mercapto- bzw. Hydroxylgruppen aufweisen, mit ein» V»bindung d» -3-

AT395 253 B allgemeinen Formel (I) zur Reaktion zu bringen und dann die so aktivierten Moleküle an einen Träger zu binden. Durch die bifunktionellen Eigenschaften der Verbindung der allgemeinen Formel (I) werden Proteine, Peptide, Liganden,... zu polymeren Makromolekülen vernetzt (welche in dieser Form ebenfalls als Immobilisate einsetzbar sind), die sodann mit den freien reaktiven Gruppen zusätzlich an ein Trägermaterial gebunden werden können. Für Spezialprobleme kann als Trägermaterial auch ein weiteres Makromolekül (Dextran, Xanthan, Polyethylenglykol, Polyethylenimin, Trägerprotein,...) dienen. Durch Wahl der Reaktionsbedingungen kann der Polymerisationsgrad und der Immobilisierungstyp gesteuert werden.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1: Derivatisierung von mikroporösem Glas A. wässerige Silanisierung 100 g mikroporöses Glas werden mit einer 10%igen wässerigen 3-(Triethoxysilyl)propylamin Lösung versetzt Innerhalb der ersten 30 Minuten muß der pH der Reaktionslösung ständig kontrolliert und auf pH = 3.5 eingestellt werden. Dieser Ansatz wird 4 Stunden bei Raumtemperatur durchmischt. Anschließend wird das mikroporöse Glas von der Reaktionslösung getrennt und 5 mal mit je 100 ml Wasser gewaschen und bei 110 °C getrocknet B. organische Silanisierung 100 g mikroporöses Glas werden mit einer 10%igen 3-(Triethoxysilyl)-propylamin Lösung in Toluol versetzt Dieser Ansatz wird 5 Stunden bei Raumtemperatur durchmischt Anschließend wird das silanisierte mikroporöse Glas von der Reaktionslösung getrennt und 5 mal mit je 50 ml Toluol gewaschen. C. Aktivierung

Das nach dem Verfahren A oder B hergestellte mikroporöse aminierte Glas wird mit einer 2%igen 3,4,5,6-Tetra-chlorcyclohexadien-1,2-dion Lösung in Toluol versetzt und 30 Minuten bei 25 °C durchmischL Nach Beendigung der Reaktion wird das Glas von der Reaktionslösung getrennt und 5 mal mit je 50 ml Toluol und 2 mal mit je 100 ml Aceton gewaschen. Helle Lichteinstrahlung und erhöhte Temperaturen sind während der Aktivierung und auch danach solange noch nicht gekoppelt wurde zu vermeiden. Anschließend wird das derivatisierte mikroporöse Glas im Wasserstrahlvakuum getrocknet und in diesem Zustand unter lichtausschluß bei 4 °C gelagert. Die Derivatisierung der silanisierten Oberflächen wurde auch unter Verwendung von 3.4.5.6- Tetrabromcyclohexadien-1,2-dion 3.4.5.6- Tetrafluorcyclohexadien-1,2-dion durchgeführt

Beispiel 2: Derivatisierung von Platin-. Palladium- und Rhodiumoberflächen A. chemische Oxidation der Oberflächen

Die Pt-, Pd- bzw. Rh- Oberflächen werden 20 Stunden in eine 15%ige wässerige HNC^-Lösung bei 25 °C gelegt und anschließend mehrmals mit Wasser gewaschen. B. elektrochemische Oxidation der Oberflächen

Die Pt-, Pd- bzw. Rh-Oberflächen werden in einer wässerigen 10%igen HNO-j, 2.5%igen C^C^-Lösung 15 Sekunden unter kräftiger Sauerstoffentwicklung oxidiert C. Silanisierung und Aktivierung

Die nach dem Verfahren A oder B oxidierten Metalloberflächen werden mehrmals mit Aceton gespült beiRaum-temperaturgetiocknetundanschließendfür30Minutenbei60oCineinel0%ige3-(Triethoxysilyl)-propylamin-Lösung in Toluol getaucht Die silanisierten Oberflächen werden mit Toluol gewaschen und 20 Minuten bei 110 °C getrok-knet. Sodann werden die aminierten Metalloberflächen in eine 2%ige Lösung von 3,4,5,6-Tetra-chlorcyclohexadien-1,2-dion in Toluol gelegt und bei 25 °C 20 Minuten darin belassen. Nach Beendigung der Reaktion werden die Elektroden mit Aceton gespült und unter Lichtabschluß bei 4 °C gelagert. Während des gesamten Aktivierungsprozesses muß bei stark gedämpftem Licht am besten Rotlicht, gearbeitet werden.

Beispiel 3: Derivatisierung von porösem Silikatmaterial 100 g poröses Silikatmaterial werden mit einer 10%igen 3-(Triethoxysilyl)-propylamin Lösung in Toluol versetzt. Dieser Ansatz wird eine Stunde bei 60 °C gerührt Anschließend wird das poröse Silikatmaterial von der Reaktionslösung getrennt und 5 mal mit je 50 ml Toluol gewaschen. Danach wird das poröse Silikatmaterial mit einer -4-

Claims (13)

1. AT 395 253 B 1 %igen 3,4,5,6-Tetrachlorcy clohexadien-1,2-dion Lösung in Toluol versetzt und 30 Minuten bei25°C gerührt Nach Beendigung der Reaktion wird das Silikatmaterial von der Reaktionslösung getrennt und 5 mal mit je 50ml Aceton gewaschen. Anschließend wird das derivatisierte Silikat im Wasserstrahlvakuum getrocknet und in diesem Zustand unter Lichtabschluß bei 4 °C gelagert Die Derivatisierung der silanisierten Oberflächen wurde auch unter Verwendung von 3.4.5.6- Tetrabromcyclohexadien-1,2-dion 3.4.5.6- Tetrafluorcyclohexadien-l ,2-dion durchgeführt Beispiel 4: Photodesaktivierung von 3.4.5.6- Tetrachlorcvclohexadien-l-2-dionbzw. 3.4.5.6- Tetrafluorcvclohexadien-l .2-dion bzw. 3.4.5.6- Tetrabromcvclohexadien-1,2-dion derivatisierten Oberflächen Die derivatisierten Metalloberflächen wurden, nach Abdeckung mit einer Photomaske, einer Bestrahlung im Bereich der Absorptionsbanden der Verbindung (200 - 600 nm) für 1 Sekunde bis 30 Minuten ausgesetzt Danach wurde Glukoseoxidase gekoppelt Die Aktivität der Glukoseoxidase wurde amperometrisch gemessen. Dabei zeigte sich, daß die belichteten Stellen der Oberfläche eine der Lichtmenge proportionale Desaktivierung der Kopplungsgruppen aufweisen. Die Menge der gekoppelten Glukoseoxidase war der Lichtmenge umgekehrt proportional. Beispiel 5: Immobilisierung auf derivatisierten Oberflächen Diederivatisierten Trägermaterialien werden mit 15(w/w)des zu immobilisierendenProteinsin der 10-20fachen Menge eines geeigneten Puffers, bei einem pH-Wert in einem Bereich von 4-9,2 Stunden bei 4-25 °C inkubiert. Das Immobilisat wurde durch Waschen mit unterschiedlichen Puffern von adsorbiertem Protein befreit. Ai Ein Glucuronidase-Immobilisat, ausgehend von nativer Glucuronidase mit 330 nkat/g, wies eine Aktivität von 22 nkat/g Immobilisat auf, der Proteingehalt betrug 51 mg/g Träger. L· Ein alk. Phosphatase-Immobilisat, ausgehend von nativer Phosphatase mit 26 kal/g, wies eine Aktivität von 420 nkat/g Immobilisat auf. Der Proteingehalt betrug 20.6 mg/g Träger. Ein ß-Galactosidase-Immobilisat, ausgehend von nativer Galactosidase mit 7.6 kat/g, wies eine Aktivität von 43 nkat/g Immobilisat auf. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen, Peptiden, Coenzymen, Liganden, Redoxmediatoren an einem Träger, welcher Amino-, Mercapto- oder Hydroxylgruppen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) R2

   RI -5- AT 395 253 B in welcher X Halogen bedeutet und RI, R2 gleich oder ungleich sind und X, R, COR, COOH, COOR, CN, CNS, N3, worin R Cj bis Cg Alkyl ist, bedeuten, umgesetzt und gewünschtenfalls getrocknet wird, wobei einer der Sub-stituenten X mit einer Amino-, Mercapto- bz w. Hydroxylgruppe des Trägermaterials reagiert, worauf die zu immobilisierenden Proteine, Peptide, Coenzyme, Liganden, Redoxmediatoren mit dem zu einer C=0 Gruppe para-ständi-5 gen und dem bereits umgesetzten Substituenten X benachbarten zweiten Substituenten X zur Reaktion gebracht werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung der allgemeinen Formel (I) 3,4,5,6-Tetrachlorcyclohexadien-l^-dion und 3,4,5,6-Tetrabromcyclohexadien-l,2-dion eingesetzt wird. 10
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit dem Trägermaterial in organischen bzw. organisch wässerigen Mischphasen vorgenommen wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen 15 Formel (I) mit dem Träger bei Temperaturen von -10 bis 50 °C vorgenommen wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Redoxenzyme wie z. B. Glukoseoxidase, Galaktoseoxidase, Aminosäureoxidase, Xanthinoxidase, Cholesterinoxidase, Uricase und Ascorbatoxidase bzw. deren Apoenzyme immobilisiert werden. 20
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene oder Antikörper zum Immobilisieren eingesetzt werden.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Naringinasen, Esterasen, Lipasen, 25 Glycosidasen, Galaktosidasen, Glucosidasen, Pectinasen, Penicillinase, Ammoniaklyasen, Urease und/oder Phosphatasen eingesetzt werden.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung zur Herstellung eines Biosensors auf einem mit Elektroden versehenen Träger erfolgt 30
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Umsetzungsproduktes mit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) teilweise durch photochemische oder durch Anwendung alkalischer Reagenzien bzw. niedermolekularer Amine und Mercaptane desaktiviert wird, worauf die Umsetzung mit den Proteinen, Peptiden, Coenzymen, Liganden mit den verbleibenden Teilen der Oberfläche vorgenommen 35 wird.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisat neuerlich mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgesetzt wird, worauf gegebenenfalls nach teilweiser Desaktivierung der Oberfläche neuerlich Proteine, Peptide, Coenzyme und Liganden immobilisiert werden. 40
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisat für die Verwen-dung als Biosensor miteiner physiologisch verträglichen Deckschicht insbesondere mit einer negativen Raumladung, versehen wird.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Immobilisats als Biosensor die Meßwerte elektrochemisch bestimmt werden.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Proteine, Peptide, Coenzyme, Liganden mit einer wenigstens äquimolaren Menge einer Verbindung der Formel (I)

    RI -6- 50 AT 395 253 B in welch«- X Halogen bedeutet und RI, R2 gleich oder ungleich sind und X, R,COR, COOH, COOR, CN, CNS, N3, worin R Cj bis Cg Alkyl ist bedeuten, umgesetzt und gewünschtenfalls getrocknet werden, wobei einer der Substituenten X mit Amino-, Mercapto- bzw. Hydroxylgruppen reagiert und das erhaltene Umsetzungsprodukt mit Amino·, Mercapto- bzw. Hydroxylgruppen eines Trägermaterials aber auch aus anderen oder identen Proteinen, Peptiden, Coenzymen, Liganden und Redoxmediatoren mit dem zu einer C = 0 Gruppe para-ständigen und dem bereits umgesetzten Substituenten X benachbarten zweiten Substituenten X zur Reaktion gebracht werden. -7-