AT395252B - Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen an einem traeger - Google Patents

Verfahren zum immobilisieren von proteinen, peptiden, coenzymen an einem traeger Download PDF

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Description

AT 395 252 B
DieErfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen, Peptiden, Coenzymen an einem Träger, welcher Amino-, Mercapto- oder Hydroxygruppen aufweist. Derartige Immobilisate sind unter anderem als Enzymimmobilisate bekannt, welche in Bioreaktoren eingesetzt werden können. Enzymimmobilisate der eingangs genannten Art enthalten beispielsweise ß-Glucosidasen, Lipasen, Phosphatasen oder Naringinasen und werden für die Behandlung von Lebensmitteln bzw. Reinigung, von Abwässern herangezogen. Immobilisate der eingangs genannten Art werden zumeist unter Verwendung von Glutardialdehyd hergestellt, wobei zunächst je nach Art des Trägers der Träger soweit derivatisiert werden muß, daß er primäre Aminogruppen aufweist, welche in der Folge mit Glutardialdehyd und in weiterer Folge mit den zu immobilisierenden Proteinen, Peptiden, Coenzymen umgesetzt werden. Derivatisierte Träger, welche mit Glutardialdehyd umgesetzt wurden, lassen sich ohne Aktivitätsverlust nicht trocknen.
Die Erfindung zielt nun darauf ab, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, bei welchem ein derivatisierter Träger, mit Amino- aber auch Mercapto- und Hydroxygruppen nach einer Kopplung unmittelbar mit den zu immobilisierenden Proteinen, Peptiden, Coenzymen umgesetzt werden kann, ohne Aktivitätsverlust getrocknet werden kann, und mit welchem auch dünne Schichten an Protein, Peptiden, Coenzymen, insbesondere Monolayers, bei gleichzeitig hoher mechanischer Beanspruchbarkeit immobilisiert werden können. Zur Lösung dieser Aufgabe besteht das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen darin, daß der Träger mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I
O
in welcher X Halogen bedeutet und Rj, R2 gleich oder ungleich sind und X, R, COR, COOR, worin R Cj - Cg Alkyl bedeutet, COOHoderCNbedeuten,umgesetztundgewünschtenfallsgetrocknetwird,woraufdiezuimmobilisierenden Peptide, Proteine, Coenzyme mit dem paraständigen, freien Halogen der Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgesetzt werden. Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) bildet hiebei zunächst eine kovalente Bindung mit den Amino-, Mercapto- oder Hydroxygruppen des Träger aus, wodurch einebesondeis stabile Kupplung erzielt wird. Die Kopplungsreaktion zwischen der Verbindung der allgemeinen Formel I und dem Träger ist in hohem Maße von der Reaktivität der jeweiligen Substituenten abhängig. So ist bei Verbindungen der allgemeinen Formel I in welcher X=Rl = R2 die Reaktivität entsprechend der folgenden Reihe abnehmend X = R1 = R2 = F, CI, Br > J, COOH, COR, COOR > R, wobei R Cj - Cg Alkyl bedeutet. Die bevorzugten Substituenten der Verbindungen der Formel I sind daher Fluor, Chlor und Brom. Auch die Reaktivität des Trägers ist von den jeweiligen Substituenten abhängig und nimmt entsprechend der folgenden Reihe ab NH2>NH,SH»OH.
Am bevorzugtesten ist daher die Umsetzung eines Trägers welcher eine primäre Aminogruppe trägt mit einer Verbindung der Formel I, in welcher die Substituenten X, R j und R2 gleich sind und jeweils Fluor, Chlor oder Brom bedeuten.
Das freie, paraständige Halogen kann in der Folge wiederum durch Ausbildung kovalenter Bindungen mit Aminogruppen bzw. gegebenenfalls Mercaptogruppen der zu immobilisierenden Proteine, Peptide, Coenzyme umgesetzt werden, wodurch ohne weiteres auch Monolayers mit hoher mechanischer Belastbarkeit hergestellt werden können. Die Umsetzung des Kopplungsagens mit den Proteinen Peptide und Coenzyme ist ebenfalls von den jeweiligen reaktiven Gruppen der Proteine, Peptide, Coenzyme abhängig. Bei der Umsetzung dieser Verbindungen in Wasser oder Pufferlösungen hat sich folgende Reaktivitätsreihe
NH2>NH~SH -2- 5
AT395 252 B
Die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) für die Immobilisierung von Proteinen, Peptiden, Coenzymen an einem Träger bietet darüberhinaus den Vorteil, daß die Verbindung der allgemeinen Formel (I) in besonders einfacher Weise über bestimmte Bereiche der Oberfläche des Trägers desaktiviert werden kann. Die Desaktivierung kann in einfacher Weise durch photochemische Umsetzung oder durch Umsetzung mit Basen vorgenommen werden, wodurch insbesondere bei photochemischer Umsetzung überaus kleine Bauteile mit der gewünschten Aktivität hergestellt werden können. Derartige kleine Bauteile eignen sich in der Folge beispielsweise auch für den Einsatz als Biosensoren. 10
Als Träger kommen hiebei übliche Träger für die Herstellung von Immobilisaten in Betracht, wobei insbesondere für die Verwendung als elektrochemische Biosensoren leitfähige Schichten oder leitfähige Träger aus Metallen, wie beispielsweise Gold, Platin, Palladium oder Kohlenstoff, in Betracht kommen. 15 eigeben.
In besonders vorteilhafter Weise kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Immobilisierung als Verbindung der Formel (I) 2,3,5,6-Tetrachlorcyclohexadien-l,4-dion eingesetzt werden. Die zusätzlichen Substituenten, wie weitere Halogenatome, COOH, COR, COOR oder CN wirken hiebei als desaktivieiende Substituenten, welche die an der Kupplungsreaktion zwischen Träger und den Proteinen, Peptiden, Coenzymen teilnehmenden paraständigen Halogenatome weiter aktivieren, so daß eine besonders stabile, kovalente Bindung erzielt werden kann. Diese Transaktivierung für die Kupplung des Trägers mit den zu immobilisierenden Substanzen kann durch Wahl der weiteren Substituenten, insbesondere durch die Auswahl von Halogen, wie CI, Br oder Gruppen wie z. B. 20 25
30 35 40 45 50 entsprechend gesteuert werden, wobei auch Aktivitätsverbesserungen durch entsprechende sterische Ausrichtung der zu immobilisierenden Substanzen erzielt weiden können. In besonders einfacher Weise kann die Umsetzung des Trägers mit Verbindungen der allgemeinen Formel I in wasserfreien, organischen Lösungsmitteln, insbesondere Toluol, vorgenommen werden. Insbesondere die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit dem Träger kann hiebei zur Beschleunigung der Reaktion ohne weiteres bei erhöhten Temperaturen vorgenommen werden, wobei bei Temperaturen zwischen 0 °C und Rückflußtemperatur, vorzugsweise 50-70 °C, gearbeitet werden kann. Für die Immobilisierung der Proteine, Peptide, Coenzyme muß naturgemäß die Temperatur in einer Weise beschränkt werden, daß die zu immobilisierenden Substanzen nicht thermisch denaturiert werden können. Als Proteine können mit V orteil im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens Redoxenzyme, wie beispielsweise Glucoseoxidase, Xanthinoxidase, Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase oder ß-Galactoseoxidase u. a. eingesetzt werden.DerartigeRedoxenzymeeignensichbesonders für die Herstellungvon Biosensoren, wobei dieentspiechende Redoxreaktion,welche dieRedoxenzymebewiricen,über Folgeproduktez.B.H202elektiochemischgemessen werden kann. Es sind auf diese Weise kleinbauende Biosensoren für die Blutzuckeibestimmung unter Verwendung von Glucoseoxidase herstellbar. Mit Biosensaren auf der Basis von Xanthinoxidase kann in besonders einfacher Weise die Frische von Lebensmitteln, wie beispielsweise Fischen, bestimmt werden. Analog lassen sich eine Reihe von Biosensoren mit derartigen Redoxenzymen herstellen, wobei für die Herstellung derartiger Biosensoren als besonderer Vorteil der Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel (0 der Umstand hinzukommt, daß sich Teilbereiche der Oberfläche des Trägers nach der Umsetzung mit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) photochemisch desaktivieren lassen. Auf diese Weise lassen sich exakt definierte, reaktive Oberflächen schaffen, und es lassen sich insbesondere auch mehrschichtige, kleinbauende Biosensoren verwirklichen, bei welchen Teilen der Oberfläche unterschiedlicher Funktionen unterschiedlich selektive Empfindlichkeit zukommt. Mit Vorteil kann hiefür so vorgegangen werden, daß die Oberfläche des Umsetzungsproduktes mit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) teilweise durch photochemische Reaktion oder durch Anwendung alkalischer Reagentien desaktiviert wird, worauf die Umsetzung mit den Peptiden, Proteinen, Coenzymen mit den verbleibenden Teilen der Oberfläche vorgenommen wird, wobei zur Erzielung eines mehrschichtigen oder multifunktionalen Biosensors in einfach«: Weise so vorgegangen werden kann, daß das Immobilisat neuerlich mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgesetzt wird, worauf gegebenenfalls nach teilweiser Desaktivierung der Oberfläche neuerlich Peptide, Proteine und/oderCoenzymeimmobilisiertwerden.Für die Herstellung eines Biosensors erfolgt dielmmobilisierung mit V arteil auf einem mit Elektroden versehenen Träger, und zur weiteren Erhöhung der mechanischen Belastbarkeit -3- 55
AT 395 252 B kann mit Vorteil so vorgegangen werden, daß das Immobilisat für die Verwendung als Biosensor mit einer physiologisch verträglichen Deckschicht, insbesondere mit einer elektronegativen Außenseite, versehen wird.
Insbesondere die Ausbildung einer elektronegativen Außenseite der Deckschicht hat hiebei den Vorteil, daß die Bestimmung beeinträchtigende Nebenreaktionen hintangehalten werden können. So wird insbesondere die Gluco-S sebestimmung mit Glucoseoxidase durch Ascorbat und Citrat gestört, wobei eine elektronegative Außenseite einer
Deckschicht einem Eindringen derartiger Anionen entgegenwirkt und auf diese Weise eine Verzerrung der Meßwerte vermieden wird.
Die Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) für die Herstellung von Biosensoren im obigen Sinne hathiebei gegenüber anderen Methoden der Immobilisierung, insbesondere gegenüber einer Immobilisierung mit 10 Glutaidialdehyd, den wesentlichen Vorteil, daß die Kupplungsschichte Redoxaktivität zeigt, so daß die Verbindung der allgemeinen Formel (I) als redoxübertragende Zwischenschicht zur Übertragung von Elektronen Verwendung finden kann. Auf diese Weise wird die Empfindlichkeit eines unter Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) hergestellten Biosensors wesentlich gesteigert.
Neben der Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Immobilisate für die Herstellung von Biosensoren 15 lassen sich auch Immobilisate für diagnostische Zwecke, beispielsweise dadurch hersteilen, daß Antigene oder Anti körper zum Immobilisieren eingesetzt werden. Schließlich ist es mit Rücksicht auf die besonders hohe mechanische Stabilität des Immobilisates, möglich auch biotechnologisch in Bioreaktoren einzusetzende Immobilisate herzustellen, wobei vorzugsweise Naringinasen, α oder ß-Glucosidasen, ß-Galaktosidasen, Lipasen, Pectinasen, Esterasen, Penicillinaseund/oder Phosphataseneingesetzt werden. Derartige Immobilisateeignensich für dieBioprozeßtechnik, 20 Lebensmitteltechnik und Umwelttechnologie.
Zur Erzielung von Multilayers hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, das Verfahren so zu führen, daß Proteine, Peptide, Coenzyme mit einer wenigstens äquimolaren Menge einer Verbindung der Formel I
in welcher X Halogen bedeutet und Rj, R2 gleich oder ungleich sind und X, R, COR, COOR, worin RC^ -Cg Alkyl 35 bedeutet, COOH oder CN bedeuten, umgesetzt werden, worauf das erhaltene Umsetzungsprodukt über ein freies paraständiges Halogen der Verbindung der Formel I mit dem Träger gekuppelt wird. Durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit Proteinen, Peptiden, Coenzymen ist es möglich über Brücken der Verbindung der Formel I quervemetzte Proteine, Peptide zu erhalten, welche über ein freies nicht vernetztes paraständiges Halogen an den Trägergebunden weidenkönnen. Auf diese Weise istesmöglich,unmittelbar innerhalbeinesReaktionsschrittes 40 Multilayers von auf einem Träger immobilisierten Enzymen zu erhalten.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1:
Derivatisierung von mikroporösem Glas 45 A. wäßrige Silanisierung: 100 g mikroporöses Glas werden mit einer 10 %-igen wäßrigen 3-(Triethoxysilyl)-propylamin Lösung versetzt Innerhalb der ersten 30 Minuten muß der pH der Reaktionslösung ständig kontrolliert und auf pH 3,5 eingestellt werden. Dieser Ansatz wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das mikroporöse Glas von der Reaktionslösung getrennt und 5-mal mit je 100 ml Wasser gewaschen und bei 110 °C getrocknet 50 B. organische Silanisierung: 100 g mikroporöses Glas werden mit einer 10 %-igen 3-(Triethoxysilyl)-propylamin-Toluol Lösung versetzt Dieser Ansatz wird 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Anschließend wird das silanisierte mikroporöse Glas von der Reaktionslösung getrennt und 5-mal mit je 50 ml Toluol gewaschen. 55 C. Aktivierung
Das nach dem Verfahren A. oder B. hergestellte mikroporöse Glas wird mit einer 2,5 %-igen 2,3,5,6 Tetrachloro- -4-
AT 395 252 B cyclohexadien-1,4-dion-Toluol Lösung versetzt und 30 Minuten bei 40 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Glas von der Reaktionslösung getrennt und 5-mal mit je 50 ml Toluol und 2-mal mit je 100 ml Aceton gewaschen. Anschließend wird das derivatisierte mikroporöse Glas mit Wasserstrahlvakuum trocken gesaugt und in diesem Zustand gelagert
Die Derivatisierung der silanisierten Oberflächen wurde auch unter Verwendung von 2,3,5,6 Tetrabromo- bzw. 2,3,5,6 Tetrafluoro- bzw. 2,3,5,6 Tetrajodo-cyclohexadien-l,4-dion durchgefühlt.
Beispiel 2:
Derivatisierung von Platin bzw. Palladium-Oberflächen A. chemische Oxidation der Oberflächen:
Die Pt bzw. Pd-Oberflächen werden 20 Stunden in eine 15 %ige wäßrige HNO3 Lösung bei Raumtemperatur gelegt und anschließend mehrmals mit Wasser gewaschen. B. elekrochemische Oxidation der Oberflächen:
Die Pt bzw. Pd-Oberflächen werden in einer wäßrigen 10%igenHNO3,2,5 %-igen Cr207-Lösung 15 Sekunden unter kräftiger Sauerstoffentwicklung oxidiert C. Aktivierung
Die nach dem Verfahren A. oder B. oxidierten Pt bzw. Pd-Oberflächen werden mehrmals mit Aceton gespült, bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend in eine 10 %-ige 3-(Triethoxysilyl)-propylamin-Toluol Lösung 30 Minuten bei 60 °C gelegt Die silanisierten Oberflächen werden danach mit Toluol gewaschen und 30 Minuten in eine 2 %-ige 2,3,5,6 Tetrachlorocyclohexadien-l,4-dion-Toluol Lösung bei 40 °C gelegt Nach Beendigung der Reaktion wurden die Oberflächen mehrmals mit Toluol und zuletzt mit Aceton gespült. Die derivatisierten Pt bzw. Pd-Oberflächen werden in trockenem Zustand unter Lichtabschluß gelagert.
Beispiel 3:
Derivatisierung von porösem Silikatmaterial lOOgporöses Silikatmaterial werden miteiner 10 %-igen 3-(Triethoxysilyl)-propylamin-Toluol Lösung versetzt Dieser Ansatz wird 1 Stunde bei 60 °C gerührt. Anschließend wird das silanisierte poröse Silikatmaterial von der Reaktionslösung getrennt und 5-mal mit je 50 ml Toluol gewaschen. Danach wird das poröse Silikatmaterial mit ein«: 1.5 %-igen 2,3,5,6 Tetrachloro-cyclohexadien-l,4-dion-Toluol Lösung versetzt und 30 Minuten bei 40 °C gerührt Nach Beendigung der Reaktionsdauer wird das Silikatmaterial von der Reaktionslösung getrennt und 5mal mit je 50 ml Toluol und 2-mal mit je 100 ml Aceton gewaschen. Anschließend wird das derivatisierte Silikat mit Wasserstrahlvakuum trocken gesaugt und in diesem Zustand gelagert
Die Derivatisierung von porösem Silikatmaterial wurde auch unter Verwendung von 2,3,5,6 Tetrabromo-cyclohexadien-l,4-dion, 2,3,5,6 Tetrajodo-cyclohexadien-l,4-dion durchgeführt
Beispiel 4:
Photodesaktivierung von 2.3.5.6 Tetrachloro bzw. 2.3.5.6 Tetrabromo- bzw. 2.3.5.6 Tetrafluoro- bzw. 2.3.5.6 Tetraiodo-cvclohexadien-1.4-dion derivatisierter Oberflächen
Die derivatisierten Pt bzw. Pd-Oberflächen wurden nach Abdeckung miteiner Photomaske einer intensiven UV-Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 200 - 450 nm für 1 Sekunde bis 30 Minuten ausgesetzt. Danach wurde Glucoseoxidase gekoppelt. Die Aktivität der Glucoseoxidase wurde amperometrisch gemessen. Dabei zeigte sich, daß die belichteten Stellen der Oberfläche eine der Lichtmenge proportionale Desaktivierung der Kopplungsgruppen aufweisen. Die Menge der gekoppelten Glucoseoxidase war um einen der Lichtmenge proportionalen Wert geringer.
Beispiel 5:
Immobilisierung auf derivatisierten Oberflächen
Die derivatisierten Trägermaterialien werden mit 5(w/w) des zu immobilisierenden Proteins in der 10 - 20-fachen Menge eines geeigneten Puffers bei einem pH-Wert im Bereich von 4 - 9,2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Immobilisat wurde durch Waschen mit unterschiedlichen Puffern von adsorbierenden Protein befreit Δ*
Ein Naringenaseimmobilisat ausgehend von nativer Naringenase mit 1 nKAT/mg wies eine Aktivität von 5.5 nKAT/g Immobilisat auf. -5-

Claims (13)

  1. AT 395 252 B & Ein Phosphataseimmobilisat ausgehend von nativer alkalischer Phosphatase mit 0,25 nKAT/mg wies eine Aktivität von 2 nKAT/g Immobilisat auf. Ein ß-Galactoxidaseimmobilisat ausgehend von nativer ß-Galactoxidase mit 0,68 nKAT/mg wies eine Aktivität von 4,6 nKAT/g Immobilisat auf. Technische Lipase aus CandidacyclindraceazeigtegleicheSynthetaseundHydrolase-Aktivität wie vergleichbare Immobilisate mit Glutardialdehyd jedoch geringes Klumpenverhalten in organischen Lösungsmitteln. Ei Die Aktivität auf Metalloberflächen immobilisierter Glucoseoxidase entsprach einer dichten monomolekularen Enzymschicht. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen, Peptiden, Coenzymen an einem Träger, welcher Amino-, Mercapto-oder Hydroxygruppen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I
    X in welcher X Halogen bedeutet und R j, R2 gleich oder ungleich sind und X,R, COR, COOR, worinR Cj bis Cg Alkyl bedeutet, COOHoderCNbedeuten.umgesetztundgewiinschtenfallsgetrocknet wird,woraufdiezuimmobilisierenden Peptide, Proteine, Coenzyme mit dem paraständigen, freien Halogen der Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgesetzt werden.
  2. 2. Verfahren nach Anbruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung der allgemeinen Formel (I) 2,3,5,6-Tetrachlorcyclohexadien-l,4-dion eingesetzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des Trägers mit Verbindungen der allgemeinen Formel I in wasserfreien, organischen Lösungsmitteln, insbesondere Toluol, vorgenommen wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit dem Träger bei Temperaturen zwischen 0 °C und Rückflußtemperatur, vorzugsweise 50 bis 70 °C, vorgenommen wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Redoxenzyme, wie z. B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase, Aminosäureoxidase, Xanthinoxidase, Cholesterinoxidase und Ascorbatoxi-dase immobilisiert werden. -6- AT 395 252 B
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene oder Antikörper zum Immobilisieren eingesetzt werden.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daßNaringinasen, aoder ß-Glucosidasen, 5 ß-Galaktosidasen, Lipasen, Pectinasen, Esterasen, Peniciilinase und/oder Phosphatasen eingesetzt werden.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung zur Herstellung eines Biosensors auf einem mit Elektroden versehenen Träger erfolgt.
  9. 9. Verfahren nach einem da* Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Umsetzungs produktes mit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) teilweise durch photochemische Reaktion oder durch Anwendung alkalischerReagentiendesaktiviert wird, worauf dieUmsetzungmitden Peptiden,Proteinen,Coenzymen mit den verbleibenden Teilen der Oberfläche vorgenommen wird. IS
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisat neuerlich mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgesetzt wird, worauf gegebenenfalls nach teil weiser Desaktivierung der Oberfläche neuerlich Peptide, Proteine und/oder Coenzyme immobilisiert werden.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisat für die Ver- 20 wendung als Biosensor mit einer physiologisch verträglichen Deckschicht, insbesondere mit einer elektronegativen Außenseite, versehen wird.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Immobilisates als Biosensor die Meßwerte elektrochemisch bestimmt werden. 25
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Proteine, Peptide, Coenzyme mit einer wenigstens äquimolaren Menge einer Verbindung der Formel I O 30 35
    X R O 2 40 in welch» X Halogen bedeutet undR i, R2 gleich oder ungleich sind und X, R, COR, COOR, worin R Cj bis Cg Alkyl bedeutet, COOH oder CN bedeuten, umgesetzt werden, worauf das erhaltene Umsetzungsprodukt über ein freies paraständiges Halogen der Verbindung der Formel I mit dem Träger gekuppelt wird. 45 50 -7- 55
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DE3330573A1 (de) * 1982-08-24 1984-03-01 Reanal Finomvegyszergyár, Budapest Verfahren zur herstellung von immobilisierten 1 oder mehr nukleophile gruppe(n) aufweisenden verbindungen und aktivierte polymere traeger

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ATA78689A (de) 1992-03-15

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