SE463921B

SE463921B - Foerfarande foer immobilisering av foereningar,som innefattar nukleofila grupper

Info

Publication number: SE463921B
Application number: SE8304572A
Authority: SE
Inventors: Z Antal; E Beller; L Boross; I Daroczi; M Kalman; I Suto; B Szajani
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1982-08-24
Filing date: 1983-08-23
Publication date: 1991-02-11
Also published as: US4670390A; DE3330573A1; FR2532319B1; HU186566B; FR2532319A1; SE8304572L; SU1690544A3; JPS5998045A; SE8304572D0

Description

4* O“\ L' ' \O PJ ...x 2 Ändamålet med föreliggande uppfinning är att eliminera olägenheterna hos de kända metoderna och att tillhanda- hålla ett förfarande för immobilisering av föreningar, som innefattar nukleofila grupper, genom kovalenta bindningar, varvid förfarandet lätt kan utföras under enkla betingel- ser med hjälp av signifikant mindre toxiska aktiverings- medel och på lättillgängliga, fördelaktiga bärare, vilka kan framställas i industriell skala.

Föreliggande uppfinning baserar sig på den överraskande upptäckten att polymerer, som innefattar amidogrupper, ingår växelverkan med kinoner och de på så sätt bildade aktiverade polymererna kan binda föreningar, som inne- fattar en nukleofil grupp, medelst kovalenta bindningar.

Ovan angivna upptäckt är så mycket mera överraskande, eftersom det är känt att karboxylsyraamider snarare utgör mindre reaktiva föreningar och på basis av teknikens ståndpunkt skulle fackmannen icke förvänta sig att nämnda föreningar skulle reagera med kinoner.

Uppfinningen avser närmare bestämt ett förfarande för immobilisering av föreningar, som innefattar nukleofila grupper, varvid man låter en polymer svälla i en buffert med ett pH-värde mellan 3 och ll, företrädesvis mellan 6 och 8, vilken buffert icke innehåller några amino-, sulf- hydryl- och/eller hydroxigrupper, tillsätter en lösning av p-bensokinon i ett med vatten blandbart, organiskt lös- ningsmedel i en sådan mängd att p-bensokinonets slutkon- centration blir 2-100 mmol, företrädesvis 40-60 mmol, aktiverar blandningen under 0,5-48 timmar, företrädesvis under 24 timmar vid 0-70°C, avlägsnar det icke-reagerande p-bensokinonet genom tvättning med en blandning av vatten och ett med vatten blandbart, organiskt lösningsmedel och därefter med destillerat vatten och/eller en buffert, sätter till den resulterande gelen vid ett pH-värde mellan 3 och 11, företrädesvis mellan 6 och 8, en 0,001-1,0-molär lösning av en förening, som innefattar en nukleofil grupp och har en låg molekylvikt eller en 3-100 mg/ml lösning av en makromolekylär förening, som innefattar en nukleofil grupp, inkuberar suspensionen vid en temperatur från -l3°C till +40°C, företrädesvis vid en temperatur från -l3°C till +7°C under 24 timmar och därefter separerar gelen och avlägsnar den icke-bundna föreningen, som innefattar en nukleofil grupp, genom tvättning, varvid förfarandet ut- märkes av att polymeren utgöres av en sampolymer av akryl- amid och N,N'-metylen-bis-akrylamid.

Som organiskt lösningsmedel för p-bensokinonet föredrages etanol eller dioxan. Det för tvättning använda med vatten blandbara organiska lösningsmedlet är företrädesvis 20 % dioxan. Den aktiverade bäraren kan förvaras i fuktigt tillstånd eller i lyofiliserat tillstånd.

Föreningar med låg molekylvikt tillsättes företrädesvis som en 0,01-molär lösning, medan koncentrationen av lös- ningar av makromolekylära föreningar företrädesvis uppgår till 20 mg/ml.

Den icke-bundna förening som innefattar en nukleofil grupp avlägsnas genom tvättning flera gånger med en buffert respektive en buffert innefattande 1,0 mol natriumklorid.

Fördelarna med förfarandet enligt föreliggande uppfinning är följande: en stabil bindning bildas; förfarandet kan utföras under användning av lättill- gängliga substanser; förfarandet är applicerbart på en mångfald bärare; förfarandet är applicerbart inom ett brett pH-intervall.

Uppfinningen áskådliggöres närmare medelst följande ut- föringsexempel.

-Cm OS (_24 \O D.) Exempel L 30 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 1200 ml av en 0,01- -molär kaliumnatríumfosfatbuffert (pH=8), varefter en lösning av 0,25 mol p-bensokinon i 20 % dioxan (300 ml) tillsättes och suspensionen får stà 24 timmar vid 50°C.

Den svällda gelen avlägsnas och tvättas i tur och ordning med 3 liter 20-procentig dioxan och 10 liter destillerat vatten. Den tvättade gelen underkastas lyofilísering. Man erhåller på så sätt 24,3 g av en aktiverad bärare.

Exemgel 2 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- -molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,2-molär p-bensokinonlösning i 20-procentig dioxan (1,0 ml) till- sättes och suspensionen får stå 24 timmar vid 50°C. Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentig dioxan och 70 ml destillerat vatten.

Den aktiverade gelen filtreras i vakuum och 2,0 ml av en 0,01-molär X-amino-smörsyralösning tillsättes. För solu- bilisering av 3'-amino-smörsyran användes en 0,2-molär kaliumnatriumfosfatbuffert (pH 7,5). Suspensíonen inkuberas vid 4°C under 24 timmar, gelen separeras och den icke-bundna X-amino-smörsyran avlägsnas genom tvättning med en 0,1-molär natriumacetatbuffert innefattande 1,0 mol natriumklorid (pH 5,0) och en 0,1-molär natriumväte- karbonatlösning (pH 8,5). På så sätt bindes 4 pmol K- amino-smörsyra, vilket motsvarar 20 % av den till reak- tionsblandningen tillsatta mängden 5'-amino-smörsyra. b”.

.Ix Ch LR! \Q hö Exempel 3 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,25-molär p-bensokinonlösning i 20-procentig dioxan (1,0 ml) till- sättes och suspensionen får stå 24 timmar vid 50°C. Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentig dioxan och 70 ml destillerat vatten.

Den aktiverade gelen filtreras i vakuum, varefter 2,0 ml av en 20 mg/ml bovinserumalbuminlösning tillsättes. I syfte att förbättra upplösningen av bovinserumalbuminet användes en 0,1-molär natriumformiatbuffert (pH 3,0).

Suspensionen innuberas 24 timmar vid 4°C, gelen separeras och det icke-bundna serumalbuminet avlägsnas genom tvätt- ning med en 0,1-molär natriumacetatbuffert innefattande 1,0 mol natriumklorid (pH 5,0) och en 0,1-molär natrium- vätekarbonatlösning (pH 8,5). På så sätt bindes 10 mg serumalbumin, vilket motsvarar 25 % av den till reak- tionsblandningen satta mängden serumalbumin.

Exempel 4 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,25-molär p- bensokinonlösnínq i 20-procentíg dioxan (1,0 ml) tillsät- tes och suspensionen får stå 24 timmar vid 50°C. Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentig díoxan och 70 ml destillerat vatten.

Den aktiverade gelen filtreras i vakuum, varefter 2,0 ml av en 20 mg/ml bovinserumalbuminlösning tillsättes. En 0,1-molär kaliumnatriumfosfatbuffert (pH 6,0) användes för att underlätta upplösningen av bovinserumalbuminet. Sus- pensionen inkuberas vid 4°C under 24 timmar, gelen sepa- reras och det icke-bundna serumalbuminet avlägsnas genom .Ex ON .. \! \ v |\_') ...x 6 tvättning med en 0,1-molär natriumacetatbuffert inne- fattande 1,0 mol natriumklorid (pH 5,0) och en 0,1-molär natriumvätekarbonatlösning (pH 8,5). På så sätt bindes 4,5 mg bovinserumalbumín, vilket motsvarar 11,25 % av det till reaktionsblandníngen satta serumalbuminet. f; Exempel 5 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- -molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,25-molär p- -bensokinonlösning i 20-procentig dioxan (1,0 ml) till- sättes och suspensionen får stå 24 timmar vid 50°C. Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentig dioxan och 70 ml destillerat vatten.

Den aktiverade gelen filtreras i vakuum, varefter 2,0 ml av en 20 mg/ml bovinserumalbuminlösning tillsättes. En 0,1-molär natriumkarbonat-natriumvätekarbonat-buffert (pH 9,0) användes för att underlätta upplösningen av bovin- serumalbuminet. Suspensionen ínkuberas vid 4°C under 24 timmar, gelen separeras och det icke-bundna serumalbuminet avlägsnas genom tvättning med en 0,1-molär natriumacetat- buffert, som innefattar 1,0 mol natriumklorid (pH 5,0) och en 0,1-molär natriumvätekarbonatlösning (pH 8,5). På så sätt bindes 5,0 g bovinserumalbumín, vilket motsvarar 12,5 % av det till reaktionsblandningen satta serum- albuminet.

Exemgel 6 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- -molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,25-molär : p-bensokinonlösning i 20-procentig dioxan (1,0 ml) till- sättes och suspensionen får stå 24 timmar vid 50°C. Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentig dioxan och 70 ml destillerat vatten. 43921 Ü\ 7 Den aktiverade gelen filtreras i vakuum och 2,0 ml av en 20 mg/ml glukooxidaslösning tillsättes. Upplösningen av glukooxidaset befrämjas med hjälp av en 0,1-molär kalium- natriumfosfatbuffert (pH 7,5). Suspensionen inkuberas 24 timmar vid 4°C, gelen separeras och det icke-bundna pro- teinet avlägsnas genom tvättning med en 0,1-molär natrium- acetatbuffert, som innefattar 1,0 mol natriumklorid (pH 5,0) och en 0,1-molär natriumvätekarbonatlösning (pH 8,5).

Mängden av det till gelen bundna proteinet är 4,5 mg och aktiviteten uppgår till 7,2 enheter/g xerogel. En enhet motsvarar den mängd enzym som kan katalysera oxidationen av 1,0 pmol ß-D-glukos vid pH 7,0 och 25°C per minut. Den specifika aktiviteten av det bundna enzymet uppgår till 8 % av aktiviteten hos det upplösta enzymet.

Exempel 7 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- -molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,2-molär p- -bensokinonlösning i 20-procentíg dioxan (1,0 ml) tillsättes och suspensíonen får stå 24 timmar vid 50°C.

Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentíg díoxan och 70 ml destíllerat Vatten.

Den aktiverade gelen filtreras i vakuum och 2,0 ml av en 20 mg/ml katalaslösning tillsättes. Upplösningen av katalaset förbättras genom användning av en 0,1-molär kalium-natriumfosfatbuffert (pH 7,5). Suspensionen inku- beras 24 timmar vid 4°C, gelen separeras och det icke- -bundna proteinet avlägsnas genom tvättning med en 0,1- -molär natriumacetatbuffert, som innefattar 1,0 mol natriumkloríd (pH 5,0) och en 0,1-molär natriumväte- karbonatlösning (pH 8,5). élóïi 92": 8 Mängden på gelen bundet protein är 5,3 mg och aktivi- teten uppgàr till 2100 enheter/g xerogel. En enhet mot- svarar den mängd enzym som förmår katalysera sönderdelnin- gen av 1 pmol väteperoxid per minut vid 25°C. Den speci- fika aktiviteten av det bundna enzymet uppgàr till 2 % av aktiviteten hos det upplösta enzymet.

Exempel 8 0,1 g Akrilex P-100 xerogel (akrylamid-N,N'-metylen-bis- -akrylamid-sampolymer) suspenderas i 4,0 ml av en 0,1- -molär fosfatbuffert (pH 8,0), varefter en 0,25-molär p-bensokinonlösning i 20-procentig dioxan (1,0 ml) till- sättes och suspensionen får stà 24 timmar vid 50°C. Den svällda gelen separeras och tvättas i tur och ordning med 70 ml 20-procentig dioxan och 70 ml destillerat vatten.

Den aktiverade gelen filtreras i vakuum och 2,0 ml av en 0,01-molär glukoslösning tillsättes. Upplösningen av glukosen befrämjas genom användning av en 0,1-molär kaliumnatriumfosfatbuffert (pH 7,5). Suspensionen inkuberas 24 timmar vid 4°C, gelen separeras och den icke- -bundna glukosen avlägsnas genom tvättning i tur och ord- ning med en 0,1-molär natriumacetatbuffert, som innefattar 1,0 mol natriumklorid (pH 5,0) och en 0,1-molär natrium- vätekarbonatlösning (pH 8,5). På så sätt bindes 6 pmol glukos, vilket motsvarar 30 % av den till reaktionsbland- ningen satta mängden glukos.

Claims

1. PATENTKRAV Förfarande för immobilisering av föreningar, som inne- fattar nukleofila grupper, varvid man låter en polymer svälla i en buffert med ett pH-värde mellan 3 och 11, företrädesvis mellan 6 och 8, vilken buffert icke inne- håller några amino-, sulfhydryl- och/eller hydroxi- grupper, tillsätter en lösning av p-bensokinon i ett med vatten blandbart, organiskt lösningsmedel i en sådan mängd att p-bensokinonets slutkoncentration blir 2-100 mmol, företrädesvis 40-60 mmol, aktiverar blandningen under 0,5- -48 timmar, företrädesvis under 24 timmar, vid 0-70°C, avlägsnar det icke-reagerade p-bensokinonet genom tvätt- ning med en blandning av vatten och ett med vatten blandbart, organiskt lösningsmedel och därefter med des- tillerat vatten och/eller en buffert, sätter till den resulterande gelen vid ett pH-värde mellan 3 och 11, före- trädesvis mellan 6 och 8, en 0,001-1,0-molär lösning av en förening, som innefattar en nukleofil grupp och har en låg molekylvikt eller en 3-100 mg/ml lösning av en makro- molekylär förening, som innefattar en nukleofíl grupp, inkuberar suspensionen vid en temperatur fràn -l3°C till +40°C, företrädesvis vid en temperatur från -l3°C till +7°C under 24 timmar och därefter separerar gelen och avlägsnar den icke-bundna föreningen, som innefattar en nukleofil grupp, genom tvättning, k ä n n e t e c k - n a t därav, att polymeren utgöres av en sampolymer av akrylamid och N,N'-metylen-bis-akrylamid. ...Ä