JPS61111685A - 安定化された酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、熱不活性化又は最終生成物介在不活性化に
対して安定化された酵素に関する。さらに詳しくは、こ
の発明はソメチルアノビミデート（ｄｌｍｅｔｈｙｌ　
ａｄｉｐｌｍｉｄａｔｓ）による架橋によって安定化さ
れたカタラーゼ、及びエチルアセチミゾ−ト（ｅｔｈｙ
ｌ　ａｃｅｔｆｍｉｄａｔｅ）又はその同族体によフ安
定化されたピラノース−２−オキシダーゼに関する。

〔発明の背景〕

カタラーゼ（ｇｃ　１．１１．１．６．）は約３２３．
０００ダルトン（ｄ）の合計分子量（ＭＷ）を有する四
量体酵素である。この酵素は、化学量論的反応において
過酸化水素ヲ水と分子状酸素とに分解する２Ｈ２０□−
一→２Ｈ２ｏ＋０２ 過酸化水素の分解は酵素の活性部位として機能するヘム
鉄錯体により触媒される２段階反応により進行する。

過酸化水素を分解するカタラーゼの特徴的反応のため、
カタラーゼは多くの工程において価値ある成分である。

例えば、米国特許Ｎｏ　４，４６４，２９６のｎ裂され
た脂肪種子蛋白質（ｏｉｌ＠、ｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
）の製造方法は、蛋白質の溶解性を増加するために十分
な過酸化物を使用する。可溶化された蛋白質は集められ
、カタラーゼを含有する水に対して透析され、そして乾
燥精製脂肪種子蛋白質を得るために透析物が凍結乾燥さ
れる。

米国特許Ｎｏ　４，４６０，６８６は、反応混合物中に
おいて固定化されたグルコースオキシダーゼ／カタラー
ゼ組成物を用いる１〜２℃の温度におけるグルコースの
酸化を記載している。この方法におけるカタラーゼ活性
は、組成物中のグルコースオキシダーゼ活性の１／６以
上に維持される。低温で酸化を行うことにより長い反応
期間が維持される。

米ｌ特許ＮＯ４，１０１，５８１に記載されているよう
に、液体、特に生物学的液体中の過酸化水素発生物質の
存在を決定するための方法においてカタラーゼが使用さ
れる。過酸化物からホルムアルデヒドを生成せしめるた
めにカタラーゼ及びメタノールが使用される。ホルムア
ルデヒドは塩化第二鉄の存在下でヒドロシンと反応して
色素を形成し、この色素を光度計により　１ｇ１Ｊ定す
ることができる。

米国特許ＮＯ３，９３５，０７１に記載されている方法
に従えば、相互に近接して適当な担体に結合しているカ
タラーゼ及びグルコースオキシダーゼを用いてグルコー
スのグルコン酸への転換が行われる。

グルコースオキシダーゼ流より介在されるグルコースの
グルコン酸への酸化により生成した過酸化物は結合した
カタラーゼにより水と分子状酸素とに転換される。この
特許によれば２種類の酵素の共存固定化が触媒活性を拡
げそして過酸化物によるグル；−スオキシダーゼの不活
性化を最小にする。

カタラーゼはまた、米国特許ＮＯ４，２４６，３４７及
びＮｏ　４，４２３，１４９に記載されているように、
グルコースから中間体グルコンン（ｇｌｕｃｏｓｏｎｅ
　）　’に介してフラクトースを製造する方法において
、過酸化水素を水と分子状酸素とに転換する。この特許
においては、酸素の存在下でグルコースの２位のヒドロ
キシル基をカルざニルに転換することができる酵素とグ
ルコースが反応する。この特異的転換を行うことができ
る酵素にはピラノース−２−オキシダーゼ（Ｐ−２−０
）及びグルコース−２−オキシダーゼ（Ｇ−２−０）が
含まれる。Ｐ−２−０によ）介在される酵素反応の１つ
の生成物として生成する過酸化水素はＰ−２−０酵素分
子上の幾つかの必須部位を酸化しその機能を破壊する。

過酸化水素を除去するため反応液にカタラーゼが添加さ
れる。これらの特許に記載されている方法は約１５°Ｃ
〜約６５℃の範囲の温度において行うことができる。

カタラーゼはまた、米国特許ＮＯ３，８８９，６８９に
記載されているように、タバコの性質を強化する方法に
おいても使用される。この方法においては、カタラーゼ
及び過酸化水素含有液がタバコのすき間に注入され、こ
こでカタラーゼ及び過酸化水素がその場で反応する。

カタラーゼを含有する層を用いる陽画写真プロセスが米
国特許Ｎｏ　３，６９４，２０７に記載されている。

このプロセスにおいてはカタラーゼが過酸化水素と反応
して層中に気泡画像を形成するか、又は発色酸化反応に
よって色素画像を形成する。カタラーゼは露出に際して
光により不活性化される。

前記のことから、酵素カタラーゼが多くの工程に訃いて
使用され、その工程においてはその工程中の少なくとも
ある期間、酵素の活性が不活性化されることなく維持さ
れなければならないことが明らかである。酵素のそのサ
ブユニットへの不可逆的解離が酵素を不活性化すること
が仰られている。４サブユニツト酵素であるカタラーゼ
は確かにサブユニットへの解離によりネ活性化される。

２官能架橋剤による酵素の分子内架橋は、酵素の固定化
及び不活性化に対する安定化の分野における重要な手段
である。

酵素の活性及び特性に対する架橋の影ｅを予想すること
は不可能ではないにしても困難である。

ある酵素の架橋は活性の増強をもたらすであろうし、他
の酵素の架橋は活性の増加をもたらさず。

又はその喪失さえするであろう、確かに、１つの２官能
酵素において、架橋が増加した活性及び減少した活性を
生じさせる場合がある。例えば、ワシ膵臓すがヌクレア
ーゼＡが２官能ジ−イミドエステルであるジメチルアソ
ビミデート（ｄ１ｍ＠ｔｈｙｌａｄｌｐｉｍｉｄａｔ＋
ｓ）により架橋された。得られた架橋されたモノマー酵
素はシチジン２／、　ａ／−サイクリ。

クホスフェー）Ｋ対する比活性の増加を示し、セしてＲ
ＮＡに対する活性の低下を示したａｍ　Ｈａｒｔｍａｎ
＋Ｆ、Ｃ，及びＷｏ　１　ｄ　＊　Ｆ　、　ｅノメチル
アジピミデートによるウシ膵臓リボヌクレアーゼ人の架
橋、バイオケミストリー（旧□ｃｈｅｍｉ＠ｔｒｙ）旦
（３）：２４３９−２４４８（１９６７）。

酵素の熱不活性化は上昇した温度において起るであろう
。上昇した温度なる語は、その酵素が得られた生物にと
りて正常な周囲温度よシも実質上高い温度を意味する。

熱不活性化は工業的酵素的方法において多くの理由によ
り重要な現象である。

化学的反応速度及び酵素反応速度は一般に温度の上昇と
共に加速する。熱不活性化が回避されるなら、２５℃か
ら７０℃への温度の上昇は反応速度の１００倍の増加を
もたらすであろう。従って、工程経済の観点から商業的
酵素工程においては高＠を用するのが有利である。

細菌汚染の可能性が高温において運転される酵素反応器
において減少する。このような細菌汚染の不都合な効果
は多数あシ、そしてこれには例えば酵素を破壊するプロ
テアーゼの遊離、フィルター〇目詰シ、不所望の副産物
の生成、及び工程サイクルのコストの上昇が含まれる。

食品工業においてはこの問題が深刻であるため、はとん
どの酵素的食品工程は６０℃を超える温度において行わ
れる。

酵素反応器中の溶存基質の濃度を最高にすることによっ
て工程生産性を増加することができる。

はとんどの基質の溶解性は温度と共に上昇する。

例エバ、グルコースのポリマーである澱粉は１００℃〜
１１０℃の温度においてゼラチン状になる。

上昇した温度で行われる工業工程の例には、グルコース
イソメラーゼを用いるグルコースからの高７ラクトース
シロツプの製造、及び澱粉のα−アミラーゼ及びグルコ
アミラーゼによる加水分解が含まれる。

〔発明の対象及び概要〕

本発明者等は、ある種の架橋剤により架橋されたカタラ
ーゼが天然カタラーゼに比べて新規且つ予想外の性質を
有することを見出した。これらの新規且つ予想外の性質
は熱不活性化に対する架橋されたカタラーゼの安定化、
他の架橋されたカタラーゼと比較した場合の架橋された
カタラーゼの比活性の増加、及び不活性化する基質、特
にＤ−アラビノ−２−へキツスロース（Ｄ−ａｒａｂｌ
ｎｏ−２−ｈｅｘｏｓｕｌｏｓ＊　）　（Ｄ−グルコソ
ン、この明細書においてグルコンンと称する）の存在下
での増加した酵素安定性である。

この明細書において１熱安定化１とは、所与の条件下で
の酵素の熱不活性化の速度定数の低下、所与の条件下で
の酵素の熱不活性化の半減期の延長又は所与の条件下で
の酵素の一定の程度の熱不活性化に達するのに必要な温
度の上昇のいずれかを意味する。特に、本発明者等は、
ある条件下でツメチルスベリミゾ−）　（ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌ　５ｕｂｓｒｉｒｎｉｄａｔｅ）又はジメチルアソ
ピミデートにより架橋されたカタラーゼがグルコソンの
存在下で安定であることを見出した。さらに、このよう
な架橋されたカタラーゼは、グルコソンの存在下で長期
間にわたって０時におけるその活性よりも約１１５〜１
２０チの範囲で増加した活性を示す。架橋されたカタラ
ーゼの上記の特性に加えて、発明者等は、ノメチルアゾ
ピミデートで架橋されたカタラーゼは熱不活性化に対す
る増加した安定性、並びにカルメツイミド及びノメチル
スペリミデートにより架橋されたカタラーゼに比べて高
い比活性を有することを見出した。

この発明はさらに、架橋されたカタラーゼが上記の特性
を有する様にカタラーゼを架橋する方法を包含する。こ
の方法は架橋剤としてノメチルアゾピミデート又はジメ
チルスベリミデートを使用する。この発明の方法におい
てジメチルスベリミデートを使用する場合、架橋された
カタラーゼはグルコンンの存在下での増加した安定性及
び活性を有するであろう。この発明の方法においてノメ
チルアノピミデートを使用すれば、得られた架橋された
カタラーゼは、グルコソンの存在下での増加した安定性
及び活性、熱不活性化に対する増加した安定性、及びカ
ルメツイミド又はジメチルスベリミデートにより架橋さ
れたカタラーゼよシも高い比活性の特徴を有するであろ
う。

この発明のカタラーゼ架橋法に関し、ソメチルアノアピ
ミデート又はノメチルスベリミデートによる満足すべき
架橋のためには、架橋剤添加中のカタラーゼ溶液の温度
の制御、架橋剤添加中のカタラーゼ溶液の声の制御、及
びカタラーゼ溶液中への架橋剤のゆるやかな添加が必要
である。

２重量％のジメチルスベリミデートをｐＪ（７において
一度にすべて添加することによりカタラーゼを架橋した
場合、５０ｍＭアセテート中４チのグルコソンの存在下
４０℃におけるカタラーゼの半減期は、わずかに係数２
をもって（５０時間か５約１００時間へ）改良されるに
過ぎない。一層多くの（５〜３０重量％）の架橋剤及び
一層高い声での反応の実施によっては、グルコソンの存
在下での酵素の安定性は実質上改良されない。架橋イミ
ノン結合は加水分解に対して耐性である。しかしながら
、架橋剤は水と反応してエステルを形成し、従って蛋白
質を架橋するのが妨げられるであろう。

ｐＨ１０の硼酸緩衝液中室温において、ＮＭＲにより測
定されるゾメチルスペＩＪ　ミデートの半減期は約２．
５時間である。

この発明の方法においては、カタラーゼ溶液の温度はＯ
℃〜１０℃の範囲、そして好ましくはＯ℃〜５℃の範囲
に維持すべきである。架橋剤と酵素との反応を妨害する
架橋剤と水との間のエステル形成反応を最少にするため
、声は架橋剤の添加中９．１〜９．９に維持すべきであ
る。声は９．４〜９．７の間に維持されるであろう。架
橋剤はカタラーゼ溶液にすべて一度にではなく徐々に添
加されるであろう。好ましくは、２０重量％のジメチル
スベリミデート又はジメチルアソ♂ミデートを５時間に
わたって添加する。同じ重量％の架橋剤を−４層ゆっく
りと添加することも熱論可能である。

一層少い重量％の架橋剤を一層短時間で添加することも
可能である。最適時間は添加されるべき架橋剤の量に依
存して異りそして実験的に決定することができようが、
しかしすべての場合において、酵素溶液に添加される場
合に低濃度の未反応架橋剤のみが存在するように徐々に
添加するのが好ましいＯ ピラノース−２−オキシダーゼ（Ｐ〜２−Ｏ）は、電子
受容体として酸素を使用する２電子機構によりグルご−
スのグルコシンへの酸化を触媒スる酵素である。この反
応の副産物として生成する過酸化水素はＰ−２−０を不
活性化することが仰うレテいる。グルコースの７ラクト
ースへの酵素的転換におけるＰ−２−０の使用が米国特
許ＮＯ４，４４６，３４７及びＮＯ４，４２３，１４９
に記載されておシ、この記載を引用によりこの明ｉｖに
組み入れる。ポリポルスーオブツスス（ｐ、ａｌｙｐｏ
ｒｏｕｇｏｂｔｕｓｕｓ　）からのＰ−２−０は合計分
子量２９０ρ００ｄを有するホモ四量体である。テプユ
ニットの分子量は７２，０００でありそして酵素は４個
の７ラピンを含有する。カタラーゼと同様に、サブユニ
ットへの酵素の解離が酵素を不活性化することが知られ
ている。しかしながら、カタラーゼと異り、ノメチルノ
アゾピミデート又はジメチルスベリミデートによるＰ−
２−０の架橋は、熱不活性化又は最終生成物グルコシン
による不活性化に対する酵素の安定化をもたらさない。

発明者等は、アミシン化剤により化学的に処理されたＰ
−２−０が、架橋されたＰ−２−０又は天然Ｐ−２−０
に比べて熱不活性化に対して安定化されることを見出し
た。特に、エチルアセチミデート（ｅｔｈｙｌ　ａｃｅ
ｔｉｍｌｄａｔｅ　）によ）処理されたＰ−２−０は２
５℃にてインキュベートされた場合、天然Ｐ−２−０に
より示される活性の７５チ〜９８チを維持する。、６５
℃にて１００分間後、アミジン化されたＰ−２−０はも
との活性の５５チ〜８０％の活性を維持するが、天然Ｅ
’−２−０はもとの活性の約２２％を維持するに過ぎな
い。

６５℃にで４５０分間後、アミジン化Ｐ　−２−０はそ
の最初の活性の約５０％をなお維持している。

発明者等はさらに、アミジン化Ｐ−２−０が天然Ｐ−２
−０に比べて最終生成物グルコシンによる不活性化に対
しても、安定化されることを見出した。グルコシンの存
在下において、Ｐ−２−００酵素活性は第１図に示すよ
うに二相反応的（ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｋｉｎｅｔｉｃ　
ｍｏｄｅ）に減少する。最初の４８時間のあいだ、活性
は約７０時間の見かけ半減期をもって減少する。４８時
間後、活性は約２５０時間の半減期を有する。第２図に
示されるように、アミシン化の後Ｐ　−２−０はわずか
に延長された目かけ半減期を有する。

この発明はさらに、アミジン化されたＰ−２−０が上記
の特性を有するようにＰ−２−０をアミシン化する方法
を含む。この発明の方法は、例えばアセチミデート及び
その同族体、例えばエチルアセチミデートのごときアミ
シン化剤を用いる。メチルアセチミデートもまたこの発
明の実施において効果的であろうと信じられる。

この発明のアミシン化法は、例えばエチルアセチミデー
トのごとき適当なアミジン化剤でＰ−２−０をアミジン
化することを含む。アミジン化剤はｐＨを９〜１０．５
に維持しながら徐々に添加される。

好ましくは声は９．５〜１０．０に維持される。

グルコシン及び／又は熱不活性化に対して安定化された
酵素カタラーゼ全提供するのがこの発明の目的である。

この発明の他の目的は架橋剤を用いてグルコシン及び／
又は熱不活性化に対して安定化された酵素カタラーゼを
提供することである。

この発明の目的はグルコシン不活性化及び熱不活性化に
対して安定化された酵素Ｐ−２−０を提供することであ
る。

この発明の他の目的はアミシン化剤を用いてグルコシン
及び熱不活性化に対して安定化された酵素Ｐ−２−０を
提供することである。

この発明の前記以外の目的は、グルコシン又は熱不活性
化に対して安定化された酵素を用いるグルコソンの酵素
的製造のための改良された方法を提供することである。

この発明の前記以外の目的は、グルコシン及び熱不活性
化に対して安定化された酵素Ｐ−２−０を用いるグルコ
シンの酵素的製造のための改良された方法を提供するこ
とである。

この発明のこれらの及び他の目的は次の例によりさらに
明らかになるでろろう。これらの例は単に例示的なもの
であって、この発明の範囲がこれにより限定されるもの
ではない。

例Ｉ Ｐ　−２−０は、米国特許ＮＯ４，４２３，１４９に記
載されている方法に従って調製し、そしてＤＥＡｆｆｉ
イオン交換カラムからの溶出によって精製した。

カラムラ、２５　ｍＭ　Ｔｒｉ　ｓ　−ＨＣ２緩衝液：
Ｐｋ１８．　ｓにより、入口及び出口の声及び電導性が
同一になるまでカラムに緩衝液を通すことによυカラム
を平衡化した。カラムに負荷する前に、Ｐ−２−０を２
５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｖｋｉ　８．５　）
に対して透析し酵素及び出発緩衝液のイオン強度が同−
知なるようにした。透析された酵素をカラムに負荷した
。

最初ＮａＣ４濃度Ｏ及び最終ＮａＣ６濃度０．２Ｍの同
じ緩衝液３ペツドボリウムから成る直線塩グラゾェント
によυカラムを溶出操作した。流速を２．５ｍ１１分に
調整した。溶出液の１０ｍｔの画分を集め、そして酵素
活性及び蛋白質濃度について分析した。

グルコシン（９，８％グルコソン、０．３％グルコース
、アミコンカラム上でのクロマトグラフにより決定した
場合８９％純度）を米国特許第４４２３，１４９に記載
されているようにして製造した。エチルアセチミデート
はアルドリッチケミカルカン／４ニーから得た。

エチルアセチミデートによるＰ−２−０のアミジン化を
異なる２つの方法により行った。第１の方法においては
、２３ｍｇのエチルアセチミデート（純エタノール中Ｑ
、’ｌ　ｍ　ｍｏｔ）をペリスタポンプを用いて徐々に
５時間にわたって、１０ｒｎＭアセテート中６　ｒｎｇ
／ｍｌの練炭の２０ｍ！ＩＤＰ−２−０に加えた。反応
混合物のｐＨをケミトリックスＰＨ−ントローラーを用
いて２０　ｍＭ　Ｎ島ＯＨを加えることによ）９．５に
維持した。すべての添加を２５℃にて行った。エチルア
セテミデートの最終添加１時間後、反応混合物を希クエ
ン酸緩衝液と共にＧ−２５セフアｆツクスカラム上でク
ロマトグラフ処理した。アミシン化されたＰ−２−０を
含有する両分を活性の測定のために保持した。

第２の方法において、エチルアセチミデートの溶液（１
〜ｌの純エタノール中１１５ｍｇ）ｔ’、３０分間ごと
Ｋ　Ｏ，ｌ　ｍｌずつ、ｐ）ｉ　５．　Ｏの１０ｍＭ酢
酸緩衝液中４　ｍｇ／ｉｎｔ濃度のＰ−２−０溶液１５
ｍｔに加えた。声を上記のようＫしてｌｏ、ＯＫ維持し
た。エチルアセチミデートの最終添加の２．５時間後、
溶液を上記のようにしてクロマトグラフ処理した。アミ
シン化Ｐ−２−０を含有する両分を活性測定のために保
持した。

アミノ基のＴＮＢＳ測定をＨａｂｅｅｂにより記載され
た方法により行つた。Ｈａｂｅｅｂ、Ａ、Ｆ″、Ｓ、ア
ナリティカルーピオケミストリ−（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉ
ｏｃｈｓｍ）１４　：３８２（１９６６）。ＴＮＢＳ及
びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）はシグマ令ケミカル
・カンパニー、セントルイス、Ｍｏ、６３１７８ＵＳＡ
から得られた。使用されたＰ−２−００量はＬｏｗ＠ｒ
ｙ法によって決定した。０．１〜ｌ　ｍｇ／　ｍＬの濃
度のＰ−２−０溶液１　ｃａｌに、４チのＮａＨＣＯ３
（Ｐ）（８，５）及び１−００．１チＴＮＢＳを加えた
。この溶液を４０℃にて２時間反応せしめ、そして１　
ｒｎｔのｌＯチドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を加えて蛋白質を可溶化しそして０．６　ｒ
ａｔのｌＮＨＣｌを加える際のその沈澱を防止した。溶
液の吸収を、蛋白質溶液の代シにｌ　ｒｎＬの水俣は緩
衝液）を用いて上記のように処理したブランクに対して
３３５簡において読み取った。ｌＸｌ０Ｍ　　″の分子
吸光係数を用いて残留アミノ基を計算した。

Ｐ−２−０を用いる結果を保証しそして標準を）ｉａｂ
ａ＠ｂ　（前掲）のそれと比較するためにＢＳＡ　ｉ使
用した。ＢＳＡについての結果はＨａｂｅｅｂの１０チ
以内でありたがＨａｂｅｓｂ　Ｋよシ使用されたＢＳＡ
標品はこの発明において使用されたそれとは異っていた
。

Ｃ，Ｐ−２−０の測定 Ｐ−２−００測定は共役反応系を用いて行った。

この系においては、グルコースのＰ−２−０により触媒
される配列により生成するＨ２０□がホースラディッシ
ュノ９−オキシダーゼ（ＨＲＰ）により触媒されるオル
ソソアニシクン（０ＤＡＤ　）の酸化において消費され
て着色物質が生成する。第２の発色反応が律速とならな
いように十分なｍｐを使用した。反応は４６０ｎｍにお
いて監視し、Ｐ−２−０活性ｔ　Ａ４６Ｇ／Ｓ　カラｂ
ｒ　’ｃｒｔを２Ｋ　’ｅＬ元ｆＪｋ　Ｌ、Ｐ−２−０
０非存在下測定溶液に既知量のＨ２Ｏ２を添加した場合
に観察される正味吸収増加から決定した。測定を行う前
にＰ−２−０サンプルをリン酸緩衝液（５０ｒｎＭ、　
ｐＨ６，０）によＦ）　０．０２〜０．０４ｒｎｇ／ａ
ａｔの酵素濃度に稀釈した。室温における希溶液中酵素
の半減期は約１〜２時間であるため、稀釈してすぐに測
定を行った。Ｏ，ｌ　ｍＬの酵素稀釈溶液を、空気飽和
５０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中に０、０
１４０ＤＡＤ　、　０．１　ｍｇ／ｍｔホースラディ７
　シュａ４−オキシダーゼ及び４．２％グルコースを含
有する溶液０．９　ｍｌに加えた。２５℃にで１０分分
間−た後、反応混合物に１．０ｍｔの２チスル７アミン
酸を添加することにより反応を停止した。４６０　ｎｔ
ｏにおける吸収を、酵素溶液の代シに緩衝液を用いて調
製したブランクに対して測定した。標準過酸化水素溶・
液を調製し、そしてこれを０ＤＡＤ−グルコース−ｎＰ
溶液と混合し、次に約１分間後に２％スルファミン酸溶
液と混合することにより、生成した過酸化水素の量を測
定した。種々の濃度において標準を測定し、そしてノ４
−キンΦエルマー・ラムダ５分光光度計による自動濃度
決定法を用いた。

標準サンプルは２−未満の標準偏差を有し、他方サンプ
ルは一般に５チ未溝の標準偏差を有していた。

Ｄ、天然Ｐ−２−０及びアミジン化Ｐ−２−０の熱変性 ｐＨ４，ｇの５７ＦＩＭクエン酸緩衝液中５ｍｇ／ｍｔ
蛋白質濃度の天然Ｐ−２−０又はアミジン化Ｐ−２−０
のサンプル１ｍｔ’！（１，５ｒｒＬｔのエッペンドル
フ試験管に入れ、そして６５℃の水浴に入れた。種々の
時点においてサンプルを遠心し、そして次に上記の０Ｄ
ＡＤ測定を用いて酵素の残留活性を測定した。

Ｅ、グルコノンとのインキュベーション３％のグルコノ
ンを含有する４５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）中
０．２　ｍｇ／ｍｔ濃度の天然Ｐ−２二〇又はアミジン
化Ｐ−２−０のサンプル２　ｒｎｔを小？υエチレンテ
、−プに入れ、そして２５℃の水浴中でインキ、ベート
した。対照溶液は同じ酵素を含むがグルコノンを含有し
なかった。

グルコノンの存在下でＰ−２−０の酵素活性は２相違度
様式で減少した（第１図）。最初の４８時間中、活性は
約７０時間の見かけ半減期をもって減少した。後の４８
時間において、活性は約２５０時間の半減期を有してい
た。

活性の減少が汚染ピラノースデヒドラターゼ（ｐｙｒａ
ｎｏａｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａａｅ）の存在に基すいて
いるおそれがあるため、２つの異るＰ−２−０標品を用
いた。第１のＰ−２−０標品においてはそのビラノース
テヒドラターゼのほとんどがＤＥＡＥカラムにより除去
され（０，０２１υ／分・ｒＩＩＩｇ）、他方筒２のＰ
−２−０標品は未精製酵素標品（１，４［Ｊ／分・ｍｒ
）でｈｚた。グル；ノンの存在下での酵素の不活性化に
おいて有意な相違は見られなかった（第１図）。活性の
２相減少は、グルコノンによって惹起される少なくとも
２種類の異る不活性化機作が存在することを示唆する。

しかしながら、これらの結果は、グルコノンの存在下で
のＰ−２−０の不活性化が大きな問題であることを示唆
している。

Ｇ、アミジン化されたＰ−２−０に対するグルコノンの
効果 上記のＰ−２−０の２つの異るアミジン化標品はグルコ
ノンの存在下で天然Ｐ−２−０よシ良好な安定性を有す
る（第２図）。十分にアミジン化されたＰ−２−０の分
子（四量体）当りわずかに９±２アミノ基がＴＮＢＳと
反応し、他方天然Ｐ−２−０はｌ　７０１−１７ミノ基
によ５　ＴＮＢＳと反応する。

アミジン化Ｐ−２−０は天然Ｐ−２−ＯＫ比べて相当大
きな熱安定性を示す（第３図）。明らかに、アミジン化
が酵素の熱安定性を増強する。高レベルのアミジン化に
よるＰ−２−０の化学修飾が、天然Ｐ−２−０よシも約
１０倍高い熱安定性を有する酵素標品をもたらす。

Ａ／一般 カタラーゼはフェルムコかう得りＣロット４９２７）。

ノメデルスペリミデート、ジメチルアジピミデート、ト
リニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ　）、　及びウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ　）＆家シグマから得た。

グル；ノンは米国特許ＮＯ４，４２３，１４９に記載さ
れている方法により得た。

Ｂ、アッセイ ２１５　ａｍにおける過酸化水素の吸収を監視すること
によってカタラーゼ活性を測定した。５ｍｇ／ｒｎＬカ
タラーゼ溶液の５０μＬのアリコートを５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７）によ＃）１：３に稀釈して１．２５ｍ
ｇ／ｍｌり最終濃度にした。５０μｔのこの稀釈された
酵素溶液を、５　ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ。

ｐＨ７）中０．００３％Ｈ２０□に加えた。ブランクサ
ンプルは、Ｈ２Ｏ２を含まない同じリン酸緩衝液５ｏｌ
Ｉｔ中５０μｔの稀釈されたサンプルを含有した。

２１５　ｎｍにおける吸収１１：１２秒ごとに３分間測
定した。ＬｎＡｐｌＡｔ／ｌを平均することにより、又
は線形最小二乗法を用いることにより一次速度定数を得
た。速度定数を過酸化水素溶液中の蛋白質のｒｎｇで除
すことにより比活性Ｕ／ｍｇ蛋白質を得た。

与えられたサンプルについて約５チの標準偏差が得られ
た。７エルムコから得られたカタラーゼは約５００　Ｕ
／ｒｎｇ蛋白質の活性を有する。

αジイミドエステルによるカタラーゼの架橋１０ｍＭク
エン酸緩衝液（ｐＨ５）中３ｍｇ／ｍｔ濃度のカタラー
ゼのサンプル２０！ｎｔｔＧ−２５カラムに通し、そし
て次に０〜５℃に冷却した。２ｍｔのメタノール中１８
　ｍｇ／ｎＡ濃度の架橋剤ジメチルスベリミデート又は
ノメチルアジビミデートをペリスタポンプにより約５時
間にわたりて加えた。

−が９．５よシ下りた場合に２５　ｍＭ　ＮａＯＨを自
動的に添加する−（コントローラーを用いて声を９．４
〜９．７に維持した。架橋剤の最終添加の１時間後、反
応混合物を再びＧ−２５カラムに通しく５〜１０−クエ
ン酸緩衝液、ｐＨ５，０と共に）、過剰の架橋剤及び塩
を除去した。蛋白質のすべてがカラムから溶比した。

アミノ基のＴＮＢＳ測定全例ＩＫ記載した方法に従って
行った。但し、すべてのカタラーゼサンプルをまずＧ−
２５カラム中でクロマトグラフ処理してすべての硫酸ア
ンモニウム及び小イデテド断片を除去した。

Ｅ、天然カタラーゼ及び架橋されたカタラーゼの熱変性 ０、０１　Ｍ　Ｎ＊ＣＬ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）中Ｑ、　２．　ｍｇ／ｒｎｔの濃度のカタ
ラーゼ又は架橋されたカタラーゼを３００μｔのポリエ
チレンエッペンドル７試験管に入わうそして所定時間８
１℃の水浴に入れた。浴から取シ出した際、バイアルを
急冷し、そして次に稀釈した後測定した。

ｇ架橋されたカタラーゼの熱安定性 上記のようにして可溶性ジイミドエステルで架橋された
カタラーゼを用いて８１℃にて熱安定性の検討を行った
。ゾメチルアソビミデートによる酵素の架橋が相当に改
良された熱安定カタラーゼをもたらす（第４図）。ジメ
チルスベリミデートによる酵素の架橋は天然酵素よシ安
定なカタラーゼをもたらさない。

ノメチルアノピミデートにより上記のように架橋された
カタラーゼを、適当な場合には濃ＨＣ１又はＮａＯＨの
添加により声４．８と５．２の間に調整された０、　０
１２　Ｍ　Ｎａ０ＡＣ中であらかじめ平衡化されたアン
バーライトＤＰ−１（メタクリル酸−ノビ二ルベンゼン
コＩリマー、アルファープロタクトΦロット０１０８０
）イオン交換樹脂に吸着させた。

この交換樹脂のデカント、再懸濁及び−の再調整を、新
たな緩衝液を加えた場合に−が４．８〜５，２の間で安
定になるまで連続した。

酵素の吸着を２つの方法の内の１つによって行った。第
１の方法においては、あらかじめ秤量した量のＤＰ−１
樹脂を２〜３倍多い容量の、０．０１ＭＮａ０Ｃ（ｐＨ
５）中カタラーゼ溶液中で５〜１５分間渦流又は攪拌し
、そして自然沈降せしめた。上溝の酵素濃度を分光光度
法により測定した後、一層濃厚なストツタ溶液からの酵
素の他のアリコートを加え、そして混合を再度続けた。

添加した酵素に比例して上清の吸収が増加するまで酵素
の添加を続けた。交換体当り添加された酵素の量に対す
る上清の酵素吸収のグラフは、すべて又はほとんどの蛋
白質が吸着されるために最初水平であシ、そして最後に
蛋白質吸光係数を示す傾斜をもって直線的に上昇する曲
線をもたらす。この方法は、酵素と交換体との急速平衡
に基く。

ＤＰ−１交換樹脂が徐々に（時間〜日のタイムスケール
で）平衡化されることが見出されたので、第２の固定化
法を欠のようにして行った。ＤＰ−１の渦流を、交換容
量よシ過剰量になるようにあらかじめ決定された架橋さ
れたカタラーゼの量をもって開始した。上清のスペクト
ルを、時〜日の間隔で、吸収速度が無視できる程度にな
るまでとった。吸収速度は２５℃にて追跡し、そしてビ
ーカー（通常、振とりテーブル上で１００〜２０Ｏｒｐ
ｍで攪拌する）をパラフィルムにより注意深く密封して
蒸発を最少にした。スペクトルの測定径上清ブンデルを
もどして一定容量を維持した。懸濁物が存在する兆候が
ある場合、テンプル全エッペンドルフモデル５４１２ミ
クローセントリフユーノ中で５分間回転せしめることに
より、渦流中に摩擦により生じた微粒子を除去した。時
間〜日のタイムスケールにおいてＤＰ−１が有意量のカ
タラ−ゼを吸着したことが明らかになった後、なんら攪
拌を行うことなく非動力学的吸着を行った。ノメチルア
ノピミデートで架橋されたカタラーゼの溶液数ｍＬ−を
１幾分少容積の樹脂粒子と共に単【放置した。しばしば
細菌汚染を最少にするためＫ、除菌フィルター（０，２
μｍ孔ティーｅ）で戸遇された架橋カタラーゼ、及びフ
ォイルでカバーされた小ガラスビーカー中であらかじめ
オートクレーブされたＤＰ−１を用いて、無菌輸送しな
がら吸着を行った。ＤＰ−交換樹脂に固定化された架橋
酵素が負荷された後、０．０１　Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ中で
繰シ返し洗浄して未吸着酵素を除去した。比活性分−１
・ｇ乾燥重量支持体−１ｔを６０量１分で除し、ｇ温室
Ｖｇ乾燥重量で除し、ｍｇ吸着された酵素／ｇ湿重量で
除し、そして３．２３　Ｘ　１０８ｍｇ酵素／ｍｏｌ＠
酵素を乗することにより比活性Ｍ−１８−１を計算した
。

Ｂ、不溶性支持体上の架橋カタラーゼの熱安定性アソビ
ミデートで架橋されたカタラーゼをＤＰ　−１メタクリ
レート樹脂ビーズ上に上記のようにして固定化した。固
定化された架橋カタラーゼの熱安定性研究を７５′Ｃに
て行った。ジメチルアノピミデートで架橋された固定化
酵素は相当に改良された熱安定性カタラーゼをもたらす
。上記の同じ方法を用いるソメチルスベリミデートによ
る酵素の架橋は一層熱安定なカタラーゼをもたらさない
。

さらに、アゾピミデートで架橋されたカタラーゼは、第
５図に示すように、カルデノイミドで架橋されたカタラ
ーゼよシも実質的に大きな比活性をもたらす。おそらく
、アノピミデートの炭素鎖の導入が、スベリミデートに
よる８炭素鎖の導入に比べて蛋白質の一層硬いコンフィ
グレーションをもたらすのであろう。

造 例１及び２に上記したようにして製造された架橋された
カタラーゼ及びアミジン化されたＰ−２−０を、前記の
例においてカタラーゼの固定化について記載した方法を
用いてＤＰ−１樹脂上に固定化することができる。Ｐ−
２−００量に対して実質的に過剰量においてカタラーゼ
を添加するのが好ましい。一般に、カタラーーｃ’／Ｐ
−２−０モル比）！ｌ　：　１〜ｌＯ：　１で６Ｄ、そ
してｚｗｉ類ノ安定化された酵素の所望のモル比量（蛋
白質を結合する樹脂の決定された容量を越える）を同時
に加えることにより、２種類の安定化された酵素を固定
化する。蛋白質を結合する樹脂の容量は、例３に記載し
たようにして上溝蛋白質のスペクトルにより決定するこ
とができる。溶解蛋白質の吸光の速度が無視できるよう
になるまで、上滑の蛋白質スペクトルをとる。ＤＰ−１
樹脂への蛋白質の付加を２５℃にて追跡する。負荷され
た樹脂を例３に記載されている様にして洗浄する。固定
化された安定化酵素を無菌発酵槽に入れ、そして無菌１
０チグルコース溶液を加える。無菌濾過された酵素ガス
又は空気をグルコース溶液に泡立てる。発酵槽の温度を
、１５℃〜６５℃の一定温度に維持する。反応混合物の
サンプルを定期的に取シ出し、そしてＨＰＬＣによりグ
ルコース及びグル；ンンにより測定する。

同一の測定を非固定化Ｐ−２−０及びカタラーゼを用い
て行う。発酵温度の上昇に従って、安定化された酵素を
含む発酵標中で一層多量のグルコンンが生産される。

上記のようにして安定化されたカタラーゼを、過酸化水
素を分解するのが好ましい多くの用途において有利に使
用することができることが、当業者に明らかであろう。

例えば、安定化されたカタラーゼを、カタラーゼを必要
とする酵素的発酵の有効寿命を延長するために使用する
ことができる。

さらに、このような酵素的発酵の効率は、天然カタラー
ゼを急速に不活性化するような上昇した温度で発酵を行
うことにより上昇することができる。

特に、安定化されたカタラーゼを用いるグルコノンの酵
素的製造に関して、支持体、例えばアガロース又は酵素
の固定化のために一般に使用される他のポリマー支持体
に固定化された安定化された酵素を工程中で使用するこ
とができることが明らかであろう。これとは異シ、安定
化されたカタラーゼを固体支持体に固定化することなく
溶解形で使用することができる。

さらに１安定化されたＰ−２−０を使用するグルコノン
の酵素的製造において、支持体、例えばアガロース又は
酵素の固定化のために一般に使用される他のポリマー支
持体に固定化された安定化されたＰ−２−０を工程にお
いて使用することができることが当業者に明らかであろ
う。これとは異シ、固体支持体に固定化することなく、
溶解形で工程中で安定化Ｐ−２−０を使用することもで
きる。

前記の安定化された酵素を用いるグルコノンの酵素的製
造において、カタラーゼ又はＰ−２−００いずれかを安
定化することができることも、当業者にとって同様に明
らかであろう。すなわち、安定化されたカタラーゼを天
然Ｐ−２−０と組み合わせて使用することができ、又は
安定化されたＰ−２−Ｏを天然カタラーゼと組合わせて
使用することもできる。上昇した温度において、安定化
された酵素の一層又は両者を使用することＫよシ、両酵
素をその天然形で使用するのよシも、よシ多くのグルコ
ノンが生産されることが期待される。

前記の態様とは異る他の有用な変法をこの発明の範囲内
において実施することができよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は最終生成物グルコノンの存在下又は非存在下で
の天然精製Ｐ−２−０及び未精製Ｐ−２−０の残留活性
を示すグラフである。 第２図は最終生成物グルコノンの存在下での天然Ｐ−２
−０及びアミジン化Ｐ−２−０の残留活性を示すグラフ
である。 第３図は熱不活性化温度における天然Ｐ−２−０及びア
ミジン化Ｐ−２−００残留活性を示すグラフである。 第４図は熱不活性化温度における天然カタラーゼ及び架
橋されたカタラーゼの残留活性を示すグラフである。 第５図はソメチルアソピミデート又はカルざソイミトに
より架橋されたカタラーゼの残留活性を示すグラフであ
る。 以下余白 七との三副咥１姻寸すＺ　　’／。 毛＆の５舌＋１１１ｊ−に対す６°ム 毛ヒの気言・１吐ＩＣかすす１　’／。 毛ｔ／）＝ｇＡ咀−ニナ＋す５　＠／。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルコソンによる不活性化に対して安定化されたカ
   タラーゼ。 ２、前記カタラーゼが架橋剤により架橋されている特許
   請求の範囲第１項記載のカタラーゼ。 ３、前記架橋剤がジイミドエステルである特許請求の範
   囲第２項記載のカタラーゼ。 ４、前記ジイミドエステルがジメチルスベリミデート及
   びジメチルアジピミデートから選ばれる特許請求の範囲
   第３項記載のカタラーゼ。 ５、前記カタラーゼが熱不活性化に対して安定化されて
   いる特許請求の範囲第４項記載のカタラーゼ。 ６、グルコソンによる不活性化に対してカタラーゼを安
   定化する方法であって、安定化されるべきカタラーゼの
   溶液を用意し、ジイミド架橋剤エステルを該カタラーゼ
   に、低い濃度の架橋剤が溶液中に存在するように徐々に
   添加し、そして架橋剤と水とのエステル形成反応が最少
   になるように条件を維持することを含んで成る方法。 ７、ｐＨを９．１〜９．９に維持し、そして温度を０℃
   〜１０℃に維持する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記ジイミドエステルがジメチルスベリミデート又
   はジメチルアジピミデートであり、前記カタラーゼが熱
   不活性化に対して安定化される特許請求の範囲第７項に
   記載の方法。 ９、熱不活性化及びグルコソンによる不活性化に対して
   安定化されており、アミジン化剤によりアミジン化され
   ているピラノース−２−オキシダーゼ。 １０、前記アミジン化剤がアセチミデート又はその同族
   体である特許請求の範囲第９項記載のピラノース−２−
   オキシダーゼ。 １１、熱不活性化及びグルコソンによる不活性化に対し
   てピラノース−２−オキシダーゼを安定化する方法であ
   って、安定化されるべきピラノース−２−オキシダーゼ
   の溶液を用意し、アミジン化剤をピラノース−２−オキ
   シダーゼの該溶液に、低濃度のアミジン化剤が溶液中に
   存在するように徐々に添加することを含んで成る方法。 １２、ｐＨを９．５〜１０に維持する特許請求の範囲第
   １１項記載の方法。 １３、グルコソンによる不活性化に対して安定化された
   カタラーゼを使用することを特徴とする、ピラノース−
   ２−オキシダーゼ及びカタラーゼを用いるグルコースの
   グルコソンへの改良された転換方法。 １４、熱不活性化及びグルコソンによる不活性化に対し
   て安定化されたピラノース−２−オキシダーゼを使用す
   ることを特徴とする、ピラノース−２−オキシダーゼ及
   びカタラーゼを用いるグルコースのグルコソンへの改良
   された転換方法。 １５、グルコソンによる不活性化に対して安定化された
   カタラーゼを使用することを特許請求の範囲第１４項記
   載の方法。