DD144559A1

DD144559A1 - Regenerierung von organischen enzymtraegermaterialien fuer die wiederverwendung als traeger

Info

Publication number: DD144559A1
Application number: DD21397379A
Authority: DD
Inventors: Jens Fischer; Alfred Schellenberger; Wolfgang Hettwer; Hans-Werner Mansfeld; Gerhard Wahl
Original assignee: Jens Fischer; Alfred Schellenberger; Wolfgang Hettwer; Mansfeld Hans Werner; Gerhard Wahl
Priority date: 1979-06-28
Filing date: 1979-06-28
Publication date: 1980-10-22

Abstract

Die Erfindung betrifft die Regenerierung von organischen Enzymträgermateriaiien für die Wiederverwendung als Träger, insbesondere von mit Aminen funktionalisierten Copolymerisaten aus Styrol und.Divinvlbenzol. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der großtechnischen Nutzung trägerfixierter Enzyme, wodurch eine erhebliche Verringerung der Kosten für das eingesetzte Trägsrmaterial erzielt werden kann. Mit der Erfindung wird das Ziel verfolgt, inaktives, kovalent an den organischen Träger gebundenes Enzym vom Träger zu entfernen, um an diesen erneut Enzym binden zu können. Dieser Vorgang soll über viele Zyklen wiederholbar sein. Erfindungsgemäß wird das Ziel dadurch erreicht, indem der inaktive Enzym-Träger-Komplex mit .Alkalilösung bei Temperaturen zwischen 20 Und 85.°C bei einer Reaktionszeit von 2 bis 36 h behandelt, der so regenerierte Träger gewaschen,.erneut aktiviert .und mit Enzym 1 beladen wird« Dieser Vorgang ist vielfach rait einer Enzymbindung von 80 bis 90%, bezogen auf die Erstfixierung, wiederholbar.

Description

a) Titel der Erfindung

Regenerierung -von organischen Snzymtragermaterialien für die Wiederverwendung als Träger

b) J*mi en durig sgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Regenerierung von organischen Trägermaterialien auf Polystyrolbasis und die erneute Bindung von Enzymen an die regenerierten Träger. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der großtechnischen nutzung trägerfixierter Enzyme im Hinblick auf die Verringerung der Kosten für das eingesetzte Trägermaterial«

c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, adsorptiv an keramische Snzymträger gebundene Enzyme unter Verwendung von Natriumhypochloritlösung au entfernen (US-FS 4 087 330). In der DS-AS 2 537 671 wird ein Verfahren zur Regenerierung eines für die Adsorption''V on G-lucoseisomerase geeigneten porösen anorganischen Trägermaterials durch Pyrolyse aller Kohlenstoff enthaltendes Stoffe bei 500 bis 900° C beschrieben. Bei adsorptiver Bindung eines Enzyms an einen Träger ist es auch möglich, das Enzym partiell oder vollständig durch hohe Salz- oder Substratkonzentrationen abzulösen (S. Adachi, G₈ Kai^amula, .K,. Nakanishi, R. Matsuno, T· Kamikubo, iol_e Chenu M2 (9) > 1707 - 171^ (1978)) ο

. Nach einem weiteren in der Literatur (DE-OS 2 720 538) beschriebenen Verfahren werden organische Tragermaterialien, die für die adsorptive Bindung von Glucoseisomerase geeignet sind, für den erneuten Einsatz als Enzyoiträger regeneriert, indem die inaktiven immobilisierten Enzyme durch wechselweise Behandlung mit einer wäßrigen Mineralsäure und einer wäßrigen Alkalilösung, ggf. in Gegenwart eines Elektrolyt salzes, vom Träger desorbiert werden. Als Träger werden bevorzugt makroporöse, stark basische, tertiäre oder quaternäre Ammoniumharze, deren Gründmasse ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat ist, verwendet. Bei dem Segener ierungsverfahren hat die wäßrige Alkalilösung keine desorbierende Wirkung, sie quillt das Tragerharz, und die adsorbierten Materialien werden vom gequollenen Harz durch die Säurebehandlung leicht entfernt. Durch Elektrolytsalzzugabe kann die Wirkung der Alkalilösung unterstützt werden. Nach mehrfacher Wiederholung der Alkali-Säure-Behandlung kann an den Träger erneut Enzym adsorbiert werden. Das Maß der Aktivitätsbewahrung liegt über QO'%.

Das in der DS-OS 2 720 538 beschriebene Verfahren zur !Regenerierung von mit inaktiven Enzymen beladenem organischen Trägermaterial bezieht sich nur auf adsorptiv gebundene Enzyme. Es ist durch die.mehrfache· Wiederholung der Alkali-Säure-Behandlung auch zeitaufwendig. Dieses Verfahren eignet sich nicht für die !Regenerierung von organischen Trägermaterialien, an die die Enzyme kovalent gebunden sind.

Die anderen genannten Verfahren eignen sich auch nicht für die Ablösung inaktiver, kovalent an den organischen Träger gebundener Enzyme.

d) Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung soll erreicht werden, 'inaktive, kovalent an organische Träger gebundene Enzyme abzuspalten, um anschließend an die Träger erneut aktive jSnayrae binden au können. Dieser Vorgang soll über viele Zyklen mit jeweils

hoher llcbivitätsbeladung wiederholbar sein.

Gegenüber der gegenwärtig praktizierten Lösung, inaktiv gewordene Enzym-Träger-Komplexe gegen aktive auszutau-_.-sehen und erstere zu verwerfen, stellt die angestrebte Lösung einen großen ökonomischen Torteil dar. Besonders bei.großtechnischer Nutzung trägerfixierter Sqζyme würde dieses Verfahren eine erhebliche Verringerung der Kosten für das eingesetzte Trägermaterial bringen.

e) Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch eine geeignete chemische Behandlung der inaktiven Enzym-Träger-Komplexedie kovalente Bindung zwischen Snzym und Träger zu spalten, ohne dabei die Struktur des Trägers zu verändern und ihn so zu behandeln, daß er über viele Zyklen fähig bleibt, hohe Snzymaktivitäten zu binden. ^Λ

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß organische Trägermaterialien, an die inaktive Enzyme kovalent gebunden sind, mit wäßriger Alkalilösung bei Temperaturen zwischen 20 und 8'5° C behandelt werden. Die Alkalilösung ist 2 bis 20pr oz ent ig. Die erforderliche !Reaktionszeit beträgt ge nach der gewählten Alkalikonzentration und Temperatur zwischen 2 und 36 Stunden.

Für das vorliegende Verfahren eignen sich besonders Copo-,· lyaerisate aus Styrol und Divinylbenzol, insbesondere mit Aminen funktionalisierte Polymerisate.

Nach Beseitigung der überschüssigen Natronlauge durch Waschen mit Wasser kann das Trägermaterial erneut aktiviert werden« Die Aktivierung des Trägers kann nach bekannten Methoden erfolgen. Als besonders geeignet hat sich die Aktivierung mit Glutaraldshyd oder mit 1j4-Benzochinon (Fischer, .J., ülbrich, E. und Schellenberger, A>, 1978, Acta.Bioi; Med. Gar., Bd.^: 37, W3 ~ 142^i) erwiesen. Der

aktivierte Träger kann erneut zur Bindung von Enzymen, vorzugsweise von Glucoamylase, eingesetzt werden. Das Verfahren ist viele Male mit einer Enzymbindung von 80 bis 90 %, bezogen auf die Erstfixierung, wiederholbar.

f) Ausführungsbeispiel

Beispiel 1

200 mg inaktiver Amiiiopolystyrol-Glucoamylase-Komplex wird in 5 ml einer Lösung suspendiert, die 500 mg NaOH enthält. Durch Evakuieren wird der Enzym-Träger-Komplex entlüftet. Das Beaktionsgemisch wird 20 h bei einer Temperatur von 85⁰ C gehalten. Anschließend wird es unter Rühren auf einem Glasfilter mit Wasser neutral gewaschen.

Die erneute Aktivierung des Trägers erfolgt mit einem Gemisch aus 0,3 ml 25 %igem Glutaraldehyd und 2,7 ml Phosphatpuffer nach SOBSNSSlT, pH 7,0. Der überschüssige Glutaraldehyd wird durch Waschen mit Wasser entfernt.

Der so aktivierte Träger wird in 3,0 ml Phosphatpuffer nach SoBSN^-SBN suspendiert, der 6,6 mg/ml lyophilisierte Glucoamylase enthält. Nach 3stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsprodukt auf einem Glasfilter nacheinander mit Wasser, 0,025 m Acetatpuffer pH 4,5» welcher 1 Mol NaCl ^e Liter enthält, und 0,025 in Acetatpuffer pH 4,5 gewaschen.

Die Aktivität des trägerfixierten Enzyms wird durch Rühren eines adäquaten Teils des Reaktionsansatzes mit 20 ml Λ jSiger Stärke (Zulkowsky) in 0,025 m Acetatpuffer pH 4,5 bei 37° C bestimmt

Der unter Verwendung regenerierten Trägermaterials hergestellte Träger-Enzym-Komplex besitzt eine amylolytische Aktivität von I90 U/g Träger. Das entspricht ca« 90 % des Wertes der Erstfixieruag von Glucöaaiylase an aminiertes Polystyrol.

'Beispiel. 2 . .

Die Regenerierung von 200 mg inaktivem Aminpolystyrol-Glucoamylase-Eomplexunddie erneute Bindung von Glucoamylase an den träger erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Aktivierung des Trägers werden jedoch 50 mg 1,4-Benzochi-· ώοώ in 3 ml Äthanol verwendet. Die Beaktionszeit beträgt 1 Stunde. Danach wird mit Äthanol und Phosphatpuffer gewaschen«, ;

Claims

„ g D Erfindungsansprüche :

1· Regenerierung von organischer] Enzymträgermaterialien für die Wiederverwendung als Träger, insbesondere von mit Aminen funktionalisierten Copolymerisaten aus Styrol und Divinylbenzol, dadurch gekennzeichnet, daß die inaktiven Träg er «-Enzym-Komplexe mit Alkalilösung bei Temperaturen zwischen 20 und 85° C bei einer !Reaktionszeit von 2 bis 36 Stunden behandelt, die so regenerierten Trägermaterialien gewaschen, erneut aktiviert und mit Enzym beladen v/erden·

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Enzym und Träger eine kovalente Bindung besteht.

3· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkalilauge 2 bis 20 %ige Natronlauge verwendet wird.

M₉ Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung des Trägers nach bekannten Methoden, bevorzugt jedoch mit Glutaraidehyd oder 1,4-Benzochinonj erfolgt.