JPS6181784A - Ａｔｐの定量的測定のためのルシフエラ−ゼ担体膜とその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に、アデノシン三りん酸、つまり、ＡＴＰ
の定量のためのルシフェラーゼ担体膜、およびその製造
法に関するものである。

ルシフェラーゼ（１ｕｅｉｆ＊ｒａｓｅ）はルシオー２
（ｌｕｃ１０、ｌｍ）　（つちぼたる−ｐｈｏｆｉｎｌ
ａ　ｐｙｒａｌｉｍ）から通常抽出される酵素である。

ルシフェラーゼはＡＴＰに対する特異性のために最近再
び関心の的になっている。これは、ルシフェラーゼがそ
の酸または塩を種々の食品中で定量的に測定することが
できるからである。例えば、ミルク中に存在するＡＴＰ
を測定することによって微生物測定またはダイアシック
（ｄｌａｓｌｃ）分析でのクレアチニンの測定を行うこ
とができる。ＡＴＰの定量分析は光化学的に行われる。

その理由はＡＴＰと酵素の反応では次の一式に従りて光
子の放射が起こるからである。

ここで、Ｅはルシフェラーゼを、Ｅ、ＬＨ２−ＡＭＰは
ルシフェリンアデニレート錯体を、Ｐはオキジルシフェ
リンを生ずる酸化反応生成物を、ＰＰはピロホスフェー
トをそれぞれ表わす。

測定された生物発光強度は研究の対象である生成物中に
存在するＡＴＰの量に直接比例する。

しかしながら、この方法の実行はルシフェラーゼの安定
性の欠除により長い間留保されていた。

従って、この酵素を測定するための特定数の方法が研究
されていた。かくして、この酵素はグルタルアルデヒド
が加えられたアルブミンゲル中にまたは、ポリアクリル
アミドゲル中に「トラップ」（ｔｒａｐｐｅｄ）　　さ
れ、この後者のゲル上に吸着されるか種々の多糖類担体
、例えば、カルボジイミドを用いたＭトセフ７ＣＩ−ス
（Ｓｅｐｈ’ａｒｏｓｅ）　＆ＢまたはＣ）（−セファ
ロースｌＩＢ、或いはウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ
　）試薬を用いたＣＨ−セファロース弘Ｂ上に固定化さ
れるか、或いは、シアナイドプロミド（ＣＮＢｒ　）に
よって活性化された多糖類担体上に固定化されてきた。

この最後の方法のみが満足すべきものと見做されてきた
。何故ならば、この方法だとルシフェラーゼ活性の、２
６％を保持することができ、これは他の方法で得られる
よりもかなり高いパーセントであるからである。このた
め、このようにして固定化されたルシフェラーゼは工業
的応用を不能にしていると考えられるかも知れない比較
的高コストで作られる。更に、この酵素は真に満足すべ
き安定性を有していない。

従って本発明の目的の一つは、固定化されたルシフェラ
ーゼを安価に提供可能とし広く工業的に用い得るように
することである。

本発明の他の目的は熱安定性で長期の保管に対し安定な
ルシフェラーゼを提供することである。

本発明の補足的な目的は、固定化されたルシフェラーゼ
を作製する簡単で工業的規模で実行可能な方法を提供す
ることである。

これらの目的は、以下に述べられる他の目的と同様、本
発明に従う、吸収性（親水性）アルブミノイドから成る
膜上に固定化されたルシフェラーゼによって達成される
。

本発明の膜は有利には豚皮ゼラチンから成る。

本発明は、また、このようなルシフェラーゼ担体膜を製
造する方法に係るものである。この方法によれば、吸収
性のアルブミノイドが弱酸性のバッファーに溶解され均
質な膜が得られ、この均質な膜は弱酸性ｐＨで、グルタ
ルアルデヒド溶液を用いて架橋される。このようにして
得られた膜は特定量のルシフェラーゼで飽和される。

弱酸性バッファーは好ましくはｐＨＡのりん酸ナトリウ
ム溶液から成る。

吸収性アルブミノイドをバッファーに溶解して得られた
溶液は有利にはこのアルブミノイドをＡ重景パーセント
含有する。

均質な膜は好ましくは、この溶液を展着することにより
作製される。ｘ−ｇｏ℃間の温度での短いインキュベー
ション後、好適な支持物の上で乾燥後、それから除去さ
れる。

インキュベーションは有利には３７℃で１時間実施され
る。

好適な支持体は好ましくはポリカーボネイトフィルムか
ら成る。

均質な膜は有利には６容量パーセントのグルタルアルデ
ヒド溶液で架橋される。

グルタルアルデヒド溶液のｐＨは好ましくはりん酸バッ
ファーのｐＨと同じである。

膜のルシフェラーゼは有利にはジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）の存在下で飽和される。

例示されるが、これに制限されるものではない次の記載
により当業者が本発明をその利点と共に理解することが
可能になろう。

ルシフェラーゼは、乾燥したつちぼたる（例えば、Ｐｈ
ｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｇ）の腹部を、０．Ｉ　Ｎ
のｐＨ７，１Ｉ（７）砒酸塩バッファー中でＳ　、　Ｒ
ＡＪＧＯＰＡＬらによりクラマドグラフィー　（Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｌｙ）ｌ？ざ一年、　＆２’１３．
　　／Ａ弘−／４７頁に記載されているような既知の方
法に従って作製される。このようにして得られた抽出物
は、バッファーを３種変更して、／ｍＭのエチレンジア
ミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）の存在下で０９０２Ｍのトリア
セテート（ｐ）Ｉ＝７゜ざ）中で評時間透析される。

入手できる吸収性アルブミノイド生成物のうちで、出願
人は、ルシフェラーゼを固定化する膜を作製するために
豚皮ゼラチンを使用することを選択した。

豚皮ゼラチンは先ず、ゼラチン濃度が６重量パーセント
である溶液が得られるように０．０２Ｍ（ｐＨ＝　ｔ、
、ｔｒ　）のりん酸ナトリウムバッファー中に溶解され
る。この溶液は次に３７℃で１時間インキュページコン
される。得られる溶液を次にポリカーボネイトフィルム
上に展着する。このフィルムはその非接着性の故に好適
な材料である。展着は、例えば、この溶液ｌＳ−を上記
フィルムのｌＳ−面積上に展着して行５゜フィルムは次
に約７０時間乾燥される。このようにして均質な膜がポ
リカーボネイトフィルム上に形成され、このフィルムか
ら膜が容易に剥離される。

この均質な膜は、そのストリップまたは正方形を短時間
、例えば５分のオーダーで、前記のバッファーと同一で
あるが、グルタルアルデヒド０．５容量パーセントを含
むバッファー中に浸漬することにより架橋される。架橋
された膜は次に数回、過剰なグルタルアルデヒドを除く
ために同様なバッファーで洗浄される。

ルシフェラーゼは、特定量のルシフェラーゼ、好ましく
はジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で飽和された
架橋法膜上に固定化される。環境温度で７時間後、ルシ
フェラーゼが固定化されている架橋渋腹は上述したバッ
ファーで洗浄される。

以下の試１験により、この方法の種々のパラメーターを
決定し蛋白質膜上に固定化されたルシフェラーゼを得る
ことができる。

種々の均質な膜を、０．５〜Ｓ、Ｏチで変化する濃度で
グルタルアルデヒド：を含有する０、ＯＡ　（ｐＨ＝６
、ｇ）のりん酸ナトリウムバッファーで架橋した。

得られた架橋筒の膜（実際には、円型状）をＤＴＴの存
在下でルシフェラーゼ溶液中に＋ダ℃で７時間浸漬した
。りＯＯμノの酵素を１００μｌのＤＴＴ　（モルホリ
ノプロパンスルホネー）（ＭＯＰＳ）］１１００ｍ１に
ＤＴＴ　？、りｍｙ〕の存在下で各１ｃｒｌ上に固定化
した。

ルシフェラーゼの最大活性が００５％のグルタルアルデ
ヒド濃度で得られることが示された。この活性は、グル
タルアルデヒド濃度が７％に増大すると減少し、次にλ
チ以上になると増大する。ルシフェラーゼの酵素活性は
濃度１％とｕ％の間でリニアーで増大する。。

溶液中のルシフェラーゼは７時間でグルタルアルデヒド
により完全に不活性化されること、および、ジチオトレ
イトールがこの不活性化速度に影響しないことを記憶す
べきである。

２）架橋渋腹に対するルシフェラーゼの接触時間の影響 ０．５％のグルタルアルデヒドの存在下の架橋済円型展
は種々の時間、ルシフェラーゼと接触させて放置する。

最大の接触時間は１時間である。種々の時間での活性の
有意な喪失が確立された。

溶液中のルシフェラーゼの場合、７時間後この溶液は新
しく作製された溶液の活性に対し１０％の残留酵素活性
を有することが見出されている。この溶液がＤＴＴを含
有するならば、この残留活性は３θチである。

３）架橋時のｐＩ（の影響 円板状の均質な膜を０，０２Ｍりん酸ナトリウムバッフ
ァー中のグルタルアルデヒドｓ％の溶液中に十参℃で１
時間保持された。

このような膜上にその後固定化されたルシフェラーゼの
酵素活性はバッファーのｐＨが６．ｆｆの時に最大とな
ることが見出された。

グルタルアルデヒドの存在下での架橋が酸性ｐＨにより
促進され、特にｐＨ＆で最大となることは勿論既知であ
る。これに対し、溶液中のルシフエラーゼの最大活性は
ｐＨ７，ｔにおいて示される。

実験の結果、ｐＨ５で架橋された膜上に固定化されたル
シフェラーゼの活性を定量的に測定することは実際上不
可能であることが示された。

リ　固定化時の温度の影響 最適の固定化温度は最大の酵素活性に対応し、架橋済円
型膜との接触中の温度を変更することにより測定された
。この温度はｌざ〜−℃、即ち、環境温度である。

本発明の方法により固定化されたルシフェラーゼの特徴
は次の実験で示された。

（１）　　固定化効率 上述の架橋渋腹と接触したルシフェラーゼの活性の約、
）０−４Ｊ　％が残留される。膜／ダ当り１００〜−〇
〇ユニットの特定活性が測定された。更に、同様な膜は
数回使用されうる。

使用後、上記円型膜は洗浄され、その活性を保存するた
めにジチオトレイトールの存在下に０．０２Ｍりん酸ナ
トリウムバッファー（ｐＨ＝Ａｊ）中に保たれる。

このような円板上に固定化され、このような状態下に保
存される酵素は７６日以上安定である。

本発明に従い作製された膜はこのような長い期間に亘り
使用され５るという事実は産業上の利用に関し重要な利
点を構成する。

（２）経時安定性 検討されたそれぞれのパラメーターについての最適条件
は前述の実験から推論された。

ＤＴＴの存在下で環境温度で１時間ｐｕａ、ｒで０１５
％のグルタルアルデヒドの存在下で架橋された膜と接触
しているルシフエラーゼは安定な酵素活性−即ち、接触
を終えてから一時間後に酵素活性は９５％を示しこの値
が維持される−を有する。

溶液中のルシフェラーゼの場合、活性水準は僅かＳＩＩ
チである。

（３）温度安定性 ルシフェラーゼを含有する架橋渋腹円板を加熱した場合
、約Ｊ−，２ｊ℃まで酵素活性の安定性が見出され、次
に比較的緩慢に活性が減少する。上記円板の機械的強度
は温度により全く影響を受けない。

ルシフェラーゼが溶液中にある場合、その最大酵素活性
はグ℃で示され、次に極めて急速に減少し、侵℃以前に
ゼロになる。

環境温度で使用できる膜が得られることは、使用中の特
別な注意が必要でない限り非常な利点を構成する。この
ような膜を採用するＡＴＰディテクターは一連の制御を
基本的に変更することな〈産業用に組み入れることがで
きる。更に、生体機構の活性も測定できる。

（４）　　ｐＨ安定性 固定化酵素ならびに溶液中の酵素の双方についての最適
ｐＨは７．ダである。

（５）ルシフェラーゼとＡＴＰの濃度 これらコ種の製品に関し、担体（豚皮ゼラチン）は、基
体（ルシフェリンまたはＡＴＰ）のルシフェラーゼに対
する親和性に影響を与えない。したがって、固定化され
た酵素の膜およびその製品表面への拡散という問題がな
い。

ルシフェラーゼの吸収性アルブミノイド膜、例えば豚皮
ゼラチン上への固定化により、使い易く、許容し得る寿
命を持ちＡＴＰに対する高度の特異性を有する膜を入手
することができる。実際、発光強度ピークのりニア−な
対応が溶液ミリリッター当１）ｔｏ２〜１０、６　　ピ
コグラムの範凹のＡＴＰ濃度について観察された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、吸収性アルブミノイドを含みルシフェラーゼがその
   上に固定化される膜。 ２、吸収性アルブミノイドが豚皮ゼラチンである特許請
   求の範囲第１項に記載の膜。 ３、吸収性アルブミノイドを均質な膜を得るために弱酸
   性バッファーに溶解し、前記均質な膜が次に弱酸性ｐＨ
   でグルタルアルデヒドによって架橋され、得られた膜が
   或る量のルシフェラーゼで飽和される、膜の製法。 ４、弱酸性バッファーが、ＰＨが６．８であるりん酸ナ
   トリウム溶液である特許請求の範囲第３項に記載の方法
   。 ５、前記吸収性アルブミノイドを前記バッファーに溶解
   することによって得られた溶液が６重量パーセントの前
   記アルブミノイドを含む特許請求の範囲第３項に記載の
   方法。 ６、前記吸収性アルブミノイドを溶解後、得られた溶液
   が２５〜５０℃の温度での短いインキュベーション後、
   乾燥後にそれから除かれる適当な支持体上に展着される
   特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ７、前記のインキュベーションが３７℃で１時間行われ
   る特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、適当な支持体がポリカーボネイトフィルムから成る
   特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ９、前記均質膜が０．５容積パーセントのグルタルアル
   デヒド溶液で架橋される特許請求の範囲第３項に記載の
   方法。 １０、前記グルタルアルデヒド溶液のｐＨが前記バッフ
   ァーのｐＨと同じである特許請求の範囲第９項に記載の
   方法。 １１、ルシフェラーゼによる前記架橋済膜の飽和がジチ
   オトレイトールの存在下で行われる特許請求の範囲第３
   項に記載の方法。 １２　前記吸収性アルブミノイドが豚皮ゼラチンである
   特許請求の範囲第３項に記載の方法。 １３、アデノシン三りん酸の定量的測定に使用される特
   許請求の範囲第１項に記載の膜。