JPS6035000A - 蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的に結合させる方法 - Google Patents
蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的に結合させる方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的に結合さ
せる方法、この方法によって見られたポリスチレン表面
ならびにその使用法に関するものである。
せる方法、この方法によって見られたポリスチレン表面
ならびにその使用法に関するものである。
酵素、抗体、抗原の如き生物学的に活性な蛋白質の固定
（ｉｍｍｏｂｌｉｚａｔｌｏｒ）には種々の目的に、た
とえば、酵素反応器、親和性クロマトグラフィー、免疫
吸着、固相分離を有するリガンド測定などに広い用途が
ある。
（ｉｍｍｏｂｌｉｚａｔｌｏｒ）には種々の目的に、た
とえば、酵素反応器、親和性クロマトグラフィー、免疫
吸着、固相分離を有するリガンド測定などに広い用途が
ある。
特別な用途は不均質な系における相分離のだめの免疫測
定（例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等）の分野における固定
された抗原と抗体のそれである。不均質免疫測定の系に
は−乃至数工程あり、それにより分析物（ａｎａｌｙｔ
ｅ）又は試薬の結合及び非結合部分の間の分離が達成さ
れる。この結合は抗原抗体反応にちる。
定（例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等）の分野における固定
された抗原と抗体のそれである。不均質免疫測定の系に
は−乃至数工程あり、それにより分析物（ａｎａｌｙｔ
ｅ）又は試薬の結合及び非結合部分の間の分離が達成さ
れる。この結合は抗原抗体反応にちる。
一定の結合パートナ−（特定の抗体又は特定の抗原）が
滑らかな巨視的表面に反応性の形で不町逆的に固定され
れば、必要な分離を優雅に実施することができる。この
固定は例えば反応容器の内壁上で又は反応液によって被
覆されているビーズ上で実施することができる。
滑らかな巨視的表面に反応性の形で不町逆的に固定され
れば、必要な分離を優雅に実施することができる。この
固定は例えば反応容器の内壁上で又は反応液によって被
覆されているビーズ上で実施することができる。
顕微鏡的に分散された表面（例えばラテックス）によっ
て必要な例えば遠心分離又は濾過による機械的な分離を
避けるに絋、そして粘着する反応液のｉｔ（これは例え
ばゲルのような多孔質な物質では高い）を減少するには
滑らかな巨視的な表面が好ましい。
て必要な例えば遠心分離又は濾過による機械的な分離を
避けるに絋、そして粘着する反応液のｉｔ（これは例え
ばゲルのような多孔質な物質では高い）を減少するには
滑らかな巨視的な表面が好ましい。
蛋白質で吸収しうるように被覆されたポリスチレン表面
は固相分離免疫測定法に広い用途がある。
は固相分離免疫測定法に広い用途がある。
ポリスチレンには次のような利点がある。
−価格が安い。
一明瞭で透明である。
−いろいろな種類の反応容器やビーズを商業的に入手す
ることができる。
ることができる。
吸着性被覆の主な利点は簡単なことである。適当な濃度
の蛋白質溶液を蛋白質吸着条件下に一定時間例えば３〜
１６時間プラスチック表面と接触させ、その後蛋白質溶
液を除去し表面を洗浄する。
の蛋白質溶液を蛋白質吸着条件下に一定時間例えば３〜
１６時間プラスチック表面と接触させ、その後蛋白質溶
液を除去し表面を洗浄する。
その収率は固定された蛋白質の６０チ以下であり、密度
は１ｃＩＴＦあシ蛋白質１μＶのオーダーである。簡単
な被覆の利点は使用上の難点と対比される。もつと弱い
結合蛋白質では、十分な密度の被覆はかなり過剰の蛋白
質を用いたときのみ達成される。
は１ｃＩＴＦあシ蛋白質１μＶのオーダーである。簡単
な被覆の利点は使用上の難点と対比される。もつと弱い
結合蛋白質では、十分な密度の被覆はかなり過剰の蛋白
質を用いたときのみ達成される。
固定は測定条件下（即ち、望ましくないつづく吸着を防
ぐため他の蛋白質又は’ｐｗｅｅｎ ２０の存在下）に
可逆的であるか、又は固定された（出血する）蛋白質の
損失が観察され、これは測定を阻害する。
ぐため他の蛋白質又は’ｐｗｅｅｎ ２０の存在下）に
可逆的であるか、又は固定された（出血する）蛋白質の
損失が観察され、これは測定を阻害する。
プラスチック表面に共有結合を導入することによって吸
着性固定のこれら難点を克服する試みがある。種々の方
法が記載されており、これはカップリング剤としてゲル
タールジアルデヒドを用いている。そこに含まれる機構
、特に観察される改良がプラスチック物質に関連してゲ
ルタールジアルデヒドを組入れたためかどうか、又はこ
れらが分子間の架橋による蛋白質の生物学的に活性な整
合（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の安定化によって生ず
るがどうかは確認されていない。
着性固定のこれら難点を克服する試みがある。種々の方
法が記載されており、これはカップリング剤としてゲル
タールジアルデヒドを用いている。そこに含まれる機構
、特に観察される改良がプラスチック物質に関連してゲ
ルタールジアルデヒドを組入れたためかどうか、又はこ
れらが分子間の架橋による蛋白質の生物学的に活性な整
合（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の安定化によって生ず
るがどうかは確認されていない。
加えて蛋白質の吸着性結合を改良するためにポリスチレ
ン物質のＹ−照射（コバルト安定化）が用いられている
が、これは商業的に入手しうる物質の価格をかなり上げ
る。
ン物質のＹ−照射（コバルト安定化）が用いられている
が、これは商業的に入手しうる物質の価格をかなり上げ
る。
従って、本発明の目的は蛋白質をその生物学的活性を保
ちつつポリスチレン表面に不町逆的に結合させるだめの
簡単で低価格の方法を提供するととである。
ちつつポリスチレン表面に不町逆的に結合させるだめの
簡単で低価格の方法を提供するととである。
この目的は、
ａ）ポリスチレン表面を一般式■
（式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ア
ルコキシ基又はニトロ基を表わし、Ｒ２は水素原子、ハ
ロゲン原子、アルキル基を表わし、Ｘはハロゲンイオン
又はテトラフルオロボレートイオンヲ表わス） のビスジアゾニウム化合物で前処理すると、ｂ）このよ
うに処理された表面につづいて蛋白質を吸着させること によって達成される。
ルコキシ基又はニトロ基を表わし、Ｒ２は水素原子、ハ
ロゲン原子、アルキル基を表わし、Ｘはハロゲンイオン
又はテトラフルオロボレートイオンヲ表わス） のビスジアゾニウム化合物で前処理すると、ｂ）このよ
うに処理された表面につづいて蛋白質を吸着させること によって達成される。
アルキル基又はアルコキシ基は１〜４炭素原子を有する
ものであり、メチルとメトキシが好ましい。ハロゲン原
子は臭素、塩素とフッ素であシ、塩素が好ましい。好ま
しいビスジアゾニウム化合物は一般式Ｉａ （式中Ｒ１ａは水素原子、メチル基又はメトキシ基を表
わし、Ｒ２３は水素原子又はメチル基を表わし、Ｘはハ
ロゲンイオン又はテトラフルオロボレートイオンを表わ
す） を有するものである。
ものであり、メチルとメトキシが好ましい。ハロゲン原
子は臭素、塩素とフッ素であシ、塩素が好ましい。好ま
しいビスジアゾニウム化合物は一般式Ｉａ （式中Ｒ１ａは水素原子、メチル基又はメトキシ基を表
わし、Ｒ２３は水素原子又はメチル基を表わし、Ｘはハ
ロゲンイオン又はテトラフルオロボレートイオンを表わ
す） を有するものである。
好ましい式Ｉａの化合物はＲｌａがメトキシ基、Ｒ２Ｉ
Ｌがハロゲン原子、ＸがＣｔ−又はＢＦ、：を表わすも
のである。
Ｌがハロゲン原子、ＸがＣｔ−又はＢＦ、：を表わすも
のである。
又このビスジアゾニウム化合物Ｉ又はＩａは他の開業的
に入手しうる形、例えば錯体の形で用いることができる
。
に入手しうる形、例えば錯体の形で用いることができる
。
ポリスチレン表面はある一定の形で存在しうる。
例えば、反応容器として、試験管、ビーカー、キュベツ
ト、カラム、微量滴定（ｍｉｃｒｏｔｌｔｅｒ）、機敏
試験（ｍｉｃｒｏｔｅ８ｔ）の板として又は部品として
例えばビーズ、ロッド、ディスク又はプレートとして存
在することができる。かかるポリスレン表面は当業者に
は周知でアシ、容易に入手することができる。
ト、カラム、微量滴定（ｍｉｃｒｏｔｌｔｅｒ）、機敏
試験（ｍｉｃｒｏｔｅ８ｔ）の板として又は部品として
例えばビーズ、ロッド、ディスク又はプレートとして存
在することができる。かかるポリスレン表面は当業者に
は周知でアシ、容易に入手することができる。
前処理（活性化）は前処理条件下、例えば約−５乃至約
＋３０℃、好ましくは４〜１０℃の温度で実施され、活
性化時間は約５乃至６０分である。
＋３０℃、好ましくは４〜１０℃の温度で実施され、活
性化時間は約５乃至６０分である。
ビスジアゾニウム化合物の典型的な濃度は、好ましくは
ｐＨ６〜８の緩衝液中で約１０乃至１０ モル／ｌの間
である。安定化のためＮａＣ４，ＫＩ又はＮａｌ０１１
のような適当な塩を安だ化量添加することができる０ つづいて蛋白質を吸着するＭｌに、ポリスチレン表面を
緩衝液及び／又は水で洗浄することによって未反応のビ
スジアゾニウム化合物Ｉから清浄にされる。吸着は活性
化の直後又はタイムラグをおいて実施される。
ｐＨ６〜８の緩衝液中で約１０乃至１０ モル／ｌの間
である。安定化のためＮａＣ４，ＫＩ又はＮａｌ０１１
のような適当な塩を安だ化量添加することができる０ つづいて蛋白質を吸着するＭｌに、ポリスチレン表面を
緩衝液及び／又は水で洗浄することによって未反応のビ
スジアゾニウム化合物Ｉから清浄にされる。吸着は活性
化の直後又はタイムラグをおいて実施される。
つづく蛋白質の吸着は、蛋白質吸着条件下に、たとえば
約１０−９〜１０−’ｆ汐、好ましくは１０−６〜１０
−１Ａｎ１の濃度でｐＨ６〜８の緩衝液に溶解した蛋白
質を約１〜７２時間保温することによって実施されろ。
約１０−９〜１０−’ｆ汐、好ましくは１０−６〜１０
−１Ａｎ１の濃度でｐＨ６〜８の緩衝液に溶解した蛋白
質を約１〜７２時間保温することによって実施されろ。
任意の蛋白質、例えば抗体、抗原、ノ・ブテン蛋白質接
合体、抗体結合蛋白質、例えばブドウ状球菌の蛋白質入
又は補体成分Ｃ１１、酵素、レクチンを用いることがで
きる。
合体、抗体結合蛋白質、例えばブドウ状球菌の蛋白質入
又は補体成分Ｃ１１、酵素、レクチンを用いることがで
きる。
吸着された（固定された）蛋白質を有するポリスチレン
表面は吸着直後又は貯蔵後所望の目的に用いる仁とがで
きる。
表面は吸着直後又は貯蔵後所望の目的に用いる仁とがで
きる。
ポリスチレン表面の活性化は蛋白質の実際的に不可逆な
結合をもたらし、これによりたとえば免疫測定（出血せ
ず）において感度の向上、物質消費量の低下が可能とな
る。この活性化は、特につづいて乾燥工程が実施される
とき、吸着された蛋白質の安定化をもたらす。
結合をもたらし、これによりたとえば免疫測定（出血せ
ず）において感度の向上、物質消費量の低下が可能とな
る。この活性化は、特につづいて乾燥工程が実施される
とき、吸着された蛋白質の安定化をもたらす。
ポリスチレン物質は活性化後又は蛋白質吸着後又はキッ
トの形で市販することができる。キットの形で市販され
るならば、これにはポリスチレン物質の外に、試験管又
は微量試験板、他の通常の成分、例えば、標識抗体やマ
ーカーのための検出試★ｊまたとえば色素産生（ｅｈｒ
ｏｍｏｇｅａｌｃ）基質が含まれる。
トの形で市販することができる。キットの形で市販され
るならば、これにはポリスチレン物質の外に、試験管又
は微量試験板、他の通常の成分、例えば、標識抗体やマ
ーカーのための検出試★ｊまたとえば色素産生（ｅｈｒ
ｏｍｏｇｅａｌｃ）基質が含まれる。
ビスジアゾニウム化合物■はよく知られており、周知の
方法で相当するベンジジンから調整される。
方法で相当するベンジジンから調整される。
（Ｈｏｕｂａｎ−Ｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓｎ ｄｅｒ
ｏｒｇａｎｉｓｅｈａｎ Ｃｈｅｍｉｅ。
ｏｒｇａｎｉｓｅｈａｎ Ｃｈｅｍｉｅ。
Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔ
ｇａｒｔ、Ｖｏｌ、１０／３．ｐｐ、 １−２１２．ｓ
ｓｐ、４６：Ｕｌｌｍａｎｎｓ Ｅｎｚｙｋｌｏｐａｄ
ｉｅ ｄｅｒ ｔｅｅｈ−ｎｉｓａｈａｎ Ｃｈｅｍｉ
ｅ、４．Ａｕｆｌａｇｓ Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｌｅ
Ｗｅｉｎ−ｈｅｉｍ、Ｖｏｌ、、８．ｐ、３５６ ｆ
ｆ、）以下の実施例は本発明を説明するだめのものであ
シ、何ら本発明を限定するものではない。温度は℃で与
えられている。
ｇａｒｔ、Ｖｏｌ、１０／３．ｐｐ、 １−２１２．ｓ
ｓｐ、４６：Ｕｌｌｍａｎｎｓ Ｅｎｚｙｋｌｏｐａｄ
ｉｅ ｄｅｒ ｔｅｅｈ−ｎｉｓａｈａｎ Ｃｈｅｍｉ
ｅ、４．Ａｕｆｌａｇｓ Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｌｅ
Ｗｅｉｎ−ｈｅｉｍ、Ｖｏｌ、、８．ｐ、３５６ ｆ
ｆ、）以下の実施例は本発明を説明するだめのものであ
シ、何ら本発明を限定するものではない。温度は℃で与
えられている。
一般的実施法
１、 ポリスチレン表面を、ｐＨ６，８，０，０１モル
／ｌのリン酸ナトリウム緩衝液中０．００１モル／ｌの
ＦＢＳ（ＢＦｑ）２（ＦＢＳ ＝ファストブルーＢ塩＝
ビスージアゾ化０−ジアニシジン）溶液で３０分間４で
、直射光線からの保護の下、完全に被覆する。ＦＢＳ溶
液を除去し、ポリスチレン物質を０．０１モル／ｌリン
酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄する。
／ｌのリン酸ナトリウム緩衝液中０．００１モル／ｌの
ＦＢＳ（ＢＦｑ）２（ＦＢＳ ＝ファストブルーＢ塩＝
ビスージアゾ化０−ジアニシジン）溶液で３０分間４で
、直射光線からの保護の下、完全に被覆する。ＦＢＳ溶
液を除去し、ポリスチレン物質を０．０１モル／ｌリン
酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄する。
２、蛋白質吸着
上記１によって前処理されたポリスチレン物Ｆを、ｐＨ
６，８，０，０１モル／ｌリン酸ナトリウム緩衝液中の
所望の蛋白質（被覆されるべき表面の平方センチメート
ルあたり最大２μｆの蛋白質）の溶液又は患濁液で１６
時間４℃に保温する。この蛋白質溶液は除去され、弱く
結合した蛋白質は０．１１Ｔｗｅｓｎ ２０ （ポリソ
ルベート２０＝ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノ
ラウレート）を含有スるリン酸ナトリウム緩（溶液で１
時間保温することによって除去される。
６，８，０，０１モル／ｌリン酸ナトリウム緩衝液中の
所望の蛋白質（被覆されるべき表面の平方センチメート
ルあたり最大２μｆの蛋白質）の溶液又は患濁液で１６
時間４℃に保温する。この蛋白質溶液は除去され、弱く
結合した蛋白質は０．１１Ｔｗｅｓｎ ２０ （ポリソ
ルベート２０＝ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノ
ラウレート）を含有スるリン酸ナトリウム緩（溶液で１
時間保温することによって除去される。
特定例
１、 Ｉ標識Ｙ−グロブリン（ヤギがら１，１１０００
０ｃｐ／ｕｇ 蛋白質）をＡ、２により未処理ポリスチ
レン管（１１Ｘ ６５ 、 Ｇｒａｉｎ＊ｒ、ドイツ）
とＡ、１にょ９前処理された同じ管として、ｖｔ、Ｍし
た。ＦＢＳとＹ−グロブリン溶液の容積は各１−であシ
、Ｙ−グロブリンは、漸次変化した濃度の範囲：１：０
．５ 、０．２５ 、０．１２５ 、０．０６２５及び
０．０３１２５μｇ／ゴで適用された。
０ｃｐ／ｕｇ 蛋白質）をＡ、２により未処理ポリスチ
レン管（１１Ｘ ６５ 、 Ｇｒａｉｎ＊ｒ、ドイツ）
とＡ、１にょ９前処理された同じ管として、ｖｔ、Ｍし
た。ＦＢＳとＹ−グロブリン溶液の容積は各１−であシ
、Ｙ−グロブリンは、漸次変化した濃度の範囲：１：０
．５ 、０．２５ 、０．１２５ 、０．０６２５及び
０．０３１２５μｇ／ゴで適用された。
得られた結果を第１表に示す。
第 １ 表
被覆収率（％）
適用した””Ｉ ＦＢＳ前処理なし ＦＢＳ前処理あシ
ーＹ−グロブリン １ ６４．８ ２４，９ ５７．２ ５４．４ｏ、ｓ
６９．１ ２ｏ、’＋ ６２．６ ５９．６０．２５
６６．２ １８．５ ６０．６ ５７．１０．１２５
６８．８ １８．７ ６２．８ ６０．５０．０６２５
６５．７ １７．３ ６２．４ ５９．２０１０３１
２５ ５９．５ １４，９ ６７．６ ６３．３Ｉ ：
Ｔｗｓｅｎによる処理前 ｎ ： Ｔｗｅｅｎによる処理後 ＦＢＳ前処理なしのときの被覆収率は約６５俤、ＦＢＳ
前処理したときのそれは約６０係であった。
ーＹ−グロブリン １ ６４．８ ２４，９ ５７．２ ５４．４ｏ、ｓ
６９．１ ２ｏ、’＋ ６２．６ ５９．６０．２５
６６．２ １８．５ ６０．６ ５７．１０．１２５
６８．８ １８．７ ６２．８ ６０．５０．０６２５
６５．７ １７．３ ６２．４ ５９．２０１０３１
２５ ５９．５ １４，９ ６７．６ ６３．３Ｉ ：
Ｔｗｓｅｎによる処理前 ｎ ： Ｔｗｅｅｎによる処理後 ＦＢＳ前処理なしのときの被覆収率は約６５俤、ＦＢＳ
前処理したときのそれは約６０係であった。
両方の被覆された管を１時間、生理食塩水中−ａｎ２０
の０．１チ溶液で保温すると、ＦＢＳ前処理なしの管の
被覆収率は約２０チに低下し、前処理した管では実際上
変化せずにとどまった。
の０．１チ溶液で保温すると、ＦＢＳ前処理なしの管の
被覆収率は約２０チに低下し、前処理した管では実際上
変化せずにとどまった。
２、 ８．１によって未処理及びＦＢＳ前処理ポリスチ
レン管をテオフィリン抗血清（ウサギから、管あたり１
９ｎｔ、希釈度１ ： ３６０００ ）で被覆した０こ
の管をつづいて１時間ＰＨ７，４，０，０１モル／１の
リン酸カリウム緩衝液中１俤のポリビニルアルコール（
低分子量型）溶・液で洗浄した。被覆した管を、１時間
室温で０．１％ゼラチン、０．９９６ ＮａＣｔと０．
０３チ１−アニリノ−ナフタレン−８−スルホン酸マグ
ネシウムを含有し、ｐＨ７，４ｔ ｏ、ｏ １モル／ｌ
リン酸カリウム緩衝液中テオフィリン−ペルオキシダー
ゼ接合体（１ｏ−７ｔ７ｒｔ 、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ１分子当り約２分子のテオフィリン）の溶液各１
−で保温した。つづいて低温タップ水で３回洗浄した。
レン管をテオフィリン抗血清（ウサギから、管あたり１
９ｎｔ、希釈度１ ： ３６０００ ）で被覆した０こ
の管をつづいて１時間ＰＨ７，４，０，０１モル／１の
リン酸カリウム緩衝液中１俤のポリビニルアルコール（
低分子量型）溶・液で洗浄した。被覆した管を、１時間
室温で０．１％ゼラチン、０．９９６ ＮａＣｔと０．
０３チ１−アニリノ−ナフタレン−８−スルホン酸マグ
ネシウムを含有し、ｐＨ７，４ｔ ｏ、ｏ １モル／ｌ
リン酸カリウム緩衝液中テオフィリン−ペルオキシダー
ゼ接合体（１ｏ−７ｔ７ｒｔ 、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ１分子当り約２分子のテオフィリン）の溶液各１
−で保温した。つづいて低温タップ水で３回洗浄した。
ｐＨ５＋ ６１０．１モル／Ｌ）リスアセテート緩衝液
中に０．３３Ｖ−の０−フェニレンジアミンと０、０５
ｑ／′ｎｔＨ２０２を含む１−の溶液で室温に２０分
間管を保温することによって抗体結合酵素活性の測定が
行なわれた。この反応は１モル／を硫酸１−の添加によ
って停止した。４９２での光学濃度を光学的に測定した
。結果は未処理の管では０．１２９、ＦＢＳ前処理した
管では０．９４４であった。
中に０．３３Ｖ−の０−フェニレンジアミンと０、０５
ｑ／′ｎｔＨ２０２を含む１−の溶液で室温に２０分
間管を保温することによって抗体結合酵素活性の測定が
行なわれた。この反応は１モル／を硫酸１−の添加によ
って停止した。４９２での光学濃度を光学的に測定した
。結果は未処理の管では０．１２９、ＦＢＳ前処理した
管では０．９４４であった。
３、（ａ） Ｂ、１に従って、未処理及びＦＢＳ前処理
ポリスチレン微量滴定板を、種々の希釈度のストレプト
リジン−〇調整液（０，１３１〜／ ＋＋１蛋白質、約
４０００ ＩＵ／Ｗ蛋白質） ＯＯ，ｌ Ｊ、 ／カッ
プで被傑した。
ポリスチレン微量滴定板を、種々の希釈度のストレプト
リジン−〇調整液（０，１３１〜／ ＋＋１蛋白質、約
４０００ ＩＵ／Ｗ蛋白質） ＯＯ，ｌ Ｊ、 ／カッ
プで被傑した。
１：２希釈シリーズ（容積０．１ｄ／カツプ）の抗−ス
トレプトリジン標準血清（Ｂｅｈｒｉｎｇ−Ｗｅｒｋｅ
。
トレプトリジン標準血清（Ｂｅｈｒｉｎｇ−Ｗｅｒｋｅ
。
Ｍａｒｂｕｒｇ、 １０ ＩＵ／ｄ）が、希釈剤として
０．１ ％Ｔｗｅｅｎ２０を有するｐＨ７，８，０，１
モル／ｌトリスーＨＣ１緩衝液を用いて、別々に被覆さ
れた微開滴定板でつくられた。この板を３０分間３７℃
に保温し、血清希釈物を除去し、板を低温タップ水で１
回洗浄した。各カップに、抗−ＨｕｌｇＧ−ペルオキシ
ダーゼ接合体（西洋わさびペルオキシダーゼにカップリ
ングされたヒ）ＩｇＧに対するウサギＩｇＧ）の２ ｕ
ｇ虐を含む滴液０．１−を加え、３０分間３７℃に保温
した。接合体溶液の除去後、その板を低温タップ水で３
回洗浄した。免疫吸着によって固定されたペルオキシダ
ーゼ活性検出のため、基質混合物（ｐＨ５、０，１モル
／１）リスサイトレート緩衝液中０．１６９／１０−）
リジン、 ０．０５ ＋％Ａｄ。
０．１ ％Ｔｗｅｅｎ２０を有するｐＨ７，８，０，１
モル／ｌトリスーＨＣ１緩衝液を用いて、別々に被覆さ
れた微開滴定板でつくられた。この板を３０分間３７℃
に保温し、血清希釈物を除去し、板を低温タップ水で１
回洗浄した。各カップに、抗−ＨｕｌｇＧ−ペルオキシ
ダーゼ接合体（西洋わさびペルオキシダーゼにカップリ
ングされたヒ）ＩｇＧに対するウサギＩｇＧ）の２ ｕ
ｇ虐を含む滴液０．１−を加え、３０分間３７℃に保温
した。接合体溶液の除去後、その板を低温タップ水で３
回洗浄した。免疫吸着によって固定されたペルオキシダ
ーゼ活性検出のため、基質混合物（ｐＨ５、０，１モル
／１）リスサイトレート緩衝液中０．１６９／１０−）
リジン、 ０．０５ ＋％Ａｄ。
Ｈ２Ｏ２）のカップ当り０．１−を加えて３０分間室温
に保養した。評価のためなお青い色を生成する最高の血
清希釈度を確認した。
に保養した。評価のためなお青い色を生成する最高の血
清希釈度を確認した。
結果を第２表に示す。
第 ２ 表
３、 （ｂ） 被憬法のあとに乾燥工程（０，１ミｌＪ
バールの減圧下室温で３時間）を行なえば差異が一層顕
著であり、これは長期の貯蔵に有利である。
バールの減圧下室温で３時間）を行なえば差異が一層顕
著であり、これは長期の貯蔵に有利である。
第３表は３ （ａ） （ストレプトリジン希釈度１：８
０標準血清及び患者血清に与えられる最高の正希釈度（
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によって見られ
た結果を示している。活性化された板がよシ良好に働い
たことが見出される。
０標準血清及び患者血清に与えられる最高の正希釈度（
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によって見られ
た結果を示している。活性化された板がよシ良好に働い
たことが見出される。
第 ３ 表
血清試料の最高圧希釈度
標弗血清 負（ｎｅｇａｔｉｖｅ） ６０患者Ｉ ２０
０ ６４００ 患者ＩＩ １５０ ６４００ 患者ＩＩＩ ５０ ４８００ ４、 ８．１に従って、処理されない又はＦＢＳ処理さ
れたポリスチレン微量滴定板を（ドイツ、プール大学、
Ｈ，Ｍａｕｃｈ博士によって予めつくられた）モニリア
菌の糖蛋白質帆０１η／ｄを含有する１カップ当、り
０．１−の溶液で被覆した。
０ ６４００ 患者ＩＩ １５０ ６４００ 患者ＩＩＩ ５０ ４８００ ４、 ８．１に従って、処理されない又はＦＢＳ処理さ
れたポリスチレン微量滴定板を（ドイツ、プール大学、
Ｈ，Ｍａｕｃｈ博士によって予めつくられた）モニリア
菌の糖蛋白質帆０１η／ｄを含有する１カップ当、り
０．１−の溶液で被覆した。
以下に示す血清試料をｐＨ７，８，０，１％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含む０．１モル／ ｔ ） ＩＪスＨＣ１緩
衝液中に１＝４６００の希釈度で希めた液をつくり、被
包された板に１カップ当り０．１−で１時間室温で保温
した。
ｎ ２０を含む０．１モル／ ｔ ） ＩＪスＨＣ１緩
衝液中に１＝４６００の希釈度で希めた液をつくり、被
包された板に１カップ当り０．１−で１時間室温で保温
した。
血清Ａ：モニリア菌に対し低い抗体濃度の健全な基本者
血清Ｂ：健全な供与者からプールされた血清血清Ｃ：モ
ニリア菌に対し高い抗体濃度を有する患者血清Ｉ 崩清り：モニリア菌に対し高い抗体濃度を有する患者柚
ｆｆｌ Ｔｌ 抑清を除去した後、板を一度低温タツブ水で洗浄した。
ニリア菌に対し高い抗体濃度を有する患者血清Ｉ 崩清り：モニリア菌に対し高い抗体濃度を有する患者柚
ｆｆｌ Ｔｌ 抑清を除去した後、板を一度低温タツブ水で洗浄した。
各カップに帆１μｙ／ｌの抗Ｈｕ ＩｇＧ−ペルオキシ
ダーゼ接合体（西洋わさびペルオキシダーゼに組合わさ
れたヒ） ＩｇＧに対するウサギＩｇＧ）を含有する０
、１−の溶液を添加し、１時間室温に採湯した。接合体
溶液除去費、板を３回低温タップ水で洗浄した。免疫吸
着によって固定されたペルオキシダーゼ活性を検出する
ためカップ当り０．１−の基質混合物（ｐＨ５、０，１
モル／ｌトリスサイトレート緩衝液中の０−１ ｑ／
ｒｎｌ ３ ＋ ３’ ｒ ５ ＋ ５’ −テトラメ
チルベンジジン、０．０６ｍ２／ｒｎｔＨ２０２）を添
加し、３０分間室温に保温した。１モル／を硫酸１モル
／カップを添加して反応を停止し、４５５鴫での吸着を
Ｋｏｎｔｒｏｎ ＳＬＴ ２１０微量滴定板リーダで光
学的に測定した。
ダーゼ接合体（西洋わさびペルオキシダーゼに組合わさ
れたヒ） ＩｇＧに対するウサギＩｇＧ）を含有する０
、１−の溶液を添加し、１時間室温に採湯した。接合体
溶液除去費、板を３回低温タップ水で洗浄した。免疫吸
着によって固定されたペルオキシダーゼ活性を検出する
ためカップ当り０．１−の基質混合物（ｐＨ５、０，１
モル／ｌトリスサイトレート緩衝液中の０−１ ｑ／
ｒｎｌ ３ ＋ ３’ ｒ ５ ＋ ５’ −テトラメ
チルベンジジン、０．０６ｍ２／ｒｎｔＨ２０２）を添
加し、３０分間室温に保温した。１モル／を硫酸１モル
／カップを添加して反応を停止し、４５５鴫での吸着を
Ｋｏｎｔｒｏｎ ＳＬＴ ２１０微量滴定板リーダで光
学的に測定した。
その結果を第４表に示す。
第 ４ 表
血清試料 ４５５ ｎｍでの吸着
ＦＢＳなし ＦＢＳあり
５、 ヒト血清中のストレプトリジン−〇に対する抗体
測定用キット このキットは次のものからなる： ａ）抗体被覆反応容器として働く、本発明に係るストレ
プトリジン−〇被覆微量滴定板ｂ） （必要により凍結
乾燥された）ヒ）ＩｇＧに対するウサギＩｇＧとホース
ラディツシュペルオキシダーゼの接合体溶液 −＞ ペルオキシダーゼ反応用ｐＨ５のＱ、 １ モｗ
／Ｌトリスサイトレート緩両液 ｄ）ペルオキシダーゼ反応の色原体として働くジメチル
スルホキシド中３ 、３’ 、 ５ 、５’−テトラメ
チルベンジジン既成溶液（０，１ｍｙ／ｒｎｔ）ｅ）ベ
ベルオキシダーゼ反応用過酸化水素溶液（３チ） ｆ）血清試料と抗体−ペル・オキシダーゼ接合体用希釈
剤上して働＜ 、ＰＨ７、８、０，１％ Ｔｗｓ＠ｎ２
０含有０．１モル／ｌトリスＨＣ１緩衝液。
測定用キット このキットは次のものからなる： ａ）抗体被覆反応容器として働く、本発明に係るストレ
プトリジン−〇被覆微量滴定板ｂ） （必要により凍結
乾燥された）ヒ）ＩｇＧに対するウサギＩｇＧとホース
ラディツシュペルオキシダーゼの接合体溶液 −＞ ペルオキシダーゼ反応用ｐＨ５のＱ、 １ モｗ
／Ｌトリスサイトレート緩両液 ｄ）ペルオキシダーゼ反応の色原体として働くジメチル
スルホキシド中３ 、３’ 、 ５ 、５’−テトラメ
チルベンジジン既成溶液（０，１ｍｙ／ｒｎｔ）ｅ）ベ
ベルオキシダーゼ反応用過酸化水素溶液（３チ） ｆ）血清試料と抗体−ペル・オキシダーゼ接合体用希釈
剤上して働＜ 、ＰＨ７、８、０，１％ Ｔｗｓ＠ｎ２
０含有０．１モル／ｌトリスＨＣ１緩衝液。
特許出願人 バイクーマリンクロット・ケミシェ・フロ
タクテ・ゲーエムペーハー 代理人弁理士 １） 澤 博 昭！″′１、＋ （外２名）
タクテ・ゲーエムペーハー 代理人弁理士 １） 澤 博 昭！″′１、＋ （外２名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、
アルコキシ基又はニトロ基を示しＲ２は水素原子、ハロ
ゲン原子、アルキル基を示し、Ｘはアニオンを示す） のビスジアゾニウム化合物で、ビスジアゾニウム化合物
処理条件下に処理する工程、 ｂ）その後蛋白質を蛋白質吸着条件下にポリスチレン表
面に吸着させる工程、 を含む蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的に結合させ
る方法。 （２１式中釜Ｒ１は窒素原子に対しオルトの位装置にあ
って水素原子、メチル基又はメトキシ基を表わし、各Ｒ
２は窒素原子に対しオルトの位置にあって水素原子、メ
チル基を表わし、Ｘは）１０ゲン又はテトーラフルオロ
ボレートイオンを表わす、特許請求の範囲第１項記載の
方法。 （３） 式中Ｒ１はメトキシ基を表わし、Ｒ２はハロゲ
ン原子、ＸはＣ４−又はＢＦｑ−を表わす、特許請求の
範囲第２項記載の方法。 （４） ビスジアゾニウム化合物は錯体の形である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 （５） 蛋白質は抗体、抗原、ハプテン蛋白質接合体、
抗体結合蛋白質、酵素又はレクチンである特許請求の範
囲第１項記載の方法。 （６） 特許請求の範囲ｉｉ１項の（、）工程によって
つくられたポリスチレン物品。 （７） 特許請求の範囲第１項記載の方法によってつく
られたポリスチレン物品。 （８） 蛋白質は抗体、抗原、ノ・ブテン蛋白質接合体
、抗体結合蛋白質、酵素又はレクチンである特許請求の
範囲第７項記載のポリスチレン物質。 （９）水性試料溶液を（り分析物と反応しうる生物学的
に活性な物質が付着した不溶性担体及び（２）測定量の
トレーサ標識部分と接触させて実質的平衡化の後、生物
学的に活性な物質に結合した一部の標識部分と非標識部
分を有する固相と残余の結合していない標識部分と非標
識部分を含む液相を含む２相系を形成し、その２相を分
離し、濃度を定量することからなる。測定量の水性試料
中の分析物の濃度を定量する免疫化学法又は酵素法にお
いて、前記不溶性担体として特許請求の範囲第１項の物
質を用いることを特徴とする方法。 αＧ 特許請求の範囲第９項記載による放射性免疫測定
法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法又は発光免疫測定
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3311889.2 | 1983-03-31 | ||
| DE19833311889 DE3311889A1 (de) | 1983-03-31 | 1983-03-31 | Verfahren zur irreversiblen bindung von protein an polystyroloberflaechen unter erhaltung der biologischen aktivitaet, so erhaltene polystyroloberflaechen und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6035000A true JPS6035000A (ja) | 1985-02-22 |
| JPH0585560B2 JPH0585560B2 (ja) | 1993-12-07 |
Family
ID=6195287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59063089A Granted JPS6035000A (ja) | 1983-03-31 | 1984-03-30 | 蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的に結合させる方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0123901B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6035000A (ja) |
| AT (1) | ATE85128T1 (ja) |
| AU (1) | AU567723B2 (ja) |
| CA (1) | CA1212916A (ja) |
| DE (2) | DE3311889A1 (ja) |
| ES (1) | ES8504836A1 (ja) |
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| JP2009518459A (ja) * | 2005-10-26 | 2009-05-07 | アルシメール | 絶縁体表面又は半導体表面を修飾する方法、及びこうして得られた生成物 |
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| DE3435744C2 (de) * | 1984-09-28 | 1986-08-07 | Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg | Trägermaterial zur Verwendung für Immunbestimmungen |
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