DK152764B

DK152764B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt

Info

Publication number: DK152764B
Application number: DK269285A
Authority: DK
Inventors: Mogens Wuempelmann
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1985-06-14
Filing date: 1985-06-14
Publication date: 1988-05-09
Also published as: US4892825A; DE3666837D1; FI862533A0; JPS6255083A; DK269285A; FI83973B; DK152764C; ES556019A0; EP0206687A1; ES8707763A1; FI83973C; FI862533A; KR940004542B1; KR870000425A; DK269285D0; EP0206687B1

Description

DK 152764 B

Det område, som omfatter immobiliserede enzymprodukter, især immobiliserede enzymprodukter, som er tiltænkt anvendt i en søjle, har været under hastig vækst i de sidste decennier. Forskningsbestræbelser har været rettet mod immobi-5 liserede enzymprodukter med lavere pris, bedre fysisk styrke, højere enhedsaktivitet og en partikelstørrelse og -form, som giver anledning til et minimalt trykfald under søjledrift samt en maksimal styrke imod slid ved operationer i tankreaktorer, der står under kontinuerlig omrøring.

10 Et af de mest almindelige immobiliserede enzympro dukter er glucoseisomerase, der er anvendt til fremstilling af fructosesirup; et andet eksempel er tryptophan-synthetase. Der skal henvises til US patentskrift nr. 3 980 521 og European J.Appl.Microbiol.Biotechnol. 7, 33-44 (1979).

15 Ved de fleste kommercielle fremgangsmåder til frem stilling af et immobiliseret enzymprodukt anvendes glutaralde-hyd som tværbindingsmiddel. Imidlertid er glutaraldehyd ikke det ideelle, passende tværbindingsmiddel i alle tilfælde. I denne sammenhæng skal der henvises til EP patentansøgning nr.

20 0 089 165 A2, som beskriver anvendelsen af en polyazetidin-præpolymer, som kan tværbindes i vandig opløsning ved reaktion med adskillige generiske funktionelle grupper, jfr. side 6, linie 5-15 af den euræiske patentansøgning. Den europæiske patentansøgning beskriver fremstillingen af en blanding omfat-25 tende immobiliserede, mikrobielle celler, fremkommet ved sammenblanding af en vandig dispersion af cellerne og en vandig opløsning af et polyazetidinprepolymerpræparat, og ved hærdning af den præpolymere i denne blanding. Ved denne kendte teknik fremkommer der immobiliserede enzympartikler, hvis form 30 og størrelse ikke er kontrolleret.

Ved knusning og sigteanalyse kan den ønskede partikelfraktion separeres, men udbyttet af den ønskede fraktion er sædvanligvis ringe, og desuden er partiklernes form ikke kontrolleret .

35 Opfindelsens formål er således at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt med høj fysisk styrke, hvorved formen og størrelsen af

DK 152764B

partiklerne kan kontrolleres med henblik på optimal drift i en søjle hvad angår trykfald, hvorved partiklernes styrke kan kontrolleres med henblik på optimal modstand mod slid ved drift i tankreaktorer med kontinuerlig omrøring, og hvorved 5 udbyttet af det immobiliserede enzym forbliver på et højt niveau.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den i krav 1 angivne art, er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

10 Det har overraskende vist sig, at det immobiliserede enzymprodukt fremstillet ifølge opfindelsen udviser et meget lille trykfald (d.v.s. et trykfald, som kun er ca. 50% af trykfaldet af et dermed sammenligneligt, kendt produkt) og en høj fysisk styrke og resistens imod slid, og at det er meget 15 billigt p.g.a. det høje partikelformingsudbytte. Det har også vist sig, at det immobiliserede enzymprodukt fremstillet ifølge opfindelsen ved visse fordelagtive udførelsesformer udviser en signifikant højere volumenaktivitet i sammenligning med kendte produkter.

20 Celleslammet fra enzymgæringen dannes typisk ved centrifugering eller filtrering af kulturvæsken efter afsluttet gæring. Celleslammet kan anvendes som sådant eller kan homogeniseres.

Tilsætning af det lavmolekylære tværbindingsmiddel 25 til celleslammet vil frembringe en partiel tværbindingsvirkning. Dialdehyder, især glutaraldehyd, er det foretrukne lavmolekylære tværbindingsmiddel, men andre lavmolekylære tværbindingsmidler, såsom diisocyanater, 2,4,6-trichloro-S-tri-azin, bisoxiran, bisimidater, divinylsulfon, 1,5-difluoro-30 2,4-dinitrobenzen, dicarboxylsyrer og diaminer i kombination med aktiveringsmidler, såsom carbodiimid, kan anvendes.

Koncentrationen af det lavmolekylære tværbindingsmiddel kan være f.eks. mellem 1 og 100%, idet resten er vand, men koncentrationen er ikke nogen kritisk faktor for opfin-35 delsen.

DK 152764B

Sammen med det lavmolekylære tværbindingsmiddel kan man tilsætte hjælpetværbindingsmidler, f.eks. polyethylenimin, chitosan, albumin og gelatine.

Den partielle afvanding kan yderligere lettes ved 5 tilsætning af polymere flocculeringsmidler.

Den partielt afvandede masse med pastaagtig konsistens fremkommer sædvanligvis som en filterkage.

Det har vist sig, at tværbindingen af den polyaze-tidin-præpolymere ikke finder sted før tørringsoperationen.

10 En fortrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne. Hvis mængden af glutaraldehyd er under 5% w/w, er filtrerbarheden af reaktionsmassen inferiør, og hvis mængden af glutaraldehyd er over 40% w/w, er enzymudbyt-15 tet af det immobiliserede produkt utilfredsstillende.

Den partielt afvandede masse med pastaagtig konsistens skal have et vandindhold på 70-90% w/w. Hvis vandindholdet er under 70% w/w, er reduktionen af trykfaldet ikke tilfredsstillende, og hvis vandindholdet er over 90% w/w, 20 forløber partikelformningen på utilfredsstillende måde. Vandindholdet er relativt kritisk for opfindelsen.

Den polyazetidinpræpolymere tilsættes i en mængde på mellem 5 og 30% w/w med hensyn til tørvægten af enzymcellerne. Hvis mængden er under 5% w/w, er reduktionen af trykfaldet 25 utilfredsstillende lav, og hvis mængden er over 30% w/w, er enzymudbyttet af det immobiliserede produkt utilfredsstillende lavt.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende 30 del af krav 3 angivne. Denne granuleringsmetode er billig og velegnet til fremstilling i industriel skala.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 angivne. Med et vandindhold på over ca. 25% er 35 produktets mikrobielle stabilitet utilfredsstillende, og desuden kan partiklerne have tendens til at aggregere. Med et

DK 152764B

vandindhold over ca. 25% kan det yderligere ske, at tværbindingen med det polyazetidinpræpolymere ikke har fundet sted eller ikke er fuldstændig, som før angivet.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden 5 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 5 angivne. Immobiliseret glucoseisomeraseprodukter er meget anvendt i industrien.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende 10 del af krav 6 angivne. Både celler af arten Streptomyces og de glucoseisomeraser, som afledes deraf, er karateristiske ved en utilstrækkelig tværbinding med glutaraldehyd, og opfindelsen er således særligt velegnet for denne gruppe enzymer.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden 15 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 7 angivne. Både cellerne af Streptomyces murinus og den glucoseisomerase, som afledes deraf, er karakteriseret ved en utilstrækkelig tværbinding med glutaraldehyd, og den foreliggende opfindelse er således særligt velegnet for dette 20 enzym.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 8 angivne. I relation til tryptophan-syntetase har opfinderen undersøgt et antal forskellige immobiliserings-25 metoder; ingen af disse gav dog anledning til fremkomsten af et immobiliseret produkt med tilfredsstillende fysisk styrke.

EKSEMPEL 1

Glucoseisomerase indeholdende celler af Streptomyces murinus, DSM 3252 blev dyrket i et konventionelt medium omfat-30 tende glucose, en kompleks nitrogenkilde, mineraler og sporgrundstoffer.

Efter indstilling af pH til 7,0-7,5 blev cellerne udvundet fra gæringsvæsken ved centrifugering og homogeniseret ved hjælp af en Manton-Goulin homogenisator efter tilsætning

DK 152764B

af MgS04.7H20 i en mængde af 0,5% w/v. Det homogeniserede celleslam blev holdt ved -18°C og optøet umiddelbart før anvendelsen ved immobiliseringsforsøget. 300 g celleslam med 6,7% tørstof blev fotyndet til 750 ml med 1,5% MgSO^, 7 Ϊ^Ο og 5 pH blev indstillet på 7,5. 30 g Corcat P-18 polyethylenimin flokkuleringsmiddel (fra Cordova Chemical Co., Michigan) blev tilsat. Så tilsattes 9,24 g 50% glutaraldehyd opløsning, og pH blev holdt på 7,4-7,6 i 1 time. Man udvandt delvist tværbundne celler ved filtrering. Filterkagen, der indeholder ca. 15.8% 10 DM, blev delt i to lige store dele hvad angår tørstofindhold.

De to dele blev blandet med henholdsvis 0 og 15% w/w Polycup 1884 polyazetidinpræpolymer, beregnet som tørstof, pH 7,5, fra Hercules Inc., Delaware, beregnet på filterkagetørstof. Alle dele blev ekstruderet gennem 0,8 mm åbninger. Man lod det 15 ekstruderede materiale tørre ved stuetemperatur til tørstofindhold 83-85% w/w. Den 300-700 μ fraktion opnåedes ved sigte-fraktionering .

Glucoseisomeraseaktiviteten (målt i henhold til NOVO dokument F 850399) udvundet i de to immobiliserede enzympræpa-20 rater var omtrent lige stor. Trykfaldet (i g/cm ) målt i henhold til NOVO, AF 166 er angivet i den følgende tabel 1.

Tabel 1

Trykfald versus procendel af polyazatidin beregnet som tørstof i forhold til filterkagetørstof.

25 % polyazetidin 0 15 trykfald (25h/50h) 14/17 6/7

DK 152764 B

EKSEMPEL 2

En tryptophan-syntetase-producerende stamme af E. coli ATCC 15491 blev dyrket på skråagar ved 37°C, og derfra blev den overført til en forkultur i rysteflasker ved 37°C.

5 Forkulturen blev podet på et medium, der fremstilledes på følgende måde; sammensætningen af mediet var: {nh4)2S04 8 5/1 KH2P04 1,6 g/1

Na2HP04,2H20 5,6 g/1 10 Trinatriumcitrat, 2H20 0,5 g/1

NaCl 3 g/1

MgS04,7H20 0,5 g/1

CaCl2,2H20 0,02 g/1

FeCl32H20 90 mg/1 15 ZnS04,7H20 20 mg/1

MgS04,4H20 24 mg/1

MnS04,4H20 22 mg/1

CuS04,5H20 4 mg/1

Kl 4 mg/1 20 NaMo04,2H20 4 mg/1 H3BC>3,6H20 1,2 mg/1

CoC12,6H20 6 mg/1

NiCl2,6H20 6 mg/1 *Biotin 4 μg/l 25 *Calciumpantothenat 800 μg/l *Folinsyre 4 μg/l *Inositol 4000 μg/l *Niacin 800 μg/l *p-aminobenzoesyre 400 μg/l 30 *Pyridoxin HCl 800 μg/l *Riboflavin 400 μg/l *Thiamin HCl 800 μg/l

7 DK 152764 B

Mediet blev steriliseret ved 121°C i 25 minutter med undtagelse af vitaminerne (*), som blev sterilfiltreret og tilsat efter afkøling sammen med dextrose (10 g/1) og indol i 48% ethanol (125 mg/1). Den submerse gæring blev gennemført 5 under aseptiske betingelser ved 37°C under beluftning med 1 volumen/volumen/minut, omrøring svarende til 500 rpm og pH kontrolleret ved syre/base-tilsætning til pH 7,0 i 40 timer.

24 timer efter podning gennemførte man en yderligere tilsætning af dextrose (40 g/1) og indol i 48% ethanol (875 mg/1).

10 Man høstede cellerne efter 40 timers forløb ved centrifugering, og de anvendtes øjeblikkeligt derefter til immobiliseringsforsøg (eksempel 3).

EKSEMPEL 3 60 g af de våde celler, der var udvundet ved centri-15 fugering fra gæringen (eksempel 2), blev blandet med 300 ml 85 mM IQ^PO^, pH 7,5; 8,4 g polystyren fra Kodak (200-400 mesh, tværbundet med 2% w/w divinylbenzoesyre), 96 mg pyridoxal-phosphat og 9,6 g af en 12,5% w/v glutaraldehydopløsning. pH-værdien blev holdt på 7,5 ved basetilsætning under hele immo-20 biliseringsmetoden. Derpå tilsattes 60 g Corcat P-150 poly-ethyleniminopløsning fra Cordova Chemical Company i Michigan, indstillet på pH 7,5 med 10 N NaOH, efterfulgt af den samme mængde glutaraldehydopløsning som før. Fortyndingen gennemførtes med 900 ml 50 mM K^PO^, pH 7,5, efter 1 time fra den 25 første glutaraldehydtilsætning. Derpå gennemførtes flocculer-ingen ved tilsætning af 250 ml 1 0/00 w/v Superfloe A 130 fra American Cyanamide. Delvist tværbundne og flocculerede celler blev udvundet ved filtrering. Filterkagen, som indeholdt ca.

19% w/w tørstof, blev delt i to lige store dele hvad angår 30 tørstofindhold. En del blev blandet med 7,2 g Polycup 172 fra Hercules Inc., Delaware, pH 7,5, svarende til 16,5% w/w af tør polyazetidin-præpolymer hvad angår tørstof i de våde celler, der blev udvundet ved centrifugering fra gæringen.

Begge dele blev ekstruderet gennem 0,8 mm huller.

8 DK 152764B

Man lod det ekstruderede materiale tørre ved stuetemperatur til et tørstofindhold af 90% w/w. Den 300 - 700 μ fraktion fremkom ved sigtefraktionering.

Den tryptophan-syntetase-aktivitet, som blev ud-5 vundet i de to immobiliserede enzymprodukter, var omtrent den samme. Trykfaldet (i g/cm'2) målt i henhold til NOVO, AF 166, af produktet med polyazetidin var 14 (25 h)/15 (50 h) og af produktet uden polyazetidin 23 (25 h)/24 (50 h).

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobili-seret enzymprodukt, kendetegnet ved, at et celleslam fra en enzymgæring behandles med et lavmolekylært tværbindingsmiddel, 5 hvorefter den således behandlede blanding afvandes delvist til en masse med pastaagtig konsistens og med et vandindhold på 70-90% w/w, fortrinsvis 80-85% w/w, hvilken masse derpå behandles med en polyazetidinpræpolymer i en mængde på mellem 5 og 30% w/w hvad angår tørvægten af enzymcellerne til dannelse 10 af en blanding med en konsistens, som er velegnet til partikelformning, hvorefter den således dannede blanding formes til partikler med den ønskede partikelform og -størrelse og tørres.

2. Fremgangsmåde ifølgé krav 1, kendetegnet ved, at 15 det lavmolekylære tværbindingsmiddel er glutaraldehyd, og at mængden af glutaraldehyd ligger mellem 5 og 40% w/w hvad angår tørstof i celleslammet, fortrinsvis mellem 10 og 20% w/w.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2, kendetegnet ved, at partikelformningen gennemføres ved ekstrudering og 20 sfæronisering.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at de formede partikler tørres til et vandindhold under ca. 25% w/w. DK 152764 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at cellerne er afledt af en glucoseisomeraseproducerende mikroorganisme.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 5 den glucoseisomeraseproducerende mikroorganisme er en stamme af slægten Streptomyces.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at stammen af slægten Streptomyces er en stamme af Streptomyces murinus.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at cellerne er afledt af en tryptophan-syntetase-producerende mikroorganisme.