DK166459B1 - Fremgangsmaade til omdannelse af plantesaft til et medium, der er velegnet som naeringssubstrat for vitamin- og aminosyrekraevende bakterier, der danner organiske syrer eller aminosyrer - Google Patents

Description

1.

DK 166459 B1

Den foreliggende opfindelse omhandler en fremgangsmåde til omdannelse af plantasaft til et medium, der er velegnet som næringssubstrat for vitamin- og aminosyrekrævende bakterier, der danner organiske syrer eller aminosyrer.

5 Fremgangsmåden er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

I forbindelse med landbrugsindustrielle produktioner, f.eks. fremstilling af kartoffelmel og grøntpiller, fremkommer der et restprodukt i form af en væske eller saft, der hidtil er 10 blevet sprøjtet ud som gødning på marker.

Saften har et tørstofindhold på 2-6 %. Tørstoffet indeholder bl.a. fibre, protein, kulhydrater, vitaminer og frie aminosyrer.

Denne saft indeholder således alle de stoffer, der er nødven-15 dige for at fremme væksten af selv krævende mikro-organismer.

Imidlertid kan saften kun anvendes som substrat for mikroorganismer, der ikke stiller store krav til indholdet af frie aminosyrer, eller som er i stand til at danne proteolytiske exoenymer, f.eks. Baci1lusarter.

20 Således kan bakterier tilhørende slægten Lactobacillus og auxotrofe mutanter, der har specielle aminosyrekrav, f.eks. mutanter af Corynebacterium glutanicum og Brevibacterium lactofermentum, der anvendes til fremstilling af aminosyrer, f.eks. glutaminsyre, L-lysin og threonin, ikke umiddelbart 25 udnytte plantesaften,fordi de fleste aminosyrer er bundet i proteinerne.

Fra GB-A-2090288 er det kendt, at det er muligt at anvende fældet protein fra f.eks. kartoffelfrugtsaft som proteinkilde i fermenteringsprocesser, hvor mikroorganismerne danner 30 proteolytiske enzymer, som kan spalte proteinet til frie aminosyrer.

2.

DK 166459 B1

Et sådant fældet protein kan imidlertid ikke udnyttes af bakterier tilhørende slægterne Lactobacillus eller Coryne-5 bacterium, som ikke udskiller proteolytiske enzymer.

Det er velkendt, at det er muligt at hydrolysere protein til frie aminosyrer enten ved sur hydrolyse under anvendelse af stærk syre og høj temperatur eller ved enzymatisk hydrolyse under anvendelse af protease og peptidase.

10 Imidlertid er det ikke muligt at udføre en sur hydrolyse på en vandig opløsning af protein, der har en så lav koncentration som den foreliggende .væske.

Det vil heller ikke være muligt at anvende enzymatisk hydrolyse, idet der skal anvendes meget store enzymmængder, der 15 vil gøre processen for kostbar og derfor ikke rentabel.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at anvise en fremgangsmåde, ved hvilken plantesaften kan omdannes til et medium, der er velegnet som næringssubstrat for dyrkning af f.eks. Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum og 20 aminosyrekrævende mutanter af Brevibacterium lactofermentum og Corynebacterium glutanicum.

Det bliver herved muligt at udnytte plantesaften i en industriel fermenteringsproces, ved hvilken der fremstilles f.eks. mælkesyre eller aminosyrer, der begge er produkter, 25 der har stor anvendelse i levnedsmiddel- og foderstofindustrien og i den kemiske industri.

Dette opnås ved den i den kendetegnende del af krav 1 angivne f remgangsmåde.

Ved denne fremgangsmåde bliver det desuden muligt som angivet 30 i krav 2 at anvende enzymer, der findes naturligt i nogle plantesafter'.

Krav 3 omhandler en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge krav 1, og 3· DK 166459 B1 krav 4 omhandler en anden udførelsesform for fremgangsmåden ifølge krav 1.

De følgende eksempler tjener til at belyse opfindelsen.

5 EKSEMPEL 1.

Ved fremstilling af grøntpiller presses det snittede græs eller lucerne enten straks, hvorved der fremkommer grønsaft, eller det opvarmes først og presses derefter, hvorved der fremkommer brunsaft.

10 Brunsaften indeholder 2-5% tørstof, hvoraf 15-35% er protein, ca. 22% aske og 20-40% er Kulhydrat.

I dette tilfælde er der anvendt en koncentreret brunsaft, inddampet ved vakuuminddampning.

Den koncentrerede brunsaft indeholder 22% tørstof, hvoraf de 15 5% er protein.

Den koncentrerede brunsaft opvarmes til 80°C i 10 timer for at pasteurisere brunsaften.

Temperaturen indstilles på 55°C, pH indstilles på 8,0 med 6N ammoniak, hvorefter temperaturen holdes på 55°C og pH på 8,0 20 (pH-Stat) ved løbende justering af pH ved tilsætning af 6N ammoniak.

Hydrolyseringen stoppes, når forbruget af base svarer til en hydrolysegrad (DH) på minimum 80%.

Hydrolysegraden beregnes på følgende måde: 25 1 Ns 1 DH = B - - - - - - - 100% ' α MP htot B : Forbrug af base i liter.

DK 166459 B1 4.

— : Kalibreringsfaktor for pH-Stat, ved pH=8 anvendes a 5 værdien 1,0.

Ns: Normalitet af base.

MP: Proteinmasse i kg.

htot: Total antal peptidbindinger. Her er htot==8,0 anvendt.

I dette eksempel er der efter 24 timer forbrugt 122 ml 6N 10 ammoniak, til hydrolyse af 2 1 koncentreret brunsaft, svarende til en hydrolysegrad på 91,5%.

Hydrolysen stoppes.

Den hydrolyserede koncentrerede brunsaft anvendes nu i et dyrkningsmedium til dyrkning af Corynebacterium glutanicum 15 ATCC 21526, en stamme med krav om homoserin og leucin.

Dyrkningsmediet sammensættes således: 10% melasse (beregnet som glucose).

20% koncentreret, hydrolyseret brunsaft, svarende til 1% proteinhydrolysat.

20 0.07% KH2PO4

0.05% MgSO*.7H2O

0.3% urinstof 0,5% (NlUJaSO* 3% CaCOs 25 pH indstilles på 7,5.

Dyrkning udføres ved 30°C i 4 døgn i 1-1iters fermentor med beluftning.

5.

DK 166459 B1

Der dannes 22,5 mg/ml L-lysin ved dyrkning i dette næringsmedium.

Ved dyrkning i et dyrkningsmedium, hvor 20% koncentreret, 5 hydrolyseret brunsaft er erstattet med ikke hydrolyseret brunsaft, dannes kun 4,3 mg/ml L-lysin.

I et dyrkningsmedium, hvor koncentreret, hydrolyseret brunsaft er erstattes med sojabønnekagesvovlsyredekomposat med samme proteinindhold (1%), dannes 19,5 mg/ml L-lysin.

10 EKSEMPEL 2.

Kartoffelfrugtsaft er et af stivelsesfabrikationens restprodukter .

Kartoffelfrugtsaft indeholder de dele af kartoflen, som ved stivelsens udvaskning er gået i opløsning, herunder en del 15 nitrogenholdige forbindelser, protein, aminosyrer m.m. .

Den i eksemplet anvendte kartoffelfrugtsaft indeholder 4,4% tørstof, heraf 2,0% protein (N x 6,25).

Kartoffelfrugtsaften varmebehandles ved 120°C i 20 min.

Den varmebehandlede kartoffelfrugtsaft afkøles til 55°C, pH 20 indstilles på 8,0 med 4N ammoniak, hvorefter der tilsættes 0,01% ALCALASE © .

pH holdes konstant på 8,0 (pH-Stat) ved tilsætning af 4N ammoniak eller 4N natrium hydroxid.

Efter 4 timer opnås en hydrolysegrad (DH) på 35%.

25 Den hydrolyserede kartoffelfrugtsaft ultrafiltreres således, at partikler og molekyler med større molekylevægt end 10.000 fjernes.

DK 166459 B1 6.

Ultrafiltratet indeholder delvist hydrolyseret protein og frie aminosyrer.

5 Ultrafiltratet tilsættes 2% glucose, pH indstilles på 7,0, det autoklaveres ved 110°C i 15 min. og anvendes som dyrkningsmedium for forskellige bakterier. Efter inkubering ved 37°C i et døgn opnås følgende vækst, målt som optisk tæthed ved 450nm (ODaso).

10 Ved dyrkning i kartoffelfrugtsaftultrafiltrat, der ikke er enzymbehandlet er væksten i de fleste tilfælde mindre.

TABEL: 15 ikke

Enzym- enzym-

Bakterier beh. beh.

Corynebacterium glutanicum ATCC 21526 6.6 0,5 20---

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798 4,4 1,2

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 6,5 1,8 25 Bacillus subtilis ATCC 6051 1,9 2,0

Lactobacillus casei ATCC 11443 2,5 0,5

Lactobacillus bulgaricus Chr.Hansen's Lab 1,5 0,3 30 -L___ EKSEMPEL 3.

Ved dyrkning af Bacillus amyloliquefacieus ATCC 23842 i et 35 sterilt medium bestående af brunsaft med et indhold af protein på 1% er det muligt at fremstille proteolytiske enzymer, som kan anvendes ved en senere hydrolyse af plantesaft.

Efter dyrkning ved 37°C i 24 timer under beluftning opnås en enzymaktivitet i brunsaften på 2,5 x 10-2 Anson units pr.ml., 40 hvilket svarer til den enzymaktivitet som anvendes, når der benyttes kommercielle enzymer som f.eks. ALCALASE © -

Claims (4)

7. DK 166459 B1 PATENTKRAV.

1. Fremgangsmåde til omdannelse af plantesaft til et medium, der er velegnet som næringssubsstrat for vitamin- og amino- 5 syrekrævende bakterier, der danner organiske syrer eller aminosyrer, kendetegnet ved, at plantesaften først varmebehandles i et interval for sammenhørende værdier af temperatur og tid gående fra 55°C og 1 døgn til 120°C og 10 min. afhængigt af plantesaftens art, at plantesaften der-10 efter afkøles til 50°C - 60°C, og at pH-værdien indstilles til 7,5 - 8,5 ved tilsætning af en base, fortrinsvis ammoniak, hvorefter plantesaften omdannes ved enzymatisk hydrolyse ved hjælp af proteolytiske enzymer, fortrinsvis proteaser og peptidaser, under omrøring og idet pH-værdien 15 holdes konstant på 7,5-8,5 ved fortsat tilførsel af base, indtil hydrolysen er færdig.

2. Fremgangsmåde til omdannelse af plantesaft ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymerne udgøres af proteolytiske enzymer, der forekommer naturligt i nogle plante- 20 safter, f.eks. i græssaft.

3. Fremgangsmåde til omdannelse af plantesaft ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymerne udgøres af proteolytiske enzymer, der dannes af mikroorganismer, der dyrkes i plantesaften, eller er dannet ved dyrkning af mikroorganismer 25. et næringssubstrat af en anden art end den plantesaft, der skal omdannes.

4. Fremgangsmåde til omdannelse af plantesaft ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plantesaften hydrolyseres ved tilsætning af et proteolytisk enzym, f.eks. ALCALASE ® *