CN1184308C - 一种制备乳酸芽孢、丁酸芽孢杆菌活菌制品的新方法 - Google Patents

一种制备乳酸芽孢、丁酸芽孢杆菌活菌制品的新方法 Download PDF

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Abstract

一种制备乳酸芽孢杆菌活菌制剂的新方法，利用酶生物技术处理植物蛋白原料制得培养基，用于乳酸芽孢杆菌单独发酵培养，形成生物量大、芽孢形成率高的发酵物，再经离心、赋形、常温以上温度干燥、制得乳酸芽孢杆菌的干粉活菌制剂。本发明的优点是生产成本低廉，产品活菌稳定，效果优良。

Description

一种制备乳酸芽孢杆菌活菌制品的新方法
所属领域
本发明涉及一种乳酸芽孢杆菌的活菌制剂的廉价制备方法。
背景技术
乳酸芽孢杆菌作为一类对人类、动物有益的微生物，由于能形成芽孢，制成活菌制剂时，干燥相对简单，制品贮存活菌稳定，通过胃酸时不易被杀死，比一般的微生物活菌制剂选用的菌株，如乳酸杆菌、双歧杆菌、粪链球菌、酵母菌等饲用微生物菌株拥有明显优势。美国专利US5.520 936(1996)利用乳酸芽孢杆菌制备一种食品添加剂；日本专利JP11322622将乳酸芽孢杆菌用来治疗皮肤病；US5.292 523(1994)、US4.892 731(1990)、JP63-146825(1986)、JP61-6625(1984)、JP06-166825(1994)、JP05-227898(1993)等专利涉及丁酸芽孢杆菌的特性及活菌制剂的制备和用途。但所有这些专利中，乳酸芽孢杆菌和丁酸芽孢杆菌发酵所用培养基的氮源都是牛肉膏、蛋白胨和酵母膏等生化培养基，因此价格昂贵。
发明目的
针对培养基成本高的不足，本发明提供了一种发酵原料成本降低而发酵液活菌数提高的制备乳酸芽孢杆菌活菌制剂的新方法，
技术方案
本发明的一种制备乳酸芽孢杆菌活菌制剂的方法，包括培养基的制备、发酵、离心、干燥，其特征在于利用酶生物技术处理豆粕原料制得基本培养基，再加入碳源和无机盐，用于乳酸芽孢单独发酵培养，形成生物量大、芽孢形成率高的发酵物，再经离心、赋形、干燥、制得乳酸芽孢杆菌的干粉活菌制品。
现对乳酸芽孢杆菌的干粉活菌制剂的制备过程进行详细叙述。
1.将植物蛋白原料与水按1∶5-20的混合均匀，然后将该混悬液加热至50-90℃保持10-30分钟进行预处理。植物蛋白原料包括脱脂大豆蛋白粉玉米蛋白粉。
2.将预处理好的混悬液调pH至6-9，加入水解酶，水解酶可以是碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸蛋白酶，但以碱性蛋白酶为佳；加酶量为100-600单位/克水解物，以200-300单位/克水解植物蛋白原料为佳。水解温度为40-80℃，水解时间为20-40分钟。
3.上述水解液过滤得水解植物蛋白上清夜，在上清液中加入适量得无机盐和碳源，制得二个菌株单独发酵液体培养基，其配方范围为1-5％植物蛋白水解物(干物资含量)，0.1-0.5％无机盐，0.1-0.5％糖，pH值为6.5-8.0，其余加水至100％。无机盐可以是氯化钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠；糖可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖。
4.将菌种种子液接种到上面得灭菌培养基中直接液体发酵或与载体混合固体发酵。发酵温度以35-37℃为佳；发酵时间以24-48小时为佳，均发酵至芽孢形成率达95％以上停止培养。
5.对于液体发酵物，先进行高速离心收集菌体，再赋形、干燥；对于固体发酵物，直接赋形、干燥。干燥温度为20-80℃，干燥至菌粉水含量小于5％。
本发明与现有的技术相比具有发酵活菌数量大，芽孢形成率高，生产成本低廉，产品活菌贮存稳定的优点。
下面结合实施例对本发明做进一步叙述。
实施例1
称取10Kg低温脱脂豆粕，加入100L自来水，边搅拌边加热至90℃；恒温20分钟后，降温至60℃，将pH调至8.5，加20g活力为10万单位/克的碱性蛋白酶于50℃酶水解30分钟，离心沉降制得大豆蛋白水解液。将该水解液泵入1吨发酵罐中，加入1.2Kg氯化钠，2.4Kg蔗糖，加水补充至600L，用氢氧化钠调pH至7.5后高压灭菌得放大用液体培养基。
将乳酸芽孢杆菌从斜面接种到3升的MRS液体培养基中，36℃摇床培养16小时左右，达到活菌数5亿/毫升后，接种到上述豆粕水解培养基中，36℃，通入300升/分钟的无菌空气，搅拌培养培养24小时左右取样显微镜观察，至95％以上的细菌从杆状转变为樱桃状端生芽孢后，压入到15000rpm的高速管式离心机离心收集菌泥；将收集的菌泥与赋形剂混合干燥得菌粉24Kg，活菌数为220亿/克。
其中MRS液体培养基配方为：
蛋白胨  1.0％  酵母膏     0.5％
乙酸钠  0.5％  柠檬酸三铵 0.2％
葡萄糖  1.0％  土温-80    0.1％
硫酸镁  0.02％ 硫酸锰     0.005％
pH调至  7.2    补充水至   100％
实施例2
称取10Kg含70％蛋白质的玉米蛋白粉，加100L水，搅拌均匀加热至90℃，搅拌维持20分钟后降温至70℃，调pH至7.0，加10g 14万单位/克的木瓜蛋白酶于70℃酶水解30分钟。往该水解液加水补充至200L，加入0.6Kg葡萄糖，0.4Kg氯化钠和0.4Kg磷酸氢二钠，用氢氧化钠调pH至7.5后高压灭菌得放大用水解玉米蛋白水解液体培养基。
将丁酸芽孢杆菌从斜面接种到2升的MRS液体培养基中，37℃摇床培养12时，达到活菌数10亿/毫升后，接种到上述玉米蛋白水解培养基中；然后将该接种液体营养液与250Kg固体载体碳酸钙混合均匀后，于37℃通氮厌氧固体培养48小时。取样显微镜观察99％以上的细菌从杆状转变为梭状空芽孢，将该固体培养物，加入赋形剂混合搓颗粒，置于50℃真空干燥4小时，得干燥菌粉310Kg，活菌数为12亿/克。
实施例3
用实施例1和实施例2方法获得的乳酸芽孢杆菌粉(2.2×1010个/克)和丁酸芽孢杆菌粉(1.2×109个/克)，进行了稳定性试验.将两种样品用铝塑复合袋密封分装，保存在25℃的恒温箱中，定期测定活菌数，.活菌数的测定方法，将等测试样用0.9％灭菌生理盐水以10倍稀释法稀释，将0.1毫升涂布在培养皿内的MRS琼脂平板上，用37℃的恒温培养箱培养48小时后，数琼脂上的菌落，乘以稀释倍数，得出活菌数.菌数检测结果见表1。
          表1 活灵活现数结果
试验时间 乳酸芽孢杆菌粉 丁酸芽孢杆菌粉
0个月 2.2×1010  1.2×109
1个月 2.1×1010  1.1×09
3个月 2.0×1010  0.9×109
6个月 2.0×1010  0.7×109
12个月 1.8×1010  0.6×109
24个月 1.5×1010  0.4×109
结果表明，本发明制备的乳酸芽孢杆菌体和丁酸芽孢杆菌体能在室温下稳定生存24个月。
实施例4
利用MRS培养基和利用植物蛋白水解液作培养基培养乳酸芽孢杆菌和丁酸芽孢杆菌的发酵物活菌数、芽孢形成率、发酵原料成本(换算成活菌数10×108个/克)对照结果见表2.
      表2发酵液活菌数、芽孢形成率、发酵原料成本对照
培养基 MRS 植物蛋白水解液
乳酸芽孢杆菌 发酵物活菌数 10×108 15×108
芽孢形成率 70％ 95％
发酵原料成本 3.90元/Kg 0.70元/Kg
丁酸芽孢杆菌 发酵物活菌数 2.5×108 9.0×108
芽孢形成率 90％ 99％
发酵原料成本 3.2元/Kg 0.35元/Kg
从表2可以看出，植物蛋白水解液培养基与MRS培养基相比，发酵液活菌数提高50％以上、芽孢形成率均有明显提高，而发酵原料成本降低70％以上，经济效益非常显著。

Claims (2)

1.一种制备乳酸芽孢杆菌活菌制剂的方法，包括培养基的制备、发酵、离心、干燥，其特征在于培养基利用酶生物技术处理低温脱脂豆粕原料制得，所述的酶生物技术包括：
(1)、将低温脱脂豆粕原料与水按1∶5-20的混合均匀，然后将该混悬液加热至90℃保持10-30分钟进行预处理；
(2)、将预处理好的混悬液调pH至8.5，加入碱性蛋白酶；加酶量为200-300单位/克水解物，水解温度为50℃，水解时间为20-40分钟；
(3)、上述水解液过滤得水解豆粕上清液，在上清液中加入无机盐和糖，制得菌株单独发酵液体培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于无机盐是氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；糖是葡萄糖、蔗糖、乳糖。
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