CN115011524B - 一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用，主要利用豆制品加工废水与柑橘深加工过程中产生的废水作为发酵基质，替代培养基中的碳氮源，采用高产纳豆激酶的生产菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KC‑20225，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.24848，发酵周期为10‑20 h，纳豆激酶产量为12500 IU/mL。本工艺将废弃物豆制品加工废水与柑橘深加工加工过程中产生的废水综合利用，提高生产效率，促进经济发展，改善环境。因此，本发明具有广阔的市场前景和工业价值。

Description

一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种制备纳豆激酶菌剂的生产工艺。
背景技术
枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性需氧菌，其能够迅速消耗动物体肠道内的游离氧，从而有效提高营养物质的利用效率。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体（人体）内的消化酶类一同发挥作用；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体（人体）内干扰素和巨噬细胞的活性。
纳豆激酶是一种功能性物质，具有防血栓作用、安全性好、易吸收、药效持久等特点，与常规溶血栓药物相比较，现行市场上使用的溶栓药物其溶栓作用主要并不是直接溶解纤维蛋白，而大部分属于纤溶蛋白酶原激活剂。而纳豆激酶具有多种溶栓机制，不仅表现为纳豆激酶可直接降解纤维蛋白为小肽或氨基酸，同时，纳豆激酶还可以刺激血管内壁，进而产生内源纤维酶原激活剂，通过该激
活剂激活纤维蛋白酶，从而达到增加溶栓效果的目的。而且，纳豆激酶还可以激活由肾脏所产生的尿激酶原转变成尿激酶，加大了溶栓效果。另外，纳豆激酶具有溶解纤维酶原激活剂抑制物的作用，由此便可以维持体内纤维酶原激活剂的活性，便于激活体内纤维蛋白酶从而溶解纤维蛋白，达到溶栓作用，纳豆激酶在治疗血栓疾病上具有广阔的研究及应用前景。因此，纳豆激酶是一种新型溶栓药物。目前，纳豆激酶的发酵工艺一般分为两种，分别为固态发酵和液态发酵。固态发酵与液态发酵相比，更易出现易染菌、味道难闻、回收率低、纳豆激酶酶活较低、操作难等问题。液体发酵成本低、污染少、产酶量高、易操作等优势。目前，用于高产纳豆激酶工程菌有大肠杆菌、乳酸菌及酵母菌等，这些工程菌并不能直接用于生产使用中，而本发明中的菌株能够自身分泌并高产纳豆激酶，同时，使用豆制品生产过程中的废水和柑橘深加工中的废水作为主要生产原料，既利用了废弃物中的碳氮含量，又避免了液态发酵中副产物嘌呤物质等，同时节约了成本，改善了环境污染。
因此，本发明主要采用液态发酵的方式，将粗原料——豆制品加工废水和柑橘深加工过程中的废水作为发酵培养基，极大程度上降低了生产成本，一定程度上提高了纳豆激酶的酶活，同时对发酵液添加一定保护剂，采用喷雾干燥工艺从而提高纳豆激酶的酶活。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株，通过ARTP诱变筛选高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌，可以利用粗原料——豆制品加工废水与柑橘深加工废水作为发酵基质，既能改善环境，又能提高经济效益。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种纳豆激酶的生产菌株，菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225，已于2022年5月 9 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 24848 。
所述菌株是通过如下方法筛选得到的：从市面上买来的纳豆激酶类的产品中进行初筛分离出枯草芽孢杆菌，使用基础培养基进行纯化与培养，37℃培养24h，同时测定生物量和纳豆激酶量，获得一株较高的产量的枯草芽孢杆菌，将其命名为perfect-1，作为出发菌株。基础培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L（固态培养基使用）。
将出发菌株perfect-1接种于基础培养基中培养后，将培养完成的液态培养基按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行稀释，量取菌液0.1mL均匀涂布于无菌的空平板上，待平板风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为（90、135、180、225、270）×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1 mL 无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，37 ℃倒置培养1 d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌落生长速度快且纳豆激酶分泌率最高的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-20225。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-20225的培养条件为：
枯草芽孢杆菌菌种采用好氧培养的方式，用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、柑橘深加工过程产生的废水等材料；用于培养该菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣、豆制品加工废水等材料。该菌株生长的最佳温度范围为20-40℃，pH范围5-9，最佳pH范围为6-8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、氯化铁等无机盐类。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20224的生理形态特征为：
枯草芽胞杆菌KC-20225，在基础培养基上生长旺盛，明显观察到单菌落着色比较均匀，芽孢呈椭圆形且菌体不膨大，有鞭毛，颜色呈现为乳白色。菌落的表面呈现粗糙不透明，且污白色。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225在液体发酵生产纳豆激酶中的应用。包括如下步骤：
1）种子培养：从活化的平板上取一环菌接入液体种子培养基中，20-40℃培养10～20 h；
2）取步骤1）的种子液接入液体培养基中进行发酵培养，接种量为2%~8%，培养温度为20℃~40℃，液体发酵。
步骤1）中所述液体种子培养基包括如下质量百分比的组分：碳源10～30g/L，氮源15～30g/L，无机盐0～5g/L，其余为水，pH5.5～8.0。其中所述碳源选自是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、柑橘深加工过程产生的废水等材料；用于培养该菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣、豆制品加工废水等材料。该菌株生长的最佳温度范围为20-40℃，pH范围5-9，最佳pH范围为6-8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、氯化铁等无机盐类。
发酵培养基为添加有无机盐的废水培养基，所述的废水为柑橘深加工过程中产生的废水和豆制品加工废水；无机盐0～10 g/L。
所述柑橘深加工过程中产生的废水和豆制品加工废水按体积比（20%~80%）：（80%~20%）混合。
最优选的生产方式为：将菌株活化后，在37℃下好氧发酵在20～40℃下好氧发酵12-24h，装液量为80ml发酵液，转速为300rpm。
其中，所述的好氧发酵培养基为：K2HPO4•3H2O 1.2 g/L，KH2PO4 1.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.56 g/L，CaCl2 0.44g/L，豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水替代水，各占比例比为（20%~80%）：（80%~20%），pH=7.4。
优选地，将发酵液中添加20%~30%的麦芽糊精和菊粉进行喷干，喷干条件为：进风温度240~280℃、出风温度80℃~140℃。
麦芽糊精和菊粉质量比2:1。
纳豆激酶菌剂的活菌数（CFU/g）≥1*109 CFU/g，纳豆激酶的酶活（IU/g）≥25000IU/g。
所述豆制品加工废水：黄豆清洗及豆腐、豆干等生产后的黄浆水，氮含量1g/L~10g/L。
所述柑橘深加工过程中产生的废水：柑橘原料、洗果、剥皮分瓣和去经络、酸软化处理、碱脱囊衣处理、囊胞分离(分离囊胞和囊衣碎片以及种子)、漂洗等废水主要来源于加工中洗果、酸软化处理、碱脱囊衣处理、漂洗工序。其中含有柑橘的囊衣、经络、果胶、有机酸、糖类等污染物，碳含量为1g/L~10g/L。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：
1、与其他菌种相比，本发明的枯草芽孢杆菌具有很高的产酶能力，在本发明的发酵条件下产酶高，同时发酵周期明显的缩短，从原来的发酵时长36小时缩短了18小时，发酵生产纳豆激酶活性高。
2、与传统的液体发酵法相比，该菌株发酵并没有使用常规的培养基——碳源与氮源，而是将废弃资源巧妙利用，可利用豆制品加工废水与柑橘深加工过程中的废水作为碳氮源，既能降低了成本，又能降低废弃物的排放，减少环境的污染。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水：豆制品废水主要来源于黄浆水、泡豆水；柑橘深加工过程中产生的废水主要来源于果品加工中果皮软化及酸、碱处理过程，其中含有柑橘的囊衣、经络、果胶、有机酸、糖类等污染物，是一种难处理的食品加工废水。
实施例1 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)KC-20225的诱变筛选
从市面上买来的纳豆激酶类的产品中进行初筛分离出枯草芽孢杆菌，使用基础培养基进行纯化与培养，37℃培养24 h，同时测定生物量和纳豆激酶量，获得一株较高的产量的枯草芽孢杆菌，将其命名为perfect-1，作为出发菌株。基础培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L（固态培养基使用）。
将出发菌株perfect-1接种于基础培养基中培养后，将培养完成的液态培养基按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行稀释，量取菌液0.1 mL均匀涂布于无菌的空平板上，待平板风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为（90、135、180、225、270）×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15 keV。辐照结束后用1 mL 无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，37 ℃倒置培养1 d，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出菌落生长速度快且纳豆激酶分泌率最高的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225。
实施例2 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-20225的培养及生理学特征
枯草芽孢杆菌菌种采用好氧培养的方式，用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、柑橘深加工过程产生的废水等材料；用于培养该菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣、豆制品加工废水等材料。该菌株生长的最佳温度范围为20-40℃，pH范围5-9，最佳pH范围为6-8。在菌株培养过程中还可添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、氯化铁等无机盐类。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225的生理形态特征为：
枯草芽胞杆菌，在基础培养基上生长旺盛，明显观察到单菌落着色比较均匀，芽孢呈椭圆形且菌体不膨大，有鞭毛，颜色呈现为乳白色。菌落的表面呈现粗糙不透明，且污白色。
实施例3 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225利用不同培养基发酵产纳豆激酶
平板培养基：胰蛋白胨 12 g/L，酵母膏 7.5 g/L，NacL12 g/L，琼脂 20 g/L，pH自然。
本发明①常规发酵培养基：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨20g/L，K2HPO4•3H2O 1.2 g/L，KH2PO4 1.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.56 g/L，Cacl2 0.34g/L，水补充，pH=7.4，500mL三角瓶装液量80mL，115℃灭菌20分钟。
②发酵培养基：K2HPO4•3H2O 1.2 g/L，KH2PO4 1.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.56 g/L，Cacl2 0.34g/L，豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水替代水，各占比例为50%，pH=7.4。500mL三角瓶装液量80mL，115℃灭菌20分钟。豆制品加工废水与柑橘深加工过程中产生的废水购买自长沙豆制品加工厂和柑橘罐生产加工厂。
③发酵培养基：K2HPO4•3H2O 1.2 g/L，KH2PO4 1.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.56 g/L，Cacl2 0.34g/L，豆制品加工废水产生的废水替代水，pH=7.4。
④发酵培养基：K2HPO4•3H2O 1.2 g/L，KH2PO4 1.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.56 g/L，Cacl2 0.34g/L，柑橘深加工过程中产生的废水替代水，pH=7.4。
将CGMCC No .24848菌首先于37℃平板活化菌种，12 h后接两环生长良好的菌体入80 mL发酵培养基，37℃，200 rpm培养12 h，然后按照5%( v/v )接种量分别接种于不同的培养基，转接入装液量为80ml发酵液（500ml三角瓶），37℃培养，转速为200 rpm。发酵10h后CGMCCNo .24848的发酵液产纳豆激酶为6200 IU/mL，较常规培养基①相比，在培养基②发酵下纳豆激酶产量提高了2.58倍，活菌数提高了3.82倍；在培养基③发酵下纳豆激酶酶活提高1.63被，活菌数提升2.64倍；在培养基发酵下，纳豆激酶酶活提高了1.46倍，活菌数提升了1.82倍。
表1 不同培养基条件下产物对比表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-20225在不同发酵条件下生产纳豆激酶
好氧发酵培养基：豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水完全替代水，K2HPO4•3H2O 1.5 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L，Cacl2 0.25g/L，其余为水，pH=7.4，7 L发酵罐装液量4 L，115℃灭菌20分钟。
将初始菌株CGMCC No .24848首先于37℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入80mL发酵培养基，37℃，300 rpm培养11 h，然后按照5%( v/v )接种量转接入4L发酵培养基，通空气1.1 vvm，转速300 rpm，37℃培养。发酵11 h后CGMCC No .24848的发酵产酶为12500 IU/mL，活菌数8.9*109CFU/mL。
表2 不同温度条件下产物对比表
温度℃ 酶活IU/mL 活菌数CFU/mL
20 0 2.1*104
25 0 3.6*105
30 1300 6.9*108
37 12500 8.9*109
40 500 1.2*108
表3 不同接种量条件下产物对比表
接种量%（V/V） 酶活IU/mL 活菌数CFU/mL
1 4500 3.1*109
3 8500 6.6*109
5 11000 9.1*109
7 8200 5.9*109
9 6800 4.3*109
表4 不同转速条件下产物对比表
转速rpm 酶活IU/mL 活菌数CFU/mL
150 2000 1.0*109
200 6100 4.1*109
250 9050 7.1*109
300 11200 9.1*109
350 5600 3.9*109
实施例5 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225发酵后进行喷雾干燥
发酵培养基：豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水完全替代水，其中，两种废水比例为1:1，K2HPO4•3H2O 1.5 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4•7H2O 0.45g/L，CaCl2 0.25g/L，其余为水，pH=7.4，7 L发酵罐装液量4 L，115℃灭菌20分钟。
将初始菌株CGMCC No .24848 菌首先于37℃平板活化菌种，12 h后接两环生长良好的菌体入80 种子培养基，37℃，300 rpm培养11 h，然后按照5%( v/v )接种量转接入4 L发酵培养基，通空气1 vvm，转速300 rpm，37℃培养。发酵11 h完成后添加25%的麦芽糊精与菊粉（质量比2:1），进行喷雾干燥（喷干条件：进风温度280℃、出风温度95℃、雾化频率85Hz），测定纳豆激酶酶活为27500 IU/g、菌落数≥1*109 CFU/g。
纳豆激酶的检测方法：试剂及溶液配制：磷酸盐缓冲液（pH=7.8）磷酸氢二钠0.895g加水溶解并稀释至250 mL作为溶液A；称取磷酸二氢钠0.789 g加水溶解至125 mL作为溶液B，将A和B两者相互混合，使其pH=7.8；0.9%氯化钠溶液的配制：称取氯化钠3.6 g加水溶解至400 mL；工作液的配制:将A+B混合液与0.9%氯化钠溶液按照1:17进行混合；1.5%琼脂糖溶液：称取琼脂糖1.5g溶解于100 mL工作液高温灭菌放于60℃烘箱中；纤维蛋白原溶液的配制：取纤维蛋白原103 mg加工作液68.67 mL进行溶解制成1.5 mg/mL可凝蛋白溶液；凝血酶溶液的配制：将160 bp凝血酶溶于20mL0.9%氯化钠溶液制成浓度为8 bp/mL凝血酶溶液，分装20支，保藏于-20℃冰箱，每次使用时取出一支稀释8 mL，浓度为1bp/mL凝血酶溶液。琼脂糖-纤维蛋白原平板的制备：将配置好纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液放入水浴锅预热,迅速取琼脂糖溶液，加入预热好的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，迅速混合，放置室温1h待凝固后进行打孔。
样品的检测：用移液枪准确量取标品及样品各15 µL，分别点在同一平皿中，加盖，放入37℃恒温培养14~16 h。
枯草芽孢杆菌菌落计数：取9 mL0.9%氯化钠溶液放入到8支干净摇管中。利用1mL的移液枪吸取1mL的发酵液放入到装有9mL液体的干净摇管中，标记为10-1。将其充分混匀后，再从10-1溶液中吸取1mL液体加入到装有下一支装有9mL液体的干净摇管中，标记为10-2。依次上述操作，一直完成到10-8。将标记为10-8的摇管中，吸取0.1mL的稀释液放入配制完成的LB固体平板上，用涂布棒顺时针向中心涂布。做3组平行试验。将其放入37℃培养箱正放培养1h，将其倒置继续培养24~48 h。观察并且记录菌落生长情况，对其进行菌落计数。

Claims (10)

1.一株能利用废水发酵生产纳豆激酶的菌株，所述菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KC-20225，已于2022年5月 9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO. 24848 。
2.权利要求1所述菌株在发酵生产纳豆激酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌KC-20225活化，在25～40℃下好氧发酵10～20 h；
其中，好氧发酵培养基为添加有无机盐的废水培养基。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的废水为柑橘深加工过程中产生的废水和豆制品加工废水。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述柑橘深加工过程中产生的废水和豆制品加工废水按体积比（20%~80%）：（80%~20%）混合。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的无机盐为镁盐、钾盐、钙盐、磷酸盐中的任意一种或几种的组合。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的无机盐含量为1～10 g/L。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌KC-20225活化后，在37℃下好氧发酵12 h，在发酵过程中通气比0.8 vvm、搅拌300 rpm，其中，所述的好氧发酵培养基为：K2HPO4•3H2O 1.2 g/L，KH2PO4 1.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.56 g/L，CaCl2 0.34g/L，豆制品加工废水和柑橘深加工过程中产生的废水替代水，各占比例为50%，pH=7.4。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将发酵液中添加20%~30%的麦芽糊精和菊粉进行喷干，喷干条件为：进风温度240~280℃、出风温度80℃~140℃。
10.根据权利要求/9所述的应用，其特征在于，纳豆激酶菌剂的活菌数≥1*109 CFU/g和纳豆激酶的酶活≥25000 IU/g。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Comparative genomic analyses of Bacillus subtilis strains to study the biochemical and molecular attributes of nattokinases;Rohit Kapoor等;Biotechnol Lett;第44卷;485-502 *
枯草芽孢杆菌筛选及其产纳豆激酶 的液态发酵条件优化;周雪琴等;食品工业科技;第43卷(第7期);163-169 *

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