CN101525631A - 一种菌体提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及泰乐菌渣及维生素B12废水的综合利用领域，提供了一种以泰乐菌渣和维生素B12废水为原料，经微生物发酵处理后，分离提取菌丝体内原生质物质制备成菌体提取物并将该菌体提取物应用于生物培养基中。本发明开辟了泰乐菌渣及维生素B12废水利用的新途径，为泰乐菌素和维生素B12发酵工业实现清洁生产这一可持续发展目标提供可能。更重要的是，解决了泰乐菌渣及维生素废水对环境的污染和对人类健康的危害问题。

Description

一种菌体提取物及其制备方法

技术领域：

本发明涉及抗生素发酵工业废渣、废水的治理和综合利用技术领域，具体涉及泰乐菌渣及维生素B12废水的环保处理及综合利用领域。具体地说，是提供了一种以泰乐菌渣和维生素B12废水为原料，经微生物发酵处理后，制备成菌体提取物；该菌体提取物可以作为生物培养基中的氮源及生长因子，应用于生物发酵工业。

背景技术：

泰乐菌素是链霉菌等产生菌液体深层发酵的代谢产物，在液体深层发酵生产过程中，产生菌不仅合成人们所需的目的产物泰乐菌素，同时产生大量的菌丝体，发酵液经处理及固液分离后，所得固相即为菌丝体和尚未利用完的培养基物质，该物质称为泰乐菌素发酵菌渣，简称泰乐菌渣。泰乐菌渣内含有丰富的蛋白质及维生素，是丰富的蛋白质资源。过去有的厂家将其干燥作为饲料蛋白，但是，由于其中有一定量的泰乐菌素残留，简称“药残”，作为饲料蛋白摄入动物体内后，会形成“抗肉”、“抗蛋”产品，造成对人类的直接危害。当然，也有将其干燥后作为农肥施用的，但是药残不解决，将直接破坏土壤微生态平衡，诱发耐药菌株的产生。尤其是该菌渣内含有较多的油脂，干燥处理时常常会起火燃烧，造成处理的难度，如果将其直接排放，将造成严重的环境污染和资源浪费。到目前为止，国际国内关于这方面的研究成果还未见报道。本发明在对泰乐菌渣进行生物治理过程中发现，维生素B12废水有助于微生物发酵作用，该废渣和废水同时治理，综合利用可收到事半功倍的效益。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种泰乐菌渣作为菌体提取物的新用途；同时提供一种菌体提取物产品及其该产品制备方法和应用；本发明的目的还在于综合治理和利用泰乐菌渣和维生素B12废水。

本发明的目的是按以下技术方案实现的：

一种将泰乐菌渣作成菌体提取物的用途。该用途是通过以下方法实现的：

以泰乐菌渣为原料，配合以维生素B12废水，通过接种酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌进行发酵后，发酵液经过固液分离、浓缩或干燥等过程制备成为膏状或粉状菌体提取物。

一种菌体提取物，该菌体提取物是以泰乐菌渣为原料，添加该菌渣重量0.5-8倍的维生素B12废水，通过接种酿酒母菌、乳杆菌属、芽胞杆菌进行发酵，发酵液经过固液分离，所得液相经浓缩制成膏状菌体提取物或经干燥过程制成粉状菌体提取物。

以上菌体提取物的具体制备步骤如下：

2、菌种制备：本发明使用的菌种是乳酸菌、酵母菌和芽胞杆菌，其中优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，乳杆菌属(Lactobacillus)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣形芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。以上菌种均来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，各菌种在泰乐菌渣发酵过程中单独使用或几种复合使用。

种子液的制备：培养基：碳源0.1-10％、有机氮源0.1-3％、磷酸氢二钾0.01-1％、硫酸铵0.1-2％、硫酸镁0.01-0.5％、碳酸钙0.01-0.5％、氯化钠0.01-0.5％，消毒降温后等比例接入经活化的酵母菌和乳酸菌或酵母菌和乳酸菌和芽孢杆菌，控制温度25-37℃，通气搅拌或间歇通气搅拌，培养24-72小时，制得种子液；

2、发酵：将泰乐菌渣投入发酵装置内，按菌渣重量的0.5-8倍加入维生素B12废水，不加或加入0.5-5％的碳源，接入发酵体积2-20％的种子液，搅拌均匀，控制温度25-37℃，在培养过程中，通气搅拌或间歇通气搅拌，培养24-72小时，得成熟泰乐菌渣发酵液；

3、分离提取：将培养成熟的发酵液进行固液分离，所得液相真空浓缩制成膏状菌体提取物；该膏状菌体提取物成品为黄褐色膏状物，总氮6-8％，水分20-40％；或将液相浓缩一定体积后喷雾干燥制成粉状菌体提取物；该粉状菌体抽提物成品为棕黄色粉状物，总氮7-10％，水分3-10％。

上述技术方案中所述的碳源主要选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、红糖、糊精、淀粉等；所述的氮源选自蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、各种蛋白粉、豆饼分、花生饼粉，铵盐、硝酸盐等。

本发明具有以下积极效果：

1、本发明首先找到了泰乐菌渣的合理用途，更重要的是解决了该菌渣对环境的污染问题，对环境保护、人类健康具有极其重大的意义。

2、本发明在进行泰乐菌渣发酵处理的同时也对维生素B12废水进行了综合利用，一举两得，同时解决了废渣和废水的污染和利用问题。

3、本发明从泰乐菌渣中提取复合氨基酸、维生素等原生质物质制备成菌体提取物，由于其原材料来自工业废渣和工业废水，所以，成本低廉，经济效益可观，可降低泰乐菌素生产的综合成本，提升企业的竞争力。

4、本发明利用的泰乐菌渣发酵过程消耗掉了菌渣内大量的油脂，在制备菌体提取物时，由于抽提掉了大量的原生质物质降低了菌渣内不易干燥物质的含量，所以发酵处理后的泰乐菌渣极容易干燥，解决了泰乐菌渣不易干燥且干燥过程易起火的问题。

具体实施方式：

实施例：

制造实施例1：处理1000千克泰乐菌渣，制备菌体提取物：

1、菌种制备：菌种选用酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae Meyenex Hansen)CGMCC AS 2.121，发酵乳杆菌(L.fermentum)AS 1.122，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC AS 1.895，三种菌复合培养；

种子液的制备：培养基为：红糖50克、蛋白胨15克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、硫酸铵10克、碳酸钙0.3克、氯化钠5克，以维生素B12废水定容至1000毫升，115℃灭菌20分钟；降温后接入经过两次以上活化过的酿酒酵母、发酵乳杆菌、蜡状芽孢杆菌，控制温度34±1℃间歇通气搅拌，培养36小时，制得一级复合种子液；用同样方法制备二级复合种子液100L。

2、发酵：将1000千克泰乐菌渣投入发酵装置内，加入维生素B12废水3000千克，接入二级复合种子液，搅拌均匀，控制温度34±1℃，在培养过程中，间歇通气搅拌，培养48小时，发酵终止；

3、分离提取：将培养成熟的发酵液进行离心分离，收集滤液，将滤液于60-90℃真空浓缩至粘稠膏状制成膏状菌体提取物，其总氮：7.5％，水分：30％。离心分离的固相干燥后用做饲料或农肥。

制造实施例2：处理1000千克泰乐菌渣制备粉状菌体提取物

1、菌种制备：菌种选用酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae Meyenex Hansen)CGMCC AS 2.610，德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.adlbrueckiisubsp bulgaricus)CGMCC AS 1.1482，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC AS 1.140；

(1)、乳酸菌的培养：

一级种子：培养基：葡萄糖10克、酵母膏5克、氯化钠1克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克、硫酸铵1克、碳酸钙0.1克，以水定容至1000毫升，115℃灭菌10分钟；降温后接入经活化的德氏乳杆菌，控制温度36±1℃培养48小时；

二级种子：培养基为：葡萄糖1000克、酵母膏250克、氯化钠100克、磷酸氢二钾10克、硫酸镁10克、硫酸铵100克、碳酸钙10克，以维生素B12废水定容至50升，100℃灭菌20分钟；降温后接入一级种子液1000毫升，控制温度36±1℃培养36小时，既得二级种子液；

(2)、枯草芽孢杆菌种子液的制备：

一级种子：称取蛋白胨10克、酵母膏3克、氯化钠5克，定容1000毫升，115℃灭菌20分钟，降温后接入活化的菌种，温度36±1℃，通气培养20小时即得枯草杆菌一级种子。

二级种子：称取蛋白胨300克、酵母膏90克、氯化钠100克，定容30升，115℃灭菌20分钟，降温后接入一级种子，于36±1℃通气搅拌培养，培养20小时即得枯草杆菌二级种子液；

(3)酵母种子的制备：

一级种子：取12Brix的麦芽汁3L，100℃灭菌15分钟，降温后，接入活化的酵母菌菌种，于30-32℃通气培养20小时，得一级种子液；

二级种子：制备方法同一级种子，体积为100L。

2、发酵：将1000千克泰乐菌渣投入发酵装置内，加入维生素B12废水4000千克，接入上述各二级种子液，搅拌均匀，控制温度36±1℃，在培养过程中，间歇通气搅拌，培养70小时，发酵终止；

3、分离提取：将培养成熟的发酵液进行离心分离，液相用氢氧化钠溶液调PH值6.5-7.5之间，再进行离心分离，收集滤液，将滤液于60-90℃真空浓缩至一半体积后喷雾干燥制得粉状泰乐菌体提取物，其总氮：7.98％，水分：5.2％。离心分离的固相物热风干燥后用做饲料或农肥。

制造实施例3：处理1000千克泰乐菌渣制备粉状菌体提取物

1、菌种制备：酵母菌选用酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae Meyenex Hansen)CGMCC AS 2.121，地衣形芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC AS 1.932；

一级种子的制备：其培养基为：糖蜜50克、牛肉膏5克、氯化钠2.5克、磷酸氢二钾5克、硫酸镁2克、硫酸铵10克、碳酸钙0.5克，以水定容至1000毫升，100℃灭菌10分钟；降温后接入活化的酿酒酵母和芽孢杆菌，控制温度30±1℃培养72小时，既得一级复合种子液；

二级种子的制备：其培养基为：糖蜜10千克、牛肉膏1千克、氯化钠500克、磷酸氢二钾1千克、硫酸镁400克、硫酸铵2千克、碳酸钙100克，以维生素B12废水定容至200升，100℃灭菌10分钟；降温后接入一级复合种子液1000毫升，控制温度30±1℃通气搅拌培养72小时，制得二级复合种子液；

2、发酵：将1000千克泰乐菌素发酵滤渣投入发酵装置内，加入1000千克维生素B12废水，接入上述二级复合种子液，搅拌均匀，控制温度30±1℃培养，在培养过程中，间歇通气搅拌，培养72小时发酵终止；

3、分离提取：将培养成熟的发酵液进行离心分离，收集液相用石灰水调PH值6.5-7.0，再进行离心分离，收集滤液，将滤液喷雾干燥，制成粉状菌体提取物，其总氮：7.6％，水分：6.5％；将离心分离的固相物烘干用做饲料或农肥。

制造实施例4：处理1000千克泰乐菌渣制备膏状菌体提取物

1、菌种制备：菌种选用酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae Meyenex Hansen)CGMCC AS 2.610，

一级种子：取12Brix的麦芽汁3L，100℃灭菌15分钟，降温后，接入活化的酵母菌菌种，于30±1℃通气培养20小时，得一级种子液；

二级种子：制备方法同一级种子，体积为1000L。

2、发酵：将1000千克泰乐菌渣投入发酵装置内，加入维生素B12废水4000千克，接入1000L酵母菌二级种子液，搅拌均匀，控制温度30±1℃，在培养过程中，通气搅拌，培养60小时发酵终止；

3、分离提取：将培养成熟的发酵液进行离心分离，收集滤液，将滤液于60-90℃真空浓缩至粘稠膏状制成膏状菌体提取物，其总氮：7.5％，水分：28％；离心分离的固相用做饲料或农肥。

需要说明的是，在制造实施例中，酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌各菌种之间的组合是随机的，各菌种所用的培养基成分含量也是随机的，并非仅限于实施例1-4的模式。

应用实施例1：菌体抽提物在阿维菌素摇瓶发酵试验中的应用：

将本发明制备的膏状菌体提取物作为阿维菌素发酵培养基的有机氮成分，其操作过程为：制备培养基：取淀粉7％、豆饼粉0.8％、本发明的菌体提取物0.3％(对照组用等量常规酵母膏)、酵母粉0.4％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.05％、碳酸钙0.002％、以水补足至100％，调PH 7.0-7.2，三角瓶分装，装量为100ml/500ml，121℃灭菌30分钟；接种和培养：接种量为1％，种后将三角瓶放于摇瓶机上，转速180rpm，温度28±1℃培养9天下摇瓶，以高效液相色谱仪测定化学效价。经过5次平行试验，每次试验设计实验组和对照组各10瓶，试验结果为10瓶平均数，结果，以本发明的菌体提取物替换常规酵母膏使用，化学效价有所提高。见表1

表1

实验组序号	1	2	3	4	5
						实验组效价ug/ml	2060	2285	2100	2260	2219
对照组效价ug/ml	1068	2120	2098	2138	2198

应用实施例2：菌体提取物在土霉素摇瓶发酵试验中的应用效果如下：

将本发明制备的粉状菌体提取物作为土霉素发酵培养基的有机氮成分，其操作过程为：制备培养基：取淀粉10％、糊精5％、豆饼粉2％、本发明的菌体体抽提物0.25％(对照组用等量常规酵母粉)、硫酸铵1.2％、磷酸氢二钾0.015％、碳酸钙1.2％、氯化钠0.4％、以水补足至100％，三角瓶分装，装量40ml/500ml，每瓶加1毫升豆油，121℃灭菌30分钟；

接种和培养：接种量为每瓶5毫升，种后将三角瓶放于摇瓶机上，转速200-220rmp，温度30±1℃培养8天下摇瓶，以581型分光光度计测定化学效价。经过5次平行试验，每次试验设计实验组和对照组各10瓶，试验结果为10瓶平均数，结果，以本发明的菌体提取物替换常规酵母粉使用，化学效价有所提高。见表2：

表2

实验组序号	1	2	3	4	5
						实验组效价ug/ml	31060	32450	34463	30580	31860
对照组效价ug/ml	29300	31580	34516	30456	31580

Claims (6)

1、一种泰乐菌渣的用途，其特征在于将泰乐菌渣制备成菌体提取物。

2、一种菌体提取物，其特征在于：该菌体提取物是以泰乐菌渣配合以维生素B12废水为原料，通过接种酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌进行发酵后，发酵液经过固液分离、液相经浓缩或干燥过程制备而成的膏状物或粉状物。

3、根据权利要求2所述的菌体提取物，其特征在于：该菌体提取物是以泰乐菌渣并添加0.5-8倍的维生素B12废水为原料，通过接种选自由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，乳酸菌的乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣形芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)组成的组中的一种或几种菌种，进行发酵，发酵液经过固液分离，液相经浓缩或干燥过程制成的膏状提取物或粉状提取物。

4、制备权利要求1或2或3所述的菌体提取物的方法，该方法的步骤如下：

菌种制备：培养基为：碳源0.1-10％、有机氮源0.1-3％、磷酸氢二钾0.01-1％、硫酸铵0.1-2％、硫酸镁0.01-0.5％、碳酸钙0.01-0.5％、氯化钠0.01-0.5％，灭菌；降温后接入酵母菌或酵母菌和乳酸菌或酵母菌和乳酸菌和芽孢杆菌，控制温度25-37℃，间歇通气搅拌，培养24-72小时，制得种子液；

发酵：将泰乐菌渣投入发酵装置内，按菌渣重量的0.5-8倍加入维生素B12废水，不加或加入0.5％-5％的碳源，接入发酵体积2-20％的种子液，控制温度25-37℃，在培养过程中，通气搅拌或间歇通气搅拌，培养24-72小时，得成熟泰乐菌渣发酵液；

分离提取：将成熟的发酵液进行固液分离，所得液相真空浓缩制成膏状菌体提取物；或将液相浓缩后干燥，制成粉状菌体提取物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的碳源主要选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、红糖、糊精、淀粉等；所述的氮源选自蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、各种蛋白粉、豆饼分、花生饼粉。

6.权利要求1或2或3或4所述的菌体提取物在生物培养基中的应用。