KR940004542B1 - 효소의 고정화방법, 구체적으로는 세포결합효소를 세포군입자로 전환시키는 방법 - Google Patents

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Description

효소의 고정화방법, 구체적으로는 세포결합효소를 세포군입자로 전환시키는 방법.

본 발명은 효소를 고정화(immobilizing)시키기 위한 방법에 관한 것인데, 구체적으로는 세포결합효소를 세포군(cell mass)효소입자로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

고정화 효소생성물, 특히 컬럼에 사용하고자 하는 고정화 효소생성물은 이날 현재 급속히 성장하는 분야가 되었다. 훨씬 저가이고, 더 양호한 물리적 강도, 더 높은 단위활성, 그리고 마모에 대한 높은 입자강도뿐만아니라 컬럼조작의 동안에 최소의 압력강하를 일으키는 입도 및 형태의 고정화 효소생성물을 생산하려는 연구 노력이 행해져 왔다.

이날 현재, 본분야 연구자들은 효소를 고정화시키기 위한 상당수의 꽤 만족스러운 방법들을 유용하게 하였다.

본 발명은 특히 세포 결합된 미생물 효소의 미생물 세포군으로부터 만든 입자형태 고정화 효소로의 전환에 관한 것이다. 이후에 제공된 효소 고정화에 대한 논의는 이 형태의 고정화 효소생성물의 배경에 포함된다.

대체로, 고정화 과정에서 중요치 않은 결점으로 오래 생각되어온, 최적하지 않은 입도분포, 입자형태에 대한 조절의 결핍 및 비교적 낮은 생성물 수율의 비용요인과 같은 생성물 및 방법부족은 본분야가 진보됨에 따라 주 결점이 되는데 이것은 제거되어야 한다.

예를 들면, 글루타르알데히드는 아모쯔(Amotz 미국 특허 제3,980,521호)의 가르침에 따라 세포 결합된 효소들을 가교결합시키기 위한 통상의 실시에 사용되어 왔다. 적어도 단지 -NH₂및 -SH기와 반응하는 세포결합효소에 대해 아직도, 글루타르알데히드는 이상적인 가교제는 아니다.

폴리아제티딘 전중합제(prepolymer)는 가교결합의 목적을 위해 유리하게 사용될 수 있으며, 이러한 것은 우드(Wood et al. 미국 특허 제4,436,813호 그리고 "신규한 고정화방법 및 아스파르트산 제조예의 그의 용도 "Wood et al., Bio/Technology, December 1984, pp. 1081-1084)에 의해 제안되어 있다.

이 특허 및 논문을 여기에 참고로 포함시킨다.

폴리아제티딘 전중합체 가교결합시스템은 가교결합반응이 폴리아제티딘 전중합체와 -NH₂및 -SH기뿐 아닌 -COOH 및 -OH기 사이에서 일어나기 때문에 글루타르알데히드 보다 세포결합효소의 고정화에 더 널리 적용가능하다.

본 발명의 실행이 관련되는 경우들은 원하는 효소형태가 미생물세포 및 세포물질로부터 만든 입자들과 가교결합시약, 그리고 임의적으로 보조가교제, 예를 들면, 단백질 및/또는 응집제, 예를 들면 고분자 전해질, 및/또는 미세분할된 충전제물질로 구성될때의 경우들이다. 이러한 효소생성물 형태는 여기에서 세포군 입자 및/또는 세포군 입상 형태로서 여러가지로 칭한다.

부언하면, 위에 참조한 우드의 특허 및 논문의 방법은 담체 입자상에 효소학적활성 미생물 세포 및 세포 물질을 고정화시키는 것에 주로 관계됨을 주목하게 된다.

본 발명자는 세포군 입자형태 효소생성물을 발생시키기 위한 폴리아제티딘 전중합체 가교결합을 사용하기위한 노력으로 과정에 대한 물질 결핍의 존재를 증명하였다.

반응혼합물은 용액중의 폴리아제티딘 전중합체의 수성 분산액과 어떠한 세포물질의 존재와 함께 개개의 미생물세포로 구성되어 있는데, 일괄하여 숙성반응의 수행을 필요로 한다.

반응생성물을 으깨고 체에 거름으로써 원하는 입도부분이 회수될 수 있으나, 원하는 입도부분의 전체 수율은 보통 낮으며 또한 개개의 입자형태로 조절되지 않는다.

따라서, 세포군 조성물을 가교결합시키는 것은 입자형태 및 입도가 조절되지 않은 고정화 효소생성물을 일으킨다.

본 발명의 목적은 높은 수율로 높은 물리적 강도의 입자로, 따라서 또한 입자의 형태와 입도가 조절될 수 있는 효소생성물을 고정화시킨 입자형태 세포군의 제조방법을 제공하는 것이다.

간단히는, 본 발명 방법은 글루타르알데히드를 가진 수성 현탁액에서 효소학적 활성 미생물 세포를 부분적으로 가교결합시키고 이어서 수분 제거시킨 다음 결과된 반죽상의 끈기있는 세포군을 폴리아제티딘 전중합체와 혼합시키는 것으로 이루어진다. 혼합물은 입자형태화에 적합한 밀도(consistency)를 나타낸다. 그다음, 원하는 형태 및 입도의 입자를 혼합물로부터 형성하고 이어서 건조시킨다. 폴리아제티딘 전중합체의 숙성이 건조단계의 동안에 일어난다.

충전된 베드에 사용된 본 발명에 따라 제조된 고정화 효소생성물을 매우 작은 압력강하(예를 들면, 비교되는 종래 기술 제품의 단지 50% 부근인 압력강화)와 높은 물리적강도 및 내마모성을 나타내고 더우기, 높은 입자수율로 인하여 제조가가 비교적 저가이다.

또한 발명에 따라 제조된 바람직한 구체예의 고정화 효소생성물은 높은 부피활성을 나타낸다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

효소를 재사용가능 조성물에 가교결합시키기 위한 세포물질과 폴리아제티딘 전중합체 사이의 가교결합반응은 위에 참조한 특허 제4,436,813과 우드(Wood et al.)의 논문에서 가르치는 대로이며 여기서 상세히 논의할 필요는 없다.

아래에 묘사한 바와 같은 대표적인 수용액중의 폴리아제티딘 전중합체, 예를 들면 Polycup

172(Hercules, Inc.)

(여기서 R은 전형적으로(CH₂)₄이다)는 열, H₂O 제거 또는 알칼리성 pH 값으로의 pH 조절에 의해 가교결합된다.

숙성반응의 어떤것은 전중합체의 효소학적활성 미생물 세포상의 또는 그것으로부터의 세포물질의 유용한 -NH₂, -OH₂,-SH₂,-COOH기와의 반응이다.

세포군이 숙성에 앞서 개개의 입자로 세분되지 않는다면 가교결합된 세포군 생성물은 한덩어리의 물질 즉, 다음에 원하는 입자형태 효소생성물로 세분되어야 하는 점착성 세포군이 될 것이다.

이미 지적한 바와 같이, 이러한 전환은 비교적 낮은 수율의 원하는 입도 범위의 입자를 가져오고 게다가, 개개 입자의 형태는 전혀 조절되지 않는다.

폴리아제티딘 전중합체의 가교결합에 앞서 세포군을 별개의 입자로 형성시키는 것이 물론 바람직할 것이다. 불행하게도, 폴리아제티딘 전중합체와 세포군의 혼합물, 예를 들면 세포슬러지는 점착성 입자로 형성되도록 잘 적용되지 않는다.

본 발명의 개선점은 수성 폴리아제티딘 전중합체와의 완전한 혼합물로 만들고 그후 별개의 입자들로 세분시킨 페이스트로의 비생물 세포군의 전환에 관련된다. 이어서, 입자를 건조시킴에 따라 폴리아제티딘 가교 결합반응이 일어난다.

미생물 세포의 가교적 접착성의 반죽상 세포군으로의 전환은 미생물 세포의 수성분산액중의 글루타르알데히드와 부분가교결합을 수행함으로써 달성된다.

본 발명의 실행을 위한 출발물질은 배양액즙을 여과 또는 원심분리시킴을 통하여 발효기로부터 회수된 효소학적활성 세포슬러지이다. 세포슬러지는 그대로 사용될수 있고 또는 먼저 균일화 될 수 있다.

발효기는 고정화 시설에 가까운 유사성이 없을 수 있기 때문에 임의적으로 균일화된 세포슬러지를 동결상태로 저장시킬 수 있음을 주의한다.

참으로, 세포슬러지를 동결시킨다음 해동시키는 것이 오히려 전체 과정순서에서 활성을 잃는 손상보다는 유리할 수 있다.

미생물세포와 세포물질의 글루타드알데히드와의 반응을 통하여 부분적인 가교결합에 수반된 반응의 상세한 화학은 본 발명자에게 알려져 있지 않다.

참으로, 본 발명자가 깨닫고 있는 바로는 글루타르알데히드와의 가교결합에 대한 화학은 충분히 밝혀져 있지 않다(참고문헌은 Douglas J. Ford, 2. 글루타르알데히드의 단백질과의 반응, University of Cincinnati ; 그리고 Hardy, 글루타르알데히드에 의한 가교결합의 성질, Part I, JOurnal of the Chemical Society, Perkin Transactions, Vol. 1. Pg. 958, 1976이 있다.). 그러나, 본 분야는 글루타르알데히드를 미생물 세포와 반응시키는 것으로부터의 실제결과에 관계된다.

글루타르알데히드는 전술한 미국 특허 제3,980,521에서의 가르침에서 본 바와 같이 효소로부터 세포군 입자를 발생시키는 가교결합을 위한 효소분야에 제안되었다. 글루타르알데히드는 또한 미국 특허 제3,779,869에서의 가르침에서 본 바와 같이 미생물 세포상의 세포 결합된 효소를 안정화시키기 위해 제안되었다.

글루타르알데히드의 본 발명 실시예의 사용은 위에 참조한 양 특허의 가르침과 관련되나 그들과는 아주 다르다. 가교결합반응이 일어나는 것이 바람직하나 대부분 글루타르알데히드와의 반응이 개개의 미생물 세포로부터 효소의 손실을 방지하거나(3,779,869 참조) 또는 세포 및 세포단편을 점착성 공유 결합된 매트릭스로 전환시킬 수 있는(3,980,521 참조) 정확한 정도는 본 발명의 실행에 대한 문제는 아니다.

본 발명의 실행에 있어서, 글루타르알데히드의 처리목적은 다음에 수성 폴리아제티딘 전중합체와의 혼합물이 될 수 있는 반죽항 세포군에 수분 제거될 수 있고 그다음, 입자가 형성될 수 있는 점착성 밀도의 혼합물이 될 수 있는 반응생성물 혼합물의 발생이다.

입자 형성능력을 일으키는 것이 본 발명 추구의 목표이다.

세포슬러지의 글루타르알데히드로의 처리에 부수하여 -NH₂기를 포함하는 보조 가교제를 반응 혼합물에 가할 수 있는데, 예를 들면, 폴리에틸렌이민, 치토산, 알부민, 젤라틴등이다. 또한, 응집제를 가할 수 있다. 더나아가서, EDTA와 같은 금속이온착화제로 세포슬러지를 처리하는 것이 유리할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 대해 이후에 제공한 예로든 상세한 것은 다른 세포결합효소에 모든 상세한 것들에 있어서 적용 가능하게 될 것 같지 않다.

보조 가교결합제의 합임 및/또는 중합체 응집제의 합입이 적당한지, 또는 아마도 수분 제거된 부분 가교 결합된 세포군에 가공할 수 있는 밀도와 적당한 수분함량을 달성하는 것이 필요한지를 확인하기 위해 바람직한 글루타르알데히드 범위내의 절단 및 시도시험이 제안된다.

미세하게 분할된 충전제물질 및/또는 효소 안정제(예를 들면, 금속이온)은 이러한 것의 존재가 효소생성물을 고정화시킨 최후의 세포군에서 바람직할때 글루타르알데히드와의 부분적인 가교결합에 부수하는 세포군에 가장 잘 함입될 수 있음을 또한 주목하게 될 것이다.

세포슬러지에 있어서의 수분의 양과, 글루타르알데히드 및 응집제, 보조가교제, 효소안정화 이온등과 같은 부분가교 반응혼합물중의 임의의 약품으로 첨가된 것은 중대한 인자가 아님을 발견하였다.

모든 과량의 수분은 부분적으로 가교결합된 세포군으로부터 여과 또는 원심분리 제거될 것이다.

그러나, 세포슬러지 건조물질 및 글루타르알데히드의 상대적 비율은 중요하다.

발명에 따르는 방법의 바람직한 구체예들에서는 글루타르알데히드의 양은 세포슬러지 건조물질에 관하여 5%와 40%w/w사이, 바람직하게는 10%와 20%w/w 사이이다. 글루타르알데히드의 양이 5%w/w 이하이면, 부분적으로 가교결합된 세포군의 여과력은 열등할 것이며 만일 글루타르알데히드의 양이 40%w/w 이상이라면 고정화 효소생성물에 있어서 효소 회수수율이 만족스럽지 못할 것이다.

본 발명에 따르는 방법의 바람직한 구체예에서 수분 제거된 부분 가교결합 세포군은 70 내지 90%w/w, 바람직하게는 80 내지 85%w/w의 수분함량을 갖는다. 만일 수분함량이 70%w/w 이하라면 효소생성물을 고정화시킨 입자의 압력강하 특징은 만족스럽지 못할 것이며, 만일 수분함량이 90%w/w 위라면 입자형태화 단계의 성능이 만족스럽지 못할 것이다.

따라서, 수분 제거된 세포군내의 비교적 좁은 70% 내지 90% 수분함량은 본 발명의 실시에 있어서 비교적 중대하다.

본 발명의 실행자는 가장 가공성의 밀도영역을 곧 인정하게 될 것이다.

입자 형성능력은 70 내지 90% 수분함량범위의 양 말단에서 다소 불량하다. 가장 가공성의 밀도에 대한 수분함량은 효소에 따라 다양함이 주목된다.

수분제거된 부분 가교결합된 세포군에 대한 위에 제공된 수분함량범위는 첨가된 폴리아제티딘 전중합체가 10 내지 15% 고체의 수용액으로서 일 것으로 고려된다. 바람직한 범위인 80 내지 85% 수분은 실질적으로 약 12% 폴리아제티딘 전중합체 용액인것으로 가정하며 세포의 건조 중량에 관하여 가장 바람직한 폴리아제티딘 전중합체 함량이 사용될 것이다.

발명에 따른는 방법의 바람직한 구체예에서는 폴리아제티딘 전중합체는 5%와 30%w/w 사이의 양으로(건조 물질기준), 더 바람직하게는 건조물질로서 세포슬러지에 관하여 10 내지 20%w/w의 양으로 가한다.

그 양이 5%w/w 이하이면, 입자생성물에서 얻은 압력강화 감소의 개선점은 불만족스럽게 낮으며, 만일 그 양이 30%w/w 위이면 고정화 효소입자 생성물에 있어서 효소 수율이 불만족스럽게 낮다.

따라서, 특정한 세포 결합된 효소는 수율 또는 생성물 안정성을 위하여 10% 이하 또는 20% 이상의 폴리아제티딘 전중합체가 요구되어야 하며, 위의 제공된 가장 바람직한 80 내지 85% 수분함량범위의 이유와 임의의 채택은 알려지고 있지 않다.

이미 지적한 바와 같이, 최종 반응 혼합물은 입자형태화에 적합한 점착성과 밀도를 나타낸다.

바람직한 입자형성기법은 반응혼합물을 압출시킨 다음 부분적으로 건조시키고(건조는 폴리아제티딘 전중합체를 숙성시킨다) 구상화 처리하고 이어서 보충 건조시키는 것으로, 마지막 단계는 임의적이다.

대영제국 1,362,265의 실시가 이어질 것이다.

수분함량에도 불구하고 종래기술에서 고찰된 세포슬러지와 폴리아제티딘 전중합체(및 다른 성분)의 수성 혼합물은 수중 고체상으로 구성되고 세분하에, 예를 들면 압출하여 단일 세포군으로 함께 융합시킨다.

글루타르알데히드와의 부분 가교결합에 의해 집성된 효소학적 활성 미생물 세포 및 세포물질의 수성 매트릭스는 명백히 어떤 종류의 고체내 수분상 플러스물인것으로 시작했다. 후자는 여과에 의해 제거된다.

수분함량과 폴리아제티딘 전중합에 비율은 최종 혼합물에서 상기한 한계내로 유지되고, 본 발명의 실행에 따라 만든(반죽상 세포군)매트릭스는 매트릭스로하여금 세분되도록, 예를 들면 압출되도록 허용하는 고체상의 특징을 나타내고, 압출물 리본은 폴리아제티딘 전중합체의 숙성이 실행되기 전에는 함께 융합되지 않는다.

발명에 따르는 방법의 바람직한 구체예에서, 입자형태의 고정화효소는 수분함량을 약 25%w/w 이하로 건조시킨다.

약 25% 이상의 최종 수분함량으로는 생성물의 세균에 의한 안정성은 만족스럽지 못하다. 더 나아가서 앞서 지적한 바와 같이, 약 25% 이상의 수분함량으로 폴리아제티딘 전중합체와의 가교결합은 일어나지 않을 수 있거나 또는 완결되지 않을 것이다. 입자는 보관시 시간 경과에 따라 집성되려 할 것이다.

약 15% 이하의 수분함량으로 건조시키는 것은 효소 활성에 있어서 손실을 일으킬 것이다.

발명을 예시하는 응용은 다음과 같다.

이미 지적한 바와 같은, 본 발명의 실행은 본 분야가 세포결합효소를 세포군 입자형태로 전환시키기 원할때의 경우에 관련된다. 본 발명 실행을 위한 상기한 파라미터들내에 어떠한 미생물 공급원 세포결합효소에 적용 가능한 발명의 실행을 하기에 충분한 변화성이 있다.

예를 들면, 글루코오스 이성화효소의 공지의 세포결합효소는 바실러스 코아글란스(Bacillus coagulans)이 배양에 의해 또는 스트렙토미세스(Streptomyces), 속(屬)에 속하는 글루코오스 이성화 효소 생성주(株), 예를 들면 스트렙토미세스 뮤리너스(Streptomyces murinus) 집락주의 배양에 의해 생성될 수 있다.

바실러스 코아글란스로부터의 세포결합된 효소는 글루타르알데히드와의 반응에 의해 쉽게 고정화될 수 있다.

전술한 미국 특허 제3,980,521 참조, 그러나 스트렙토미세스 뮤리너스 집락을 포함하여 스트렙토미세스속의 주들에 의해 생성된 세포결합효소는 효소를 고정화시킨 만족스러운 원기세포군 입자형태를 생성하는 글루타르알데히드와의 불충분한 가교결합능력으로 특징 지어진다. 그러나, 이들 세포결합효소중 어느 것도 본 발명의 실행을 통하여 세포군 입자형태로 고정화될 수 있다. 물론 이것은 본 발명의 실행이 스트렙토미세스 뮤리너스 효소에 특히 적합함을 따른다. 글루코오스 이성화 효소는 상업상 중요한 효소인데, 말하지면, 스트렙토미세스 뮤리너스 글루코오스 이성화 효소의 고정화는 본 발명의 하나의 바람직한 양상의 실행이다.

본 발명의 광범위한 적용을 근본적으로 다른 상업상 중요한 세포결합효소 즉 E. Coli 주로부터 유도된 트립토판 합성효소에 의해 이후에 또한 예시한다. 이 효소의 제조도 역시 본 발명의 바람직한 양상의 실행이다.

본 발명자에 의한 조사된바 종래의 고정화 방법중 어떤 것도 만족스러운 물리적 강도의 고정화 트립토판 합성효소 생성물을 가져온 것은 없다. 트립토판 합성효소는 보조인자를 요함이 주목된다. 이러한 것은 세포질에 존재한다. 세포의 파괴는 보조인자의 손실을 일으키게 되기 때문에, 전체세포의 고정화는 트립토판 합성효소의 경우에 사용된다.

본 발명의 실해에 따라, 특히 발명의 바람직한 실행에 따라 만든 효소 과립은 우수한 물리적 특성을 나타낸다. 충전된 베드에서, 그들은 비교할만한 종래기술 생성물의 단지 약 50%인 액체흐름에 대한 압력강하를 나타내었다. (이 시험연구에서, 비교할만한 종래기술 생성물은 미국 특허 제3,980,521의 가르침에 따라 만든 글루타르알데히드 가교결합된 바실러스 코아글란스 글루코오스 이성화 효소 이었다. 이것은 광범위하게 상용되고 있다.)게다가, 높은 물리적 강도 및 내마모성을 발견하였다.

본 발명의 실행을 더 이해하기 위해, 다음의 특정 실시예를 제시한다.

[실시예 1]

스트렙토미세스 뮤리너스의 세포들을 포함하는 글루코오스 이성화 효소인 DSM 3252를 글루코오스, 착물 질소공급원, 광물질 및 미량의 원소로 이루어지는 종래의 매체에서 배양시켰다. 7.0-7.5의 pH 조절후, 0.5%w/w의 양으로 MgSO₄,7H₂O의 첨가후 만톤-굴린(Manton Goulin) 균동기에 의하여 균일화 시켰다.

균일화된 세포슬러지는 -18℃로 유지시키고 고정화 실험에 사용하기 바로전에 해동시켰다. 건조물질 함량 6.7%의 균일화된 세포슬러지 300g을 1.5% MgSO₄, 7H₂O로 750ml로 희석시키고 pH를 7.5로 조절하였다.

30g 코르캣(Corcat) P-18 폴리에틸렌이민응집제(Cordova Chem. Co.)를 가하였다. 다음에 50% 글루타르알데히드 9.24g을 가하였다. pH는 7.4 내지 7.6으로 1시간동안 유지시켰다. 응집제는 여과에 의해 수집하였다.

대략 15.8% DM을 포함하는 필터케익을 건조물질 함량에 의해 두개의 균등부분으로 분활하였다.

두부분을 pH 7.5인(Hercules, Inc., Delaware로부터의) Polycup

1884 폴리아제티딘 전중합체 용액을 필터케익 건조물질로 계산하여 각각 0와 15%w/w(건조물질)와 혼합하였다. 양 부분을 0.8mm 구경을 통하여 압출시켰다. 압출된 물질을 실온에서 건조되도록 두어 83 내지 85%w/w의 건조물질함량으로 하였다.

300 내지 700μ 분율을 체 분별(Sieve fractionation)에 의해 얻었다.

두 고정화 효소제제로 회수된 글루코오스 이성화 효소활성(NOVO Documment F850399에 따라 측정했음)은 대략 같았다. NOVO, AF166에 따라 측정한 압력강하(g/㎠으로)는 다음의 표 1에 제공한다.

표 1

압력강하대 폴리아제티딘 백분율.

필터케익 건조물질상에서 건조물질로서 계산했음.

% 폴리아제티딘 0 15

압력강화(25h/50h) 14/17 6/7

[실시예 2]

E. Coli 주, ATCC 15491을 생성하는 트립토판 합성효소를 37℃에서 한천 경사면상에서 성장시키고 거기로부터 37℃에서 흔듦 플라스크의 사전배양균으로 이동시켰다. 사전배양균을 다음과 같이 제조된 배지상에 접종시켰다.

배지의 조성은 다음과 같다.

[실시예 2 (계속)]

비타민(*)에 대한 것을 제외하고 121℃에서 25분간 살균하고 이것을 덱스트로스(10g/ℓ) 및 48% 에탄올중의 인돌(125ml)과 함께 냉각시킨 후 살균 여과에 의해 첨가하였다.

1부피/부피/분으로 공기유통하에 37℃에서 무균상태하에 액침발효를 행하고 500rpm으로 교반 및 산/염기 첨가에 의해 pH를 7.0으로 40시간동안 조절하였다. 접종 24시간 후 덱스트로스(40g/ℓ)와 48% 에탄올중의 인돌(875㎎/ℓ)의 더이상의 첨가를 수행하였다.

세포들을 원심분리 40시간 후 거둬들이고 이후의 실시예 3에 기술된 고정화 실험에 곧 사용하였다.

[실시예 3]

17%w/w의 건조물질 함량을 갖는 실시예 2에 기술된 바와 같이 회수된 습한 세포 60g을 0.2M EDTA(pH 7.5로 조절됨) 1200ml에 재부유시키고 실온에서 30분간 둔 다음 원심분리 하였다. 수성 EDTA 세정방법을 1회 반복하였다.

습한 세포를 pH 7.5인 85mM KH₂PO₄300ml, 코닥(Kodak)으로부터의 폴리스티렌 8.4g(200 내지 400메시, 2%w/w 디비닐벤조산과 가교결합된것), 인산피리독살 96mg 및 12.5w/v 글루타르알데히드용액 9.6g과 혼합하였다. pH 값은 고정화과정을 통하여 염기의 첨가에 의해 7.5로 유지시켰다.

다음에 미시간의 코르도바 케미칼 컴패니로부터의 Coract P-150 폴리에틸렌 이미 용액 60g을 10N NaOH로 pH 7.5로 조절된 것을 첨가하고 이어서 전과 같이 같은 양은 글루타르알데히드용액을 가하였다.

글루타르알데히드의 첫번째 첨가로부터 1시간후, pH 7.5인 50mM KH₂PO₄900ml로 희석을 수행하였다.

그다음 아메리칸 시아나미드로부터의 250ml og lo/oo w/v Superfloc A130의 첨가에 의해 응집을 수행하였다. 부분적으로 가교결합되고 응집된 세포를 여과에 의해 회수하였다.

대략 19%w/w의 건조물질을 포함하는 필터케이크를 두개의 동등한 부분으로 분할하였다.

한 부분을 발효로부터 원심분리에 의해 회수된 습한 세포중의 건조물질에 관하여 16.5%w/w의 건조한 폴리아제티딘 전중합체에 해당하는 pH 7.5의 Polycup

172(Hercules, Inc., Delaware) 7.2g과 혼합하였다.

양부분을 0.8mm 구멍을 통해 압출하였다.

압출된 물질(양부분)을 실온에서 건조하도록 두어 90%w/w의 건조물질함량이 되도록 하였다. 300 내지 700μ 분율을 체분별에 의해 얻었다.

두 고정화 효소생성물에 회수된 트립토판 합성효소 활성은 대략 같았다. 폴리아제티딘과의 생성물 NOVO, AF166에 따라 측정된 압력강화(g/㎠으로)는 14(25h)/15(50h)이었고 폴리아제티딘이 없는 생성물의 압력강하는 23(25h)/24(50h)이었다.

Claims (9)

1. 효소학적활성 미생물 세포와 세포물질의 수성분산액을 수성폴리아제티딘 전중합체와 이러한 분산액을 혼합시키고 이어서 숙성시키는 것을 수반하는, 고정화시키는 방법에 있어서, 효소학적활성 미생물 세포슬러지를 글루타르알데히드로 처리하여 이로써 부분 가교결합이 일어나도록 하며, 그후 부분 가교결합된 세포슬러지를 70-90%w/w 범위의 수분함량으로 수분제거시키고, 이로써 반죽상 세포군을 발생시키며, 상기 반죽상 세포군을 수성 폴리아제티딘 전중합체와 혼합한 다음 혼합된 반죽상 세포군과 수성폴리아제티딘 전중합체를 세분하고, 이어서 전술한 숙성을 시켜 이로써 입자형태 고정화 효소생성물을 가져오는 것을 특징으로 하는 효소학적활성 미생물세포와 세포물질의 수성분산액을 고정화시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 과립혼합물의 수분함량은 숙성의 동안에 약 25중량% 이하로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 글루타르알데히드는 세포슬러지 건조물질의 5%-40%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 폴리아제티딘은 세포슬러지 건조물질의 5%-30중량%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 효소학적활성 미생물세포는 스트렙토미세스뮤니너스 집락이 글루코오스 이성화 효소생성주로부터의 세포로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 효소학적활성 미생물세포는 트립토판 합성효소생성 미생물주로부터의 세포로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 세포는 E.coli의 주로부터 인것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 부분가교결합된 세포슬러지는 80-85%w/w 범위의 수분함량으로 수분제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 글루타르알데히드는 세포슬러지 건조물질의 10%-20%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.