DE2407961A1 - Verfahren zur herstellung einer enzymatisch aktiven membran, danach hergestellte membran und anwendung dieser membran zur durchfuehrung enzymatischer reaktionen - Google Patents
Verfahren zur herstellung einer enzymatisch aktiven membran, danach hergestellte membran und anwendung dieser membran zur durchfuehrung enzymatischer reaktionenInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran,
danach hergestellte Membran und Anwendung dieser Membran zur
Durchführung enzymatischer Reaktionen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran, bestehend
aus enzymatisch aktiven ganzen Mikrobenzellen, die mit Protein komplexiert wurden, auf eine nach diesem Verfahren
hergestellte Membran und auf Anwendung dieser Membran zur Durchführung enzymatischer Reaktionen.
Enzyme sind Proteinkatalysatoren, die für eine grosse Anzahl
von Anwendungen in Industrie und Forschung benutzt werden, insbesondere in Arzneimitteln sowie in der Pauier- und
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Textilverarbeitung usw. Sie sind äusserst spezifisch in ihrer Aktivität und erzeugen im allgemeinen keine "bedeutenden
Mengen an unerwünschten Nebenprodukten. Enzymreaktionen
sind industriell vorteilhaft, da sie keine grossen Investitionen für Wärmeübertragungsapparaturen erfordern
und leicht abgestuft werden können, wodurch die Probleme, die "bei den Zwischenstufen-Produkttrennungen auftreten,
minimalisiert werden.
Ein Problem beschäftigte diejenigen, die sich mit industriellen Anwendungen von Enzymen befassten, jedoch lange,
und zwar die Schwierigkeit, Enzymmaterialien zu trennen und wieder zu gewinnen. Bei den meisten kommerziellen
Arbeitsverfahren wird die Enzymreaktion durch einfaches Mischen des Enzyms mit dem Substrat bewirkt, d.h., man
lässt die Chemikalie auf das Enzym einwirken und inaktiviert das Enzym danach und / oder stellt es wieder her und zwar
aus den Produkten oder dem unreagierten Substrat, welches sich aus der Reaktion ergibt. Dieser Vorgang führt jedoch
häufig zu einem fehlerhaften Produkt und zu einem charakteristischen
Verlust grosser Enzymmengen, da üblicherweise kein Enzym wiederhergestellt wird oder, wenn man es versucht,
die Ausbeute äusserst gering ist.
Ein weiteres Problem von grosser Bedeutung für jene, die sich mit dieser Technologie beschäftigen, ist darin zu
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sehen, dass die Enzyme normalerweise in wässriger Dispersionsform vorliegen. In der Regel weisen Enzyme in dieser
Form jedoch nur eine "begrenzte Haltbarkeit auf und unterliegen, insbesondere dann, wenn sie in flüssiger Porm aufbewahrt
werden, bei Lagerung einem schnellen Aktivitätsverlust.
Um diese Probleme abzuschwächen, wurden verschiedene sogenannte
"immobilisierte Enzyme" entwickelt, in denen die Enzyme unbeweglich gemacht wurden oder an inerte oder unlösliche
Träger gebunden wurden. Bei Abschluss der Enzymreaktion können diese unlöslichen enzymenthaltenden Materialien von
dem unreagierten Substrat oder dem Produkt durch Techniken wie Ultrafiltrierung oder ähnlichem getrennt werden.
Wie bei Kay in Process Biochemistry, August 1963, wo eine
Übersicht über die Geschichte der immobilisierten Enzyme zu finden ist, diskutiert wird, gibt es im wesentlichen
drei bekannte Verfahren, um Enzyme zu immobilisieren: '
1. Kovalente Bindung an ein chemisch modifiziertes Substrat
oder an ein Substrat, welches kovalente Bindungen eingehen kann.
2. Absorption in Kleie oder einem Gel oder Einbetten in eine inerte Matrix (d.h. keine Bindung eingehen).
3. Vernetzung des Enzyms mit sich selbst.
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Alle diese bekannten Verfahren haben sich für industrielle Anwendungen jedoch als nachteilig herausgestellt und zwar
vor allem deshalb, da die Verfahren, die die Unbeweglichkeit der Enzyme bewirken, kompliziert sind und eine sehr
genaue Kontrolle des pH-Wertes, der Temperatur, der Materialien usw. erfordern.
Wenn ein Enzym in Vorbereitung auf kovalente Bindungen chemisch modifiziert wird, werden einige der enzymatisch
aktiven Plätze des Enzyms chemisch beständig angegriffen, wobei die Aktivität der Enzyme reduziert wird. Beispielsweise
diskutieren Silman et al, in Biopolymers, Band 4, Seite 441-448 (1966) die kovalente Bindung der Enzyme an
Kollagen und p-Aminophenylalanin - Leucin - Polymere durch
die Verwendung von Diazoniumsalz. Dieses Verfahren liefert jedoch ein Produkt herabgesetzter enzymatischer Aktivität.
Adsorption der Enzyme in Kleie oder einem Gel, oder Einbetten eines Enzyms in eine inerte Matrix, wie dies von
Leuschner in der GB-PS 953^14 gezeigt wird, liefert wegen
der Behinderung oder des Blockiereffekt$ der Matrix .ebenfalls
Produkte von herabgesetzter enzymatischer Aktivität.
Bei der Vernetzung der Enzyme mit sich selbst, wie dies durch Kay oder Silman et al. in den vorstehenden Veröffentlichungen
offenbart wurde, treten ähnliche Nachteile wie beim kovalenten Binden der Enzyme auf.
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In der noch nicht entschiedenen amerikanischen Anmeldung
Nr. 135.753 der Anmelder vom 20. April 1971 offenbarten
die Anmelder ein neues Verfahren, um das Enzym durch Komplexieren des Enzyms mit einem Protein oder einen Folypeptid
zu immobilisieren. In einem Ausführungsbeispiel wurde berichtet, dass die erhöhte Immobilität einfach durch G-iessen
und nachfolgendes Trocknen einer Membran aus einer Dispersion aus Proteinmakromolekülen, welche mit einer wässrigen
Lösung aus Enzym vermischt und komplexiert wurden, bewirkt werden könnte.
In der noch nicht entschiedenen amerikanischen Anmeldung Nr. 176.546 vom 31. August 1971 offenbarten die Anmelder
ein Verfahren, um ein Enzym mit einem Protein durch elektrolytische Fällung zu komplexieren.
Es wurde gefunden, dass die direkte Bindung eines unnodifizierten
Enzyms an eine Proteinmembran, wie etwa eine Membran aus Kollagen oder Zein, durch eine Komplexform der Bindung,
welche Verknüpfungen von Salzen* Wasserstoffbrücken und
van der Waals-Kräfte umfasst, ermöglicht wurde, und dass
sich hieraus ein Produkt überlegener Aktivität und Stabilität ergibt.
Die Immobilität der Enzyme bringt jedoch sogar bei dem in der entsprechenden Anmeldung der Anmelder offenbarten Verfahren
noch gewisse Nachteile mit sich, da es noch notwendig war, zunächst die 3nzyme aus der ganzen I-Iikrotenselle
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zu extrahieren und dann die Enzyme in gereinigter Form
wiederherzustellen. Die erforderlichen Verfahren für diese
Extraktion und Wiederherstellung führen jedoch im allgemeinen zu einem 90 %igen Verlust an Enzymen, sodass es
höchst wünschenswert wäre, ein Verfahren anzugeben, welches diesen wesentlichen Nachteil nicht aufweist.
Ein weiterer Nachteil der immobilisierten Enzyme ist darin zu sehen, dass sie das Bestreben haben, einen grossen Teil
ihrer Aktivität zu verlieren, wenn sie über längere Zeiträume erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden. Manchmal sind
Enzyme derartig temperaturempfindlich, dass ihre enzymatische Aktivität bei Temperaturen um 800C innerhalb weniger
Minuten schnell zerstört wird, während die Immobilität im allgemeinen einen stabilisierenden Effekt auf die Aktivitäten
zu haben scheint. Nichtsdestoweniger weisen mit der Zeit sogar immobile Enzyme einen Trend in Richtung auf eine
herabgesetzte Aktivität auf.
Es ist bekannt, dass ganze Mikrobenzellen sogar ohne Trennung und Reinigung der Enzymkomponenten der Zelle ein
erhebliches Mass an enzymatischer Aktivität aufweisen. Bisher bestand jedoch das einzige bekannte Verfahren, um
ganze Mikrobenzellen immobil zu machen, im Einfangen in einer inerten Matrix (vgl. Mosbach et al., Biotech, and
Bioeng. XII, 19 (1970). Die Schwierigkeit dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Matrix hinsichtlich der eingefangenen
Enzyme dazu neigt, sich ungünstig oder hindernd auf die enzymatische Aktivität der Zelle auszuwirken.
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Andere Verfahren, die die Immobilität von Enzymen bewirken, wurden vor allem wegen der grösseren Abmessung der
ganzen Mikrobenzellen, die üblicherweise in der Grössenordming
von Mikron liegt, nicht in Erwägung gezogen.
Solche grossen Partikel können nicht ohne weiteres in die Zwischenräume einer immobilisierenden Membran eindringen,
sodass angenommen wurde, dass eine erfolgreiche chemische Bindung nicht wahrscheinlich sei.
In der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass ganze Mikrobenzellen durch Protein oder Polypeptid in Membranform
komplexiert werden können und in dieser Form nicht nur ein höheres Mass an enzymatischer Aktivität aufweisen als bisher
durch den Stand der Technik erreichbar war, sondern dass wegen der Schutzfunktion der Zellstruktur auch eine
bedeutend höhere Temperaturstabilität erreicht wird.
!Folglich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, immobilisierte
ganze Mikrobenzellen in Membranform zu schaffen und Verfahren anzugeben, um diese Mikrobenzellen in Membranform
herzustellen.
Eine andere Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Angabe eines Verfahrens, bei dem enzymatische Reaktionen dadurch
bewirkt werden, dass ein enzymatisch aktives Substrat eine Komplexmembran, welche aus ganzen Mikrobenzellen und einem
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Träger "besteht und durch gute kateJLytische Aktivität charakterisiert
ist, durchtritt.
Diese und andere Aufgaben wurden nun in einer Ausführungsform dieser Erfindung durch Immobilisieren ganzer Mikrobenzellen
auf Proteinmembranen gelöst.
Passende Membranen umfassen sowohl synthetische Polypeptide als auch natürliches Protein. Die Immobilisierung der
ganzen Mikrobenzelle wird durch die Bildung einer Proteindispersion bewirkt, durch Vermischen und Komplexieren dieser
Dispersion mit einer Zellsuspension, durch G-iessen einer Membran und deren Trocknung.
In einer weiteren Ausführungsform werden ganze Mikrobenzellen
mit Proteinmakromolekülen durch elektrolytische Fällung in einem Bad komplexiert, um auf diese Weise eine
enzymatisch aktive Membran zu bilden.
Der Komplexierungsmechanismus zwischen ganzen Mikrobenzellen
und Proteinmembranen oder filmähnlichen Proteinträgern umfasst die Bildung von vielfältigen Wasserstoffbrücken,
Verknüpfungen von Salzen und vqn der Waals-Wechselwirkungen.
Die Komplexbildung wird bei einem pH-Wert zwischen den isoelektrischen Punkten der ganzen
Mikrobenzelle und der Proteinmembran erleichtert.
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Jedes aus der grossen Vielzahl der synthetischen Polypeptide und natürlichen Proteine kann zur Bildung des Ilembranbestandteils
des Komplexes verwendet werden. So umfassen zum Beispiel die geeigneten natürlichen Proteine Kollagen,
Zein, Kasein, Ovalbumin, G-luten des Weizens, Fibrinogen,
Myosin, Mucoprotein und ähnliches. Geeignete synthetische Polypeptide sind Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylalanin,
Polytyrosin und Copolymere von Leucin mit p-Aminophenylalanin und ähnliches. Kollagen und Zein sind
"bevorzugte natürliche Proteinausgangsstoffe.
Die Wahl eines bestimmten synthetischen Polypeptide oder natürlichen Proteins wird im wesentlichen durch die Eigenschaften
des zu komplexierenden Enzyms, des zu behandelnden Substrates und der einzubeziehenden Reaktionsumgebung
bestimmt.
Geeignete ganze Mikrobenzellen, welche gemäss dieser
Erfindung verwendet werden können, umfassen:
Bakterien, insbesondere Acetobacter, lactobazillus, Clostridium und Pseudomonas wie Suboxydans, Acetixylinum
und ähnliches; Delbruecki, Suboxydans und ähnliches; Acetobutylicum und ähnliches; Hydrophila und ähnliches.
Auch Actinomyceten, insbesondere Streptomyces wie Phaechromogenes, Griseus und ähnliches.
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Auch Sohimmel und Pilze, insbesondere Aspergillus und
Penicillium wie Niger, Oryzae und ähnliches; Notatum,
Griseofulvin, Funiculosum, Bilacinum und ähnliches.
Ebenso Hefe, insbesondere Saccharomyces und Torula wie
Cerevisiae, Ellipsoideus und ähnliches, Torulopsis, Utilis und ähnliches.
Diese ganzen Mikrobenzellen können eine grosse Vielzahl verschiedene Enzymen enthalten, wobei dies membrangebundene
Enzyme, intrazellulare oder Endoenzyme sind, und alle diese Enzyme wesentlich an der zellularen Umwandlung beteiligt
sind. Diese Enzyme umfassen Adenosintriphosphatasen, Hydroxymethyl-G-lutaryl-Coenzym A-Reduktase; die mitochondrisehen
Enzyme wie pyruvische Oxidasekomplexe und Acyl-Coenzym
A-Synthetase; oder membrangebundene Enzyme wie Adenylcyclase und Phosphodiesterase; intrazellulare Enzyme
des glycolytischen Pfades wie Alkoholdehydrogenase, laktische
Dehydrogenase, Aldolase, Glucose-6-phosphat-Isomerase
und ähnliches; Enzyme des Pentosephosphatzweiges wie G-lucose-6-phosphatdehydrogenase, Transketolase, Transaldolase
und ähnliches; Enzyme des Fettsäure-Synthetase-Komplexes
wie Malonyl CoA-Synthetase, D-Sorbitol-Dehydrogenase,
Gluconolactonase, 3-Keto-steriod Δ'-Dehydrogenase,
11_ t^-Progesterone-Hydroxylase, 9-cL -Fluorocortisol-Hydroxylase,
Xylose-Isomerase,β-Galactosidase, Penicillin-
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Amidase, Tryptophan-Pyrrolase, Sucrοse-6-Glueοsyl-Transferase,
Glucoamylase, Glucose-Oxidase, Galactose-Oxidase, Enzyme des Nukleinsäurestoffwechsels wie Dihydroorotase,
glutaminische Synthetase, folische Reduktase, dihydrofolische
Reduktase, Penicillinase und Äthanolamin-Oxidase.
Invertase oder ß-D-Fructofuranosidase wird in der Nahrungsmittel-
und Getränkeindustrie sowie für analytische Zwecke häufig verwendet. Invertase kann dazu verwendet werden,
die Hydrolyse von Sucrose zu Glucose und Fructose oder Invertzucker zu katalysieren. Invertase ist "bei der
Hydrolyse von ß-D-Fructofuranosyl-Bindungen in Sucrose,
Raffinose, Gentianose und Methyl- und β-Fructofructose
wirksam. Eine "besonders bedeutende Anwendung für eine immobilisierte, invertaseenthaltende ganze Mikrobenzelle
ist bei der kontinuierlichen Hydrolyse von Sucrose möglich.
dl-Amylase wird als "verflüssigendes Enzym" eingestuft
und ist bekannt dafür, Stärke, Glykogen und Dextrane zu hydrolysieren. B-Amylase kann Maltose aus Zucker, Glykogen
und Dextran erzeugen. Andere geeignete Amylasen umfassen oC-Glucosidase, Amyloglucosidase, Amylo-1,6-o£-Glucosidase
(unverzweigtes Enzym), Oligo-1,6-Glucosidase (Grenze Dextrinase),
Isomaltase und Isotriase. Wie hier verwendet
bezieht sich der Begriff "Amylase" im allgemeinen auf eine oder mehrere von diesen oder anderen Amylasen. Eine besonders
wichtige Anwendung einer immobilisierten ganzen Zelle,
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welche Amylase enthält, ist die kontinuierliche Hydrolyse von Stärke.
Immobilisierte Komplexe, die auf diese Weise gebildet werden, liefern eine gute enzymatisch^ Aktivität. Wird
ein enzymatisch aktives Substrat mit solchen Komplexen in Kontakt gebracht, so ist die Stufe der enzymatischen
Aktivität bestrebt, konstant zu bleiben und es gibt keine Notwendigkeit, ein getrenntes Trennungsverfahren wie bisher
vorzusehen.
Um die Komplexe dieser Erfindung herzustellen, ist es notwendig, die Zellen zu "fixieren". Dies bedeutet, dass
die ganzen Zellen in einer stationären Phase verbleiben sollen, wie etwa der Wärmebehandlung bei einer Temperatur
von 60 bis 800C über eine Minute bis zwei Stunden und / oder
durch Zufügen von nichtkoppelnden Substanzen wie 2,4-Dinitrophenol,
Pentachlorophenol, andere hochsubstituierte flüssige, lösliche Phenole, Gramicidin und Dikumarol.
Wenn Sporen als ganze Zellen verwendet werden, erübrigt sich ein Fixieren, da Sporen bereits in einem beharrenden Zustand
vorliegen.
Die ganzen, zu immobilisierenden Mikrobenzellen werden in einem geeigneten, inerten Medium, etwa Wasser, dispergiert.
Man erhält gute Resultate, wenn der Feststoffanteil der
Dispersion zwischen 0,5 und 10 Gewichtsprozent liegt.
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Das Protein ist in der Dispersion in Mengen von ca. 0,1 bis ca. 5 Gewichtsprozent enthalten. Die Konzentration des
Proteins wird natürlich von den Eigenschaften des verwendeten Proteins abhängen. Zum Beispiel neigt bei der
Verwendung von Kollagen als Protein die Suspension bei Zugabe von mehr als 1 Gewichtsprozent dazu, zu zähflüssig
zu werden. Vorzugsweise wird daher das Protein in Kengen von 0,1-1 Gewichtsprozent zugesetzt.
Die Temperatur bei der Vorbehandlung der Zellsuspension ist äusserst wichtig, da es notwendig ist, die eiweissspaltende
Aktivität der Zellen zu zerstören. Wird die eiweissspaltende Aktivität nicht zerstört, neigen die Zellen dazu,
sich selbst zu zersetzen und die strukturelle Einheit der Proteinmembran zu zerstören. Es wurde nun gefunden, dass
die wirksame Zerstörung der eiweisspaltenden Aktivität einsetzt, sobald die Zellsuspension über wenigstens 10 Minuten
auf eine Temperatur von 800C bis 820C erhitzt wird.
Längere Zeiträume und höhere Temperaturen sind ebenfalls wirkungsvoll, jedoch treten bei Steigerung der Temperatur
auf über 9O0C schädliche Effekte für die Eigenschaften der Zellen auf.
Der Proteinträger wird durch .jedes beliebige konventionelle
Verfahren dispergiert. Es wird sodann eine Suspension der ganzen Zellen damit zusammengemischt und komplexiert,
wonach eine Komplexmembran gegossen und getrocknet wird.
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Gute Ergebnisse sind erreichbar, wenn die Dicke der Membranen
zwischen 6 und 500 Tausendstel Millimeter
liegt.
Der pH-Wert der Dispersion sollte im Zeitpunkt des Kontaktes dem verwendeten ganzen Zellentyp entsprechen. Wenn die
ganzen Zellen ein Alkalienzym enthalten, sollte der pH-Wert der Dispersion alkalisch sein, und wenn das Enzym sauer ist,
sollte der pH-Wert der Dispersion sauer sein.
Nach Beendigung der Trocknungszeit werden die ganzen Mikrobenzellen
an die Membran gebunden worden sein. Die Bindung wird vielfach sein und der Bindungsmechanismus wird mindestens
Salzverknüpfungen, van der Waals-Kräfte und Wasser- ;
stoffbindungen aufweisen. Ein wichtiger Gesichtspunkt dieser
Erfindung ist die Erkenntnis, dass die Mikrobenzellen direkt an das Protein der Membran gebunden sind. Abweichend von
der bekannten Bindung der Enzyme an Proteinmaterialien werden die ganzen Zellen und die Membran vorher nicht mit Diazo
versetzt und das Proteinmaterial oder die ganzen Zellen chemisch nicht behandelt, um kovalente Bindungen herzustellen.
Bei der vorliegenden Erfindung werden die ganzen Zellen mit den Proteinmakromolekülen in Berührung gebracht,
und es wurde gefunden, dass die Bindung direkt eintritt. Die Reaktion ist in grober Analogie mit der Wiederherstellung
eines einfachen Gewebes durch Kombination von faserigem Protein und ganzen Zellen, welche mit Hilfe von
physikalisch-chemischen Bindungen miteinander verknüpft
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werden, zu vergleichen.
Das sich hieraus ergebende Produkt ist eine enzymatisch aktive Membran, welche durch eine gute strukturelle Einheit
charakterisiert ist. Da ganze Mikrobenzellen darüber hinaus durch eine hohe Konzentration an Enzymen gekennzeichnet
sind, ist die enzymatische Aktivität der immobilisierte
ganze Mikrobenzellen enthaltenden Membran höher als diejenige, die früher durch Immobilisieren der Enzyme auf
Proteinmembranen erreicht wurde. Darüber hinaus wurde gefunden, dass das verbleibende Zellskelett einen beachtlichen
Temperaturstabilisierungseffekt auf die Enzyme ausübt, wie in dem nachfolgenden Beispiel belegt wird:
Zwei Reaktionsgefasse, von denen das eine mit immobilisierten
ganzen Zellen (Streptomyces Phaechromogenes, welche
aktive Giucose-Isomerase enthalten) und das andere mit immobilisierter
Glucose-Isomerase (Enzym aus Streptomyces-
. gefüllt
, Phaechromogen-Zellen gewonnen und gereinigt)/' wurden bei 70 C
über einen Zeitraum in der Grössenordnung von Monaten kontinuierlich
betrieben. Immobilisierte ganze Mikrobenzellkomplexe hatten eine Glucose-Isomerase-Aktivität von
Einheiten pro Gramm Produkt und immobilisierte Enzyme wurden mit 80 Einheiten pro Gramm Produkt festgestellt.
Unter Berücksichtigung des Temperaturstabilisierungseffekts wiesen immobilisierte ganze Zellen eine Halbwertszeit von
60 Tagen auf, wohingegen die immobilisierten Enzymderivate eine solche von 20 Tagen hatten. (Halbwertszeit ist definiert
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als derjenige Zeitraum, In dem das immobilisierte Präparat
die Hälfxe seiner ursprünglichen Aktivität erreicht).
Das besondere Verfahren und die besonderen Apparaturen, welche für die elektrolytische Fällung benötigt werden,
sind dieselben wie in der noch nicht erledigten Anmeldung S.I1I. 176.546 angegeben wurden.
Die Verwendung immobilisierter ganzer Zellen kann sich, wenn für ein gegebenes Verfahren eine bestimmte Anzahl an
Enzymen erforderlich ist, als sehr fruchtbar erweisen. Sin besonderer Vorteil tritt auf, wenn ein Verfahren
Zusatzfaktoren, wie NAD/NADH+,Η+, aufweist. In solchen Pällen werden die Zellen nicht nur als Enzym- oder Enzymequelle
verwendet, sondern auch als Quelle der Zusatzfaktoren.
In einem Ausführungsbeispiel wurde Kollagen als Membranmaterial verwendet. Kollagen ist ein faseriges Hydroxyprolin
aus einem Protein von Glycintyp, welches den hauptsächlichen organischen Bestandteil des tierischen Bindegewebes
und der Knochen darstellt. In diesem Ausführungsbeispiel wird Kollagen aus Rindersehne oder -haut in ainem
Waringmiseher in Dispersion gebracht. Der pH-Wert der Dispersion wurde je nachdem, welches Enzym verwendet wurde,
an die sauren oder basischen Bedingungen angepasst. Die Konzentration des Kollagens in der Dispersion liegt üblicherweise
zwischen 0,5 und 5 Gewichtsprozent pro Gewicht dieser Stufe. Der Dispersion im Waringmischer wird sodann
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eine Zellsuspension zugefügt und ebenfalls untergemischt. Das Verhältnis Zelle zu Kollagen (auf der Grundlage des
Trockengewichts) liegt zwischen 1/5 und 3/1 und hängt vom Zellentyp ab; d.h. Kugel, Stab oder Faden usv.
Die gutverteilte Mischung wird sodann auf einem TJntern;rund
aus Mylar in einer Dicke von 100-12500 Tausendstel Millimeter
ausgegossen. Die gegossene Membran darf auf dem Mylar bei Zimmertemperatur trocknen.
Der getrocknete Film wird sodann durch Eintauchen in saure Chromsulfatlösung (11,67%, mindestens 1 Monat gealtert)
(saures Enzym), oder in alkalischer Eormaldehydlösung
(10% HGHO, V/o NaHGO3) oder Glutaraldehydlösung usw.
(alkalisches Enzym) gegerbt. Die Gerbzeit liegt normalerweise zwischen 1 /2 Minute und 1/2 Stunde und hängt von
der Stabilität der in die Gerblösung gebrachten Enzyme ab. Die gegerbte Membran wird sodann sorgfältig mindestens
eine 1/2 Stunde lang in fliessendem Wasser ausgewaschen. Die Membran ist sodann gebrauchsfertig. Die Membran kann
sowohl trocken als auch nass aufbewahrt werden. Die Dicke der getrockneten Membran liegt normalerweise zwischen 2
und 250 Tausendstel Millimeter.
Das aus den Zellen und dem Kollagen komplexierte Medium
sollte sorgfältig bei Raumtemperatur oder darunter getrocknet werden, um nicht die gebundenen Zellen zu beschädigen.
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Die Membran mit den in ihr enthaltenen immobilisierten
ganzen Zellen wird üblicherweise auf einem inerten Untergrund, wie etwa Kunstseide-Baumwoll-Misehgewebe, aufgetragen
und zu einer zylinderförmigen Patrone aufgerollt. Die Dicke des inerten Untergrundes liegt im allgemeinen
zwischen 5 und 500 Tausendstel Millimeter.
Üblicherweise wird ein zentral angebrachter Stab dazu verwendet, um den Aufbau der Patrone zu bewirken, welche sodann
eng in eine ummantelte Säule oder ein anderes Gehäuse eingepasst wird, um auf diese Weise ein katalytisches
Reaktionsgefäss zu bilden.
Während Kollagen ein bevorzugtes Beispiel für die vorstehend beschriebenen Anwendungen ist, können andere membranbildende
Materialien wie Zein und andere dispergierbare natürliche oder synthetische Polymere ebenfalls als Trägermaterial
für immobilisierbare ganze Zellen in Membranform verwendet werden.
Als zweites Beispiel für die Verwendung natürlichen Proteins zum Komplexieren von Mikrobenzellen wird ein PiIm aus Zein
und ganzen Zellen aus einer Lösung aus Zein und ganzen Zellen gemäss dem Stand der Technik gegossen. Dasselbe
Verfahren wie beim Kollagen-Film wurde auch bei Präparieren der Komplexe aus dem Protein und den Zellen angewendet.
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" 19 " 2407981
Zein ist ein Prolamin (alkohollösliches Protein) aus Mais.
Es ist das einzige kommerziell erhältliche Prolamin und
eines der am wenigsten leicht erhältlichen Pflanzenproteine. Zein tritt überwiegend in der Endosperma des
Maiskornes auf. Die Menge an alkohollöslichem Protein steht in direkter Beziehung zum gesamten Endosperma-Proteingehalt,
wobei der Zeingehalt in verschiedenen Maisproben zwischen 2,2 und 10,4% der Trockensubstanz schwankt.
Zein wird im Vergleich zu den meisten Proteinen durch einen relativ hohen Fehlbetrag an hydrophilen Gruppen gekennzeichnet.
In der Tat bewirkt der hohe Anteil an unpolaren (Kohlenwasserstoffe) und sauren amidischen Seitenketten die
Löslichkeit von Zein in organischen Lösungsmitteln und deren Klassifikation als ein Prolamin.
Eines der kommerziell erhältlichen Zeine ist Argo Zein G-200, welches von der Com Products Refining Company, Argo, Illinois
hergestellt wird. Lösungen zum G-iessen von Filmen können
auf reiner Komponentenbasis hergestellt werden, wobei der Wassergehalt von rohem Zein und anderen Reagenzien in Betracht
gezogen werden muss. Die giessfertigen Lösungen werden durch Lösen des Proteins in einem frei wählbaren organischen
Lösungsmittel unter leichtem Rühren bei Zimmertemperatur während eines Zeitraums von 1-2 Stunden, innerhalb dessen
die Lösung vervollständigt wird, bereitet. Als geeignete Lösungsmittel werden vorzugsweise 81 Gew# Isopropylalkohol
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und 4 %±ge Methylcellosolve (Äthylenglycol-Monoäthyl-Äther)
verwendet. Die klaren Lösungen enthielten 20-30 Gewichtsprozent trockenes Zein und waren von bernsteinfarbigem
Aussehen. Polymerisationsmittel, wie Formaldehyd, und
Weichmacher sollten kurz vor dem Ausgiessen des Films "beigefügt werden.
Natürlich kann auch jedes "beliebige andere bekannte Verfahren
zum Ansetzen geeigneter giessfertiger Zeinlösungen verwendet werden und in der vorstehenden Beschreibung wurde
nur ein geeignetes bekanntes Verfahren beispielhaft ausgewählt.
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von Membranen durch Komplexieren von enzymatisch aktivem Protein und ganzen
Mikrobenzellen besteht in der elektrolytischen Fällung einer makromolekularen Proteindispersion, welche mit ganzen
Mikrobenzellen von enzymatischer Aktivität zusammengemischt und komplexiert wurde. Die Mikrobenzeilwände sind zum Teil
aus Polypeptiden zusammengesetzt, sodass die Zellen eine elektrische Ladung aufweisen, welche vom pH-Wert der
Zellsuspension abhängt.
Beim Mischen einer Dispersion aus geeignetem Proteinträgermaterial
und einer wässrigen Lösung aus ganzen Mikrobenzellen werden stabile Makromolekularkomplexe zwischen den
Zellen und dem Protein gebildet. Diese aus Zellen und
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Protein bestehenden Makromolekularkomplexe weisen "bei einem
auf jeder Seite ihres isoelektrischen Punktes gelegenem
pH-Wert eine elektrische Nettoladung auf und würden sich
daher unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes "bewegen. Beim Trocknen der Komplexe, welches erst nach dem Vorliegen
ausreichender Dicke der elektrolytisch gefällten, makromolekularen Komplexe einsetzt, ergibt sich dann die enzymatisch
aktive Membran, welche ganze immobilisierte Mikrobenzellen
enthält. Sowohl die Zellen als auch das Trägermaterial brauchen nicht in geladener Form vorzuliegen, da
sie in der Dispersion Komplexe bilden und daher entweder die Zelle oder der Träger eine elektrische Nettoladung für
den Komplex beisteuert.
Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird ein mehr ins Einzelne gehendes Verständnis der Erfindung
durch Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele erreicht, welche in diese Beschreibung aufgenommen wurden,
um die Erfindung besser zu erläutern, und nicht dazu dienen sollen, als Begrenzung der Erfindung betrachtet zu werden,
wenn dies nicht ausdrücklich betont wird.
20 g gefrorene Zellen von Streptomyces Phaeochromogenes
(Chargen-Nr. 6-7-72) wurden mit destilliertem "Wasser so
aufgefüllt, dass das Volumen der Suspension bei 100 ml lag. Die Suspension wurde 10 Minuten lang gerührt, um die Zellen
zu dispergieren. Die Zellsuspension wurde 15 Minuten lang
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unter Schütteln (130 Umdrehungen pro Minute) in einem Rotationswasserbadschüttler auf 800C erhitzt und die Suspension
sodann langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt.
110 g Hautkollagen wurde 100 ml Wasser zugegeben und in
einem Waringmischer vermischt. Der pH-Wert des innig vermischten Gemenges wurde durch Zugabe von 1 n-Na0H-Lösung
auf 11,2 eingestellt. Die sich hieraus ergebende Zellsuspension wurde sodann langsam in die Kollagendispersion
eingegeben. Die Mischung wurde in Abständen abgekühlt, um ein Ansteigen der 'Temperatur auf über 200C
zu verhindern. Die gemischte Dispersion wurde auf einem Blatt aus Mylar vergossen und sodann bei Zimmertemperatur
getrocknet. Das totale Trockengewicht des Komplexes betrug 12,5 g. Der getrocknete Komplex wurde eine Minute lang in
Pormaldehydlösung (10?<6ig und \% Natriumbicarbonat enthaltend,
pH-Wert 8,35) gegerbt. Er wurde danach sofort eine halbe Stunde lang unter kaltem fliessendem Wasser
gewaschen. 1,23 g der gegerbten Komplexmembran wurden in kleine Stücke geschnitten und auf ihre Glucose-Isomerase-Aktivität
hin untersucht. Die 1/4 Zoll χ 1/4 Zoll (ca. 6x6 mm) messenden Stückchen wurden dazu verwendet,
um die Isomerisation von 5 ml 18%iger Glucose (bestehend aus 0,01-molarem Mg++ und 0,2-molarem Phosphatpuffer
mit pH 7) bei 700C zu katalysieren. Die Reaktion wurde in
einem auf einem Schüttler angebrachten Testrohr eingeleitet und bei 700C durchgeführt. Das Schütteln wurde mit
einer Geschwindigkeit von 150 Umläufen pro Minute durch-
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geführt. Die Reaktion wurde durch. Feststellen der sich
"bildenden Menge an Fructose, wobei die Tiii ο barb i tur säure methode
(2) verwendet wurde, verfolgt. Das Probeverfahren
wurde modifiziert und für die Verwendung im Analyseapparat
Autoanalyzer (Technicon Instruments Corporation, Tarrytown,
New York) automatisiert. Der prozentuale in Fructose umgewandelte Glucoseanteil wurde während verschiedener Reaktionszeiten
entnommen. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse zusammen. Aus den anfänglichen Umwandlungsdaten wurde berechnet,
dass pro Gramm des Komplexes insgesamt Streptomyces Phaeochromogenes-Zellen, welche 131 Einheiten von
Glucose-Isomerase-Aktivität entsprechen, immobilisiert wurden. Eine Einheit wurde definiert als diejenige Menge
an Enzym, welche 1 mg Fructose bei 700C pro Stunde erzeugt.
Zeit (Stunden) Umwandlung in Prozenten
0,5 9,0
1,0 16,6
1,5 23,5
2,0 30,1
4,0 42,1
5,5 45,0
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Dieses Beispiel weist den Einfluss des Gerbens von Membranen aus Komplexen von Kollagen und Zellen in einer Formaldehyd-Lösung
als Funktion der Zeit nach. Das Vernetzen der Membran führt zu stabilen Komplexen, welche bei hohen
Temperaturen (bis zu 7O0C) verwendet werden können.
Destilliertes Wasser wurde zu 33 g gefrorener Streptomyces
Phaeochromogen-Zellen (Chargen-Nr. 6-29-72) gegeben, bis das Volumen der Suspension 200 ml betrug. Die Suspension
wurde magnetisch 15 Minuten lang gerührt, um die Zellen gut zu dispergieren. Die Zellsuspension wurde 1,5 Stunden lang
in einem Rotationswasserbadschüttler (bei 130 UpM) über 800C erhitzt.
Der Suspension wurden 150 g Hautkollagen zugegeben und der Kollagen-Zeil-Komplex magnetisch gerührt. Der pH-Wert der
Mischung wurde unter fortgesetztem Rühren langsam auf einen Wert von 11,35 geändert, indem tropfenweise 1-n NaOH zugegeben
wurde. (Langsame Zugabe von verdünntem Natriumhydroxyd verhindert bei schnellem magnetischem Rühren ein lokales
Ansteigen des pH-Wertes der Mischung über den erwünschten Wert.) Während der zweistündigen Rührperiode wurde ein
Ansteigen der Mischungstemperatur auf über 200C vermieden.
Die Dispersion wurde auf ein Blatt aus Mylar gegossen und ' bei Zimmertemperatur trocknen gelassen.
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Ein kleiner Teil der getrockneten Komplexmembran warde zerschnitten
und in sieben Stücke geteilt. Jedes Stück wurde gewogen und unterschiedlich lange in flüssigem Formaldehyd
(iO&Lg mit 1% Natriumbikarbonat, pH 8) gegerbt. Ur.raittel"bar
danach wurde jedes Stück unter fliessendem kalten V/asser eine halbe Stunde lang gewaschen. Auch die nicht gegerbten
Stücke wurden eine halbe Stunde lang gewaschen. Jedes Stück wurde sodann bei 70 0C aui Glucose-Isomerase-Aktivität untersucht,
wobei 10 ml 18%iger Giucose (welche 0,01-nolares Mg
und 0,1% Methylparaben enthielt) als Substrat verwendet wurden. Die Reaktion wurde in Teströhren unter Schütteln
(130 Zyklen p.M.) durchgeführt. Durch Messung der in einer halben Stunde gebildeten Fructose wurden die Enzymeinheiten
bei jedem Stück berechnet. Tabelle 2 fasst die Resultate zusammen:
Komplexgewicht Gerbzeit Gesamte Einheiten Einheiten des (g) (min) der Glucose-Isomerase Komplexes (g)
| 0,42 | 0 |
| 0,29 | 0,5 |
| 0,35 | 1,0 |
| 0,26 | 2,0 |
| 0,45 | 5,0 |
| 0,47 | 10,0 |
| 0,38 | 30,0 |
54,0 80,4 71,4 64,2 93,6 25,6 4,8
128,5 268,4 201,0 249,0 207,6
54,6
12,7
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EeiSOiel 3
66 g gefrorener Streptomyces Phaeochromogen-Zellen (Chargen-Kr.
6-29-72) wurden in 200 ml Wasser und 210 g Hautkollagen suspendiert und die Membranen aus Kollagen-Zeil-Komplexen
wurden nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die Membrane wurde sodann in einer Formaldehydlösung
gegerbt und danach eine halbe Stunde unter fliessendem kaltem Wasser gewaschen.
25 g der Koaplexmembranen wurden auf ein 5 Zoll (ca. 128 mm)
breites Viskon-Piltergewebe (Nr. 3362, Typ Nr. SK 350-CM, Chicopee Mills Inc., 1450 Broadway, New York), welches als
Abstandselenient diente, geschichtet. Ein 5 Zoll (128 mm)
langer und 3 mm dicker Giasstab wurde als Zentralelement verwendet. Der Kollagen-Zellmembran-Komplex wurde auf dem
Piltergewebe (3,15κώι dick) zu zwei Patronen aufgewickelt.
Jede Patrone war 5 Zoll (128 mm) lang und hatte 1 Zoll (25,6 mm) Aussendurchmesser.
Die zwei Patronen wurden Rücken an Rücken in eine ummantelte Giassäule gepackt. Die Säulenabmessungen hatten 11,5 Zoll
(395 nun) Mantellänge und einen Innendurchmesser von 1 Zoll
(25,6 mm). Die Säulen hatten am Boden Ausschnitte, auf denen die Patronen abgestützt wurden. Die Säule war auch
nit einem Vorerwärmungsteil ausgerüstet, um die Substratlösung vor der Kontaktnahme mit dem Katalysatorbett auf die
richtige Temperatur zu bringen. Die Temperatur wurde in
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diesem System durch Wasser, welches mit einer hohen Flussrate
durch den Säulenmantel zirkulierte, kontrolliert, wobei ein Thermostat (Haake Instruments, Inc., Model ?J) verwendet
wurde. In dieser Weise konnte die Temperatur des Reaktionsgefässes auf + 0,20C konstant gehalten werden.
Die Säule wurde dazu verwendet, um kontinuierlich Glucose su isomerisieren, welche durch eine peristaltische Pumpe
am Boden der Säule eingeleitet wurde. Die flüssigkeit floss durch die Säule nach oben und das Produkt wurde im Kopf der
Säule gesammelt. In dieser Durchflussvorrichtungsanordnung
wurde das gleichförmige laminare Eliessverhalten an den
.»lembr anober flächen durch die Kapillarwirkung der Piltertuchabstände
und den kleinen Druck, der von der peristaltischen Pumpe bewirkt wird, erleichtert. Der Transport der Reagenzien
und der Produkte in den Membrankomplex hinein bzw. heraus wurde durch Diffusion bewirkt. Die komplexierte Zellmembran
wurde auf diese Weise wirksam in Kontakt gebracht.
Die Säule arbeitete bei 700O. Das verwendete Substrat war
185'oige G-lucose, welche 0,01-molares Mg++ und 0,1% Methylparaben
enthielt. Im Substrat wurde kein Puffer verwendet und der pH-Wert des Substrates wurde durch die Verwendung
von 1-n Natronlauge auf 7»1 gebracht. Das leere Volumen
der Säule betrug ungefähr 20 ml und die Durchflussrate variierte zwischen 11 und 12 ml/Stunde. Diese Zahlen entsprechen
einer Verweilzeit von 1,7 bis 1,8 Stunden in der Säule. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst:
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"Tabelle 3
Dauer der Probe
| 4 | Stunden |
| 5,5 | Stunden |
| 31 | Stunden |
| 53 | Stunden |
| 79 | Stunden |
| 4 | Tage |
| 5 | Tage |
| 6 | Tage |
| 7 | Tage |
| 8 | Tage |
| 10 | Tage |
| 11,12 | Tage |
| 12 | Ta?re |
| 13 | Tage |
| 14 | Tage |
| 15 | Tage |
Umwandlung in Prozenten
41,0 42,5 40,0 40,0 41,8 40,6 40,6 41,0 39,7 38,4 35,4 35,0 35,0 38,4
38,5 40,0
Die Kolonne setzte die G-lucose-Isomerisierung sogar noch
einige Wochen nach Beendigung der täglichen Messungen kontinuierlich fort.
Dieses Beispiel weist die Herstellung von Komplexmembranen aus enzymatisch aktiven Protein und ganzen Mikrobenzellen
durch elektrolytische Fällung nach.
0,75 g Natriumalginat wurden in 75 ml destilliertem V/asser
gelöst und zu 100 ml 1%iger Kollagendispersion zugegeben.
Dazu wurde tropfenweise und unter ständigem magnetischen Rühren TRIS-Lösung zugegeben bis ein pH-Wert von 8,5 er- ·
reicht und die Mischung gut dispergiert war. Ein Gramm ge-'trocknete
Streptomyces Phaechromogen-Zellen wurde mit
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hoher magnetischer Rührgesehwindigkeit unter die Dispersion
gemischt.
Die Dispersion wurde in ein Edelstahlgefäss, welches als
Kathode diente, getan. Ein flexibler Edelstahlschirir. wurde
in der Mitte des elektrolytischen Fällungsgefässes angeordnet und wie eine Anode mit der Stromquelle verbunden.
Beim Anlegen eines Gleichstroms von 0,5-0,6 Amperes bei einer Spannung von 50 V. begann sich der Komplex aus den ganzen
Zellen und dem Kollagen auf der flexiblen Sdelstahlanode niederzuschlagen. Wach 15-minütiger Ablagerung wurde die
Stromquelle abgeschaltet und die Anode aus dem G-efäss herausgenommen.
Die Membran wurde auf der Elektrode getrocknet. Durch vvriederholung dieses Vorganges wurden insgesamt 3,6 g
('Trockengewicht) Membranmaterial aus ganzen Zell-Kollagen-Komplexen
auf 9 Edelstahlschirmen niedergeschlagen.
Diese Schirme wurden zusammen mit den aufgetragenen Membranen in ein mit Ein- und Auslass versehenes Glasgehäuse gebracht.
Diese Vorrichtung wurde dazu verwendet, um die Umwandlung von
Glucose in Fructose durch Hindurchtretenlassen der Substratlösung
durch die aktive, immobilisierte, ganze Mikrobenseile enthaltende Membran zu katalysieren. Diese Vorrichtung wurde
nach dem Zirkulationsverfahren, mit Auswaschen nach jedem Durchlauf, bei 600C dreimal betrieben. Jedesmal wurde festgestellt,
dass die immobilisierte ganze Mikrobenzellen enthaltende Glucose-Isomerase aktiv war, wie dies durch eine beachtliche
(I3%ige) Umwandlung von Glucose in Fructose bewiesen
wurde.
409835/0796
Claims (18)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran, bestehend aus enzymatisch aktiven ganzen Mikrobenzellen, die mit Protein komplexiert wurden, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus einer Dispersion von Proteinnolekülen, welche mit einer Suspension von ganzen Mikrobenzellen zusammengemischt und komplexiert wurden, hergestellt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus der Dispersion gegossen und anschliessend getrocknet wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass aas Protein Kollagen ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran gegerbt wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dispersion bei einem pH-Wert von 2-12 gebildet wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus der Gruppe der Substanzen Kollagen, Zein, Kasein, Ovalbumin, Gluten des Weizens, Fibrinogen, Myosin, Mucoprotein oder aus der Gruppe der Polypeptide wie409835/0796Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylanalin, Polytyrosin und deren Polymeren mit Leucin und p-AmirLophenylanalin ausgewählt wird, um nach Vermischen und Komplexieren mit ganzen Mikro"benzellen komplexierende Gruppen zu bilden, welche aus den Gruppen mit vielfachen Wassersxoffbrücken, salzartigen Verknüpfungen und van der Waals-V/echse!Wirkungen aus gewählt s ind.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dispersion elektrolytisch gefällt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus der Gruppe der Substanzen Kollagen, Zein, Kasein, Ovalbumin, Gluten des V/eizens, Fibrinogen, Myosin, liucoprotein oder aus der Gruppe der Polypentide wie PoIyglutarnat, Polyaspartat, Polyphenylanalin, Polytyrosin und deren Polymere mit Leucin und p-Aninophenylanalin ausgewählt wird, um nach Vermischen und Kcmplexieren mit einer Suspension ganzer Mikrobenzellen komplexierende Gruppen zu bilden, welche aus den Gruppen mit vielfachen Wasserstoffbrücken, salzartigen Verknüpfungen und van der Waals-V/echselwirkungen ausgewählt sind, und dass die Xembran danach getrocknet wird.
- 9. Membran, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass besagte Membran eine ausreichende enzymatische Aktivität beibehält, um eine enzymatisch katalysierte Reaktion zu bewirken, wenn ein enzymatisch409835/0796behandelbares Substrat mit besagter Membran in Berührung gebracht wird.
- 10. Membran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus Kollagen oder Zein besteht.
- 11. Membran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dassdie Membran auf einer selbsttragenden Basis aufgeschichtet ist,
- 12. Membran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Membran in trockenem Zustand zwischen 0,005 und 0,1 mm liegt.
- 13. Membran nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Kollagen und die Membran gegerbt ist.
- 14. Membran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus der Gruppe der Substanzen Kollagen, Zein, Kasein, Ovalbumin, Gluten des Weizens, Fibrinogen, Myosin, Mucoprotein oder aus der Gruppe der Polypeptide wie PoIyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylanalin, Polytryosin und deren Polymeren mit Leucin und p-Aminophenylanalin ausgewählt wird, wobei das Komplexieren durch die Berührung besagter ganzer Mikrobenzellen mit dem besagten Protein eintritt, sodass komplexierende Gruppen gebildet werden, welcheaus der Gruppe mit vielfachen tfasserstoffbrücken, salzartigen Verknüpfungen und van der Waals-Wechselwirkungen ausgewählt sind.409835/0796
- 15. Anwendung der Membran nach, einem der vorhergehenden Ansprüche 9 "bis 14 zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in enzymatisch, reaktiven Substraten, wobei die besagten Substrate mit der enzymatisch, aktiven Membran in Berührung kommen.
- 16. Anwendung nach. Anspruch 15, dadurch, gekennzeichnet, dass das reaktive Substrat eine Stärkelösung ist, welche durch die Berührung mit der enzymatisch aktiven Membran hydrolysiert wird.
- 17c Anwendung nach. Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktive Substrat eine Sucrose-Lösung ist, welche durch die Berührung mit der enzymatisch aktiven Membran hydrolysiert wird.
- 18. Anwendung nach. Anspruch. 15, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktive Substrat D-Glucose ist, welche durch die Berührung mit besagter enzymatisch aktiver Membran isomerisiert wird.409835/0796ORIGINAL INSPECTED
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