DK148513B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzympraeparat ved hjaelp af et tvaerbindingsmiddel - Google Patents

Description

1 148513

Enzymer, der er inunobiliserede ved hjælp af et tværbindingsmiddel, er nogle af de mest udbredte udførelsesformer for inunobiliserede enzymer. Por at fremstille sådanne inunobiliserede enzymer har man udviklet et antal metoder. Ved en metode af denne art aktiverer man først en bærer med tværbindingsmidlet, og derpå behandles den med enzymet, som således bliver solidt knyttet til bæreren. En sådan aktivering kan omfatte en imprægnering af bæreren med en polyamin og en påfølgende behandling med et overskud af glutaraldehyd, som beskrevet i US patentskrift nr.

4.292.199, eller i Biotechnology and Bioengineering 22, side 271 - 287, 1980. En anden aktivering af denne art kan omfatte en overtrækning af en bærer med adsorptionsfremmende, uopløselig polymer, påfølgende adsorption af enzymet på den polymere, og en yderligere immobilisering ved tværbinding in situ, som beskrevet i US patentskrift nr. 3.705.084. En anden aktivering af denne art er beskrevet i US patentskrift nr. 4.069,106: En keratinholdig bærer aktiveres ved reduktion af kerat'inet og tværbinding af enzymet dertil via S-S grupper. En anden aktivering af denne art er beskrevet i US patentskrift nr. 3.802.909: Man sønderdeler glas i nærværelse af et protein, hvorved der fremkommer frisk fremstillede, aktive centre til at binde proteinet. En anden aktivering af denne art er beskrevet i US patentskrift nr. 3.519.538: Man behandler glas med kemikalier i en bestemt rækkefølge til frembringelse af de ønskede aktive centre. En anden fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzym er beskrevet i Biochemical and Biophysical Research Communications, bind 36, side 235 - 242, 1969: Enzymet adsorberes på kolloidalt silica, uden forudgående aktivering, og derpå stabiliseres det yderligere ved tværbinding med glutaraldehyd.

Alle de ovenfor angivne metoder udmærker sig ved, at et tyndt lag af enzymmolekyler bliver direkte tilknyttet til de aktive centre på en bærer, og at mængden af immobi- 2 148513 liseret enzym således bestemmes af antallet af de aktive centre.

En helt anden problemtilnærmelse omfatter, at man tilvejebringer et meget tykkere lag, der er knyttet til overfladen af bæreren, hvorved kun en lille brøkdel af enzymmolekylerne er i direkte kontakt med bæreren. På denne måde er det ikke overfladearealet af bæreren, der bestemmer mængden af immobiliseret enzym, og denne problemtilnærmelse muliggør, at man kan optimere mængden af bundet enzym, afhængigt af procesparametrene ved den sluttelige anvendelse. Denne problemtilnærmelse er imidlertid vanskeligere at gennemføre, fordi den relativt store enzymmængde gør det vanskeligt at holde enzymet på plads under immobiliseringen. Derfor har man publiceret relativt lidt i forbindelse med denne problemtilnærmelse, på trods af dens klare fordele. Et forslag, der er beskrevet i de canadiske patentskrifter nr. 1.011.671 og 1.011.672, er anvendelsen af en vandig opløsning af et vandopløseligt, organisk opløsningsmiddel som tværbindingsmediet, hvorved koncentrationen af det organiske opløsningsmiddel bliver holdt på en. værdi, der er tilstrækkeligt høj til at holde enzymet i uopløst tilstand, men alligevel tilstrækkeligt lille til ikke at interferere for meget med tværbindingsreaktionen. Den største ulempe i forbindelse med denne metode er kravet omfattende relativt store mængder af organiske opløsningsmidler, hvilket er ledsaget af eksplosionsrisici, som nødvendiggør omfattende sikkerhedsforanstaltninger. Det produkt, der fremkommer på denne måde, er heller ikke helt tilfredsstillende hvad angår fysisk stabilitet og aktivitetsudbytte, sandsynligvis på grund af den relativt høje koncentration af det organiske opløsningsmiddel, som er nødvendig for at holde enzymet ude af opløsning under immobiliseringen. En anden fremgangsmåde, der har relation til dette problem, er foreslået i US patentskrift nr. 4.116.771: Enzymet behandles med glutar-aldehyd og et indifferent protein i et begrænset volumen af vand, før det hurtigt tilsættes til bæreren, hvorefter man 3 148513 lader blandingen gelere, hvorpå der granuleres og slutteligt tørres. Den største ulempe ved denne fremgangsmåde er den høje koncentration af tværbindingsmiddel, som er en følge af den begrænsede vandmængde. Mange enzymer er meget følsomme overfor høje koncentrationer af tværbindingsmidler, enten fordi de bliver inaktiveret eller fordi de gøres utilgængelige ved den senere anvendelse på grund af den udstrakte tværbinding, eller på grund af begge disse forhold. Dette illustrerer den største vanskelighed, som forekommer, når man gør brug af en stor mængde enzym i forhold til en bærer:

For at opnå en tilstrækkelig lav koncentration af tværbindingsmidlet behøver man relativt store mængder af medium, som gør det umuligt at forhindre enzymet i at opløses i mediet, før tværbindingen bliver effektiv, hvorimod høj koncentration af tværbindingsmidlet, som kan forhindre enzymet i at blive opløst, er uønsket, som forklaret i det foregående.

En helt anden problemtilnærmelse er den fuldstændige undgåelse af det vandige medium og anvendelse af en gasfase i stedet; dette er beskrevet i The Journal of Society of Chemical Industry, bind 18, side 16 - 20 (1899), i forbindelse med fremstilling af uopløselige gelatinefibre, og i japansk patentskrift J 57002683 i forbindelse med immobilisering af enzymer. Denne metode vil imidlertid kræve et meget gennemført ventilationssystem, og den vil yderligere kræve specielle midler til forhindring af dannelsen af uopløselige aflejringer inden i ventilationssystemet.

Det er således opfindelsens formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat ved hjælp af et tværbindingsmiddel, hvilken metode skal være simpel at gennemføre, f.eks. uden nødvendigheden af omstændelige sikkerhedsforanstaltninger, og ved hvis hjælp det immobiliserede enzym kan fremstilles med højt enzymudbytte og med god fysisk stabilitet.

Ifølge opfindelsen har det nu vist sig, at det er muligt at opfylde opfindelsens formål ved hjælp af visse 4 148513 salte i en specificeret minimalkoncentration. Selvom den tidligere anførte, kendte teknik udelukkénde har relation til immobiliserede enzympræparater på bærere, kan der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen også fremstilles immobili-serede enzympræparater uden nogen bærer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den i indledningen til krav 1 angivne art, er således ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

I tilfælde af, at det færdige, immobiliserede enzym indeholder et overskud af glutaraldehyd, kan dette sidste fjernes ved vaskning.

Det må forstås, at enzympræparatet kan være et enzym i fast eller opløst tilstand; desuden kan enzympræparatet foreligge i høj renhed, eller dét kan indeholde indifferente additiver (f.eks. fyldstoffer, forstærkningsmidler, bindemidler eller granuleringsmidler). Det må også forstås, at den rækkefølge, i hvilken bestanddelene bringes sammen, er vilkårlig, med det forbehold, at enzymudbyttet vil synke, . hvis salttilsætningen forsinkes urimeligt meget, i det tilfælde, at enzympræparatet og tværbindingsmidlet bringes sammen før salttilsætningen.

Den ovenfor angivne kategori af salte (hvorved en specifik kategori af salte kan tildeles til hver kombination af et specifikt enzym og et specifikt tværbindingsmiddel) omfatter sædvanligvis billige salte. Det må forstås, at et eller flere enzymer, et eller flere tværbindingsmidler og et eller flere salte kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne. Skønt fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres uden bærer, jfr. eksempel 15, foretrækkes det sædvanligvis at anvende en bærer, hovedsageligt på grund af den mulighed, som bæreren frembyder hvad angår fremstilling af en partikel med overlegne strømningsegenskaber, som er fordelagtige i forbindelse med anvendel 5 U8513 sen af sammenpakkede masser. Uanset, om enzymet foreligger i fast eller opløst tilstand, er det i dette tilfælde fast bundet til bæreren; i fast tilstand kan enzymet være et overtrækslag på bæreren, og i opløst tilstand kan enzymopløsningen imprægnere den (porøse) bærer.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 3 angivne. Herved muliggøres det, at man kan producere et enzympræparat med enhver ønsket enzymladning indenfor brede grænser ved at variere tykkelsen af enzymlaget.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af kra/ 4 angivne. Herved tilvejebringes der en meget simpel fremgangsmåde til fremstilling af det immobili-serede enzympræparat ifølge opfindelsen.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 5 angivne. Glutaraldehyd er relativt billigt, og sundhedsmyndighederne rejser ikke indvendinger imod glutaraldehyd. Hertil kommer, at glutaraldehyd overfor mange enzymer er et meget effektivt og dog mildt tværbindingsmiddel.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 6 angivne. Som det fremgår af eksemplerne senere i denne beskrivelse afhænger enzymaktivitetsudbyttet af koncentrationen af glutaraldehyd, og sædvanligvis vil den glutaraldehydkoncentration, der svarer til et maksimalt enzymaktivitetsudbytte, findes indenfor de ovenfor angivne intervaller. Det procentiske indhold af glutaraldehyd (w/v) beregnes i henhold til formlen 6 148513 vægt af glutaraldehyd, g x 100 volumen af (saltopløsning og glutaraldehyd), ml

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendtegnen-de del af krav 7 angivne. Sædvanligvis er disse salte billige og genvindelige, og de frembyder mulighed for fremstilling af et immobiliseret enzympræparat med højt enzymaktivitet s udbyt te.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 8 angivne. Som det fremgår af eksemplerne senere i denne beskrivelse er det muligt at vælge en glutar-aldehydkoncentration og en saltmolaritet indenfor de ovenfor angivne intervaller, som svarer til et meget højt enzymaktivitetsudbytte .

Selvom man anvender de ovenfor angivne salte i lavere koncentrationer end hvad der er nødvendigt til bund-fældning af enzymerne, vil man således herved i praksis forhindre enzymet i at gå i opløsning i tværbindingsmediet (saltopløsningen), mens det holdes fuldt ud tilgængeligt for tværbindingsmidlet, hvis enzymet foreligger i fast tilstand, eller man vil forhindre enzymet i at blandes med saltopløsningen, hvis enzymet er opløst. På denne måde kan man anvende én optimal koncentration af tværbindingsmidlet, som kun vil beskadige enzymet i minimalt omfang, og alligevel meddele en tilstrækkeligt god fysisk stabilitet. Det har således vist sig, at man for at reducere koncentrationen af tværbindingsmiddel må forøge saltkoncentrationen for at holde enzymaktivitetsudbyttet på det optimale niveau. Ifølge opfindelsen bør man undgå anvendelsen af salte, som reagerer med enten enzymet eller tværbindingsmidlet, såsom sølveller kviksølvsalte, som kan inaktivere enzymet, eller ammoniumsalte eller primære aminsalte eller sulfitsalte, der har tendens til at reagere med mange forskellige tværbindingsmidler. De salte, som kan anvendes til opfindelsen, 7 148513 varierer i høj grad hvad angår deres effektivitet, og hertil kommer, at denne effektivitet har tendens til at variere fra et enzym til et andet. Nogle generelle retningslinier hvad angår valget af salt kan dog opstilles, nemlig følgende. Det er tilrådeligt at vælge det mest opløselige salt, når to salte iøvrigt er identiske hvad angår deres egenskaber.

Således foretrækker man sædvanligvis Na2S0^ fremfor I^SO^ , fordi det først anførte salt har langt højere opløselighed.

Det har også vist sig, at det sædvanligvis gælder, at salte af multivalente anioner, såsom sulfater, phosphater, carbo-nater, citrater og lignende, er mere effektive end salte af de monovalente anioner, såsom chlorider og nitrater. Det modsatte gælder sædvanligvis for kationerne: De monovalente kationer, såsom Na+, K+ eller tetramethylammonium, er mere effektive end de multivalente kationer, såsom Mg++ eller Ca++. De foretrukne salte er derfor alkalimetalsaltene af sulfater, phosphater og citrater, især natriumsulfat, natri-umphosphat, kaliumphosphat, kaliumcitrat og tetramethylam-moniumsulfat.

Saltkoncentrationen holdes sædvanligvis på en så lav værdi som muligt. Dette minimum afhænger på den ene side af det pågældende enzym, fordi forskellige enzymer ofte kræver forskellige koncentrationer, og på den anden side af koncentrationen af tværbindingsmidlet: Jo højere denne sidste er, desto mindre salt kræves der, og vice versa. Koncentrationen af tværbindingsmiddel holdes også på et miminum, da de fleste enzymer er følsomme overfor tværbindingsmidler. Dog bør koncentrationen være tilstrækkelig høj til at sikre en effektiv immobilisering. Man bør dog udvise særlig omhu, når man etablerer de optimale betingelser for tværbindingsreaktionen ved meget høje saltkoncentrationer, især med effektive salte. Det har således vist sig, at aktivitetsudbytterne ved høje koncentrationer af f.eks.

Na SO eller kaliumphosphat reduceres i betydeligt omfang i sai&meAligning med aktivitetsudbytterne ved moderate koncentrationer. Dette skyldes formentligt den meget solide 8 1485 13 tværbinding, som gør enzymmolekylerne partielt utilgængelige.

En yderligere fordel ved at anvende disse salte i tværbindingsmediet er, at man forhindrer de enzymholdige - partikler i at aggregere under immobiliseringsreaktionen, hvis enzymet foreligger i fast tilstand. En sådan aggregering er uønsket, fordi den resulterer i lavere effektiviteter og i underlegne strømningsegenskaber under anvendelsen. Det har også vist sig, at salte afviger meget fra hinanden, i denne henseende.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen 3.an gennemføres i et antal trin, hvis rækkefølge ikke er kritisk. Ved en foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen behandler man således først en bærer med en enzymopløsning, man tørrer, og derefter behandles i en opløsning indeholdende et tværbindingsmiddel og salt, hvorpå der vaskes og eventuelt tørres. Ved en variation af den samme proces kan en del af den totale saltmængde foreligge i enzymopløsningen. Ved en anden variation behandles enzymet først med tværbindingsmidlet og umiddelbart derefter med saltet. Til visse anvendelser, f.eks. når det er ønskværdigt, at det immobiliserede enzym skal være let og fibrøst, kan mængden af bæreren være meget lille, eller bæreren kan fuldstændig undgås, og enzymet behandles i et koaguleringsbad med tværbindingsmidlet og saltet. Enzymet kan således opløses i en opløsning, som koaguleres i et saltbad, hvorved tværbindingsmidlet tilsættes til enzymopløsningen eller til badet, enten før eller efter koagulering. Saltet kan også tilsættes som et tørt pulver, i stedet for en opløsning, når det ønskes at begrænse mængden af vand. Den rækkefølge, i hvilken de forskellige komponenter bringes sammen, eller deres tilstand, d.v.s. om de foreligger i en opløsning eller i tør tilstand, er således ikke kritisk for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

pH, temperaturen og varigheden af tværbindingsreaktionen kan have en dybtgående virkning på aktivitetsbyttet, afhængigt af enzymet og indifferente additiver, hvis 9 U8S13 sådanne er tilstede. Sædvanligvis har det vist sig, at et pH-interval fra ca. 4 til ca. 9 er velegnet. Det temperaturinterval, der i de fleste tilfælde er velegnet, ligger mellem ca. 15°C og ca. 30°C, skønt højere temperaturer med fordel kan anvendes i visse tilfælde, f.eks. når det ønskes at forkorte varigheden af tværbindingsreaktionen, og lavere temperaturer med fordel kan anvendes i tilfælde af meget temperaturfølsomme enzymer. Varigheden af tværbindingsreaktionen kan variere i vidt omfang, fra nogle få minutter til nogle få dage, i afhængighed af typen og koncentrationen af tværbindingsmidlet, typen og koncentrationen af saltet, enzymet, pH og temperaturen, og den bør derfor bestemmes i hvert individuelt tilfælde. For glutaraldehyd og de fleste enzymer synes imidlertid intervallet fra ca. 10 minutter til adskillige timer ved stuetemperatur at være velegnet.

I det følgende er der henvist til forskellige NOVO-referencer. Kopier af alle disse referencer kan rekvireres fra NOVO Industri A/S, Novo Alle, 2880 Bagsværd,

Danmark.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal nu illustreres ved de følgende eksempler.

I den følgende del af beskrivelsen omfattende eksemplerne er der angivet værdier for trykfaldet (fysisk styrke) under søjledrift. Denne værdi bestemmes i overensstemmelse med AF 166/2, der er en beskrivelse af en NOVO-laboratoriemetode. Nogle teoretiske betragtninger i forbindelse med denne trykfaldsbestemmelse er beskrevet i Starch/St’årke 31 (1979) nr. 1, side 13 - 16. Med henblik på sammenligning med kendte, kommercielle produkter kan det anføres, at de bedste værdier for trykfaldet for de immobi-liserede glucoseisomerasepræparater SWEETZYME er ca. 10 g/cm2 . Det fremgår af eksemplerne, at trykfald med de immo-biliserede enzympræparater produceret ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan være så små som 2 g/cm2, og at alle værdier er betydeligt lavere end 10 g/cm2, hvorved den tekniske fordel ved opfindelsen er tydeligt påvist.

10 U8513

Eksempel 1

Portioner på 20 g af tørre bærepartikler, der er overtrukket med et partielt renset glucoseisomerasepræparat i en udstrækning svarende til 28% w/w og fremstillet i henhold til den metode, der er beskrevet i eksempel 12 i den samtidigt verserende danske ansøgning nr. 4427/83, blev suspenderet og holdt under moderat omrøring ved stuetemperatur i 500 ml opløsning indeholdende 0,06 M natriumphosphat, 1,4 M Na2SO^ og forskellige mængder glutaraldehyd, indstillet på pH 7,0. Efter 1 times forløb blev partiklerne fjernet og suspenderet i 1 time i 0,06 M natriumphosphatopløsning indstillet på pH 7,0. Denne vaskning blev gentaget 3 gange, og derpå blev partiklerne overladt til sig selv natten over i phosphatopløsningen, hvorpå deres aktivitet blev bestemt i henhold til NOVO analyseforskrift AF 189/1. Resultaterne er vist på fig. 1, som er en afbildning, hvor den procentiske mængde glutaraldehyd er afbildet mod enzymaktivitetsudbyttet udtrykt som enzymenheder/g, og som viser følsomheden af enzymet overfor glutaraldehyd.

Eksempel 2 (sammenligning)

Man fremstillede partikler som i eksempel 1, men man tilsatte dog ikke noget salt, med undtagelse af en minimal mængde phosphat, der tjente som stødpude (0,06 M natriumphosphat, pH 6,5). Den procentiske mængde glutaraldehyd blev afbildet mod enzymaktivitetsudbyttet i enheder/g, jfr. fig. 2, der viser, at tværbindingsmidlet har to modsatte virkninger: På den ene side forøger det udbyttet ved at forhindre enzymet i at gå i opløsning, og på den anden side reducerer det udbyttet ved at inaktivere enzymet. Den optimale værdi ligger i dette tilfælde ved ca. 1% glutaraldehyd. Ved at sammenligne fig. 1 med fig. 2 viser det sig, at den optimale værdi for glutaraldehydkoncentrationen er ca.

40 gange så høj som med 1,4 M natriumsulfat, og at udbyttet i dette tilfælde kun er ca. 60% af udbyttet med saltet.

11 148513

Eksempel 3

Man fremstillede partikler som i eksempel 1, men i dette tilfælde anvendte man kaliumphosphat som saltet, og saltkoncentrationen blev varieret, mens man holdt glutaral-dehydkoncentrationen konstant på tre niveauer og mens pH blev holdt på 6,5. Den procentiske mængde af kaliumphosphat blev afbildet mod enzymaktivitetsudbyttet i enheder/g, jfr. fig. 3, hvoraf den fordelagtige virkning ved at forøge saltkoncentrationen tydeligt fremgår, især ved en lav glu-taraldehydkoncentration.

Eksempel 4

Forsøget i eksempel 3 blev gentaget, med undtagelse af, at man her anvendte natriumsulfat i stedet for kaliumphosphat. Molariteten af Na2S04 blev afbildet mod enzymaktivitetsudbyttet i enheder/g, jfr. fig. 4, hvoraf den fordelagtige virkning af saltet tydeligt fremgår. Som det også fremgår af fig. 4 foreligger der en optimal værdi for salteffekten, hinsides hvilken aktivitetsudbyttet reduceres, hvorved dette optimum afhænger af glutaraldehydkoncentratio-nen.

Eksempel 5

Det i eksempel 3 beskrevne forsøg gentages, med undtagelse af, at saltkoncentrationen forøges. Molariteten af kaliumphosphat blev afbildet mod enzymaktivitetsudbyttet i enheder/g, jfr. fig. 5. En sammenligning mellem fig. 4 og fig. 5 viser, at Na2S04 og kaliumphosphat opfører sig på lignende måde.

Eksempel 6

Det i eksempel 1 beskrevne forsøg gentages, med undtagelse af, at man anvendte kaliumcitrat, pH 7,0, i stedet for phosphat og sulfat i tværbindingsmediet. På fig.

6 er glutaraldehydkoncentrationen afbildet mod aktiviteten i 12 168513 enzymenheder/g, og det er tydeligt, at resultaterne ligner resultaterne i eksempel 1.

Eksempel 7 20 g tørrede bærerpartikler fremstillet som i eksempel 4 i den samtidigt verserende danske patentansøgning nr. 4427/83 blev fluidiseret i en fluidiseret masse af laboratorietypen. 45,8 g 11,0% w/w homogeniseret celleslam (fermenteret som angivet i eksempel 1 af dansk patentansøgning nr. 5190/79, slam produceret som angivet i eksempel 4 af dansk patentansøgning nr. 5190/79) indeholdende 80,1 enheder/g thermophil lactase fra Bacillus sp. NRRL B-11.229 blev sprøjtet på bærerpartiklerne ved 30 - 40°C, og man lod de overtrukne partikler tørre. Lactaseaktivitetsenheden er defineret som den mængde lactase, som vil spalte 1 μπιοί lactose/minut under følgende reaktionsbetingelser: substratkoncentration = 10% lactose, temperatur = 60°C, pH = 6,5 og reaktionstid =30 minutter. Enzymaktivitetsudbyttet var 79,8%. 10 g overtrukne kugler blev derpå behandlet i 250 ml opløsning indeholdende 0,06 M Na2HP04, 1,4 M Na2S04 og 0,1% w/v glutaraldehyd ved pH 7,5. Efter 1 time ved stuetemperatur blev partiklerne fjernet og vasket grundigt med 0,06 M K2HPC>4 ved pH = 7,5. Aktivitetsudbyttet under tværbindingstrinnet var 17,2%.

Eksempel 8 24 g tørrede bærerpartikler fremstillet som i eksempel 4 i samtidigt verserende dansk patentansøgning nr. 4427/83 blev udblødt i 20,2 g opløsning af en 39,6% w/w delvist renset amyloglucosidase fra A. niger fremstillet ved ultrafiltrering af det kommercielle produkt AMG 200 L (beskrevet i NOVO-brochuren NOVO ENZYMES AMG, B020 g-GB) for at fjerne lavmolekylære bestanddele til et tørstofindhold af 39,6% w/w (aktivitet 2610 IAG/g, hvorved aktivitetsenheden er defineret i NOVO Analyseforskrift AF 159/2). Man gjorde brug af vacuum i 1 time. Det således fremkomne produkt 13 1A8513 indeholdt 25 vægt% tørstof af delvist renset amyloglucosida-se med et enzymaktivitetsudbytte på 77,9%.

20 g partikler med 71,8% tørstof blev derpå behandlet i 1600 ml af en opløsning af 0,06 M NaH^PO^, 1,4 M Na2SC>4 og 0,2% glutaraldehyd ved pH = 4,5. Efter 1 time blev partiklerne fjernet ved filtrering og vasket med 0,06 M NaH2P04 ved pH = 4,5.

Enzymaktivitetsudbyttet under tværbindingstrinnet var 55,1%.

Eksempel 9 40 g bærerpartikler fremstillet som angivet i eksempel 4 i samtidigt verserende dansk patentansøgning nr. 4427/83 og med et tørstofindhold på 98,8% og 24 g under vacuum behandlet delvist renset glucoseisomerasekoncentrat fra Bacillus coagulans, hvortil der var tilsat 5% glucose og 8% natriumsulfat (tørstof 41,8%) blev blandet, og man lod væsken fortrænge luften i porerne af partiklerne ved vacuum-behandling. Vægt efter blanding var 63,22 g. Tørstofprocenten var 79,2.

18 g portioner af dette præparat ( 14 g tørstof) blev behandlet i 1 time ved stuetemperatur med 375 ml af en opløsning, der i alle tilfælde indeholdt 1,5 M natriumsulfat, 5% glucose og 0,06 M natriumphosphat, indstillet på pH 7,5, og som yderligere enten indeholdt 0,1 eller 0,2 eller 0,3% glutaraldehyd.

Efter denne behandling blev portionerne vasket 5 gange med ca. 150 ml 1% natriumphosphat, pH 7,5.

Enzymaktiviteten blev bestemt i henhold til AF 189/1 efter at væsken var løbet bort fra partiklerne. Man bestemte også tørstof på de drænede partikler.

14 148513 tørstoffer, enhe- enhe- Udbytte, Irmtob.

% dsr/g der/g % udbytte, % våd tør

Enzymkoncentrat 41,8 1415 3385 -

Enzymkoncentrat 79,2 463 585 86 + bærer

Inniobiliseret m. 32,5 158 486 72 83

0,1% GA

Inniobiliseret m. 38,9 141 362 53 62 0,2% (¾

Inniobiliseret m. - 117 333 49 57 0,3%

Man undersøgte portioner, som svarede til 5 g tørstof, for trykfald.

Glutaraldehyd- Trykfald koncentration 25 timer 50 timer under immobilisering OTTI 3 5 0,2% 1 3 0,3% 2 3

Eksempel 10

Dette eksempel beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt baseret på aktivt kul fra Norit som bærer.

Man udblødte således 20 g Norit Rox 0,8 aktivt kul af type Ά-3397 i 33 g opløsning af 39,2% w/w delvist renset glucoseisomerase fra Bacillus coagulans (aktivitet 3950 enheder/g tørstof, hvorved aktivitetsenheden er defineret i NOVO "Analyseforskrift" AF 189/1).

Man vacuumbehandlede i 20 timer ved 4°C, idet man dog i denne periode afbrød vacuet 4 gange. Det således 15 U8513 fremkomne produkt indeholc.t 35 vægt% partielt renset glucoseisomerasetørstof med 97% enzymaktivitetsudbytte.

98% af det ovenfor angivne, som et aggregat foreliggende produkt blev derpå immobiliseret i 890 ml af en opløsning af 0,06 M KH2P04, 1,4 M Na2S04 og 0,18% glutaral-dehyd, indstillet til pH 7,5 med 4 N NaOH. Efter 2 timers forløb ved stuetemperatur under forsigtig omrøring blev partiklerne fjernet ved filtrering og vasket grundigt med 0,06 M KH2P04, pH 8,0.

Aktivitetsudbyttet under tværbindingstrinnet var 31%.

Eksempel 11

Dette eksempel beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat med en bærer bestående af silica-kugler med en diameter på ca. 2 mm.

A. 20 g af silica-kuglerne blev fluidiseret i en fluidiseret masse af laboratorietypen, og 40 g opløsning af 15% w/w delvist renset glucoseiso-merase fra Bacillus coagulans (aktivitet 3306 enheder/g tørstof, hvorved aktiviteten er defineret i NOVO analyseforskrift AF 189/1) blev sprøjtet på kuglerne ved 25 - 30°C, og man lod de overtrukne kugler tørre. Det således opnåede produkt indeholdt 23 vægt% delvist renset glucose-isomerase med 78% aktivitetsudbytte.

95% af de overtrukne kugler blev derpå behandlet i 500 ml opløsning indeholdende 0,06 M F^HPO^, 1,4 M Na^SO^ og 0,1% w/v glutaraldehyd, indstillet til pH 7,5 med 4 N NaOH; efter en time ved stuetemperatur blev partiklerne fjernet og vasket grundigt med 0,06 M KH2P04 ved pH 8,0.

Derpå bestemtes aktiviteten. Aktivitetsudbyttet under tværbindingstrinnet var 55%.

16 148513 B. 20 g af silica-kuglerne blev udblødt i 15 g opløsning af 40% w/w delvist renset glucose-isomerase fra Bacillus coagulans (aktivitet 3270 enheder/g tørstof), idet der var tilsat 0,56 M Na^SO^. Man vacuumbehandlede i 20 minutter, idet vacuet dog blev afbrudt fire gange i dette tidsrum. Det således fremkomne produkt indeholdt 20 vægt% delvist renset glucoseisomerase med 90% enzymaktivitetsudbytte. 75% af de overtrukne kugler blev derpå behandlet som beskrevet i del A i dette eksempel. Aktivitetsudbyttet under tværbindingstrinnet var 45%.

I nogle tilfælde, hvor enzymet er særligt vanskeligt at tværbinde, er tilstedeværelsen af salte ikke blot fordelagtig, men snarere absolut nødvendig, hvis enzymet skal tværbindes i ren tilstand. Et godt eksempel er den amyloglucosidase, som produceres af NOVO (og som f.eks. sælges under varemærket AMG 200 L, jfr. brochuren NOVO ENZYMES AMG, B 020 g-GB 2500 July, 1982), og som er praktisk taget umulig at immobilisere med glutaraldehyd, når den foreligger i ren tilstand: det har vist sig umuligt at uopløseliggøre denne amyloglucosidase selv ved så høj en glutaraldehydkoncentration som 50% w/w. Ved hjælp af de salte, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (ganske vist i ret høje koncentrationer), er det imidlertid muligt på effektiv måde at insolubilisere enzymet, selv ved • en glutaraldehydkoncentration, der er så lav som 0,05% w/v, som vist i de følgende eksempler 12 - 17. De således fremkomne præparater, som har udmærket filtrerbarhed, men som alligevel let kan bringes i suspension, kan med fordel anvendes ved fremstillingen af f.eks. øl med lavt kalorieindhold.

17 148513

Eksempel 12

Kommercielt NOVO AMG 200 L fortyndet til et tørstofindhold af 30% w/v blev blandet med Hiflo Celite og tørret, hvorved man opnåede et præparat, der indeholdt 21% w/w tørstof hidrørende fra AMG-præparatet. 1 g portioner af præparatet blev derpå tilsat til en opløsning indeholdende 2,4 M Na2S04, 0,06 M kaliumphosphat ved pH 6,5 og glutaral-dehyd i forskellige koncentrationer ved 32°C, og hele blandingen blev overladt til sig selv ved denne temperatur i 20 timer. Partiklerne blev derpå filtreret og skyllet tre gange med afioniseret vand, og aktivitetsudbyttet blev målt. Resultaterne viser det sædvanlige mønster omfattende de to modsat rettede virkninger af glutaraldehyd med et optimum på 0,05%, jfr. fig. 7.

Eksempel 13

Man gentog den samme metode som i eksempel 12, men anvendte dog forskellige koncentrationer af Na2S04· Aktivitetsudbyttet med dette enzym er yderst følsomt overfor mængden af tilstedeværende salt, jfr. fig. 8.

Eksempel 14

Fremgangsmåden i eksempel 12 blev gentaget, med undtagelse af, at man her anvendte et AMG-præparat, der kun indeholdt halvt så meget enzym. Som resultat heraf kunne man tydeligt iagttage en forskydning af glutaraldehyd-optimet til en lavere koncentration, jfr. fig. 9.

Eksempel 15 NOVO AMG 200 L blev sprøjtetørret, og det resulterende pulver blev anvendt som udgangsmateriale, hvorved metoden blev varieret i et vist omfang: 0,5 g af AMG-pulver blev tilsat til 100 ml af en opløsning indeholdende 2,5 M Na2S04, 0,1 M kaliumphosphat, pH 6,5, og 1% w/v glutaraldehyd ved 32°C, og blandingen blev overladt til sig selv ved denne temperatur i 1 time med lejlighedsvis rystning. De 18 148513 således dannede, uopløselige partikler blev derpå filtreret og inkuberet igen i det samme medium, blot uden glutaralde-hyd, og ved den samme temperatur i yderligere 20 timer.

Derpå blev det filtreret og skyllet tre gange med afioniseret vand. Disse let filtrerede mikrokugler havde en diameter på ca. 10 - 100 μιίι, og de bibeholdt 19% af den oprindelige aktivitet.

Eksempel 16

Man fulgte en fremgangsmåde, der var identisk med fremgangsmåden i eksempel 15, med undtagelse af, at glutar-aldehydet blev tilsat til saltopløsningen efter at enzympul-veret var blevet tilsat dertil. På denne måde fremkom der et lignende produkt med 34% af den oprindelige aktivitet.

Eksempel 17

Også i dette tilfælde fulgte man metoden i eksempel 15, med undtagelse af, at man kun anvendte 0,4% w/v glutaraldehyd, og at den totale inkubation blev forkortet til 3 timer. På denne måde fremstilledes et produkt med 37% af den oprindelige aktivitet.

Eksempel 18

Dette eksempel illustrerer anvendeligheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forbindelse med andre tværbindingsmidler end glutaraldehyd, nemlig multivalente kationer. I dette tilfælde anvendtes Sn++++ som tværbindingsmidlet. Man tilsatte således langsomt og under omrøring 0,5 g af Celite-AMG-præparatet fra eksempel 12 i den tilstand, hvori det forelå før tværbinding, til en 100 ml opløsning indeholdende 2 M Na2S04, 0,4 M kaliumacetat (pH 4,35) og 0,086 M SnCl4, 5 H20, og man overlod blandingen til sig selv ved stuetemperatur i 5 minutter med lejlighedsvis rystning. De således dannede partikler blev filtreret og tilført til 100 ml 0,2 M kaliumacetat, pH 4,35,. og suspensionen blev holdt under omrøring i 5 minutter. Denne proce- 19 1 <485 13 dure blev gentaget 3 gange. Slutproduktet udviste et enzymaktivitetsudbytte på 43%.

Eksempel 19 I dette eksempel fremstillede man et produkt i henhold til den metode, der er beskrevet i eksempel 18, med undtagelse af, at koncentrationerne af acetat og stannisalt blev fordoblet til henholdsvis 0,8 M og 0,017 M. Der fremkom et lignende produkt, hvorved enzymaktivitetsudbyttet var 65%.

Eksempel 20

Også i dette eksempel gentog man metodeh fra eksempel 18; men her var acetatkoncentrationen reduceret til halvdelen, d.v.s. 0,2 M. Også i dette tilfælde fremkom der et lignende produkt med et enzymaktivitetsudbytte på 48%.

Eksempel 21 I dette eksempel beskrives anvendelsen af et yderligere tværbindingsmiddel, nemlig benzoquinon. Man tilsatte således 0,5 g af et tørret Celite-AMG-præparat som i eksempel 12 til 75 ml af en blanding indeholdende 2,1 M Na2SO^ og 0,05 M natriumacetat, og derpå tilsattes 5 ml af en opløsning af 20% w/v benzoquinon i rent ethanol, og hele blandingen blev overladt til sig selv ved stuetemperatur i 80 minutter med lejlighedsvis omrøring. De således blandede partikler blev derpå filtreret, indført i 75 ml 0,1 M kaliumacetat-stødpude, pH 4,4, holdt under omrøring i 5 minutter og igen filtreret. Denne procedure blev gentaget 3 gange, og derpå blev aktiviteten bestemt. Enzymaktivitetsudbyttet var 14%.

Claims (4)

20 148513

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat ved hjælp af et tværbindingsmiddel, kendetegnet ved, at følgende komponenter bringes sammen i et vandigt medium: a) et enzympræparat i fast eller opløst tilstand, b) et tværbindingsmiddel og c) et vandopløseligt salt, som ikke reagerer med tværbindingmidlet eller inaktiverer enzymet, i en koncentration, der er tilstrækkelig til at forhindre, at nogen væsentlig del af enzymet opløses i eller blandes med saltopløsningen, medens tværbindingsreaktionen finder sted, hvorpå det immobiliserede enzympræparat udvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzympræparatet omfatter en bærer.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at enzympræparatet er en bærer, der er overtrukket med et lag af fast enzym.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at enzympræparatet er en porøs bærer, der er imprægneret med en enzymopløsning.