DK146481B

DK146481B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt

Info

Publication number: DK146481B
Application number: DK311279AA
Authority: DK
Inventors: Sven Branner-Joergensen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1978-08-14
Filing date: 1979-07-24
Publication date: 1983-10-17
Also published as: NL7906064A; US4266029A; DK311279A; DK146481C

Description

λ 146481

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt, der er velegnet til anvendelse i et ekspanderet eller fluidiseret leje.

Det er kendt, at man kan tilskrive anvendelsen af 5 immobiliserede enzymer i et ekspanderet eller fluidiseret leje mange fordele i sammenligning med anvendelsen af immobiliserede enzymer i en fast masse. Sådanne fordele er anført i U.S.A. patent nr. 3.928.143. De vigtigste fordele ved driften i et fast leje er, at man totalt undgår forstop-10 pelse i et ekspanderet eller fluidiseret leje, og at det er muligt at anvende substrater med partikelformede materialer i et ekspanderet eller fluidiseret leje.

På trods af disse fordele gennemføres næsten alle industrielle kontinuerlige processer, hvori man anvender 15 immobiliserede enzymer, i fast leje, blandt andet fordi partiklerne med den enzymatiske aktivitet i et ekspanderet eller fluidiseret leje slides ned under drift som resultat af kollisioner mellem de individuelle partikler.

Der foreligger således et behov for immobilisering 20 af enzymholdige partikler, der er velegnet til anvendelse i et ekspanderet eller fluidiseret leje, som har bedre slidresistens end de tidligere kendte, immobiliserede enzymholdige partikler, der er velegnet til anvendelse i et ekspanderet eller fluidiseret leje.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

Det har overraskende ifølge opfindelsen vist sig, at overtrækningen af det partikelformede materiale med høj massefylde med gelatine og behandlingen af det således over-30 trukne, partikelformede materiale med høj massefylde med glutaraldehyd i kombination med anvendelsen af polyethylen-imin og den senere behandling af den pastaagtige blanding med glutaraldehyd frembringer et immobiliseret enzymprodukt, hvori enzymerne binder yderst stærkt til det partikelformede 35 materiale med høj massefylde, og som udviser en exceptionelt høj slidresistens.

2 166481

Man kender ganske vist fra U.S.A. patent nr.

3.796.634 en fremgangsmåde til fremstilling af et immobili-seret enzymprodukt, hvor et enzym adsorberes på et partikelformet materiale, såsom silica, overtrukket med en tværbun-5 det polyamin, hvorpå enzymet tværbindes, fortrinsvis med glutaraldehyd, men ved denne kendte fremgangsmåde foreligger der en række begrænsninger, der ikke foreligger ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, jævnfør de følgende forskelle 1), 2) og 3). 1) I henhold til U.S.A. patentet krydsbindes 10 det til bæreren adsorberede enzym ved indvirkning af et krydsbindingsreagens, fortrinsvis glutaraldehyd. Det er således en forudsætning for bevarelse af enzymets biologiske aktivitet, at krydsbindingsreagenset ikke inaktiverer enzymet. Glutaraldehyd vil i almindelighed inaktivere enzymer, 15 hvor SH- eller NH2-grupper er essentielle i det katalytisk aktive center. I henhold til opfindelsen blandes enzym og polyethylenimin til en pasta. Således kan selv enzymer, hvis aktivitet er meget følsom overfor glutaraldehyd, immobilise-res uden væsentligt tab af aktivitet, idet reaktionen i 20 disse tilfælde fortrinsvis kan bringes til at foregå mellem - - glutaraldehyd og polyethylenimin. 2) U.S.A. patentet angår en adsorption af enzymet til en passende ladet partikeloverflade, og aktiviteten af det kendte immobiliserede enzym er derfor begrænset af bærepartiklernes adsorptionskapacitet.

25 Ifølge opfindelsen foreligger der ikke en sådan begrænsning, idet den overtrukne bærepartikel blandes med en pasta indeholdende enzymet og polyethylenimin, og herved kan man frit vælge mængdeforholdene mellem bærer og enzym. 3) Ifølge U.S.A. patentet er valget.af krydsbindingsreagens afhængigt 30 af det protein, der ønskes immobiliseret. Således må man vælge andre krydsbindingsreagenser end det foretrukne glu-. taraldehyd, .hvis proteinet har en utilstrækkelig aminfunkti-onalitet. Ifølge opfindelsen kan glutaraldehyd anvendes som . krydsbindingsreagens uanset hvilket protein, der ønskes 35 immobiliseret, idet den nødvendige aminfunktionalitet opnås ved passende tilsætning af polyethylenimin til proteinet.

3 146481

Man kender ganske vist også fra Developments in Industrial Microbiology, vol. 17 (4) 1976, side 241 - 246 en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt, men denne består udelukkende i fiksering af levende 5 mikroorganismer på en bærer, mens fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke kan anvendes til dette formål.

Ved udøvelsen af opfindelsen gennemfører man sædvanligvis overtrækningen med gelatine ved at udbløde gelatinen i vand, kassere overskud af vand, smelte gelatinen og 10 blande den således smeltede gelatine med det varme, partikelformede materiale med høj massefylde. Herved dannes der et pastaagtigt materiale. Dette pastaagtige materiale behandles med glutaraldehyd, hvorved gelatineovertrækket hærdes og de enkelte partikler falder fra hinanden. Pastaen 15 af enzym- og polyethyleniminopløsning dannes ved at blande enzymproduktet og polyethyleniminopløsningen. Når denne pasta blandes med det med gelatine overtrukne, med glutaraldehyd hærdede, partikelformede materiale med høj massefylde, dannes der en anden pasta, men efter behandling af denne 20 pasta med glutaraldehyd falder pastaen fra hinanden i enkelte granulære partikler, hvorved tilsyneladende hver granulær partikel fortrinsvis indeholder to eller flere partikler af materiale med høj massefylde. De individuelle partikler af materiale med høj massefylde synes at være sammenbundet ved 25 hjælp af polyethylenimin og glutaraldehyd. Det sluttelige immobiliserede produkt består således af en enhed, i hvilken styrken og slidresistensen hidrører fra de partikelformede partikler med høj massefylde, hvilke danner de ydre grænselinier for den granulære partikel, og hvori enzymaktiviteten 30 hidrører fra den tværbundne masse af enzymholdigt materiale, som er beskyttet af det partikelformede materiale med høj massefylde, der fungerer som et skjold for den (mindre slidresistente) masse af enzymholdigt materiale.

Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen 35 er det partikelformede materiale med høj massefylde sand.

Herved tilvejebringes der et billigt, partikelformet materiale med høj massefylde.

146481 4

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen har det partikelformede materiale med høj massefylde en partikelstørrelse på mellem 0,1 og 1 mm. Dette partikelstørrelsesinterval er passende for de fleste ekspanderede 5 eller fluidiserede lejer.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen, har det partikelformede materiale med høj massefylde 3 en massefylde over 4 g/cm , og fortrinsvis er det partikelformede materiale med høj massefylde titandioxid. Ved at 10 anvende partikelformede materialer med høj massefylde med en sådan massefylde kan den enzymatiske proces i det ekspanderede eller fluidiserede leje bedre kontrolleres, og man kan behandle væsker med højere massefylde uden vanskelighed. Det partikelformede materiale med høj massefylde bør udvælges på 15 en sådan måde, at massefylden deraf er desto højere, jo højere massefylden er af den væske, der skal behandles i det ekspanderede eller fluidiserede leje. Man foretrækker titandioxid, fordi det er billigt og i høj grad indifferent.

Ved en anden foretrukken udførelseform for opfin-20 delsen andrager vægten af gelatinen i det med gelatine over-trukne, partikelformede materiale med høj massefylde mellem 0,2 og 5 vægt-% af det partikelformede materiale med høj massefylde, fortrinsvis mellem 0,5 og 2% deraf. Denne gelatinemængde er optimal hvad angår opnåelsen af en stærk adhæ-25 sion af enzymet til partikler på det partikelformede materiale med høj massefylde.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen andrager vægten af det glutaraldehyd, hvormed det med gelatine overtrukne, partikelformede materiale med høj mas-30 sefylde behandles, mellem 2 og 25 vægt-% af gelatinen, fortrinsvis mellem 10 og 20 vægt-% af gelatinen. Denne mængde af glutaraldehyd er optimal hvad angår opnåelsen af stærk adhæsion mellem enzymet og partiklerne af det partikelformede materiale med høj massefylde.

35 Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfin delsen er enzymet urease. Ved tilvejebringelse af et immobi-liseret ureaseprodukt kan man dekomponere urinstofholdigt 5 146481 spildevand, før det kloakeres, hvorved man på en simpel og billig måde kan opfylde de miljømæssige renhedskrav.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen er enzymet urease, der er fremstillet ad mikrobiel 5 vej ved hjælp af Bacillus pasteurii. Denne urease er velegnet til det formål, der er angivet i det foregående afsnit, fordi den har god temperaturstabilitet' og god aktivitet ved de pH-værdier, som findes i det urinstofholdige spildevand.

Ved en anden foretrukken udførelseform for opfin-10 delsen er enzymet lactase. Herved er det muligt kontinuerligt at konvertere lactosen i valle til glucose og galactose ved drift i ekspanderet eller fluidiseret leje.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen er enzymet inulinase. Herved er det muligt at kon-15 vertere inulin til fructose på en simpel og billig måde.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen består enzymproduktet af tørre, enzymholdige, hele bakterieceller blandet med de ledsage- og fyldstoffer, der er normale bestanddele af industrielle enzymprodukter. Dette 20 er en meget billig metode, fordi det ikke er nødvendigt at behandle bakteriecellerne, der er isoleret fra enzymgæringsvæsken. Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen består enzymproduktet af tørre, enzymholdige bakterieceller, der er delvist eller totalt homogeniseret og 25 blandet med de ledsage- og fyldstoffer, der er normale bestanddele af industrielle enzymprodukter. Hvis det ønskes at homogenisere bakteriecellerne, kan denne metode hensigtsmæssigt anvendes, og dette medfører den fordel, at det ikke er nødvendigt at anvende det betydeligt dyrere, rensede 30 enzym.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen forstøvningstørres enzymproduktet. Det er simpelt og hensigtsmæssigt at anvende et tørt enzymprodukt, og et forstøvningstørret produkt er billigt og velegnet til frem-35 gangsmåden ifølge opfindelsen.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen andrager vægten af polyethyleniminet mellem 2 og 50% , 6 146481 af enzymproduktet, fortrinsvis mellem 5 og 15% af enzymproduktet. Med mindre polyethylenimin end 2% af enzymproduktet dannes der ikke noget immobiliseret produkt med tilstrækkelig kohærens, og mere polyethylenimin end 50% af enzympro-5 duktet vil ikke give anledning til dannelsen af nogen gavnlig effekt.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen har polyethylenimin en molekylvægt mellem 300 og 100.000. Disse polyethyleniminer er i stand til at danne et 10 immobiliseret produkt med den bedste kohærens.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen andrager vægten af det glutaraldehyd, hvormed den pastaagtige blanding behandles, mellem 10 og 1000% af vægten af polyethyleniminen, fortrinsvis mellem 50 og 200% af væg-15 ten af polyethyleniminen. Med en mindre glutaraldehydmængde end 10% af vægten af polyethyleniminen vil der ikke dannes noget immobiliseret produkt med tilstrækkelig slidstyrke, og mere glutaraldehyd end 1000% af vægten af polyethyleniminen vil ikke have nogen gavnlig effekt.

20 Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfin delsen gennemføres tørringen i fluidseret leje. Denne tørringsmetode er billig, effektiv og fuldt ud tilfredsstillende .

Opfindelsen skal nu illustreres under henvisning 25 til de følgende eksempler.

Eksempel 1 1,8 g gelatine blev udblødt i demineraliseret vand i 10 - 15 minutter, overskuddet af vand blev hældt fra, og gelatinen blev smeltet i et vandbad.

30 180 g strandsand blev opvarmet til 60°C på vand bad.

Derpå blev strandsandet hældt i gelatinen under omrøring for at danne en homogen pasta. Det med gelatine på denne måde behandlede sand blev delt i to dele og behandlet 35 med henholdsvis 0,2 og 0,1% glutaraldehyd (20 og 10% i forhold til gelatinemængden).

7 146481

Efter tilsætningen af glutaraldehyd omrørtes, indtil massen gelerede, og der dannedes et partikelformet materiale med partikler af ensartet størrelse. Geleringstiden var ca. 1 minut.

5 2 g forstøvningstørret urease med en aktivitet på 6250 ureaseenheder/g og fremstillet ved hjælp af Bacillus pasteurii NCIB 8841 blev blandet med (1) 2 ml 5% PEI 600 (polyethylenimin med molekylvægt 40.000 - 60.000, købt fra Dow Chemical Co.), (2) 2 ml 10% PEI 600 og (3) 3 ml 10% PEI 10 600, alle ved pH 7; når der dannedes en pasta, tilsattes 10 g af det strandsand, der var behandlet som ovenfor angivet, blandeprocessen fortsattes, og immobiliseringsprocessen blev gennemført ved tilsætning af 1,25, 1,75 eller 2,25 ml 25% glutaraldehyd og ved at blande grundigt. Det dannede produkt 15 blev sammenpresset forsigtigt, hvorved det faldt fra hinanden som et granulat.

Ureaseaktiviteten (både for opløselige og immobi-liserede præparater) måles på følgende måde. Analysen gennemføres i en pH-stat ved pH 7,0 og 30°C med 3% (0,5 M) 20 urinstof i 0,2 M phosphat som substrat. Reaktionen kan repræsenteres ved reaktionsskemaet nh2 / + urease + C = 0 + H -aO + H,0 ->2ΝΗδ + HCO-3 \ 3 2 pH 7,0 4 3 \nh2 1 urease-aktivitetsenhed spalter pr. definition 1 pmol urinstof pr. minut under de ovenfor angivne reaktions-25 betingelser.

Den følgende tabel viser immobiliseringsbetingelserne og aktivitetsparametrene af de dannede produkter.

Den fysiske styrke af alle immobiliserede produkter blev bedømt som god, da man ikke kunne iagttage nogen 8 146481 fysisk nedbrydning efter 60 timer på et rystebord. En grovere manuel behandling af produket viste, at produkterne nr. 3 og 5 var lidt svagere end de andre produkter. Produkt nr. 6 er noget stærkere end de øvrige.

9 146481 I <u ω 4-1

r- i 4J 4J dP

H 0) >i Hocovonn

IE :1 4J 4J X5 mnHnoiN

a X -H t3 ο id > 0 » o Λ o-- U H -p id I I 01 XJ (D\ VD ω OUD Η n Ο ,0 P Π N O f'

»o C 0) romcNmrocN

4-) 0) Ό (U ---

-P I

•Η -Η I > > I 4-) dP

•rl 3 Ή ID

4J 4_) 4_) JD «. ko m co σι ιο

,ϋ Ο ,Μ Ο) Ό O) 04 04 CNCNH

< Ο ίβ 4-) 3 +) t"---

I I CP

<i)\ 0 xd P φ ω o m o O 0 ¢) ΟΟΓ'ΟιΟΟΗ'Λ ιη (D fl Ol 04 04 Γ0 r—1 a) 4J -p -P Μ τ^ί 4J q d lininoiriino >1 4-> T3 <"-·*·· >·

hO :HiHOO)HH

d iH i4 ΪΗΗΗΗΗΗ D id 04 σ> j Ί—;—I- Οι i i<i) k m m in in in in

C dP 3 P T3 *3 ! r- Γ- Γ' (N CN

•H in rH ftf «Η rH | *· ·*»“** *» *·

W CM t7* *P £ IrHrHrHrHi—ICN

aj i in -" -----------------\-----

*H ^ O

ι-Ι Η H :

-P Η ε ! M

m Λ ft Id ~ 0 - jo4 04 £ m oi 04 » iss +

p Hrlxi H

•η I CP

® i (d pi p 4-) Q) - 010404040404 ft o) s a) p a) k 4-) 4-) p 3 ω j rH Ό i id >1 0 p X3 dP H04HH040) i—i Id d) ϋ+)Ό oooooo

Td id ¢) (3H fi(*>

id 0) *rl i—I i—I i—I i—! i—1 i—I

Cfl u -P_ <u

4-) "C

τ! cp i c c CP

0(1)¾ oooooo >4] £> £ ΗΗΗΗΗΗ PNM^mio _d_ 146481 ίο

Produkterne blev undersøgt som den aktive masse i et fluidiseret leje med en vandig opløsning indeholdende 1% urinstof som substrat. Urinstoffet blev nedbrudt på tilfredsstillende måde.

5 Eksempel 2 2 g lyophiliseret lactase med en aktivitet på 973 lactaseenheder/g og fremstillet ved hjælp af Bacillus sp:NRRL B-ll, 299 blev blandet med 3 ml 10% PEI 15 T (poly-ethylenimin med molvægt 700, købt fra Taihei Sangyo Kaisha) 10 ved pH 7,0. Da der var dannet en pasta, tilsattes 10 g gelatinebehandlet sand, fremstillet som beskrevet i eksempel 1. Blandeprocessen fortsattes, og immobiliseringen gennemførtes ved tilsætning af 1,75 ml 25% glutaraldehyd. Produktet blev sammenpresset forsigtigt, hvorved det faldt fra hinanden som 15 et granulat. Efter tørring var aktiviteten 25,5 lactaseenheder/g, og aktivitetsudbyttet var 16,3%.

Lactaseaktiviteten blev målt på følgende måde.

Analysen gennemføres i et rystevandbad ved 60°C og pH 6,5 med 10% lactose i mælkestødpude som substrat. Reaktionen 20 afsluttes ved kogning i 10 minutter i tilfælde af, at man ønsker at bestemme aktiviteten af den opløselige lactase, og ved filtrering af enzympartiklerne i tilfælde af, at man ønsker at bestemme aktiviteten af den immobiliserede lactase. Den mængde glucose, der frigøres i supernatanten, 25 bestemmes ved hjælp af glucoseoxidase-peroxidase-metoden (Tech. Bull. no. 510, Sigma Chemical Co.). 1 lactase-aktivi-tetsenhed frigør pr. definition 1 μπιοί glucose pr. minut under de ovenfor angivne reaktionsbetingelser.

Man kunne ikke konstatere nogen nedbrydning af 30 partiklerne af immobiliseret lactase ved visuel inspektion efter kontinuerlig rystning i 20% lactoseopløsning i en uge.

n 146481

Eksempel 3 2 g sprøjtetørret inulinase med en aktivitet på 105 inulinaseenheder/g og fremstillet ved hjælp af Kluyvero-myces fragilis (NRRL Y 1156) blev blandet med 3 ml neutrali-5 seret 10% polyethyleniminopløsning (PEI 15 T, Taihei Sangyo Kaisha). Da der dannedes en pasta, tilsattes 10 g gelatine-og glutaraldehydbehandlet sand, fremstillet som angivet i eksempel 1. Blandeprocessen blev fortsat, og immobiliseringsreaktionen blev gennemført ved tilsætning af 1,75 ml 10 25%-opløsning af glutaraldehyd og grundig blanding. Produktet blev forsigtigt sammenpresset, hvorved det faldt fra hinanden som et granulat, og lufttørredes.

Aktiviteten af produktet var 13,5 inulinaseen-heder/g, svarende til et aktivitetsudbytte på 77%.

15 Aktiviteten af det opløselige enzym blev målt som μπιοί reducerende sukker dannet pr. minut ved pH 4,7 og 50°C med en 2,5% opløsning af inulin som substrat.

Aktiviteten af det immobiliserede enzym blev målt som μπιοί reducerende sukker dannet pr. minut ved pH 4,7 og 20 50°C på basis af 5%-opløsning af inulin ved reaktion i et rystebad.

Claims

146481

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt, kendetegnet ved, at man overtrækker et partikelformet materiale med høj massefylde med gelatine, 5 at man derpå behandler det således overtrukne materiale med høj massefylde med glutaraldehyd, at man fremstiller en pasta omfattende et enzymprodukt og en vandig opløsning af polyethylenimin, at man blander det med gelatine overtrukne, glutaraldehydbehandlede, partikelformede materiale med pas-10 tåen til dannelse af en pastaagtig blanding, at man derpå behandler den således dannede, pastaagtige blanding med glutaraldehyd til dannelse af en masse, og at man granulerer og tørrer massen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved, at det partikelformede materiale med høj massefylde er sand.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det partikelformede materiale med høj massefylde har en massefylde på over 4 g/cm .

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendeteg net ved, at vægten af gelatinen i det med gelatine overtrukne, partikelformede materiale med høj massefylde andrager mellem 0,2 og 5 vægt-% af det partikelformede materiale med høj massefylde.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendeteg net ved, at vægten af det glutaraldehyd, hvormed det med gelatine overtrukne, partikelformede materiale med høj massefylde er behandlet, andrager mellem 2 og 25 vægt-% af gelatinen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendeteg net ved, at enzymet er urease.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendeteg net ved, at enzymproduktet består af enzymholdige bakterieceller, der er blandet med de ledsage- og fyldstoffer, 35 der er normale bestanddele af industrielle enzymprodukter.