DE2732301B2 - Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen ProteinenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten trägergebundenen Proteinen. Bei
Verfahren, die auf der biospezifischen Wechselwirkung zwischen einem Protein und einem korrespondierenden
Substrat beruhen, werden die Proteine mit Vorteil in Form eines an einen festen Träger gebundenen
Materials eingesetzt. Das Protein läßt sich dadurch dur;h einfaches Filtrieren von der behandelten Substratlösung
abtrennen. Trägergebundene Proteine hüben Bedeutung bei der Affinitätschromatographie und
besonders bei der Durchführung enzymatischer Prozesse, wobei das von dem Träger gebundene Protein ein
Enzym ist.
Gegenüber den freien Proteinen in wäßriger Lösung zeichnen sich irägergebundene Proteine in der Regel
durch eine erhöhte Stabilität gegen Inaktivierung durch pH-Werl-Verschiebung, hohe Temperaturen oder
Auloxydation aus. Trotzdem sinkt die biospezifische Wirksamkeit, z. B. im Falle von Enzymen die enzymatische
Aktivität, bei mehrfacher Wiederverwendung des trägergebundenen Proteins bei jeder Verwendungsstufe
etwas ab. Es ist bekannt, daß man den Aktiviiätsverlust
von Proteinen aufhalten oder rückgängig machen kann.
wenn man sie mit Merkaptanen behandelt (vgl. Dissertation Jan Carlsson, Uppsala 1974, S. 8, Abstract).
Die Wirkung der Merkaptane wird darauf zurückgeführt,
daß sie Disulfidbrücken innerhalb des Proteinmoleküls aufspalten, die durch Autoxydation aus Thiolgruppen
entstanden sind. Diese Autoxydation wird als die Ursache des reversiblen Aktivitätsverlustes angesehen.
Es ist in den meisten Fällen jedoch nicht erwünscht,
zur Aufrechterhaltung der Aktivität des gebundenen Proteins der Substratlösung ein Merkaptan zuzusetzen,
weil die Substratlösung dadurch verunreinigt wird und eine zusätzliche aufwendige Reinigungsstufe erforderlich
wird Auch die getrennte Reaktivierung des trägergebundenen Proteins zwischen zwei Anwendungen
ist wegen des zusätzlichen Arbeitsaufwandes keine befriedigende Lösung. Außerdem sind o"-? meisten
Merkaptane toxisch und übelriechend.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, trägergebundene Proteine mit erhöhter Stabilität
gegen allmählichen Äktivitätsverlust in wäßriger Lösung durch Umsetzung des Proteins mit einem
wasserunlöslichen Trägermaterial herzustellen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
man auf das an einen merkaptogruppenfreien und noch Oxirangruppen enthaltenden Träger gebundene Protein
Schwefelwasserstoff oder eine Verbindung mit einem Molekulargewicht unter 5000, vorzugsweise unter 2000,
mit wenigstens einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxy- oder primären
oder sekundären Aminogruppe einwirken läßt.
Da in der Fachwelt die Meinung vertreten wurde, daß die stabilisierende Wirkung von Merkaptanen auf ihrer
Reaktion mit Disulfidbrücken beruht, war nicht zu erwarten, daß sie auch dann wirksam sein würden, wenn
sie an das Träger1 ,aerial gebunden und daher nicht in
der Lage sind, in ία jmliche Nähe der Disulfidbrücken zu
gelangen. Überraschenderweise wird durch die gebundenen Merkaptogruppen dennoch eine erhebliche
Stabilisierung erreicht. In der nachfolgenden Tabelle wird am Beispiel einer trägergebundenen Penicillin-Acylase
der Aktivitätsverlust bei mehrfacher Wiederverwendung mit und ohne Merkaptogruppen am Träger
gegenübergestellt. Die Merkaptogruppen wurden in diesem Falle durch Bindung von Dithioerythrit an einen
Epoxydgruppen enthaltenden Enzymträger eingeführt. Das Trägermaterial war ein verneiztes Acrylamidpolymcrisat
mit Epoxidgruppen, das zunächst mit Penicillin-Acylase
und danach gegebenenfalls mit 50 bzw. 500 mg Dithioerythrit je Gramm des Feuchten Trägerma'erials
umgesetzt worden war. Die Aktivität des Präparats gegenüber 6-Amino-pt'nicillansäure wurde in
wiederholter Umsetzung von I bis 2 g des Präparats mit jeweils 5% Substrat in 200 ml Substratlösung (0.01 M
Phosphatpuffer. pH 7,5) bei 37°C durch automatische
Titration mit 1.0 N NaOH ermittelt. Die Ausgangsaktivität
bei der ersten Verwendung wurde jeweils als 100% bezeichnet.
Zahl der | Aklivil.it in | % der | Ausg.ings.iklivihil | 100 |
Ver | 100 | |||
wendungen | ohne | mil | Vt mg mit VH) mg | 98 |
MerkiipMn | l)ilhii*vryihrit Diihiocryihiit | 98 | ||
I | 100 | 100 | ||
2 | 96 | 100 | ||
J | 89 | 99 | ||
4 | 85 | 96 |
Fortsetzung
Zahl der Aktivität in % der Ausgangsaktivität
Verwendungen ohne mit 50 mg mit 500 mg
Merkaptan Dithioerythrii Dithioerythrit
Verwendungen ohne mit 50 mg mit 500 mg
Merkaptan Dithioerythrii Dithioerythrit
5 | 76 | 96 | 98 |
6 | 75 | 96 | 96 |
7 | 69 | 97 | 95 |
8 | 65 | 96 | 92 |
9 | 64 | 96 | 95 |
10 | 64 | — | 95 |
11 | 61 | 84 | 95 |
12 | 56 | 79 | 93 |
15 | 52 | 75 | 93 |
20 | 43 | 65 | 89 |
25 | 34 | 58 | 75 |
Die erfindungsgemaß erreichte Stabilisierung beruht auf der Bindung von Schwefelwasserstoff oder einer
wenigstens eine Merkaptogruppe und wenigstens eine weitere Merkapto-, Hydroxy- oder primäre oder
sekundäre Aminogruppe enthaltenden Verbindung an die bindungsaktiven Gruppen des Trägermaterials. Die
Merkapto-, Hydroxy- oder Aminogruppen der genannten Verbindungen reagieren ebenso wie die entsprechenden
Gruppen der zu bindenden Proteine mit den bindungsaktiven Gruppen des Trägermaterials. Da die
Verbindungen ein Molekulargewicht unter 5000 haben, vermögen sie aufgrund ihrer geringen Molekülgröße
noch mit solche · bindungsaktiven Gruppen des Trägermaterials zu reagieren, die für Proteinmoleküle
aus Gründen statischer Hinderung nicht zugänglich sind. Die bindungsaktiven Oxira^grup^en reagieren mit
Schwefelwasserstoff bzw. mit Merkapto-, Hydroxy- und Aminogruppen leichter als mit Wasser, so daß es
möglich ist, sowohl die Umsetzung der Oxirangruppen mit dem Protein als auch die nachfolgende Umsetzung
mit der Merkapto- und gegebenenfalls Hydroxy- oder Aminogruppen enthaltenden Verbindung in wäßriger
Phase vorzunehmen. Da die Oxirangruppen dennoch allmählich durch Wasser zersetzt werden, sollte
zwischen der Bindung des Proteins und der Umsetzungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kein
unnötig langer Zeitraum liegen.
Die erwünschte Stabilisierungswirkung kommt dann zustande, wenn wenigstens eine Merkaptogruppe je
gebundenes Molekül in freier Form erhalten bleibt und die weitere Merkaplo-, Hydroxy- oder Aminogruppe
mit der bindungsaktiven Gruppe des Trägers reagiert. Da der Träger aus einer unlöslichen festen Matrix
besteht und eine entsprechend niedrige Molekülbeweglichkcil
hat, wird die Merkaptogruppen-haltige Verbindung zum weit überwiegenden Teil nur mit einer ihrer
funktionellcn Gruppen an den Träger gebunden. Wenn diese Gruppe cine Hydroxyl- oder Aminogruppe ist,
bleibt auf jeden Fall eine Merkaptogruppc erhalten. Bei Verwendung einer Verbindung mit nur einer Merkaptogruppe
und einer oder mehreren Amino- oder Hydroxygruppen kann gerade die Merkaptogruppe mit
der bindungsaktiven Gruppe des Trägers reagieren, so daO nur noch Amino- oder Hydroxygruppen übrigbleiben.
In diesem Falle trägt das gebundene Molekül nicht zur Stabilisierung bei. Da jedoch ein Teil der Moleküle
nicht mil der Merkapto- sonder mit einer Amino- oder Hydroxygruppe reagiert, bleiben im statistischen Mittel
genügend stabilisierend wirkende Merkaptogiuppen übrig.
Die Menge der Merkaptogruppen-haltigen Verbindung wird im allgemeinen so gemessen, daß wenigstens
0,3 Gew.-%, bezogen auf das Feuchtgewicht des Träger-Enzym-Produkts, an freien SH-Gruppen gebunden
ist Schwefelwasserstoff und Verbindungen mit 2 oder mehr Merkaptogruppen enthalten zwei (oder
mehr) an Schwefel gebundene Wasserstoffatome, so daß nach ihrer Bindung an den Träger auf jeden Fall
wenigstens eine freie Merkaptogruppe übrig bleibt, ίο Verbindungen mit zwei oder mehr SH-Gruppen sind
besonders bevorzugt. Dazu gehören
Dithioäthylenglykol,
Dithiopropylenglykol oder
Dithiobutylenglykol,
1,12-Dimerkaptododecan,
Dithioäthylenglykol,
Dithiopropylenglykol oder
Dithiobutylenglykol,
1,12-Dimerkaptododecan,
Di-merkaptoessigester des Äthylenglykols,
Dodecandiols, Neopentylglykols oder des
2,2'-Bis-(4-hydroxy-cyclohexyl)-propans,
Trimethylolpropan-tri-merkaptopropionat,
Pentaerythrit-tetra-merkaptoacetat,
-ieira-merkaplopropioiial,
-tetra-merkaptocapronsäureesteroder
-tetra-merkaptoundecansäureester
sowie Verbindungen mit weiteren funktioneilen Gruppen, wie Dithioerythrit. Als Verbindungen mit je einer Amine- und einer Merkaptogruppe seien Merkaptoäthylamin und Cystein genannt. Verbindungen mit nur einer Merkapto- und einer oder mehr Hydroxylgruppen sind am wenigstens bevorzugt, da die Merkaptogruppen in in der Regel leichte·" als die Hydroxylgruppen mit den bindungsaktiven Gruppen des Trägers reagieren. Beispiele dieses Verbindungstyps sind Monothioäthylenglykol und Monothiopropylenglykol.
Dodecandiols, Neopentylglykols oder des
2,2'-Bis-(4-hydroxy-cyclohexyl)-propans,
Trimethylolpropan-tri-merkaptopropionat,
Pentaerythrit-tetra-merkaptoacetat,
-ieira-merkaplopropioiial,
-tetra-merkaptocapronsäureesteroder
-tetra-merkaptoundecansäureester
sowie Verbindungen mit weiteren funktioneilen Gruppen, wie Dithioerythrit. Als Verbindungen mit je einer Amine- und einer Merkaptogruppe seien Merkaptoäthylamin und Cystein genannt. Verbindungen mit nur einer Merkapto- und einer oder mehr Hydroxylgruppen sind am wenigstens bevorzugt, da die Merkaptogruppen in in der Regel leichte·" als die Hydroxylgruppen mit den bindungsaktiven Gruppen des Trägers reagieren. Beispiele dieses Verbindungstyps sind Monothioäthylenglykol und Monothiopropylenglykol.
Wasserunlösliche Trägermaterialien mit gegenüber ]'i Proteinen bindungsaktiven Oxirangruppen sind bekannt.
Die Oxirangruppen können schon bei der Herstellung eines vernetzten Acrylamidpolymerisats,
vorzugsweise eines durch umgekehrte Suspensionspolymerisation erzeugten Perlpolvmeris,.t5, durch Mitver-
M) wendung glycidylgruppenhaitiger Comonomerer, wie
Glycidylacrylat oder -methacrylat, eingebaut werden. In Trägerkörper mit Kohlehydratstruktur, wie Cellulose,
Agarose oder Dextran, können Glycidylgruppen z. B. durch Umsetzung mit Epichlorhydrin oder l,4-Bis-(2,3-4".
epoxypropyl)-butan eingeführt werden. Perlförmige Trägerstoffe mit Perldurchmessern vor; H bis 5000 μιη
sind wegen ihrer leichten Handhabbarkeit und ihrer Strömungsdurchlässigkeit besonders vorteilhaft.
Die Natur des zu bindenden Proteins richtet sich nach Vi dem vorgesehenen Verwendungszweck des Verfahrensproduktes. Für Zwecke der Affinitätschromatographie
wirr1 ein Protein an den Träger gebunden, das in biospezifische Wechselwirkung zu einer Komponente
eines aufzutrennenden Substratgemisches treten kann. ■>>
Diese Komponente wird an dem trägergebundenen Protein vorübergehend festgehalten. Vorzugswiese
werden Enzyme an den Träger gebunden, wie z. B. Penicillinacylasc, Ribonuclease, Amylase oder Katalasc.
Im Sinne der Erfindung gebundene und stabilisierte W) Penicillinacylase hat besondere technische Bedeutung,
weil erst dadurch eine wirtschaftliche Wiederverwendung dieses wertvollen Enzyms im technischen Maßstab
möglich wird.
Einige Enzyme sind gegenüber Schwefelwasserstoff
hi oder Merkaptanen empfindlich; sie eignen sich dann im
allgemeinen nicht für das Verfahren der Erfindung.
Enzyme, die schon durch Schwefelwasserstoff oder freie
Merkaoiane stabilisiert oder reaktiviert werden lassen
sich durch das Verfahren der Erfindung in Enzymprodukte von erhöhter Stabilität überführen.
Beispiel 1
a) Herstellung von Oxiranacrylharzperlen
a) Herstellung von Oxiranacrylharzperlen
In einem Rundkolben (6000 ml), versehen mit Thermometer, Impeller-Rührer, Rückflußkühler und
Nj-Einleitungsrohr werden
1740 g n-Heptan
1100 g Perchloräthylen
1100 g Perchloräthylen
2 g Polymerisat der Zusammensetzung
95% n-Butylmethacrylat
5% 2-Trimethylammoniumäthylmethacryiat-chlorid
95% n-Butylmethacrylat
5% 2-Trimethylammoniumäthylmethacryiat-chlorid
vorgelegt Unter Einleitung von Stickstoff wird bei ca. 55° C eine Mischung aus
791 g Formamid
60 g Methacrylamid
60 g Aüylglycidäther
60 g Glycidylmethacrylat
120 g Methylen-bis-methacrylamid
6 g Benzoylperoxid
zugegeben und durch Rühren in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 6 g
Dimethylanilin beschleunigt. Nach lOstündiger Polymerisation wird auf Raumtemperatur abgekühlt, die Perlen
absetzen gelassen und die überstehende flüssige Phase abdekantiert. Die Perlen werden durch Zugabe von ca.
2000 ml Aceton entquollen, abgesaugt und zweimal mit Aceton nachgewaschen. Anschließend werden sie über
Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Ausbeute: ca. 90% feine, leicht gelbl. Perlen.
b) Immobilisierung der Penicillinacylase
1,2 g Penicillinacylase (E. coli, spez. Aktivität 12,1 U/mg) werden in 40 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,
0,02% NaN3) gelöst und zu 10g des Produkts (la) gegeoen. Man läßt bei 23°C 72 Stunden lang stehen und
wäscht anschließend dreimal mit jeweils 1000 ml 1 M wäßriger NaCI-Lösung und zweimal mit 0,05 M
Phosphatpuffer (pH 73; 0,02% NaN3). Ausbeute 37 g Feuchtprodukt (nach Absaugen auf Glasfritte). Enzymatische
Aktivität: 237 U/g Feuchtprodukt.
c) Aktivitätsbestimmung
2 g Penicillin-G (Kaliumsalz) werden in 90 ml
Phosphatpuffer (pH 7,5; 0,05 M) gelöst und das Volumen mit diesem Puffer auf 100 ml gebracht.
20 ml dieser Substratlösung und 250 mg (Feuchtgewicnt!)
des Produktes (Ib) werden in einem Titrierstand (TTA 3, Fa. Radiometer, Kopenhagen) bei 37°C
thermostatisiert gerührt. Die durch Hydrolyse freiwerdende Phenylessigsäure wird bei pH 7,8 mit I N NaOH
aus einer Autobürette (ABU 12, Fa. Radiometer, Kopenhagen) automatisch 'itriert, über pH-Meter und
Titrator-(Typ 11. Fa. Radiomeier, Kopenhagen) ge-
steuert. Simultan wird der NaOH-Verbrauch mit Hilfe
eines Schreibers (Titrigraph SBR 2c, Fa. Radiometer, Kopenhagen) registriert.
Die Aktivität wird aus dem linearen Anfangsbereich der Umsatzkurve graphisch ermittelt; 1 Enzymeinheit
(U) entspricht 1 μΜοΙ gespaltenem Substrat pro Minute.
d) Aktivitätsverlust bei wiederholter
Verwendung bei 95%
Umsatz von Substratlösungen einer
Umsatz von Substratlösungen einer
Konzentration von 5%
2,0 g des Produktes (Ib) und 2OmI einer 5%igen Substratlösung (5% Penicillin-G-K in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,02% NaN3) werden bei pH 7^ und 37CC bis zu einem Substratumsatz von 95-98% gerührt. Apparatur und Registrierung der Umsatzkurve wie unter (Ic) beschrieben.
2,0 g des Produktes (Ib) und 2OmI einer 5%igen Substratlösung (5% Penicillin-G-K in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,02% NaN3) werden bei pH 7^ und 37CC bis zu einem Substratumsatz von 95-98% gerührt. Apparatur und Registrierung der Umsatzkurve wie unter (Ic) beschrieben.
Dann werden die Enzymperlen auf einer Glasfritte abgesaugt und erneut gegen 20 ml Substratlösung
eingesetzt. Diese Prozedur wird 20mal hintereinander
wiederholt. Aktivitätsverlust na^h 20 Verwendungen:
57%.
Zu 2 g der trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) werden 10 ml einer wäßrigen Lösung von
Dithioglykol (2%, mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt) gegeben. Man läßt das Gemisch bei 37° 18 h lang stehen
und wäscht mit Wasser (zehnmal jeweils 100 ml) und zweimal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 73).
Ausbeute: 1,95 g Feuchtprodukt.
Das Produkt wird wie in Beispiel 1 (a) geprüft. Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen:
42%.
50 mg 1,4-Dithioerythrit werden in 1 ml H2O gelöst
und der pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wird zu 2 g trägergebundenen
Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) gegeben und das Gemisch wird 48 h lang bei 23°C stehen gelassen. Dann
wird es mit Wasser (fünfmal) und Puffer (zweimal) gewaschen.
Ausbeute: 1,98 g.
Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen, durchgeführt wie im Beispiel 1 (d):35%.
500 mg Dithioerythrit werden in 5 ml Wasser gelöst und durch NaOH-Zugabe wird ein pH von 7,8
eingestellt. Diese Lösung wird zu 2 g der trägergebundenen Penicillinacylase nach Beispiel 1 (b) gegeben und
das Gemisch bei 23°C 48 h lang stehen gelassen. Dann wird es nii Wasser (fünfmal) uno Puffer (zweimal)
gewaschen.
Aktivitätsverlust nach 20 wiederholten Verwendungen, durchgeführt wie im Beispiel 1 (d). 11 %.
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung vor stabilisierten trägergebundenen Proteinen durch Umsetzung
eines Proteins in wäßriger Lösung mit einem wasserunlöslichen, merkaptogruppenfreien Trägermaterial,
das gegenüber Proteinen bindungsaktive Oxirangruppen enthält, dadurch gekennzeichnet,
daß man nach der Bindung des Proteins das noch unreagierte Oxirangruppen enthaltende Trägermaterial mit Schwefelwasserstoff
oder einer Verbindung mit einem Molekulargewicht unter 5000, vorzugsweise unter 2000, und wenigstens
einer Merkaptogruppe und wenigstens einer weiteren Merkapto-, Hydroxy- oder primären oder
sekundären Aminogruppe umsetzt
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet,
daß ein Trägermaterial auf Basis eines Polyacrylamids oder von Kohlehydratderivaten
eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein perlförmiges Trägermaterial mit
einem Perldurchmesser zwischen 5 und 1000 μιτι auf
Basis eines vernetzten Polyacrylamid;; mit Oxirangruppen eingesetzt wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung mit
wenigstens einer Merkaptogruppe eine aliphatische Verbindung mit 2 bis 8 C-Atomen einsetzt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Protein ein
Enzym ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene Enzym Penicil- r>
iinacylase ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 0,03 Gew.-%
(bezogen auf das Feuchtgewicht des Endprodukts) an freien Merkaptogruppen an da» Trägermaterial
angelagert werden.
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---|---|---|---|
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---|---|---|---|
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ID=6014150
Family Applications (2)
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Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE7878100312T Expired DE2860880D1 (en) | 1977-07-16 | 1978-07-06 | Method for preparing stabilized carrier-bound proteins |
Country Status (6)
Country | Link |
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