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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Teilchen und ihre Verwendung bei der molekularen
Prägung.
Spezieller betrifft diese Erfindung Teilchen, die zur Verwendung
als Abtrennungsmedien geeignet sind, und ihre Herstellung durch
molekulare Prägung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es
sind viele Verfahren bekannt, um eine Abtrennung und Analyse eines
Ziel-Moleküls
aus einer unreinen Mischung zu erzielen, beispielsweise Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie
(LC-MS) und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC). Diese beiden Verfahren sind nichtspezifisch. Das heißt, gewisse
Parameter (wie UV-Wellenlänge
und Strömungsgeschwindigkeit)
müssen
eingestellt und aufrechterhalten werden, um eine spezielle Verbindung
zu identifizieren.
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Die
molekulare Prägung
kann verwendet werden, um Polymere zu erzeugen, die für spezielle
Ziel-Moleküle
selektiv sind. Das Produkt wird in einer Reihe von Stufen hergestellt.
Zuerst werden ausgewählte
copolymerisierte Monomere mit dem Ziel-Molekül gemischt. Zweitens geht die
Mischung eine Polymerisation ein, wodurch das Ziel-Molekül in dem
Polymer eingeschlossen wird. Drittens wird das Ziel-Molekül extrahiert,
was einen Hohlraum oder eine Prägung
(einen Abdruck) zurücklässt, der
dem Ziel-Molekül
entspricht. Das resultierende polymere Produkt ist deshalb für das Ziel-Molekül selektiv.
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Es
gibt jedoch eine Anzahl von Nachteilen bei dieser Technik. In den
meisten Fällen
hat die Polymerisation der Monomere und des Ziel-Moleküls eine
feste Masse zum Ergebnis, die zerbrochen und beispielsweise in einer
Mühle gemahlen
werden muss, um Teilchen mit einer geeigneten Größe bereitzustellen. Mit diesem Verfahren
ist es schwierig, Teilchen mit einer gleichförmigen „Form" zu erzeugen, wie sie z.B. typisch zur
Verwendung in Trennungsrohren oder -säulen erforderlich ist, um bei
der Verwendung einen signifikanten Staudruck zu vermeiden. HPLC-Säulen erfordern beispielsweise
Teilchen mit einem engen Bereich von Durchmessern, typisch 80 %
der Teilchen mit ± 20
% des mittleren Durchmessers. Deshalb werden, wenn relativ gleichförmige Teilchen
erforderlich sind, die Teilchen gesiebt. Die Verwendung irgendeines
oder aller dieser Verfahren hat große Materialverluste als „Feinteilchen" zur Folge. Beispielsweise
kann das Zerbrechen und Mahlen einen 50%-igen Verlust des hergestellten
Materials zur Folge haben, und das Sieben kann einen Verlust von so
viel wie 95 % des hergestellten Materials zur Folge haben. Offensichtlich
ist dies ein großer
wirtschaftlicher Nachteil.
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Ein
weiterer Nachteil der derzeitigen Techniken besteht darin, dass
gewöhnlich
ein hoher Anteil des Ziel-Moleküls
innerhalb der Polymer-Matrix eingeschlossen wird. Es wird allgemein
verstanden, dass, obwohl etwas Ziel entfernt werden kann (z.B. durch
Waschen mit organischem Lösungsmittel),
ein Anteil in der Matrix eingeschlossen verbleibt.
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Dies
weist zwei unerwünschte
Auswirkungen auf. Erstens sind Ziel-Moleküle häufig teuer. Sie können z.B.
Arzneistoff-Kandidaten sein, die speziell hergestellt wurden, um
ihre Wirksamkeit zu testen. In derartigen Fällen ist es wünschenswert,
das Ziel-Molekül
zu entfernen und wiederzuverwenden. Zweitens beeinflussen alle Ziel-Moleküle, die
in der Matrix verbleiben, nachteilig deren Nützlichkeit bei der Spurenanalyse
und quantitativen Analyse. Die Abdruck- (Prägungs-) Moleküle „lecken" heraus und maskieren
die Adsorption des Ziel-Moleküls.
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Dies
ist ein ernsthaftes Problem und ist im Stand der Technik angesprochen
worden. Es hat sich eine Strategie entwickelt, die ein Analogon
des Ziel-Moleküls
als den Abdruck verwendet. Wenn das Analogon einen Hohlraum bildet,
der selektiv durch das Ziel-Molekül gefüllt werden kann, und das Analogon
von dem Ziel-Molekül
beispielsweise mittels HPLC abgetrennt werden kann, können Matrizes
in Spuren- und quantitativen Assays verwendbar sein.
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Noch
ein weiterer Nachteil entsteht aus der typisch geringen Wasserlöslichkeit
der Monomere. Als Folge wird die Polymerisation in organischem Lösungsmittel
durchgeführt.
Neben den höheren
Kosten von organischen Lösungsmitteln
im Vergleich zu Wasser und den erhöhten Umweltbedenken bezüglich der
Verwendung von organischen Lösungsmitteln
entspricht ein organisches System nicht biologischen Systemen. Viele Bioassays,
für die
geprägte
Polymere nützlich
sein könnten,
sollten in Wasser durchgeführt
werden, um ein natürliches
System darzustellen. Es ist allgemein anerkannt, dass der Ersatz
von organischem Lösungsmittel durch
Wasser aufgrund des hohen Vernetzungsgrades, der erforderlich ist,
um die Hohlraumform aufrechtzuerhalten, nicht durchführbar ist.
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Glad
et al., Reactive Polymers, Bd. 25, Nr. 1, 1995, Seiten 47–54, beschreiben
die Herstellung von kugelförmigen
Mikroteilchen, die eine Schale aus molekular geprägten vernetzten
Methacrylat-Polymeren umfassen. Eine Mischung aus Methacrylsäure, Ethylenglycoldimethacrylat
und einem Abdruck-Analyten wird zu TRIM-Teilchen gegeben und polymerisiert.
Die geprägten
Verbundteilchen werden gewaschen. Eine Chromatographie unter Verwendung
des Matrizen-Moleküls als Analyt
wird durchgeführt.
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Glad
et al., J. Chromatography, Bd. 347, Nr. 1, 1985, Seiten 11–24, beschreiben
die Verwendung von organischen Silan-Monomeren bei der Herstellung
von Substrat-selektiven Polymeren durch molekulare Prägung. Man
lässt die
Silane auf der Oberfläche
von porösen
Siliciumdioxid-Teilchen in wässriger
Lösung
in Anwesenheit eines Farbstoff-Substrats polymerisieren. Die resultierenden
Teilchen werden gründlich
gewaschen. Die Siloxan-beschichteten Teilchen werden in HPLC-Experimenten
unter Verwendung eines wässrigen
Lösungsmittels
bewertet.
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Sundaresan
et al., J. Chromatography, A (1997), 775(1+2), 51–63, und
auch in Biotechnology and Bioengineering, Bd. 48, Nr. 5, 1995, Seiten
431–436,
beschrieben geprägte
Polymere, die auf derivatisierte Siliciumdioxid-Teilchen oder TRIM-Teilchen
gepfropft sind, und ihre Verwendung für den Nachweis von Analyten.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung weist ein Teilchen, das sich spezifisch an ein Abdruckmolekül binden
kann, eine äußere Schale,
die Hohlräume
einschließt,
welche dem Abdruckmolekül
entsprechen, und einen inneren Kern auf, der im Wesentlichen frei
von derartigen Hohlräumen
ist. Das Teilchen schließt
auch ein amphipathisches Material ein.
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Derartige
Teilchen können
durch die Schritte:
- a) Polymerisieren einer
Mischung des Abdruckmoleküls
und von polymerisierbarem Material um den Kern herum, um eine Schale
zu bilden, welche das Abdruckmolekül enthält; und
- b) Entfernen des Abdruckmoleküls z.B. durch Waschen, um einen
entsprechenden Hohlraum zurückzulassen,
hergestellt werden.
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Die
Erfindung ermöglicht
vorteilhaft, dass Auswahlassays in einer wässrigen Umgebung durchgeführt werden
können.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Teilchen der Erfindung
leicht mit einer gleichförmigen Größe hergestellt
werden können.
Die Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren zur Abtrennung von
Molekülen
auf der Grundlage ihrer Form, Größe und chemischen
Zusammensetzung bereit.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die
Teilchen der vorliegenden Erfindung werden aus Materialien hergestellt,
die an sich bekannt sein können.
Es gibt im Wesentlichen zwei Stufen zur Herstellung der Teilchen.
Zuerst wird eine Mischung aus polymerisierbarem Material und Abdruckmolekül (nachstehend
als die polymerisierbare Mischung bezeichnet) um einen Kern herum
polymerisiert, um eine Schale zu bilden, welche das Abdruckmolekül enthält. Zweitens wird
das Abdruckmolekül
entfernt, was Abdruck-spezifische Hohlräume zurücklässt.
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Der
Kern des Teilchens kann im Handel erhältlich sein oder er kann in
situ hergestellt werden. Zum Beispiel kann er aus polymerisierbaren
Monomeren, wie Divinylbenzol (DVB)/Styrol gebildet werden.
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Die
Schale wird aus irgendeinem geeigneten polymerisierbaren Material
gebildet. Bei diesem kann es sich beispielsweise um Methylmethacrylat
(MMA) oder EGDMA oder eine Kombination derselben handeln. Ein Abdruckmolekül wird dann
dazugegeben, bei dem es sich um irgendeinen geeigneten Liganden
handeln kann, für
den ein Test gewünscht
wird, und schließlich
wird das Abdruckmolekül
ausgewaschen. Bei der Waschlösung
kann es sich beispielsweise um eine Lösung von Wasser/Aceton, H3PO4 oder Methanol
handeln.
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Um
seine Benetzungseigenschaften zu verbessern, weist das Teilchen
auf seiner Oberfläche
polare Gruppen auf, indem ein amphipathisches Molekül in das
Teilchen eingeschlossen wird. Derartige amphipathische Moleküle dienen
auch dazu, die Porenbildung und die nicht-kovalente Bindungswechselwirkungen
mit dem eingeprägten
Molekül
zu verstärken.
Das amphipathische Molekül
kann in die polymerisierbare Mischung eingeschlossen werden, oder
der Kern kann um ein „molekulares
Gerüst" herum gebildet werden,
welches das amphipathische Molekül
umfasst. Beispielsweise kann Oleylphenylhydrogenphosphat (OPHP),
ein amphiphatisches Molekül,
in die polymerisierbare Mischung eingeschlossen werden oder kann
eine Mizelle bilden, um die herum ein Kern gebildet wird.
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Die
Teilchen der Erfindung weisen typisch eine Größe auf, die 10-, 50- oder 100-mal
kleiner oder größer als
das Beispiel hierin ist, und weisen bevorzugt eine Größenverteilung
auf, die ähnlich
mit dem Beispiel in Beziehung steht. Die Schale macht typisch bis
zu 10, 20, 30, 40 oder 50 % der Querschnittsabmessung des Teilchens
aus und kann zwischen 10- 50- und 100-mal dünner oder dicker als das Beispiel
hierin sein. Je dünner
die Schale ist, desto leichter können
die Abdruckmoleküle
aufgrund ihrer Nähe
zu der äußeren Oberfläche ausgewaschen
werden.
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Die
Erfindung wird nun lediglich mittels Beispiels mit Bezug auf die
begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
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1 ein schematisches Diagramm
ist, das eine Reihenfolge von Schritten zur Erzeugung der Teilchen
zeigt;
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2 schematische Diagramme
von zwei alternativen Reihenfolgen von Schritten zur Erzeugung der Teilchen
liefert;
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3 die Strukturen von zwei
Verbindungen zeigt, die bei der Herstellung der Teilchen nützlich sind;
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4 eine schematische Veranschaulichung
von nicht-spezifischen und spezifischen Hohlräumen ist, die durch die Erfindung
gebildet werden können;
und
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5 die Auswirkungen des pH
auf die Bindung von Koffein und Theophyllin auf die geprägten Kern-Schale-Teilchen
veranschaulicht.
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Mit
Bezug auf 1 wird ein
vernetzter Polystyrol-Kern aus Styrol und DVB hergestellt. Dieser
wird mit einer Kombination aus OPHP und EGDMA (3) beschichtet, um ein „Kern-Schale"-Teilchen zu erzeugen.
Anschließend
wird ein Matrizen-Molekül
oder Abdruck- (Prägungs-)
Molekül
dazugegeben, und dem folgt die Polymerisation des EGDMA mit einem
wasserlöslichen
Initiator. Die Abdruckmoleküle
werden durch Lösungsmittelextraktion
z.B. unter Verwendung von Aceton entfernt, was Ziel-spezifische
Hohlräume
in der Schale des Teilchens zurücklässt.
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Mit
Bezug auf 2 kann der
Kern aus einer Mischung von Styrol und DVB hergestellt werden, und die
Schale kann aus MMA/EGDMA hergestellt werden. OPHP wird eingeschlossen,
um polare Oberflächengruppen
auf dem Teilchen bereitzustellen. Alternativ kann ein Styrol/DVB-Kern
um eine OPHP-Mizelle herum gebildet werden, und dann kann MMA dazugegeben
werden, um die äußere Schale
zu bilden.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung.
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Beispiel 1
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i. Herstellung von Divinylbenzol-vernetzten
Polystyrol-Kern-Teilchen
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Eine
wässrige
Pufferlösung
von 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat
(0,6398 g, 3,00 mMol, 50 mM) in deionisiertem Wasser (52,5 ml) wurde
hergestellt, dann 15 min mit Stickstoff gespült. Natriumdodecylsulfat [Quelle
BDH, „besonders
rein"] (1,50 g,
5,20 mMol) wurde dann dazugegeben, dann wurde die Mischung zur Lösung gerührt, 10
min bei Raumtemperatur beschallt, dann durch die Zugabe von 1 M
NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde bei 300 – 350 U/min
unter Stickstoffatmosphäre
gerührt,
wobei die Temperatur bei 60 °C
gehalten wurde, und eine Styrol (4,0173 g, 38,57 mMol)/Dinvinylbenzol
(5,0217 g, 38,57 mMol)-Mischung wurde dann tropfenweise über 30 min
zu der Mischung gegeben. Die Polymerisation wurde durch die Zugabe
einer einzigen Portion von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,5460
g, 1,95 mMol) initiiert, und das Rühren wurde 16 Stunden fortgesetzt,
was eine Emulsion von Kern-Teilchen ergab.
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ii. Molekulares Oberflächenprägen
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Eine
Mischung von Ethylenglycoldimethacrylat (0,4520 g, 2,28 mMol) [5
bezüglich
Masse] (ml) wurde bei 60 °C
zu der Emulsion gegeben, und das Rühren wurde 30 Minuten fortgesetzt.
Ein Koffein-Abdruck wurde erhalten, indem man Koffein (0,3735 g;
1,92 mMol; 2,0 Moläquivalente)
dazugab, und das Rühren
wurde 30 Minuten fortgesetzt, um ein Gleichgewicht zu erreichen,
dann wurde die Oberflächenpolymerisation
durch die Zugabe von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,5460
g, 1,95 mMol) in einer einzigen Portion initiiert. Die Reaktion
wurde 105 min bei 60 °C
fortgesetzt, dann durch Erniedrigen der Temperatur auf 0 °C unter Verwendung eines
Eiswasserbads gequencht.
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Es
wurden stabile Emulsionen gebildet, als der Massenprozentsatz von
EGDMA in der Beschichtungsdicke sowohl auf 20 % erhöht als auch
auf 1 % verringert wurde, wobei man die oben beschriebene Standardmethode
für die
molekulare Oberflächenprägung der
Polymerkolloidteilchen mit Koffein verwendet.
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Bespiel 2
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Eine
Vielfalt von Kern-Schale-Teilchen mit molekular geprägter Oberfläche wurde
gemäß dem in
Beispiel 1 angegebenen Verfahren hergestellt, außer dass Koffein durch alternative
Abdruckmoleküle,
einschließlich
Theophyllin, Codein, Morphin, Piperazin, Imidazol, Harmin, Carbolin,
Propranolol und Atenolol, bei relativen Konzentrationen im Bereich
von 1,0 bis 2,0 Moläquivalenten
ersetzt wurde. In allen Fällen
wurden stabile Emulsionen von geprägten Kern-Schale-Teilchen erhalten.
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Beispiel 3
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Synthese von Kern-Schale-Teilchen
mit einer Schale mit geringer Vernetzungsdichte.
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Teilchen
mit einer Gesamt-Schalenmasse von 5 % Gew./Gew., die aus Methylmethacrylat
(90 %) und EGDMA (10 %) bestand, wurden hergestellt, wie in 2(a) gezeigt.
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i. Herstellung von Divinylbenzol-vernetzten
Polystyrol-Kern-Teilchen
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Eine
wässrige
Lösung
von 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat
(4,265 g, 20 mMol, 50 mM) in deionisiertem Wasser (350 ml) wurde
hergestellt, dann 15 min mit Stickstoff gespült. Natriumdodecylsulfat (10,0
g, 34,6 mMol) wurde dazugegeben, und die Mischung wurde gerührt, 10
min bei Raumtemperatur beschallt und dann durch die Zugabe von 1
M NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre bei 300 – 350 U/min
gerührt,
wobei die Temperatur bei 60 °C
gehalten wurde, und eine Styrol (26,782 g, 0,257 Mol)/ Divinylbenzol
(33,478 g, 0,257 Mol)-Mischung wurde dann tropfenweise über 30 Minuten
zu der Mischung gegeben. Die Polymerisation wurde durch die Zugabe
einer einzigen Portion von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (3,640
g, 11,8 mMol) initiiert, und das Rühren wurde 16 h fortgesetzt,
was eine Emulsion aus Kern-Teilchen
ergab.
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ii. Molekulares Oberflächenprägen, um
Teilchen mit einer Schale mit geringer Vernetzungsdichte zu bilden
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Eine
Mischung von Methylmethacrylat (3,013 g, 30,1 mMol), Oleylphenylhydrogenphosphat
(1,0 g) in Wasser (50 ml) wurde dann dazugegeben, und das Rühren wurde
30 Minuten fortgesetzt. Das Matrizen-Molekül, in diesem Fall Koffein (3,883
g, 20 mMol, 2,0 Moläquivalent
bezüglich
OPHP), wurde dazugegeben, und das Rühren wurde 30 min fortgesetzt,
um ein Gleichgewicht zu erreichen, dann wurde die Oberflächenpolymerisation
durch Zugabe von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (3,64
g, 11,8 mMol) in einer einzigen Portion initiiert. Die Reaktion
wurde 105 min bei 60 °C
fortgesetzt, dann durch Verringern der Temperatur auf 0 °C unter Verwendung
eines Eiswasserbades gequencht.
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Beispiel 4
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Synthese von Kern-Schale-Teilchen
mit einem Divinylbenzol/Oleylphenylhydrogenphosphat-vernetztem Kern
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i. Herstellung von Divinylbenzol-vernetztem
Polystyrol/Oleylphenylhydrogenphosphat-Kern-Teilchen
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Eine
wässrige
Lösung
von 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat
(0,4265 g, 2 mMol) in in deionisiertem Wasser (35 ml) wurde hergestellt,
dann 15 min mit Stickstoff gespült.
Natriumdodecylsulfat (1,0 g, 3,46 mMol) wurde dazugegeben, und die
Mischung wurde gerührt,
10 min bei Raumtemperatur beschallt, dann durch die Zugabe von 1
M NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre bei 300 – 350 U/min
gerührt,
wobei die Temperatur bei 60 °C
gehalten wurde. Oleylphenylhydrogenphosphat (0,4260 g, 1,0 mMol)
wurde dazugegeben, und das Rühren
wurde 30 min fortgesetzt. Eine Mischung von Styrol (2,677 g, 25,7
mMol) und Divinylbenzol (3,349 g, 25,7 mMol) wurde tropfenweise über 30 min
dazugegeben. Die Polymerisation wurde durch die Zugabe einer einzigen
Portion von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,3640
g, 1,18 mMol) initiiert, und das Rühren wurde 8 h fortgesetzt.
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ii. Molekulares Oberflächenprägen mit
Methylmethacrylat
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Eine
Suspension von Methylmethacrylat (0,3013 g, 3,0 mMol) in deionisiertem
Wasser (5,0 ml) wurde bei 80 °C
zu der Emulsion gegeben, und das Rühren wurde 30 min fortgesetzt.
Die Matrizen-Verbindung, in diesem Fall Koffein (0,3883 g, 2,0 mMol),
wurde dazugegeben, und das Rühren
wurde 30 Minuten fortgesetzt, um ein Gleichgewicht zu erreichen,
wonach die Oberflächenpolymerisation
durch die Zugabe von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,3640
g, 1,18 mMol) in einer Portion initiiert wurde. Die Reaktion wurde
105 min bei 60 °C
fortgesetzt, dann durch Erniedrigen der Temperatur auf 0 °C unter Verwendung
eines Eiswasserbads gequencht. Diese Reaktionen sind in 2(b) gezeigt.
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Beispiel 5
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Herstellung
von geprägten
Kern-Schale-Teilchen für
Bindungsstudien
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Eine
2,0 ml-Aliquote einer Kern-Schale-Teilchenemulsion wurde rasch bei
Raumtemperatur gerührt, und
Aceton (1,4 – 1,8
ml) wurde tropfenweise über
eine zweiminütige
Zeitspanne dazugegeben, bis eine dicke Suspension erzielt wurde.
Die Suspension wurde in ein SEC-Gehäuse mit einem Fassungsvermögen von
5,0 ml (zuvor in eine Vakuum-Verteilerleitung eingefügt) gegossen
und sich 30 Minuten absetzen gelassen, dann unter Vakuum ablaufen
gelassen. Eine 2: 1-Lösung aus
Aceton/deionisiertem Wasser (2,0 ml) wurde zu der SEC-Patrone gegeben,
gerührt,
um eine Suspension zu bilden, dann abgelassen. Dieses Verfahren
wurde weiter wiederholt (6 × 2,0
ml), bis in dem Filtrat mittels UV-Absorptionsspektroskopie kein SDS mehr
nachgewiesen werden konnte und mittels LC-MS keine rückständige Matrize
nachgewiesen werden konnte. Die SECs wurden mit 20 ml-Lösungsmittelreservoirs
versehen und nacheinander gemäß dem in
Tabelle 1 angegebene Protokoll gewaschen. Nach diesem Verfahren
wurden die geprägten
Harze entweder direkt verwendet oder an Luft getrocknet und für die zukünftige Verwendung
aufbewahrt.
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Als
Alternative zu einem Waschen unter Verwendung von Filtration wurden
die geprägten
Polymerteilchen der Erfindung mit Isopropylalkohol gefällt und
durch Zentrifugation isoliert. Das Waschen wurde durch Resuspendieren
der Teilchen in den in Tabelle 1 beschriebenen Lösungsmitteln und Isolieren
der Teilchen nach jedem Waschen durch Zentrifugation durchgeführt. Es
wurde gefunden, dass dieses Verfahren eine besonders schnelle und
nützliche
Weise des Waschens der geprägten
Polymerteilchen war.
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Tabelle
1: Waschprotokoll für
die Herstellung von geprägten
Harzen
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Beispiel 6
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Binden von Koffein und Theophyllin
an geprägte
Kern-Schale-Teilchen
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Geprägte und
nicht-geprägte
Kern-Schale-Teilchen (2,0 ml), die wie in den Beispielen 1 und 2
beschrieben synthetisiert wurden und wie in Beispiel 5 beschrieben
zur Verwendung präpariert
wurden, wurden in eine Ultrazentrifugationspatrone mit einem Fassungsvermögen von
220 ml, die einen 100 000 Dalton- Rückhaltemembran
enthielt, gegeben und mit 3 ml Isopropanol gefällt. Proben wurden nacheinander
mit 70 % IPA/Wasser (3 × 15
ml), 1 M H3PO4 (2 × 20 ml);
Methanol (2 × 20
ml) und Wasser (2 × 20
ml) mit einer Zentrifugation bei 10 °C, 8000 × g zwischen den Waschungen
gewaschen.
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Eine
wässrige
1 : 1-Mischung von Koffein (57,5 μg/ml)
und Theophyllin (53,5 μg/ml)
wurde hergestellt und auf pH 7,0 eingestellt. Proben (2,0 ml) wurden
zu gewaschenen Koffein-geprägten,
Theophyllin-geprägten und
nicht-geprägten
Kern-Schale-Teilchen gegeben, und die Suspensionen wurden gründlich gemischt
und 30 min unter wiederholtem Rühren
alle 10 min stehen gelassen. Die Mischungen wurden unter Vakuum
abgelassen, filtriert, und die Überstände wurden
mittels LC-MS-Analyse unter Verwendung eines Waters 2690-Abtrennungsmoduls
und einer Micromass LCZ-Plattform analysiert, welche im ESI-Modus
mit einem Quadrupol-Massenanalysator mit einem 4000 Dalton-Bereich betrieben
wurde. Der Aufnahme-Bruchteil (U) wurde durch die Peakfläche U =
(A1 – A2)/A1 bestimmt, worin
A1 = Peakfläche der Lösung vor der Aufbringung auf
das Harz und A2 = Peakfläche des Überstands nach Kontakt mit
dem Harz. Die Ergebnisse dieser Bindungsstudien sind in Tabelle
2 mitgeteilt.
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Tabelle
2: Aufnahme-Bruchteil von Koffein/Theophyllin durch geprägte Polymerharze
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Es
wurde aus diesen Studien gefunden, dass die Selektivität für die Koffein-Aufnahme gegenüber Theophyllin
nur beobachtet wurde, als die Schalendicke einen optimalen Wert
von 5 % aufwies (d.h. Masse des verwendeten EGDMA war 5 % der Kernteilchen-Masse),
was auch eine Schichtdicke von 10 nm darstellt - äquivalent
zu den molekularen Abmessungen des verwendeten Matrizen-Moleküls, in diesem
Fall Koffein oder Theophyllin.
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Es
wurde keine Selektivität
für Koffein
beobachtet, wenn die Schale 20 % der Kernmasse beträgt, was nahelegt,
dass die vollständige
Einkapselung der Matrizen-Moleküle
durch vernetztes EGDMA allein an der Teilchenoberfläche stattfindet,
d.h. ohne Beteiligung der Phosphat-Kopfgruppen.
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Es
wird keine Selektivität
für Koffein
beobachtet, wenn die Schale 1 % der Kernmasse beträgt, und
es wurde auch beobachtet, dass die Aufnahme von sowohl Koffein als
auch Theophyllin bei dem mit Koffein geprägten Harz 14– 20 % niedriger
war als bei dem mit Theophyllin geprägten und nicht geprägten Harz.
Der Mangel an Selektivität
legt nahe, dass die hydrophilen Bindungskräfte aus den Phosphat-Kopfgruppen
aufgrund der flachen Schalendicke alle hydrophoben Wechselwirkungen
an der Kolloidoberfläche
dominieren.
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Beispiel 7
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Auswirkung des
pH auf die kompetitive Bindung an geprägte Harze
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Die
Auswirkung des pH auf die kompetitive Bindung einer 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Mischung (57,5/53,5 μg/ml) in
0,1 M Natriumphosphat-Puffer auf durch Koffein und Theophyllin geprägte Kern-Schale-Teilchen
und nichtgeprägte
Harze wurde im pH-Bereich von 4,0 – 9,0 bestimmt. Drei Reihen
von Festphasen-Extraktionspatronen (9 jeweils von durch Koffein
und Theophyllin geprägten
Harzen und Blindproben-Harzen), die jeweils 300 mg Harz enthielten,
wurden gemäß Beispiel
5 hergestellt. Lösungen
von 1 : 1 Koffein/Theophyllin (57,5/53,5 μg/ml) in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer
wurden im pH-Bereich von 4,0 – 9,0
hergestellt. Diese Lösungen
wurden bezüglich
des Koffein- und Theophyllin-Gehalts sowohl vor als auch nach der
Auftragung auf das Harz gemäß dem in
Beispiel 6 beschriebenen Verfahren analysiert. Die Aufnahme von
Koffein (UK) aus den 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Lösungen im
pH-Bereich von 4,0 – 9,0
wurde für
das durch Koffein geprägte
Harz [P(Koff)], das durch Theophyllin geprägte Harz [P(Theo)] und für die Blindproben-Harze
bestimmt. Ähnlich
wurde die Aufnahme von Theophyllin (UT)
aus den 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Lösungen im pH-Bereich von 4,0 – 9,0 für das durch
Koffein geprägte
Harz [P(Koff)], das durch Theophyllin geprägte Harz [P(Theo)] und für die Blindproben-Harze
bestimmt. Die Aufnahmewerte (relativ zur Blindprobe) wurden gegen
den pH aufgetragen, wie in 5 gezeigt.
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Diese
Studien demonstrieren, dass (i) die selektive Aufnahme von Koffein
aus einer 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Mischung in Natriumphosphat-Puffer
bei pH 8,0 bei dem durch Koffein geprägten Harz ausgeprägter ist
als bei dem durch Theophyllin geprägten Harz; (ii) dass die selektive
Aufnahme von Theophyllin aus einer 1 : 1 Koffein/Theophylllin-Mischung
in Natriumphosphat-Puffer bei pH 8,0 bei dem durch Koffein geprägten Harz
ausgeprägter
ist als bei dem durch Theophyllin geprägten Harz; und (iii) dass die
selektive Aufnahme von Theophyllin in Natriumphosphat-Puffer bei
pH 8,0 auf einem mit Koffein geprägten Harz ausgeprägter ist
als die selektive Aufnahme von Koffein auf einem mit Koffein geprägten Harz.
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Beispiel 8
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Untersuchungen der Selektivität von molekular
geprägten
Kern-Schale-Teilchen unter Verwendung von 1 : 1-Mischungen von strukturell
analogen Komponenten.
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Verschiedene
Kern-Schale-Teilchen wurden mit wasserlöslichen Verbindungen gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren molekular oberflächengeprägt. Wässrige 1
: 1-Mischungen der Abdruckmoleküle
und einer strukturell analogen Verbindung wurden hergestellt, und
die Lösungen
wurden mit 1 M NaOH/1 M HCl auf pH 7,0 eingestellt. Der Gehalt jeder
Komponente in der Mischung sowohl vor als auch nach der Auftragung
auf die Harze wurde unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen
Verfahrens ermittelt. Die Aufnahme-Bruchteilwerte (U1 und
U2) jeder Komponente in der 1 : 1-Mischung
nach der Auftragung auf das Harz wurden für Harze (P), die mit jeder
der analogen Verbindungen 1 und 2 geprägt waren, und auch für das Blindproben-
(nicht geprägte)
Harz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst
und demonstrieren eine erhöhte
Selektivität
für das
Molekül,
das für
die Prägungsbildung
verwendet wurde, verglichen mit einer strukturell ähnlichen
Verbindung. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die molekular geprägten Kern-Schale-Teilchen der
Erfindung für
die Auftrennung von strukturell ähnlichen
Verbindungen verwendet werden können.
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Tabelle
3: Aufnahme-Bruchteil (U) für
analoge Paare
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Beispiel 9
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Die
Auswirkung der verwendeten Monomer-Art, um die Schale der Kern-Schale-Teilchenemulsionen zu
konstruieren, wurde untersucht, wenn die molekulare Oberflächenprägung unter
Verwendung von Koffein- und Theophyllin-Matrizen-Molekülen in dem in Beispiel 1 beschriebenen
zweistufigen Emulsions-Polymerisationsverfahren
durchgeführt
wird.
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Die
Kern-Teilchen wurden hergestellt, indem man einen 1 : 1 DVB-vernetzten
Polystyrol-Kern mit SDS als Tensid und wässrigem 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat-Puffer
bei pH 6,0 bildete. Kern-Schale-Teilchenemulsionen wurden durch
Oberflächenprägungs-Polymerisation
mit Koffein und Theophyllin in Anwesenheit von Oleylphenylhydrogenphosphat
(OPHP) und einem Monomer hergestellt, das aus Ethylenglycoldimethacrylat
(EGDMA), Methacrylsäure
(MA), Methylmethacrylat (MMA) und Styrol (ST) ausgewählt war. Blindproben-
(nicht-geprägte}
Teilchen wurden hergestellt, indem man das zweistufige Emulsions-Polymeri sationsverfahren
in Abwesenheit von Matrizen-Molekül durchführte. Feste Extraktionspatronen,
die geprägte Kern-Schale-Teilchen
enthielten, wurden hergestellt, wie in Beispiel 5 beschrieben, und
die Bindung von Koffein und Theophyllin wurde bestimmt, wie in Beispiel
6 beschrieben. Die Befunde dieser Studie sind in Tabelle 4 mitgeteilt.
Ein hohes Selektivitätsverhältnis (1,84)
wird nur beobachtet, wenn die Schalen-Komponenten EGDMA/OPHP sind,
und die Selektivität
nähert
sich null, wenn andere Komponenten verwendet werden. Dementsprechend
ist eine Schalen-Polymerschicht, die aus EGDMA und OPHP gebaut ist,
für die
Konstruktion von molekular geprägten
Kern-Schale-Teilchen der Erfindung vorteilhaft.
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Tabelle
4: Auswirkung der Schalen-Zusammensetzung auf die selektive Aufnahme
von Koffein gegenüber Theophyllin
in Kern-Schale-Teilchenharz