DE60106442T2 - PARTIKEL UND IHRE VERWENDUNG IN MOLEKULARER Prägung - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Teilchen und ihre Verwendung bei der molekularen Prägung. Spezieller betrifft diese Erfindung Teilchen, die zur Verwendung als Abtrennungsmedien geeignet sind, und ihre Herstellung durch molekulare Prägung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es sind viele Verfahren bekannt, um eine Abtrennung und Analyse eines Ziel-Moleküls aus einer unreinen Mischung zu erzielen, beispielsweise Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie (LC-MS) und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese beiden Verfahren sind nichtspezifisch. Das heißt, gewisse Parameter (wie UV-Wellenlänge und Strömungsgeschwindigkeit) müssen eingestellt und aufrechterhalten werden, um eine spezielle Verbindung zu identifizieren.
  • Die molekulare Prägung kann verwendet werden, um Polymere zu erzeugen, die für spezielle Ziel-Moleküle selektiv sind. Das Produkt wird in einer Reihe von Stufen hergestellt. Zuerst werden ausgewählte copolymerisierte Monomere mit dem Ziel-Molekül gemischt. Zweitens geht die Mischung eine Polymerisation ein, wodurch das Ziel-Molekül in dem Polymer eingeschlossen wird. Drittens wird das Ziel-Molekül extrahiert, was einen Hohlraum oder eine Prägung (einen Abdruck) zurücklässt, der dem Ziel-Molekül entspricht. Das resultierende polymere Produkt ist deshalb für das Ziel-Molekül selektiv.
  • Es gibt jedoch eine Anzahl von Nachteilen bei dieser Technik. In den meisten Fällen hat die Polymerisation der Monomere und des Ziel-Moleküls eine feste Masse zum Ergebnis, die zerbrochen und beispielsweise in einer Mühle gemahlen werden muss, um Teilchen mit einer geeigneten Größe bereitzustellen. Mit diesem Verfahren ist es schwierig, Teilchen mit einer gleichförmigen „Form" zu erzeugen, wie sie z.B. typisch zur Verwendung in Trennungsrohren oder -säulen erforderlich ist, um bei der Verwendung einen signifikanten Staudruck zu vermeiden. HPLC-Säulen erfordern beispielsweise Teilchen mit einem engen Bereich von Durchmessern, typisch 80 % der Teilchen mit ± 20 % des mittleren Durchmessers. Deshalb werden, wenn relativ gleichförmige Teilchen erforderlich sind, die Teilchen gesiebt. Die Verwendung irgendeines oder aller dieser Verfahren hat große Materialverluste als „Feinteilchen" zur Folge. Beispielsweise kann das Zerbrechen und Mahlen einen 50%-igen Verlust des hergestellten Materials zur Folge haben, und das Sieben kann einen Verlust von so viel wie 95 % des hergestellten Materials zur Folge haben. Offensichtlich ist dies ein großer wirtschaftlicher Nachteil.
  • Ein weiterer Nachteil der derzeitigen Techniken besteht darin, dass gewöhnlich ein hoher Anteil des Ziel-Moleküls innerhalb der Polymer-Matrix eingeschlossen wird. Es wird allgemein verstanden, dass, obwohl etwas Ziel entfernt werden kann (z.B. durch Waschen mit organischem Lösungsmittel), ein Anteil in der Matrix eingeschlossen verbleibt.
  • Dies weist zwei unerwünschte Auswirkungen auf. Erstens sind Ziel-Moleküle häufig teuer. Sie können z.B. Arzneistoff-Kandidaten sein, die speziell hergestellt wurden, um ihre Wirksamkeit zu testen. In derartigen Fällen ist es wünschenswert, das Ziel-Molekül zu entfernen und wiederzuverwenden. Zweitens beeinflussen alle Ziel-Moleküle, die in der Matrix verbleiben, nachteilig deren Nützlichkeit bei der Spurenanalyse und quantitativen Analyse. Die Abdruck- (Prägungs-) Moleküle „lecken" heraus und maskieren die Adsorption des Ziel-Moleküls.
  • Dies ist ein ernsthaftes Problem und ist im Stand der Technik angesprochen worden. Es hat sich eine Strategie entwickelt, die ein Analogon des Ziel-Moleküls als den Abdruck verwendet. Wenn das Analogon einen Hohlraum bildet, der selektiv durch das Ziel-Molekül gefüllt werden kann, und das Analogon von dem Ziel-Molekül beispielsweise mittels HPLC abgetrennt werden kann, können Matrizes in Spuren- und quantitativen Assays verwendbar sein.
  • Noch ein weiterer Nachteil entsteht aus der typisch geringen Wasserlöslichkeit der Monomere. Als Folge wird die Polymerisation in organischem Lösungsmittel durchgeführt. Neben den höheren Kosten von organischen Lösungsmitteln im Vergleich zu Wasser und den erhöhten Umweltbedenken bezüglich der Verwendung von organischen Lösungsmitteln entspricht ein organisches System nicht biologischen Systemen. Viele Bioassays, für die geprägte Polymere nützlich sein könnten, sollten in Wasser durchgeführt werden, um ein natürliches System darzustellen. Es ist allgemein anerkannt, dass der Ersatz von organischem Lösungsmittel durch Wasser aufgrund des hohen Vernetzungsgrades, der erforderlich ist, um die Hohlraumform aufrechtzuerhalten, nicht durchführbar ist.
  • Glad et al., Reactive Polymers, Bd. 25, Nr. 1, 1995, Seiten 47–54, beschreiben die Herstellung von kugelförmigen Mikroteilchen, die eine Schale aus molekular geprägten vernetzten Methacrylat-Polymeren umfassen. Eine Mischung aus Methacrylsäure, Ethylenglycoldimethacrylat und einem Abdruck-Analyten wird zu TRIM-Teilchen gegeben und polymerisiert. Die geprägten Verbundteilchen werden gewaschen. Eine Chromatographie unter Verwendung des Matrizen-Moleküls als Analyt wird durchgeführt.
  • Glad et al., J. Chromatography, Bd. 347, Nr. 1, 1985, Seiten 11–24, beschreiben die Verwendung von organischen Silan-Monomeren bei der Herstellung von Substrat-selektiven Polymeren durch molekulare Prägung. Man lässt die Silane auf der Oberfläche von porösen Siliciumdioxid-Teilchen in wässriger Lösung in Anwesenheit eines Farbstoff-Substrats polymerisieren. Die resultierenden Teilchen werden gründlich gewaschen. Die Siloxan-beschichteten Teilchen werden in HPLC-Experimenten unter Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels bewertet.
  • Sundaresan et al., J. Chromatography, A (1997), 775(1+2), 51–63, und auch in Biotechnology and Bioengineering, Bd. 48, Nr. 5, 1995, Seiten 431–436, beschrieben geprägte Polymere, die auf derivatisierte Siliciumdioxid-Teilchen oder TRIM-Teilchen gepfropft sind, und ihre Verwendung für den Nachweis von Analyten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung weist ein Teilchen, das sich spezifisch an ein Abdruckmolekül binden kann, eine äußere Schale, die Hohlräume einschließt, welche dem Abdruckmolekül entsprechen, und einen inneren Kern auf, der im Wesentlichen frei von derartigen Hohlräumen ist. Das Teilchen schließt auch ein amphipathisches Material ein.
  • Derartige Teilchen können durch die Schritte:
    • a) Polymerisieren einer Mischung des Abdruckmoleküls und von polymerisierbarem Material um den Kern herum, um eine Schale zu bilden, welche das Abdruckmolekül enthält; und
    • b) Entfernen des Abdruckmoleküls z.B. durch Waschen, um einen entsprechenden Hohlraum zurückzulassen, hergestellt werden.
  • Die Erfindung ermöglicht vorteilhaft, dass Auswahlassays in einer wässrigen Umgebung durchgeführt werden können. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Teilchen der Erfindung leicht mit einer gleichförmigen Größe hergestellt werden können. Die Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren zur Abtrennung von Molekülen auf der Grundlage ihrer Form, Größe und chemischen Zusammensetzung bereit.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Teilchen der vorliegenden Erfindung werden aus Materialien hergestellt, die an sich bekannt sein können. Es gibt im Wesentlichen zwei Stufen zur Herstellung der Teilchen. Zuerst wird eine Mischung aus polymerisierbarem Material und Abdruckmolekül (nachstehend als die polymerisierbare Mischung bezeichnet) um einen Kern herum polymerisiert, um eine Schale zu bilden, welche das Abdruckmolekül enthält. Zweitens wird das Abdruckmolekül entfernt, was Abdruck-spezifische Hohlräume zurücklässt.
  • Der Kern des Teilchens kann im Handel erhältlich sein oder er kann in situ hergestellt werden. Zum Beispiel kann er aus polymerisierbaren Monomeren, wie Divinylbenzol (DVB)/Styrol gebildet werden.
  • Die Schale wird aus irgendeinem geeigneten polymerisierbaren Material gebildet. Bei diesem kann es sich beispielsweise um Methylmethacrylat (MMA) oder EGDMA oder eine Kombination derselben handeln. Ein Abdruckmolekül wird dann dazugegeben, bei dem es sich um irgendeinen geeigneten Liganden handeln kann, für den ein Test gewünscht wird, und schließlich wird das Abdruckmolekül ausgewaschen. Bei der Waschlösung kann es sich beispielsweise um eine Lösung von Wasser/Aceton, H3PO4 oder Methanol handeln.
  • Um seine Benetzungseigenschaften zu verbessern, weist das Teilchen auf seiner Oberfläche polare Gruppen auf, indem ein amphipathisches Molekül in das Teilchen eingeschlossen wird. Derartige amphipathische Moleküle dienen auch dazu, die Porenbildung und die nicht-kovalente Bindungswechselwirkungen mit dem eingeprägten Molekül zu verstärken. Das amphipathische Molekül kann in die polymerisierbare Mischung eingeschlossen werden, oder der Kern kann um ein „molekulares Gerüst" herum gebildet werden, welches das amphipathische Molekül umfasst. Beispielsweise kann Oleylphenylhydrogenphosphat (OPHP), ein amphiphatisches Molekül, in die polymerisierbare Mischung eingeschlossen werden oder kann eine Mizelle bilden, um die herum ein Kern gebildet wird.
  • Die Teilchen der Erfindung weisen typisch eine Größe auf, die 10-, 50- oder 100-mal kleiner oder größer als das Beispiel hierin ist, und weisen bevorzugt eine Größenverteilung auf, die ähnlich mit dem Beispiel in Beziehung steht. Die Schale macht typisch bis zu 10, 20, 30, 40 oder 50 % der Querschnittsabmessung des Teilchens aus und kann zwischen 10- 50- und 100-mal dünner oder dicker als das Beispiel hierin sein. Je dünner die Schale ist, desto leichter können die Abdruckmoleküle aufgrund ihrer Nähe zu der äußeren Oberfläche ausgewaschen werden.
  • Die Erfindung wird nun lediglich mittels Beispiels mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
  • 1 ein schematisches Diagramm ist, das eine Reihenfolge von Schritten zur Erzeugung der Teilchen zeigt;
  • 2 schematische Diagramme von zwei alternativen Reihenfolgen von Schritten zur Erzeugung der Teilchen liefert;
  • 3 die Strukturen von zwei Verbindungen zeigt, die bei der Herstellung der Teilchen nützlich sind;
  • 4 eine schematische Veranschaulichung von nicht-spezifischen und spezifischen Hohlräumen ist, die durch die Erfindung gebildet werden können; und
  • 5 die Auswirkungen des pH auf die Bindung von Koffein und Theophyllin auf die geprägten Kern-Schale-Teilchen veranschaulicht.
  • Mit Bezug auf 1 wird ein vernetzter Polystyrol-Kern aus Styrol und DVB hergestellt. Dieser wird mit einer Kombination aus OPHP und EGDMA (3) beschichtet, um ein „Kern-Schale"-Teilchen zu erzeugen. Anschließend wird ein Matrizen-Molekül oder Abdruck- (Prägungs-) Molekül dazugegeben, und dem folgt die Polymerisation des EGDMA mit einem wasserlöslichen Initiator. Die Abdruckmoleküle werden durch Lösungsmittelextraktion z.B. unter Verwendung von Aceton entfernt, was Ziel-spezifische Hohlräume in der Schale des Teilchens zurücklässt.
  • Mit Bezug auf 2 kann der Kern aus einer Mischung von Styrol und DVB hergestellt werden, und die Schale kann aus MMA/EGDMA hergestellt werden. OPHP wird eingeschlossen, um polare Oberflächengruppen auf dem Teilchen bereitzustellen. Alternativ kann ein Styrol/DVB-Kern um eine OPHP-Mizelle herum gebildet werden, und dann kann MMA dazugegeben werden, um die äußere Schale zu bilden.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
  • Beispiel 1
  • i. Herstellung von Divinylbenzol-vernetzten Polystyrol-Kern-Teilchen
  • Eine wässrige Pufferlösung von 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat (0,6398 g, 3,00 mMol, 50 mM) in deionisiertem Wasser (52,5 ml) wurde hergestellt, dann 15 min mit Stickstoff gespült. Natriumdodecylsulfat [Quelle BDH, „besonders rein"] (1,50 g, 5,20 mMol) wurde dann dazugegeben, dann wurde die Mischung zur Lösung gerührt, 10 min bei Raumtemperatur beschallt, dann durch die Zugabe von 1 M NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde bei 300 – 350 U/min unter Stickstoffatmosphäre gerührt, wobei die Temperatur bei 60 °C gehalten wurde, und eine Styrol (4,0173 g, 38,57 mMol)/Dinvinylbenzol (5,0217 g, 38,57 mMol)-Mischung wurde dann tropfenweise über 30 min zu der Mischung gegeben. Die Polymerisation wurde durch die Zugabe einer einzigen Portion von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,5460 g, 1,95 mMol) initiiert, und das Rühren wurde 16 Stunden fortgesetzt, was eine Emulsion von Kern-Teilchen ergab.
  • ii. Molekulares Oberflächenprägen
  • Eine Mischung von Ethylenglycoldimethacrylat (0,4520 g, 2,28 mMol) [5 bezüglich Masse] (ml) wurde bei 60 °C zu der Emulsion gegeben, und das Rühren wurde 30 Minuten fortgesetzt. Ein Koffein-Abdruck wurde erhalten, indem man Koffein (0,3735 g; 1,92 mMol; 2,0 Moläquivalente) dazugab, und das Rühren wurde 30 Minuten fortgesetzt, um ein Gleichgewicht zu erreichen, dann wurde die Oberflächenpolymerisation durch die Zugabe von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,5460 g, 1,95 mMol) in einer einzigen Portion initiiert. Die Reaktion wurde 105 min bei 60 °C fortgesetzt, dann durch Erniedrigen der Temperatur auf 0 °C unter Verwendung eines Eiswasserbads gequencht.
  • Es wurden stabile Emulsionen gebildet, als der Massenprozentsatz von EGDMA in der Beschichtungsdicke sowohl auf 20 % erhöht als auch auf 1 % verringert wurde, wobei man die oben beschriebene Standardmethode für die molekulare Oberflächenprägung der Polymerkolloidteilchen mit Koffein verwendet.
  • Bespiel 2
  • Eine Vielfalt von Kern-Schale-Teilchen mit molekular geprägter Oberfläche wurde gemäß dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren hergestellt, außer dass Koffein durch alternative Abdruckmoleküle, einschließlich Theophyllin, Codein, Morphin, Piperazin, Imidazol, Harmin, Carbolin, Propranolol und Atenolol, bei relativen Konzentrationen im Bereich von 1,0 bis 2,0 Moläquivalenten ersetzt wurde. In allen Fällen wurden stabile Emulsionen von geprägten Kern-Schale-Teilchen erhalten.
  • Beispiel 3
  • Synthese von Kern-Schale-Teilchen mit einer Schale mit geringer Vernetzungsdichte.
  • Teilchen mit einer Gesamt-Schalenmasse von 5 % Gew./Gew., die aus Methylmethacrylat (90 %) und EGDMA (10 %) bestand, wurden hergestellt, wie in 2(a) gezeigt.
  • i. Herstellung von Divinylbenzol-vernetzten Polystyrol-Kern-Teilchen
  • Eine wässrige Lösung von 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat (4,265 g, 20 mMol, 50 mM) in deionisiertem Wasser (350 ml) wurde hergestellt, dann 15 min mit Stickstoff gespült. Natriumdodecylsulfat (10,0 g, 34,6 mMol) wurde dazugegeben, und die Mischung wurde gerührt, 10 min bei Raumtemperatur beschallt und dann durch die Zugabe von 1 M NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre bei 300 – 350 U/min gerührt, wobei die Temperatur bei 60 °C gehalten wurde, und eine Styrol (26,782 g, 0,257 Mol)/ Divinylbenzol (33,478 g, 0,257 Mol)-Mischung wurde dann tropfenweise über 30 Minuten zu der Mischung gegeben. Die Polymerisation wurde durch die Zugabe einer einzigen Portion von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (3,640 g, 11,8 mMol) initiiert, und das Rühren wurde 16 h fortgesetzt, was eine Emulsion aus Kern-Teilchen ergab.
  • ii. Molekulares Oberflächenprägen, um Teilchen mit einer Schale mit geringer Vernetzungsdichte zu bilden
  • Eine Mischung von Methylmethacrylat (3,013 g, 30,1 mMol), Oleylphenylhydrogenphosphat (1,0 g) in Wasser (50 ml) wurde dann dazugegeben, und das Rühren wurde 30 Minuten fortgesetzt. Das Matrizen-Molekül, in diesem Fall Koffein (3,883 g, 20 mMol, 2,0 Moläquivalent bezüglich OPHP), wurde dazugegeben, und das Rühren wurde 30 min fortgesetzt, um ein Gleichgewicht zu erreichen, dann wurde die Oberflächenpolymerisation durch Zugabe von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (3,64 g, 11,8 mMol) in einer einzigen Portion initiiert. Die Reaktion wurde 105 min bei 60 °C fortgesetzt, dann durch Verringern der Temperatur auf 0 °C unter Verwendung eines Eiswasserbades gequencht.
  • Beispiel 4
  • Synthese von Kern-Schale-Teilchen mit einem Divinylbenzol/Oleylphenylhydrogenphosphat-vernetztem Kern
  • i. Herstellung von Divinylbenzol-vernetztem Polystyrol/Oleylphenylhydrogenphosphat-Kern-Teilchen
  • Eine wässrige Lösung von 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat (0,4265 g, 2 mMol) in in deionisiertem Wasser (35 ml) wurde hergestellt, dann 15 min mit Stickstoff gespült. Natriumdodecylsulfat (1,0 g, 3,46 mMol) wurde dazugegeben, und die Mischung wurde gerührt, 10 min bei Raumtemperatur beschallt, dann durch die Zugabe von 1 M NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre bei 300 – 350 U/min gerührt, wobei die Temperatur bei 60 °C gehalten wurde. Oleylphenylhydrogenphosphat (0,4260 g, 1,0 mMol) wurde dazugegeben, und das Rühren wurde 30 min fortgesetzt. Eine Mischung von Styrol (2,677 g, 25,7 mMol) und Divinylbenzol (3,349 g, 25,7 mMol) wurde tropfenweise über 30 min dazugegeben. Die Polymerisation wurde durch die Zugabe einer einzigen Portion von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,3640 g, 1,18 mMol) initiiert, und das Rühren wurde 8 h fortgesetzt.
  • ii. Molekulares Oberflächenprägen mit Methylmethacrylat
  • Eine Suspension von Methylmethacrylat (0,3013 g, 3,0 mMol) in deionisiertem Wasser (5,0 ml) wurde bei 80 °C zu der Emulsion gegeben, und das Rühren wurde 30 min fortgesetzt. Die Matrizen-Verbindung, in diesem Fall Koffein (0,3883 g, 2,0 mMol), wurde dazugegeben, und das Rühren wurde 30 Minuten fortgesetzt, um ein Gleichgewicht zu erreichen, wonach die Oberflächenpolymerisation durch die Zugabe von 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) (0,3640 g, 1,18 mMol) in einer Portion initiiert wurde. Die Reaktion wurde 105 min bei 60 °C fortgesetzt, dann durch Erniedrigen der Temperatur auf 0 °C unter Verwendung eines Eiswasserbads gequencht. Diese Reaktionen sind in 2(b) gezeigt.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von geprägten Kern-Schale-Teilchen für Bindungsstudien
  • Eine 2,0 ml-Aliquote einer Kern-Schale-Teilchenemulsion wurde rasch bei Raumtemperatur gerührt, und Aceton (1,4 – 1,8 ml) wurde tropfenweise über eine zweiminütige Zeitspanne dazugegeben, bis eine dicke Suspension erzielt wurde. Die Suspension wurde in ein SEC-Gehäuse mit einem Fassungsvermögen von 5,0 ml (zuvor in eine Vakuum-Verteilerleitung eingefügt) gegossen und sich 30 Minuten absetzen gelassen, dann unter Vakuum ablaufen gelassen. Eine 2: 1-Lösung aus Aceton/deionisiertem Wasser (2,0 ml) wurde zu der SEC-Patrone gegeben, gerührt, um eine Suspension zu bilden, dann abgelassen. Dieses Verfahren wurde weiter wiederholt (6 × 2,0 ml), bis in dem Filtrat mittels UV-Absorptionsspektroskopie kein SDS mehr nachgewiesen werden konnte und mittels LC-MS keine rückständige Matrize nachgewiesen werden konnte. Die SECs wurden mit 20 ml-Lösungsmittelreservoirs versehen und nacheinander gemäß dem in Tabelle 1 angegebene Protokoll gewaschen. Nach diesem Verfahren wurden die geprägten Harze entweder direkt verwendet oder an Luft getrocknet und für die zukünftige Verwendung aufbewahrt.
  • Als Alternative zu einem Waschen unter Verwendung von Filtration wurden die geprägten Polymerteilchen der Erfindung mit Isopropylalkohol gefällt und durch Zentrifugation isoliert. Das Waschen wurde durch Resuspendieren der Teilchen in den in Tabelle 1 beschriebenen Lösungsmitteln und Isolieren der Teilchen nach jedem Waschen durch Zentrifugation durchgeführt. Es wurde gefunden, dass dieses Verfahren eine besonders schnelle und nützliche Weise des Waschens der geprägten Polymerteilchen war.
  • Tabelle 1: Waschprotokoll für die Herstellung von geprägten Harzen
    Figure 00110001
  • Beispiel 6
  • Binden von Koffein und Theophyllin an geprägte Kern-Schale-Teilchen
  • Geprägte und nicht-geprägte Kern-Schale-Teilchen (2,0 ml), die wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben synthetisiert wurden und wie in Beispiel 5 beschrieben zur Verwendung präpariert wurden, wurden in eine Ultrazentrifugationspatrone mit einem Fassungsvermögen von 220 ml, die einen 100 000 Dalton- Rückhaltemembran enthielt, gegeben und mit 3 ml Isopropanol gefällt. Proben wurden nacheinander mit 70 % IPA/Wasser (3 × 15 ml), 1 M H3PO4 (2 × 20 ml); Methanol (2 × 20 ml) und Wasser (2 × 20 ml) mit einer Zentrifugation bei 10 °C, 8000 × g zwischen den Waschungen gewaschen.
  • Eine wässrige 1 : 1-Mischung von Koffein (57,5 μg/ml) und Theophyllin (53,5 μg/ml) wurde hergestellt und auf pH 7,0 eingestellt. Proben (2,0 ml) wurden zu gewaschenen Koffein-geprägten, Theophyllin-geprägten und nicht-geprägten Kern-Schale-Teilchen gegeben, und die Suspensionen wurden gründlich gemischt und 30 min unter wiederholtem Rühren alle 10 min stehen gelassen. Die Mischungen wurden unter Vakuum abgelassen, filtriert, und die Überstände wurden mittels LC-MS-Analyse unter Verwendung eines Waters 2690-Abtrennungsmoduls und einer Micromass LCZ-Plattform analysiert, welche im ESI-Modus mit einem Quadrupol-Massenanalysator mit einem 4000 Dalton-Bereich betrieben wurde. Der Aufnahme-Bruchteil (U) wurde durch die Peakfläche U = (A1 – A2)/A1 bestimmt, worin A1 = Peakfläche der Lösung vor der Aufbringung auf das Harz und A2 = Peakfläche des Überstands nach Kontakt mit dem Harz. Die Ergebnisse dieser Bindungsstudien sind in Tabelle 2 mitgeteilt.
  • Tabelle 2: Aufnahme-Bruchteil von Koffein/Theophyllin durch geprägte Polymerharze
    Figure 00120001
  • Es wurde aus diesen Studien gefunden, dass die Selektivität für die Koffein-Aufnahme gegenüber Theophyllin nur beobachtet wurde, als die Schalendicke einen optimalen Wert von 5 % aufwies (d.h. Masse des verwendeten EGDMA war 5 % der Kernteilchen-Masse), was auch eine Schichtdicke von 10 nm darstellt - äquivalent zu den molekularen Abmessungen des verwendeten Matrizen-Moleküls, in diesem Fall Koffein oder Theophyllin.
  • Es wurde keine Selektivität für Koffein beobachtet, wenn die Schale 20 % der Kernmasse beträgt, was nahelegt, dass die vollständige Einkapselung der Matrizen-Moleküle durch vernetztes EGDMA allein an der Teilchenoberfläche stattfindet, d.h. ohne Beteiligung der Phosphat-Kopfgruppen.
  • Es wird keine Selektivität für Koffein beobachtet, wenn die Schale 1 % der Kernmasse beträgt, und es wurde auch beobachtet, dass die Aufnahme von sowohl Koffein als auch Theophyllin bei dem mit Koffein geprägten Harz 14– 20 % niedriger war als bei dem mit Theophyllin geprägten und nicht geprägten Harz. Der Mangel an Selektivität legt nahe, dass die hydrophilen Bindungskräfte aus den Phosphat-Kopfgruppen aufgrund der flachen Schalendicke alle hydrophoben Wechselwirkungen an der Kolloidoberfläche dominieren.
  • Beispiel 7
  • Auswirkung des pH auf die kompetitive Bindung an geprägte Harze
  • Die Auswirkung des pH auf die kompetitive Bindung einer 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Mischung (57,5/53,5 μg/ml) in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer auf durch Koffein und Theophyllin geprägte Kern-Schale-Teilchen und nichtgeprägte Harze wurde im pH-Bereich von 4,0 – 9,0 bestimmt. Drei Reihen von Festphasen-Extraktionspatronen (9 jeweils von durch Koffein und Theophyllin geprägten Harzen und Blindproben-Harzen), die jeweils 300 mg Harz enthielten, wurden gemäß Beispiel 5 hergestellt. Lösungen von 1 : 1 Koffein/Theophyllin (57,5/53,5 μg/ml) in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer wurden im pH-Bereich von 4,0 – 9,0 hergestellt. Diese Lösungen wurden bezüglich des Koffein- und Theophyllin-Gehalts sowohl vor als auch nach der Auftragung auf das Harz gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren analysiert. Die Aufnahme von Koffein (UK) aus den 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Lösungen im pH-Bereich von 4,0 – 9,0 wurde für das durch Koffein geprägte Harz [P(Koff)], das durch Theophyllin geprägte Harz [P(Theo)] und für die Blindproben-Harze bestimmt. Ähnlich wurde die Aufnahme von Theophyllin (UT) aus den 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Lösungen im pH-Bereich von 4,0 – 9,0 für das durch Koffein geprägte Harz [P(Koff)], das durch Theophyllin geprägte Harz [P(Theo)] und für die Blindproben-Harze bestimmt. Die Aufnahmewerte (relativ zur Blindprobe) wurden gegen den pH aufgetragen, wie in 5 gezeigt.
  • Diese Studien demonstrieren, dass (i) die selektive Aufnahme von Koffein aus einer 1 : 1 Koffein/Theophyllin-Mischung in Natriumphosphat-Puffer bei pH 8,0 bei dem durch Koffein geprägten Harz ausgeprägter ist als bei dem durch Theophyllin geprägten Harz; (ii) dass die selektive Aufnahme von Theophyllin aus einer 1 : 1 Koffein/Theophylllin-Mischung in Natriumphosphat-Puffer bei pH 8,0 bei dem durch Koffein geprägten Harz ausgeprägter ist als bei dem durch Theophyllin geprägten Harz; und (iii) dass die selektive Aufnahme von Theophyllin in Natriumphosphat-Puffer bei pH 8,0 auf einem mit Koffein geprägten Harz ausgeprägter ist als die selektive Aufnahme von Koffein auf einem mit Koffein geprägten Harz.
  • Beispiel 8
  • Untersuchungen der Selektivität von molekular geprägten Kern-Schale-Teilchen unter Verwendung von 1 : 1-Mischungen von strukturell analogen Komponenten.
  • Verschiedene Kern-Schale-Teilchen wurden mit wasserlöslichen Verbindungen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren molekular oberflächengeprägt. Wässrige 1 : 1-Mischungen der Abdruckmoleküle und einer strukturell analogen Verbindung wurden hergestellt, und die Lösungen wurden mit 1 M NaOH/1 M HCl auf pH 7,0 eingestellt. Der Gehalt jeder Komponente in der Mischung sowohl vor als auch nach der Auftragung auf die Harze wurde unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens ermittelt. Die Aufnahme-Bruchteilwerte (U1 und U2) jeder Komponente in der 1 : 1-Mischung nach der Auftragung auf das Harz wurden für Harze (P), die mit jeder der analogen Verbindungen 1 und 2 geprägt waren, und auch für das Blindproben- (nicht geprägte) Harz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst und demonstrieren eine erhöhte Selektivität für das Molekül, das für die Prägungsbildung verwendet wurde, verglichen mit einer strukturell ähnlichen Verbindung. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die molekular geprägten Kern-Schale-Teilchen der Erfindung für die Auftrennung von strukturell ähnlichen Verbindungen verwendet werden können.
  • Tabelle 3: Aufnahme-Bruchteil (U) für analoge Paare
    Figure 00150001
  • Beispiel 9
  • Die Auswirkung der verwendeten Monomer-Art, um die Schale der Kern-Schale-Teilchenemulsionen zu konstruieren, wurde untersucht, wenn die molekulare Oberflächenprägung unter Verwendung von Koffein- und Theophyllin-Matrizen-Molekülen in dem in Beispiel 1 beschriebenen zweistufigen Emulsions-Polymerisationsverfahren durchgeführt wird.
  • Die Kern-Teilchen wurden hergestellt, indem man einen 1 : 1 DVB-vernetzten Polystyrol-Kern mit SDS als Tensid und wässrigem 4-Morpholinethansulfonsäure-Monohydrat-Puffer bei pH 6,0 bildete. Kern-Schale-Teilchenemulsionen wurden durch Oberflächenprägungs-Polymerisation mit Koffein und Theophyllin in Anwesenheit von Oleylphenylhydrogenphosphat (OPHP) und einem Monomer hergestellt, das aus Ethylenglycoldimethacrylat (EGDMA), Methacrylsäure (MA), Methylmethacrylat (MMA) und Styrol (ST) ausgewählt war. Blindproben- (nicht-geprägte} Teilchen wurden hergestellt, indem man das zweistufige Emulsions-Polymeri sationsverfahren in Abwesenheit von Matrizen-Molekül durchführte. Feste Extraktionspatronen, die geprägte Kern-Schale-Teilchen enthielten, wurden hergestellt, wie in Beispiel 5 beschrieben, und die Bindung von Koffein und Theophyllin wurde bestimmt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Befunde dieser Studie sind in Tabelle 4 mitgeteilt. Ein hohes Selektivitätsverhältnis (1,84) wird nur beobachtet, wenn die Schalen-Komponenten EGDMA/OPHP sind, und die Selektivität nähert sich null, wenn andere Komponenten verwendet werden. Dementsprechend ist eine Schalen-Polymerschicht, die aus EGDMA und OPHP gebaut ist, für die Konstruktion von molekular geprägten Kern-Schale-Teilchen der Erfindung vorteilhaft.
  • Tabelle 4: Auswirkung der Schalen-Zusammensetzung auf die selektive Aufnahme von Koffein gegenüber Theophyllin in Kern-Schale-Teilchenharz
    Figure 00160001

Claims (10)

  1. Teilchen, das sich spezifisch an ein Abdruckmolekül binden kann, wobei das Teilchen eine äußere Schale, die Hohlräume einschließt, welche dem Abdruckmolekül entsprechen, und einen inneren Kern aufweist, der im Wesentlichen frei von derartigen Hohlräumen ist, und ein amphipathisches Material einschließt.
  2. Teilchen nach Anspruch 1, das polare Oberflächengruppen aufweist.
  3. Teilchen nach einem vorangehenden Anspruch, in dem die Schale durch Polymerisation von Ethylenglycoldimeth-acrylat und Oleylphenylhydrogenphosphat erhältlich ist.
  4. Teilchen nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Hohlräume durch Verwendung eines löslichen Abdruck-moleküls gebildet werden.
  5. Teilchen nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die äußere Schale eine Dicke von 1 bis 100 nm aufweist.
  6. Verwendung von Teilchen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 als Medium zur Abtrennung eines Zielmoleküls, das dadurch gebunden wird.
  7. Verwendung von Teilchen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 als Medium zur Identifikation, Reinigung, Quantifizierung oder Charakterisierung eines Zielmoleküls, das dadurch gebunden wird.
  8. Verfahren zur Herstellung von Teilchen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, welches die Schritte umfasst: a) Polymerisieren einer Mischung des Abdruckmoleküls und von polymerisierbarem Material um den Kern herum, um eine Schale zu bilden, welche das Abdruckmolekül enthält; und b) Entfernen des Abdruckmoleküls, um einen entsprechenden Hohlraum zurückzulassen; wobei das amphipathische Material in die Mischung eingeschlossen wird oder der Kern um ein molekulares Gerüst herum gebildet wird, welches das amphipathische Material umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem der Schritt (a) in einem wässrigen Medium durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, in dem der Schritt (b) ein Waschen umfasst.
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