ES2228879T3 - Particulas y su uso en la impresion molecular. - Google Patents

Abstract

Partícula capaz de unirse de manera específica a una molécula de impresión, presentando la partícula una envoltura externa que comprende cavidades que corresponden a la molécula de impresión, y un núcleo interno sustancialmente libre de dichas cavidades y que incluye un material anfipático.

Description

Partículas y su uso en la impresión molecular.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a partículas y a su uso en la impresión molecular. Más particularmente, la presente invención se refiere a partículas adecuadas para su uso como medios de separación y a su preparación mediante impresión molecular.

Antecedentes de la invención

Se conocen muchos procedimientos para lograr la separación y el análisis de una molécula diana, a partir de una mezcla impura, por ejemplo, cromatografía de líquidos-espectroscopía de masas (LC-MS) y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Ambos procedimientos son no específicos. Es decir, ciertos parámetros (tales como la longitud de onda UV y la velocidad de flujo) deben fijarse y mantenerse con el fin de identificar un compuesto particular.

La impresión molecular puede utilizarse para producir polímeros que son selectivos para moléculas diana específicas. El producto se fabrica en una serie de fases. En primer lugar, se mezclan monómeros copolimerizables seleccionados con la molécula diana. En segundo lugar, la mezcla experimenta la polimerización, mediante lo cual la molécula diana queda atrapada dentro del polímero. En tercer lugar, la molécula diana se extrae, dejando una cavidad o impresión que corresponde a la molécula diana. Por tanto, el producto polimérico resultante es selectivo para la molécula diana.

Sin embargo, existen varias desventajas con esta técnica. En la mayoría de los casos, la polimerización de los monómeros y la molécula diana da como resultado una masa sólida que debe fragmentarse y molerse, es decir, en un molino, para proporcionar partículas de un tamaño apropiado. Mediante este procedimiento, es difícil producir partículas que presenten una "forma" uniforme, por ejemplo, tal como se requiere normalmente para su uso en tubos o columnas de separación, con el fin de evitar una contrapresión significativa en uso. Las columnas de HPLC, por ejemplo, requieren partículas que presenten un estrecho intervalo de diámetros, normalmente con el 80% de las partículas con \pm 20% de diámetro medio. Por tanto, si se requieren partículas relativamente uniformes, las partículas se pasan por un tamiz. El uso de cualquiera o todos estos procesos da como resultado grandes pérdidas de material, como "finos". Por ejemplo, la fragmentación y el molido pueden dar como resultado un 50% de pérdida del material preparado y el tamizado puede dar como resultado una pérdida de hasta el 95% del material preparado. Obviamente, esto es una grave desventaja económica.

Otra desventaja de las técnicas actuales es que una elevada proporción de la molécula diana normalmente queda atrapada dentro de la matriz polimérica. Generalmente se entiende que, aunque pueda extraerse parte de la molécula diana (por ejemplo, mediante lavado con un disolvente orgánico), una parte quedará atrapada en la matriz.

Esto tiene dos efectos no deseados. En primer lugar, las moléculas diana a menudo resultan caras. Por ejemplo, pueden ser fármacos experimentales, fabricados específicamente para probar su eficacia. En tales casos, es deseable extraer y reutilizar la molécula diana. En segundo lugar, cualquier molécula diana que permanezca en la matriz afecta adversamente a su utilidad en el análisis de trazas y en el análisis cuantitativo. Estas moléculas de impresión se "escaparán" y enmascararán la adsorción de la molécula diana.

Esto resulta un problema grave y uno que se ha tratado en la técnica anterior. Se ha desarrollado una estrategia que utiliza un análogo de la molécula diana, como la impresión. Si el análogo forma una cavidad que puede llenarse selectivamente por la molécula diana, y el análogo puede separarse de la molécula diana mediante, por ejemplo, HPLC, entonces las matrices pueden utilizarse en los ensayos de trazas y cuantitativo.

Todavía surge otra desventaja, normalmente, de la baja solubilidad en agua de los monómeros. En consecuencia, se lleva a cabo la polimerización en un disolvente orgánico. Aparte del coste más elevado de los disolventes orgánicos en comparación con el agua, y de la creciente preocupación medioambiental acerca del uso de disolventes orgánicos, un sistema orgánico no se corresponde con los sistemas biológicos. Numerosos bioensayos para los que los polímeros de impresión podrían ser útiles deben realizarse en agua, con el fin de representar un sistema natural. Se reconoce ampliamente que la sustitución del disolvente orgánico por el agua no es factible, debido al alto grado de reticulación requerido para mantener la forma de la cavidad.

Glad et al., Reactive Polymers, vol. 25, nº 1, 1995, páginas 47-54, describe la fabricación de micropartículas esféricas, que comprenden una envoltura de polímeros de metacrilato reticulados de impresión molecular. Una mezcla de ácido metacrílico, dimetacrilato de etilenglicol y un analito de impresión se añaden a partículas de TRIM (trimetacrilato de trimetilpropano) y se polimerizan. Las partículas compuestas de impresión se lavan. Se realiza cromatografía usando la molécula molde como analito.

Glad et al., J. Chromatography, vol. 347, nº 1, 1985, páginas 11-24, describe el uso de monómeros de silano orgánicos en la preparación de polímeros selectivos de sustrato mediante impresión molecular. Se permite que los silanos polimericen sobre la superficie de partículas porosas de sílice en disolución acuosa, en presencia de un sustrato colorante. Las partículas resultantes se lavan meticulosamente. Las partículas recubiertas de polisiloxano se evalúan en experimentos de HPLC, usando un disolvente adecuado.

Sundaresan et al., J. Chromatography, A (1997), 775 (1 + 2), 51-63, y también en Biotechnology and Bioenginneering, vol. 48, nº 5, 1995, páginas 431-436, describieron polímeros de impresión injertados a partículas de sílice derivatizadas o partículas de TRIM, y su uso para la detección de analitos.

Sumario de la invención

Según la presente invención, una partícula que puede unirse de manera específica a una molécula de impresión, tiene una envoltura externa que incluye cavidades que corresponden a la molécula de impresión, y un núcleo interno sustancialmente libre de tales cavidades. La partícula también incluye un material anfipático.

Dichas partículas pueden fabricarse mediante las etapas siguientes:

a)

polimerizar una mezcla de la molécula de impresión y el material polimerizable, alrededor del núcleo, para formar una envoltura que contiene la molécula de impresión; y

b)

extraer la molécula de impresión, por ejemplo, mediante lavado, para dejar una cavidad correspondiente.

La invención permite ventajosamente que se realicen ensayos de selección en un entorno acuoso. Una ventaja adicional es que las partículas de la invención pueden prepararse fácilmente, presentando un tamaño uniforme. La invención proporciona un procedimiento genérico para separar moléculas basándose en su forma, tamaño y composición química.

Descripción de la invención

Las partículas de la presente invención se fabrican a partir de materiales que pueden ser conocidos en sí mismos. Esencialmente, hay 2 fases para la fabricación de las partículas. En primer lugar, se polimeriza una mezcla de material polimerizable y molécula de impresión (denominada en lo sucesivo en el presente documento, mezcla polimerizable), alrededor de un núcleo, para formar una envoltura que contiene la molécula de impresión. En segundo lugar, la molécula de impresión se extrae, dejando cavidades de impresión específicas.

El núcleo de la partícula puede estar disponible comercialmente, o puede fabricarse in situ. Por ejemplo, puede formarse a partir de monómeros polimerizables, tales como divinilbenceno (DVB)/estireno.

La envoltura se forma a partir de cualquier material polimerizable adecuado. Éste puede ser, por ejemplo, metacrilato de metilo (MMA) o EGDMA (dimetacrilato de etilenglicol), o una combinación de éstos. A continuación, se añade una molécula de impresión, que puede ser cualquier ligando adecuado que se desea probar y, finalmente, la molécula de impresión se extrae por lavado. La disolución de lavado puede ser, por ejemplo, una disolución de agua/acetona, H_{3}PO_{4} o metanol.

Con el fin de mejorar sus propiedades de humectación, la partícula presenta grupos polares sobre su superficie externa, incluyendo una molécula anfipática en la partícula. Dichas moléculas anfipáticas también sirven para mejorar la formación de poros y las interacciones de enlaces no covalentes con la molécula de impresión. La molécula anfipática puede incluirse en la mezcla polimerizable, o el núcleo puede formarse alrededor de un "soporte molecular" que comprende la molécula anfipática. Por ejemplo, puede incluirse en la mezcla polimerizable hidrogenofosfato de oleilo y fenilo (OPHP), una molécula anfipática, o puede formarse una micela alrededor de la cual se forma el núcleo.

Las partículas de la invención normalmente son entre 10, 50 y 100 veces más pequeñas o más grandes en tamaño que en el ejemplo de la presente memoria y preferiblemente tienen una distribución de tamaño relacionada de manera similar con el ejemplo. La envoltura normalmente constituye hasta el 10, 20, 30, 40 ó 50% de la dimensión en sección transversal de la partícula y puede ser entre 10, 50 y 100 veces más fina o más gruesa que en el ejemplo de la presente memoria. Cuanto más fina sea la envoltura, más fácilmente pueden extraerse por lavado las moléculas de impresión, debido a su proximidad a la superficie externa.

La invención se describirá ahora a modo de ejemplo sólo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es una representación esquemática que muestra una secuencia de etapas para producir partículas;

la figura 2 proporciona representaciones esquemáticas de dos secuencias alternativas de etapas para producir partículas;

la figura 3 muestra las estructuras de dos compuestos útiles en la fabricación de las partículas;

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la figura 4 es una ilustración esquemática de las cavidades específicas y no específicas que pueden formarse mediante la invención; y

la figura 5 ilustra el efecto del pH sobre la unión de cafeína y teofilina a partículas de impresión de núcleo-envoltura.

Con referencia a la figura 1, se fabrica un núcleo de poliestireno reticulado a partir de estireno y DVB. Éste se recubre con una combinación de OPHP y EGDMA (figura 3) para producir una partícula de "núcleo-envoltura". Posteriormente, se añade una molécula molde, o molécula de impresión, y esto va seguido por la polimerización de EGDMA con un iniciador soluble en agua. Las moléculas de impresión se extraen mediante extracción con disolventes, por ejemplo, usando acetona, dejando cavidades específicas diana en la envoltura de la partícula.

Con referencia a la figura 2, el núcleo puede fabricarse a partir de una mezcla de estireno y DVB, y la envoltura puede fabricarse a partir de MMA/EGDMA. Se incluye OPHP para proporcionar grupos de superficie polares sobre la partícula. Alternativamente, puede formarse un núcleo de estireno/DVB alrededor de una micela de OPHP, y después puede añadirse MMA para formar la envoltura externa.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 I. Preparación de partículas de núcleo de poliestireno reticulado con divinilbenceno

Se preparó una disolución tampón acuosa de ácido 4-morfolinoetanosulfónico monohidratado (0,6398 g, 3,00 mmoles, 50 mM) en agua desionizada (52,5 ml), después se purgó con nitrógeno durante 15 minutos. Se añadió dodecilsulfato sódico [fuente BDH, "especialmente puro"] (1,50 g, 5,20 mmoles) a continuación se agitó la mezcla para su disolución, se sonicó durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se ajustó a pH 6,0 mediante la adición de NaOH 1 M. La disolución se agitó a 300-350 r.p.m. bajo una atmósfera de nitrógeno, manteniendo la temperatura a 60ºC y se añadió a continuación gota a gota una mezcla de estireno (4,0173 g, 38,57 mmoles)/divinilbenceno (5,0217 g, 38,57 mmoles) a la mezcla durante 30 minutos. La polimerización se inició mediante la adición de una parte de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) (0,5460 g, 1,95 mmoles) y se continuó con la agitación durante 16 horas, dando una emulsión de partículas de núcleo.

II. Impresión molecular de superficie

Se añadió una mezcla de dimetacrilato de etilenglicol (0,4520 g, 2,28 mmoles) [5% en masa] ml) a la emulsión a 60ºC y se continuó agitando durante 30 minutos. Se obtuvo una impresión de cafeína añadiendo cafeína (0,3735 g, 1,92 mmoles; 2,0 equivalentes molares) y se continuó agitando durante 30 minutos hasta alcanzar el equilibrio, entonces se inició la polimerización en superficie mediante la adición de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) (0,5460 g, 1,95 mmoles) en una porción. La reacción se continuó durante 105 minutos a 60ºC, después se extinguió disminuyendo la temperatura hasta 0ºC usando un baño de hielo-agua.

Se formaron emulsiones estables cuando el porcentaje en masa de EGDMA en el espesor del recubrimiento aumentó hasta el 20% y se redujo hasta el 1% usando la metodología estándar descrita anteriormente para la impresión molecular de superficie de las partículas coloidales poliméricas con cafeína.

Ejemplo 2

Se preparó una variedad de partículas de núcleo-envoltura de impresión molecular de superficie según el procedimiento dado en el ejemplo 1, excepto en que la cafeína se sustituyó por moléculas de impresión alternativas, incluyendo teofilina, codeína, morfina, piperazina, imidazol, harmina, carbolina, propanolol y atenolol, a concentraciones relativas en el intervalo de 1,0 a 2,0 equivalentes molares. En todos los casos se obtuvieron emulsiones estables de partículas de núcleo-envoltura de impresión.

Ejemplo 3 Síntesis de partículas de núcleo-envoltura con una envoltura de baja densidad de reticulación

Se prepararon partículas con una masa de envoltura total del 5% en p/p que consistía en metacrilato de metilo (90%) y EGDMA (10%), tal como se muestra en la figura 2(a).

I. Preparación de partículas de núcleo de poliestireno reticulado con divinilbenceno

Se preparó una disolución acuosa de ácido 4-morfolinoetanosulfónico monohidratado (4,265 g, 20 mmoles, 50 mM) en agua desionizada (350 ml), se purgó a continuación con nitrógeno durante 15 minutos. Se añadió dodecilsulfato sódico (10,0 g, 34,6 mmoles) y la mezcla se agitó, se sonicó durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se ajustó a pH 6,0 mediante la adición de NaOH 1 M. La disolución se agitó a 300-350 r.p.m. bajo una atmósfera de nitrógeno, manteniendo la temperatura a 60ºC y después se añadió gota a gota una mezcla de estireno (26,782 g, 0,257 mmoles)/divinilbenceno (33,478 g, 0,257 mmoles) a la mezcla durante 30 minutos. La polimerización se inició mediante la adición de una porción de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) (3,640 g, 11,8 mmoles) y se continuó con la agitación durante 16 horas, dando una emulsión de partículas de núcleo.

II. Impresión molecular de superficie para formar partículas con envoltura de baja densidad de reticulación

Entonces se añadió una mezcla de metacrilato de metilo (3,013 g, 30,1 mmoles), hidrógeno hexano de oleílo y fenilo (1,0 g) en agua (50 ml) y se continuó agitando durante 30 minutos. Se añadió la "molécula molde", en este caso cafeína (3,883 g, 20 mmoles, 2,0 equivalentes molares con respecto a OPHP), se continuó agitando durante 30 min hasta alcanzar el equilibrio, entonces se inició la polimerización en superficie mediante la adición de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) (3,64 g, 11,8 mmoles) en una porción. La reacción se continuó durante 105 minutos a 60ºC, se extinguió a continuación disminuyendo la temperatura hasta 0ºC usando un baño de hielo-agua.

Ejemplo 4 Síntesis de partículas de núcleo-envoltura con un núcleo reticulado de divinilbenceno/hidrogenofosfato de oleílo y fenilo I. Preparación de partículas de núcleo de poliestireno/hidrogenofosfato de oleílo y fenilo reticulado con divinilbenceno

Se preparó una disolución acuosa de ácido 4-morfolinoetanosulfónico monohidratado (0,4265 g, 2 mmoles) en agua desionizada (35 ml), después se purgó con nitrógeno durante 15 minutos. Se añadió dodecilsulfato sódico (1,0 g, 3,46 mmoles) y la mezcla se agitó, se sonicó durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se ajustó a pH 6,0 mediante la adición de NaOH 1 M. La disolución se agitó a 300 y 350 r.p.m. en una atmósfera de nitrógeno, manteniendo la temperatura a 60ºC. Se añadió hidrogenofosfato de oleílo y fenilo (0,4260 g, 1,0 mmoles) y se continuó con la agitación durante 30 minutos. Se añadió gota a gota una mezcla de estireno (2,677 g, 25,7 mmoles) y divinilbenceno (3,349 g, 25,7 mmoles) durante 30 minutos. La polimerización se inició mediante la adición de una porción de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) (0,3640 g, 1,18 mmoles) y se continuó con la agitación durante 6 horas.

II. Impresión molecular de superficie con metacrilato de metilo

Se añadió a la emulsión una suspensión de metacrilato de metilo (0,3013 g, 3,0 mmoles) en agua desionizada (5,0 ml) a 60ºC y se continuó agitando durante 30 minutos. Se añadió el compuesto molde, en este caso cafeína (0,3883 g, 2,0 mmoles), y se continuó agitando durante 30 minutos hasta alcanzar el equilibrio, con lo que se inició la polimerización en superficie mediante la adición de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) (0,3640 g, 1,18 mmoles) en una porción. La reacción se continuó durante 105 minutos a 60ºC, después se extinguió disminuyendo la temperatura hasta 0ºC usando un baño de hielo-agua. Las reacciones se muestran en la figura 2(b).

Ejemplo 5 Preparación de partículas de núcleo-envoltura de impresión para estudios de unión

Una alícuota de 2,0 ml de emulsión de partículas de núcleo-envoltura se agitó rápidamente a temperatura ambiente y se añadió acetona (1,4-1,8 ml) gota a gota durante un periodo de 2 minutos hasta que se obtuvo una suspensión espesa. La suspensión se vertió en un alojamiento SEC (single edge contact, contacto de un solo canto) de 5,0 ml de capacidad (preinsertado en un colector a vacío) y se dejó sedimentar durante 30 minutos, después se drenó a vacío. Se añadió una disolución de acetona/agua desionizada 2:1 (2,0 ml) al cartucho SEC, se agitó hasta formar una suspensión y después se drenó. Este procedimiento se repitió adicionalmente (6 x 2,0 ml) hasta que no pudo detectarse más SDS (dodecilsulfato sódico) en el filtrado por espectroscopia de absorción UV y no pudo detectarse ningún molde residual mediante LC-MS. Los SEC se equiparon con depósitos de disolvente de 20 ml y se lavaron secuencialmente según el protocolo dado en la tabla 1. Tras este procedimiento, las resinas de impresión se usaron directamente o se secaron al aire y se almacenaron para su uso futuro.

Como una alternativa al lavado mediante el uso de filtración, las partículas de polímero de impresión de la invención se precipitaron con alcohol isopropílico y se aislaron mediante centrifugación. Se realizó el lavado suspendiendo de nuevo las partículas en los disolventes descritos en la tabla 1 y aislando las partículas tras cada lavado por centrifugación. Se encontró que este procedimiento es una forma especialmente rápida y útil de lavado de las partículas de polímero de impresión.

TABLA 1 Protocolo de lavado para la preparación de resinas de impresión

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Ejemplo 6 Unión de cafeína y teofilina a partículas de núcleo-envoltura de impresión

Se añadieron partículas de núcleo-envoltura de impresión y no de impresión (2,0 ml) sintetizadas tal como se describió en los ejemplos 1 y 2 y preparadas para su uso tal como se describió en el ejemplo 5, a un cartucho de ultracentrifugación de 220 ml de capacidad que contenía una membrana de punto de corte de 100.000 Dalton y se precipitaron con 3 ml de isopropanol. Las muestras se lavaron secuencialmente con IPA (alcohol isopropílico) al 70%/agua (3 x 15 ml), H_{3}PO_{4} 1 M (2 x 20 ml); metanol (2 x 20 ml) y agua (2 x 20 ml) con centrifugación a 10ºC, 8000 x g entre lavados.

Se preparó una mezcla acuosa 1:1 de cafeína (57,5 \mug/ml) y teofilina (53,5 \mug/ml) y se ajustó a pH 7,0. Se añadieron las muestras (2,0 ml) a partículas de núcleo-envoltura lavadas de no impresión, de impresión de teofilina y de impresión de cafeína y las suspensiones se mezclaron meticulosamente y se dejaron reposar durante 30 minutos con agitación repetida cada 10 minutos. Las mezclas se drenaron a vacío, se filtraron y se analizaron los sobrenadantes mediante análisis de LC-MS usando un módulo de separaciones Waters 2690 y un espectrómetro de masas Micromass Platform LCZ que funciona en modo ESI (ionización por electrospray) con un analizador de masas de tipo cuadrupolo con un intervalo de 4000 Dalton. Se determinó la captación fraccionada (U) mediante el área de pico U = (A_{1}-A_{2})/A_{1}, en la que A_{1} = área de pico de la disolución antes de la aplicación a la resina y A_{2} = área de pico del sobrenadante tras el contacto con la resina. Los resultados de estos estudios de unión se notifican en la tabla 2.

TABLA 2 Captación fraccionada de cafeína/teofilina por resinas poliméricas de impresión

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A partir de estos estudios se encontró que la selectividad por la captación de cafeína con respecto a la de teofilina sólo se observaba cuando el espesor de la envoltura era un valor óptimo del 5% (es decir, la masa de EGDMA utilizada era el 5% de la masa del núcleo de la partícula), lo que también representa un espesor de la capa de 10 nm, equivalente a las dimensiones moleculares de la molécula molde utilizada, en este caso cafeína o teofilina.

No se observa selectividad para la cafeína cuando la envoltura es el 20% de la masa del núcleo, lo que sugiere que se produce la encapsulación completa de las moléculas molde por EGDMA reticulado solo, en la superficie de la partícula, es decir, sin participación de grupos de cabeza de fosfato.

No se observa selectividad para la cafeína cuando la envoltura es el 1% de la masa del núcleo y también se observó que la captación de cafeína y teofilina fue el 14-20% inferior para la resina de molde de teofilina que para las resinas de molde de teofilina y blanco. La falta de selectividad sugiere que las fuerzas de unión hidrófilas de los grupos de cabeza de fosfato dominan cualquier interacción hidrófoba en la superficie coloidal, debido al espesor poco profundo de la capa.

Ejemplo 7 Efecto del pH sobre la unión competitiva a las resinas de impresión

El efecto del pH sobre la unión competitiva de una mezcla 1:1 de cafeína/teofilina (57,5/53,5 \mug/ml) en tampón fosfato de sodio 0,1 M a partículas de núcleo-envoltura de impresión de cafeína y teofilina y resinas de molde de blanco se determinó en el intervalo de pH de 4,0-9,0. Se prepararon tres series de cartuchos de extracción en fase sólida (9 de cada una de las resinas de molde de cafeína y teofilina y resinas de blanco), conteniendo cada una 300 mg de resina, según el ejemplo 5. Se prepararon disoluciones 1:1 de cafeína/teofilina (57,5/53,5 \mug/ml) en tampón fosfato de sodio 0,1 M en el intervalo de pH 4,0-9,0. Estas disoluciones se analizaron para determinar el contenido de cafeína y teofilina, tanto antes como después de la aplicación a la resina, según el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Se determinó la captación de cafeína (U_{c}) a partir de las disoluciones 1:1 de cafeína/teofilina en el intervalo de pH de 4,0-9,0 para la resina de impresión de cafeína [P(caf)], la resina de impresión de teofilina [P(teo)] y para las resinas de blanco. De manera similar, se determinó la captación de teofilina (U_{t}) a partir de las disoluciones 1:1 de cafeína/teofilina en el intervalo de pH de 4,0-9,0 para la resina de impresión de cafeína [P(caf)], la resina de impresión de teofilina [P(teo)] y para las resinas de blanco. Los valores de captación (con respecto al blanco) se representaron frente al pH, tal como se muestra en la figura 5.

Estos estudios demuestran que (i) la captación selectiva de cafeína a partir de una mezcla 1:1 de cafeína/teofilina es más pronunciada para la resina de molde de cafeína que para la resina de molde de teofilina, en tampón fosfato de sodio a pH 8,0; (ii) que la captación selectiva de teofilina a partir de una mezcla de 1:1 cafeína/teofilina es más pronunciada para la resina de molde de cafeína que para la resina de molde de teofilina, en tampón fosfato de sodio a pH 8,0; y (iii) que la captación selectiva de teofilina sobre una resina de molde de cafeína es más pronunciada que la captación selectiva de cafeína sobre una resina de molde de cafeína, en tampón fosfato de sodio a pH 8,0.

Ejemplo 8 Investigación sobre la selectividad de las partículas de núcleo-envoltura de impresión molecular utilizando mezclas 1:1 de componentes estructuralmente análogos

Se realizó una impresión molecular en superficie de diversas partículas de núcleo-envoltura con compuestos solubles en agua según el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se prepararon mezclas acuosas 1:1 de la molécula de impresión y un compuesto estructuralmente análogo y las disoluciones se ajustaron a pH 7,0 con NaOH 1 M/HCl 1M. Se llevó a cabo la determinación del contenido de cada componente en la mezcla, tanto antes como después de la aplicación a las resinas según el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Se determinaron los valores de captación fraccionada (U_{1} y U_{2}) para cada componente en la mezcla 1:1 tras la aplicación a la resina, para las resinas (P) sometidas a impresión con cada uno de los compuestos análogos 1 y 2, y también para la resina de blanco (sin impresión). Los resultados se resumen en la tabla 3 y demuestran la selectividad mejorada para la molécula usada para la formación de impresión en comparación con un compuesto estructuralmente similar. Estos resultados confirman que las partículas del núcleo-envoltura de impresión molecular de la invención pueden usarse para la separación de compuestos estructuralmente similares.

TABLA 3 Captación fraccionada (U) para pares análogos

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Ejemplo 9

Se investigó el efecto del tipo de monómero utilizado para construir la envoltura de emulsiones de partículas de núcleo-envoltura cuando se llevó a cabo la impresión molecular en superficie usando moléculas molde de cafeína y teofilina en el procedimiento de polimerización en emulsión de dos etapas descrito en el ejemplo 1.

Se prepararon partículas de núcleo mediante la formación de un núcleo de poliestireno reticulado con DVB 1:1, con SDS como tensioactivo y tampón de ácido 1-morfolinoetanosulfónico acuoso monohidratado a pH 6,0. Se prepararon emulsiones de partículas de núcleo-envoltura mediante polimerización de molde en superficie, de cafeína y teofilina en presencia de hidrogenofosfato de oleílo y fenilo (OPHP) y un monómero seleccionado de dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA), ácido metacrílico (MA), metacrilato de metilo (MMA) y estireno (ST). Se prepararon partículas en blanco (de no impresión) llevando a cabo el procedimiento de polimerización en emulsión de dos etapas en ausencia de molécula molde. Se prepararon cartuchos de extracción en fase sólida que contenían partículas de núcleo-envoltura de impresión tal como se describe en el ejemplo 5 y se determinó la unión de cafeína y teofilina, tal como se describe en el ejemplo 6. Los hallazgos de este estudio se notifican en la tabla 4. Sólo se observa una alta razón de selectividad (1,84) cuando los componentes de la envoltura son EGDMA/OPHP y la selectividad se aproxima a cero cuando se usan otros componentes. En consecuencia, una capa de polímero de envoltura construida de EGDMA y OPHP resulta ventajosa para la construcción de partículas de núcleo-envoltura de impresión molecular de la invención.

TABLA 4 Efecto de la composición de la envoltura sobre la captación selectiva de cafeína sobre teofilina en resina de partículas de núcleo-envoltura

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Claims (10)

1. Partícula capaz de unirse de manera específica a una molécula de impresión, presentando la partícula una envoltura externa que comprende cavidades que corresponden a la molécula de impresión, y un núcleo interno sustancialmente libre de dichas cavidades y que incluye un material anfipático.

2. Partícula según la reivindicación 1, que presenta grupos de superficie polares.

3. Partícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la envoltura puede obtenerse mediante la polimerización de dimetilacrilato de etilenglicol e hidrogenofosfato de oleílo y fenilo.

4. Partícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las cavidades se forman mediante el uso de una molécula de impresión soluble.

5. Partícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la envoltura externa presenta un espesor de 1 a 100 nm.

6. Uso de partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, como un medio para la separación de una molécula diana que se une mediante ellas.

7. Uso de partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, como un medio para la identificación, purificación, cuantificación o caracterización de una molécula diana que se une mediante ellas.

8. Procedimiento de fabricación de partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas siguientes:

a) polimerizar una mezcla de la molécula de impresión y un material polimerizable, alrededor del núcleo, para formar una envoltura que contiene la molécula de impresión; y

b) extraer la molécula de impresión para dejar la cavidad correspondiente;

en el que el material anfipático está incluido en la mezcla o el núcleo se forma alrededor de un soporte molecular que comprende el material anfipático.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa (a) se lleva a cabo en un medio acuoso.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que la etapa (b) comprende un lavado.