KR100699442B1 - 거대다공성 중합체의 건조방법, 제조방법 및 그 방법을이용하여 제조된 거대다공성 중합체의 용도 - Google Patents

거대다공성 중합체의 건조방법, 제조방법 및 그 방법을이용하여 제조된 거대다공성 중합체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 수행성을 제공하는 거대 다공성 중합체의 건조방법을 제공한다. 상기 중합체는 패킹에 용이하며 거대 스케일의 크로마토그래피 컬럼에 유용한 것이다.
크로마토그래피, 패킹, 거대 다공성 중합체, 역상 크로마토그래피

Description

거대다공성 중합체의 건조방법, 제조방법 및 그 방법을 이용하여 제조된 거대다공성 중합체의 용도{Drying Method For Marcroporous Polymers, And Method Of Preparation And Use of Marcroporous Polymers Made Using The Method}
본 발명은 경성이며, 매질에서 사용하기 적합한 고수행성 중합체 패킹 및 고압 역상 액체 크로마토그래피(RPC)을 제공하는 선택된 다공성 및 삼투성을 갖는 신규한 거대 다공성 중합체를 제조하는 건조방법에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 건조방법을 사용하여 제조된 중합체는 특히, 인슐린 및 인슐린-형 화합물과 같은 생체분자의 크로마토그래피 분리 및 폴리싱(polishing)에 유용하다.
본 발명을 이용하여 제조된 중합체 수지는 현재 기술분야의 중대한 결점을 극복하는 것이다. 기술분야의 결점은 중합체 수지의 패킹 효율성이 일반적으로 역상 실리카 패킹의 것보다 낮다는 것이다. 생체분자의 폴리싱에 매우 유용하도록, 중합체 패킹은 역상 실리카 패킹만큼 높거나 또는 그 보다 높은 수준으로 크로마토그래피 컬럼에 패킹될 수 있어야 한다. 또한, 상기 패킹의 공극직경은 제한없이 물 질의 내부 및 외부로 생체분자를 확산시키는데 적합해야 한다. 공극 및 내부 불량 구조는 비드의 분리를 위해 기계적 압력을 사용하는 건조기술을 사용하는 경우에 품질이 악화된다.
대형 스케일의 처리에 유용한 패킹의 입자크기는 가능한 가장 높은 수득율로, 최소 순환시간으로 혼합물로부터 고도로 정제된 생성물을 회수할 수 있도록 충분히 작아야 한다. 그러나, 상기 입자 크기는 크로마토그래피 컬럼에서 극소의 압력 저하가 발생하도록 매우 작지 않아야 한다. RPC 제조 크로마토그래피에서 이러한 요구조건을 만족하는 입자 크기는 일반적으로 5 내지 50 마이크론, 가장 바람직하게는 10 내지 20마이크론의 범위이다.
중요하게는, 제조공정에서 실험된 조건하에서 유용하도록, RPC 패킹은 크로마토그래피 컬럼 즉, 일반적으로 2 내지 100센티미터의 내부 직경을 갖는 컬럼내에서 발생하는 높은 조작압력을 견딜수 있도록 기계적으로 경성이여야 한다. 상기 컬럼은 일반적으로 크로마토그래피 공정에 사용되는 작은 입자크기, 높은 유속 및 점성 유기용매의 조합으로부터 기인하는 20 내지 100바의 높은 역압(back pressure)에서 일반적으로 조작된다. 산업적인 고압 액체 크로마토그래피에서, 수지상에 바로 동력을 발생하는 피스톤이 장착된 컬럼을 사용하는 것이 일반적이다. 크로마토그래피 컬럼에서 수동력 압력 이상의 힘(압력)을 발생하는 능동적인 피스톤을 유지하는 것이 바람직하다. 예로는, Novasep(Novasep, BP-50 54340 Pompey, France로부 터 상업적으로 이용가능)에 의해 제조된 Dynamic Axial Compression(DAC) 컬럼이 대형 스케일의 HPLC 공정에 사용된다.
합성 중합체를 기초로 하는 크로마토그래피 패킹은 강알칼리 조건에 화학적으로 불침투성인 것이다. 일반적으로 이러한 물질은 매우 광범위한 pH 조건으로 조작될 수 있으며, 생체분자 분리에서 실리카-기초 물질보다 유용성을 제공한다. 중합체 수지는 높은-pH 용액을 사용하여 세척될 수 있으며, 이에 따라 컬럼의 수명이 증가되고, 결과적으로 전체적인 생물 약제학 제조공정의 경제성이 증가된다. 또한, 실리카-기초 패킹으로 수행하는 것이 불가능한 방법에 중합체 패킹을 사용하여 높은-pH 이동상을 사용하는 것이 가능하기 때문에, 연구 개발자들은 효율적인 생물 약제학적 제조공정을 고안을 이용하여 작업하기에 바람직하다. 특정한 분자는 높은 pH 조건하에서 개선된 용해도를 가질수 있으며 공정에서 컬럼 장입성 및 크로마토그래피 선택성이 또한 개선될 수 있다.
그러나, 현재 중합체 물질의 결점은 이 기술분야의 RPC 실리카겔에 의해 제공되는 우수한 크로마토그래피 수행성 및 압력 안정성의 조합을 동시에 가지지 않는다는 것이다. "우수한 크로마토그래피 수행성"은 최소 순환시간으로 높은 처리량과 함께 높은 수득율-순도를 얻을 수 있는 것을 말한다. "압력 안정성"은 공정의 높은 압력 조건하에서 충분한 변형에 견디는 패킹의 성능을 말한다. 겔 입자가 상당히 변형되는 경우에, 패킹된 층의 공극부피(및 이에 따른 매질 침투성)이 감소되 며, 역압의 증가되며, 컬럼내의 허용가능한 용매의 유속이 감소된다. 이는 공정의 순환시간 및 처리량을 감소시킨다.
인슐린과 같은 화합물의 엔드-폴리싱(end-polishing)을 위한 크로마토그래피 수행성은 높은 수득율, 높은 순도, 빠른 순환시간 및 높은 처리랑을 나타내는 4개의 최극치를 갖는 테트라헤드론으로서 개시되거나 또는 가시화된다. (처리량은 수득율, 컬럼 장입 및 순환시간의 조합이다.)
본 발명에 의해 개시되는 문제점은 상기와 같은 4개의 척도를 만족하는 엔드-폴리싱 단계에서의 크로마토그래피 수행성을 이루며, 동시에 최대 100바의 압력에 노출되는 경우 상당한 변형에 견디는 능력을 나타내는 중합체 수지를 제공한다는 것이다.
본 발명에 의해 개시된 문제점은 쉽게 패킹되는 거대다공성의, 중합체 물질을 제공한다는 것이다. 이러한 물질 및 이러한 물질이 패킹된 컬럼은 크로마토그래피 및 예를 들어, 인슐린 및 인슐린-형 화합물과 같은 생체분자의 엔드-폴리싱에 적합한 것이다.
본 발명은 다수의 거대다공성 크로마토그래피 수지 비드의 개선된 제조방법을 제공한다. 이러한 개선은 비드의 내부 공극구조를 방해하지(disturb) 않는 방식으로 비드 주위의 용매를 제거하는 것을 포함한다. 통상적인 건조 기술은 컬럼내의 비드의 내부 공극구조에 손상을 입히며 이에 따라 컬럼내의 비드의 수행성 및 패킹이 불량해진다. 본 발명에서는 비드가 함유된 물과 같은 용매의 빠른 제거에 의해 이러한 문제를 해결한다. 실시에 있어서, 다수의 비드가 용매, 예를 들어, 물에 의해 둘러싸이며, 여러개의 비드가 물방울내에 포함되도록 원자화된다. 본 발명의 일 변형에 있어서, 물소적내의 비드는 비드 주위의 물이 플래시 오프되도록 하는 빠른 건조 조건에 적용된다. 이러한 물은 약 1초미만에 플래시 오프(flash off)될 수 있다. 그 다음 상기 비드는 그 손상된 내부공극 구조를 갖지 않는 물 소적으로부터 유리된다. 반대로, 다음 실시예에 나타낸 바와 같이, 통상적인 건조기술을 사용하여 건조된 비드 케이크는 결과 케이크에서 비드를 유리시키기 위해 기계적 교반 및 다른 기계적 기술에 적용되어야 한다. 이러한 기계적 교반으로 또한 비드 공극구조 손상이 결과된다.
본 발명의 일 변형에 있어서, 상기 용매는 물을 포함한다. 이러한 변형에 있어서, 상기 물(또는 다른 용매)은 비드를 플래시 건조 제거한다. 플래시 건조는 이하 설명되는 바와 같이, 표 6에 나타낸 바와 같이 개선된 수행성을 부여한다.
다른 변형에 있어서, 제거단계는 비드를 전자파 건조시키는 단계를 포함한 다. 전자파는 상기 용매가 비드의 내부공극 구조 또는 비드의 표면을 손상시키지 않고 비드로부터 용매가 빠르게 제거되도록 비드에 제공된다. 다른 변형에 있어서, 상기 제거단계는 상기 비드의 냉동건조를 포함한다. 상기 비드의 냉동건조는 상기 비드의 공극 구조를 손상시키지 않도록 용매를 빠르게 제거하도록 하는 역할을 한다.
본 발명은 비드의 내부 공극구조를 방해하지(disturb) 않는 방식으로 비드 주위의 용매를 제거하는 단계를 사용하는 방법으로 제조된 거대다공성 비드를 제공한다.
이러한 종류의 비드는 다양하게 사용된다. 일 예시로 크로파토그래피에 사용된다. 예로서, 크로마토그래피의 개선된 방법은 비드의 내부공극 구조를 방해하지 않는 방식으로 상기 비드 주위의 용매를 제거하는 단계를 사용하는 공정으로 제조된 다수의 거대다공성 비드를 사용하는 것을 포함한다. 제거단계는 용매의 플래시 오프, 용매의 냉동건조 제거 및 용매의 전자파 제거로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 용매, 예를 들어 물의 다른 플래시방법은 본 발명의 실시예에서 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
다른 견지에 있어서, 본 발명은 본 발명에 개시된 크로마토그래피 방법을 사용하는 다른 화합물로부터 분리된 생체분자 또는 약품을 제공한다.
본 발명을 사용하여 건조될 수 있는 거대다공성 중합체의 예로는 하나 이상의 폴리비닐방향족 단량체를 50 내지 100 중량% 및 하나 이상의 단일 불포화된 비닐방향족 단량체를 0 내지 50중량%의 중합 단량체 유니트로 포함하는 중합체를 포함한다. 본 발명의 일 변형에 있어서, 상기 중합체는: (ⅰ) 그램 당 0.7 내지 2입방센티미터의 전체 다공성; (ⅱ) 그램당 0.7 내지 1.9 입방 센티미터의 조작가능한 중간 다공성; (ⅲ) 5 내지 50 마이크론의 평균입자크기 직경; (ⅳ)그램 당 200 내지 1500 평방미터의 표면적; (ⅴ) 100바의 압력에서 2000미만의 흐름 저항값; (ⅵ) 중합체의 리터당 인슐린 전체 인슐린 양 60 내지 150그램 및 중합체 리터당 역학적 인슐린 양 50 내지 150 그램을 갖는다. 상기 중합체가 인슐린 또는 인슐린-형 분자와 같은 생체분자의 처리에 사용되는 경우, 상기 중합체는 상기 인슐린 또는 인슐린-형 분자를 70 내지 99.9% 범위로 수율할 수 있으며, 임의로 다수의 인슐린 또는 인슐린-형 분자를 95 내지 100%의 범위의 순도로 달성할 수 있다. 본 발명의 다른 변형에 있어서, 상기 거대다공성 중합체는 시드 팽창된 중합체이다.
본 발명의 일 변형에 있어서, 상기 시드 팽창된 중합체 또는 다른 중합체는 하나 이상의 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 디비닐안트라센 및 디비닐자일렌 중 하나 이상으로부터 선택되는 폴리비닐방향족 단량체를 포함한다. 상기 단일불포화 비닐방향족 단량체는 스티렌 및 (C1-C4)알킬-치환된 스티렌중 하나 이상으로부터 선택된다.
다른 변형에 있어서, 상기 중합체는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: (a) 그램당 400 내지 1000 평방미터의 표면적; (b) 그램당 0.9 내지 1.4 입방센티미터의 조작가능한 중간 다공성; (c) 5 내지 20 마이크론의 평균입자크기 직경; (d) 100바 압력에서 2000 미만의 흐름저항값; (e) 중합체 리터당 전체 인슐린 양 60 내지 150 그램 및 중합체 리터당 역학적 인슐린 양 50 내지 150 그램.
다른 변형에 있어서, 상기 중합체는: (a) 하나 이상의 폴리비닐방향족 단량체 75 내지 100중량% 및 (b) 하나 이상의 단일불포화 비닐방향족 단량체 0 내지 25중량%를 중합 단량체 유니트로 포함한다. 임의로, 상기 중합체는 디비닐벤젠 공중합체, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 디비닐벤젠 에틸렌비닐벤젠 공중합체 및 스티렌-에틸비닐벤젠-디비닐벤젠 공중합체 중 하나 이상으로부터 선택된다.
다른 변형에 있어서, 본 발명에서 건조된 물질의 패킹은: 최대 100바의 압력에 노출되는 경우에 압력 안정성 및 낮은 변형성; 고분해능을 위한 작은 입자크기, 및 최소 압력 저하를 위한 균일한 입자크기분포; 타겟 분자의 높은 장입성; 및 최소 순환시간으로 타겟물질의 높은 수득율-순도를 달성하는 성능을 동시에 제공한다. 작은 입자크기의 패킹이 - 높은 수득율-순도를 달성하는 - 높은 역압을 발생하기 때문에 최대 100바의 압력 안정성은 또한 소형 균일 입자크기의 패킹을 촉진한다.
일 변형에 있어서, 상기 수지의 공극크기는 200 내지 800 옹스트롬이며, 공극부피는 0.8 내지 2.4 cc/cc이다. 패킹된 층의 "흐름저항성(flow resistance)"에 의해 측정되는 수지의 압력 안정성은 100바의 압력에서 2000 이하이다. (용어 "흐름 저항성"은 매질 침투성의 반대이며, 다음 섹션에서 정의된다.)
본 발명의 다른 변형에 있어서, 시드-팽창 공정에 의해 제조된 소형의, 균일한 입자크기, 압력-안정성, 역상 중합체 수지로 크로마토그래피된다. 이러한 기술은 0.5 마이크론 내지 200 마이크론의 균일한 중합체 비드를 제조하는데 사용될 수 있다. 입자크기가 5 내지 50 마이크론인 경우가 특히 유용하며, 5 내지 20마이크론의 입자크기가 엔드-폴리싱에 가장 유용하다. 컬럼 크로마토그래피 적용에서, 협소한 입자크기 비드는 컬럼 분해능(즉, 수득율-순도)을 극적으로 증가시킨다. 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 건조된 단일 분산된 입자크기와 관련된 일장점은 컬럼의 효율적인 패킹, 균일한 흐름 및 낮은 역압을 포함한다. 입자형태, 공극크기 및 표면적은 본 발명에 개시된 기술을 사용하여 이롭게 조절되는 중요한 물성의 다른 그룹이다. 이러한 기술은 엔드 폴리싱 단계를 위한 우수한 크로마토그래피 분리, 고압 조건하에서 변형에 대한 저항성 및 낮은 역압 및 고 분해능을 위한 균일한 입자크기를 갖는 중합체 수지를 형성할 수 있다. 본 발명에 개시된 기술을 사용하여 소형, 단일크기의, 압력-안정성 입자를 제조할 수 있는 성능은 본 발명의 중요한 장점이다.
시드된, 팽창 중합 공정에서, 팽창가능한 단일분산된 시드는 안정화제와 함께 연속적인 수성상으로 먼저 서스펜드된다. 상기 단량체-함유 개시제(일반적으로 에멀젼 형태로)는 상기 시드를 보다 큰 크기로 패창시키도록 첨가된다. 상기 시드의 크기가 균일하고 동일한 조성을 갖기 때문에, 이들은 동일한 팽창용량을 가지며, 각각의 독립적인 시드의 경우에 동일한 양의 단량체를 열역학적으로 흡수한다. 이에 따라, 균일한 단량체 소적이 얻어진다. 상승된 온도에서 서스펜션 중합후에, 균일한 중합체 입자가 형성된다.
상기 시드는 템플리트로서 제공되며, 단량체를 쉽게 흡수할 수 있는 중합체 및/또는 올리고머를 함유하는 균일한 입자이다. 최종 중합체의 결과 입자크기는 다음의 특성 초기 시드; 크기, 크기 분포 및 팽창성에 의해 주로 결정된다. 시드 입자의 경우에 다수의 요구조건이 있다. 먼저, 상기 시드가 템플리트로 사용되기 때문에, 그 크기분포는 유사 균일하도록 최종, 확장된 중합체 입자의 입자크기 분포를 균일하게 해야한다. 둘째로, 상기 시드는 빠르고 균일하게 용매(포로겐)를 함유하는 단량체를 흡입할수 있어야 한다. 빠른 팽창은 상기 팽창공정이 전체 중합체 공정에서 대부분 시간-소비 단계이기 때문에 특히 요구된다. 셋째로, 상기 시드는 흡입된 단량체 및 최종 중합체 모두와 화학적으로 혼화되어야 하고, 다른 경우라면, 상기 시드는 최종 생성물에 구멍을 남기고 중합 도중에 방출된다. 마지막으로, 상기 시드는 최종 중합체 수지 생성물의 화학적, 물리적 또는 수행성에 역효과를 갖지 않아야 한다. 본 발명의 일 변형에 있어서, 상기 시드는 단일분산된 것이며, 조성물에서 올리고머이며, 타겟된 중합체 수지 생성물의 크기를 만족시키도록 최소로 팽창되는 최적의 크기 및 높은 팽창 용량의 것이다. 본 발명의 다른 변형에 있어서, 본 발명에 사용되는 수지의 제조방법은 사슬전이제로서 티올의 사용을 포함한다.
본 발명과 결합하여 사용될 수 있는 중합체 입자를 제조하는 시드된 팽창 중합 어프로치가 있다. 이러한 공정은 두단계의 "활성화된" 시드된 팽창중합("Ugelstad 공정")이라 한다. 미국특허 제 4,336,173호. 이러한 공정은 조성물에서 중합체인 시드와 함께 시작한다. 이러한 중합체 시드는 전체 팽창용량을 증가시키기 위해 고도의 물불용성 유기 화합물 또는 팽창제를 사용하여 "연화" 또는 "예비-팽창"되어야 한다. 결과 시드(팽창제 함유)는 순수한 중합체 시드 그 자체 보다 큰 부피의 단량체를 흡수할 수 있다.
본 발명의 다른 변형에 있어서, 수지는 조성물에서 올리고머인 시드를 사용하는 개선된 일단계의 팽창/중합 공정을 사용하여 제조된다. 올리고머 시드가 쉽게 이용가능한 경우 - 본 발명에 가르친 바와 같이 - 팽창공정이 용이해지며 순환시간은 Ugelstad의 두단계 팽창공정 보다 훨씬 단축된다. 올리고머 시드를 사용하는, 본 발명의 일-단계 팽창/중합 공정은 상기 개시된 수행성을 갖는, 엔드-폴리싱에 적합한 역상 중합체 입자를 합성하는 중요한 것이다.
일 견지에 있어서, 이러한 기술은 엔드-폴리싱 정제에 적합한 거대다공성의, 역상 중합체 수지를 제공하여 본 발명에 의해 개시된 문제를 해결하는데 사용된다. 상기 중합체 수지는 높은 품질의 RPC 실리카겔에 비교되는 엔드 폴리싱 단계에서의 크로마토그래피 수행성을 달성하며, 최대 100바의 압력에 노출되는 경우 DAC 컬럼에서 상당한 변형에 견디는 성질을 나타낸다.
이와 관련하여, 본 발명은: (a) 하나 이상의 폴리비닐방향족 단량체를 50 내지 100중량% 및 (b) 하나 이상의 단일불포화된 비닐방향족 단량체를 0 내지 50중량%로 중합 단량체 유니트로 포함하는 거대 다공성 중합체를 제공하며; 이 때, 상기 중합체는 (ⅰ)전체 다공성이 그램당 0.7 내지 2입방 센티미터; (ⅱ) 조작 가능한 중간 다공성이 그램당 0.7 내지 2입방센티미터; (ⅲ) 평균 입자크기 직경이 2 내지 50마이크론; (ⅳ) 그램당 200 내지 1500 평방미터의 표면적; (ⅴ) 100 바 압력에서 2000 미만의 흐름 저항값; (ⅵ)중합체 1리터당 전체 인슐린 양 50 내지 150 그램 및 중합체 1리터당 역학적 인슐린 양 50 내지 150 그램을 가지며; (ⅶ) 70 내지 99.9%의 범위로 인슐린 또는 인슐린-형 분자의 수득율 및 임의로 95 내지 100% 범위의 인슐린 또는 인슐린-형 분자의 순도를 달성할 수 있다. (상이한 공급원으로부터의 인슐린 혼합물은 상이한 불순물 프로파일을 가지며 - 이는 수득율-순도 차이를 생성할 수 있는 것으로 여겨지며 - 따라서 고-품질의 실리카겔은 본 발명과 비교하여 참고기준으로 나타내어진다.)
또한, 본 발명은 포로겐 40 내지 100% 및 자유라디칼 중합 개시제 0.5 내지 10%의 존재하의 수성 서스펜션에서, 모노비닐방향족 단량체 0 내지 50% 및 폴리비닐방향족 단량체 50 내지 100%를 중합하는 단계를 포함하는 거대다공성 중합체의 시드된 팽창 중합 공정을 제공하며; 이 때 모든 퍼센트양은 전체 단량체의 중량을 기준으로 한다.
나아가 본 발명은 내부직경이 2 내지 100센티미터이며 10 내지 100바의 압력에서 조작되는 액상 크로마토그래피 컬럼에서 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 건조된 거대다공성 중합체와 수용액을 접촉시키는 단계를 포함하는, 인슐린 또는 인슐린-형 분자와 같은 생체분자 혼합물의 수용액을 엔드-폴리싱(end-polishing)하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는, 다음 용어는 달리 명시하지 않는 한, 다음의 의미를 갖는다.
용어 "알킬(메트)아크릴레이트"는 상응하는 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르를 칭하며; 유사하게, 용어 "(메트)아크릴"이란, 아크릴 또는 메타크릴산 및 에스테르 또는 아미드와 같은 상응하는 유도체를 칭한다. 모든 퍼센트는 달리 명시하지 않는 한, 포함된 중합체 또는 조성물의 전체 중량을 기준으로, 중량% 로 나타내어진다. 용어 "공중합체"는 위치 이성질체를 포함하는 둘 이상의 상이한 단량체의 유니트를 함유하는 중합체 조성물을 칭한다. 다음의 약어가 본 발명에서 사용된다: g= 그램; ppm= 백만분 중량/부피; cm= 센티미터, mm= 밀리미터, ml=밀리리터, L=리터. 달리명시하지 않는한, 열거된 범위는 포함되거나 조합가능한 것이며, 온도는 섭씨(℃)이다.
고수행성의 역상 액체 크로마토그래피(직경이 2 내지 100cm인 컬럼과 같은)에 의해 생체분자의 엔드-폴리싱에 유용한 본 발명의 중합체는 일반적으로 2 내지 150, 바람직하게는 5 내지 100, 보다 바람직하게는 10 내지 75, 가장 바람직하게는 5 내지 20㎛의 평균입자크기 직경을 갖는다. 그러나, 이러한 중합체의 다른 용도가 또한 본 발명에 고려된다.
본 발명의 거대다공성 중합체는 일반적으로, 시드된 팽창 중합체 의해 제조되며, 그램 당 200 내지 1500, 바람직하게는 300 내지 1200, 보다 바람직하게는 400 내지 1000 평방미터(g/m2)의 표면적을 갖는다. 바람직하게 상기 거대 다공성 중합체는 미국특허 제 4,382,123호에 개시된 형태의 것이며, 예를 들어, 다공성이 비드에 도입되며, 즉, 단량체용 용매이나 중합체의 용매는 아닌, 포로겐 (또한 "상증량제" 또는 "침전제"로 알려짐)존재에 의해 중합체 비드에 도입된다. 미국특허 제 4,382,124호에 따라 제조된 것과 같은 통상적인 거대다공성 중합체는 일반적으로 광범위한 포로겐의 종류, 단량체 상에 상대적인 포로겐 농도, 단량체 종류, 가교 단량체 종류, 가교제 수준, 중합 개시제 및 개시제 농도를 포함한다. 그러나, 선택된 중합 개시제 농도와 함께, 특정한 단량체 및 선택된 가교수준을 갖는, 이동상에 대하여 특정하게 선택된 포로겐 형태 및 농도와 결합된, 본 발명은 다음의 시드 팽창 중합 기술을 사용하여 제조된 거대 다공성 중합체는 고수행성 역상 액체 크로마토그래피에 의해 생체분자의 분리 및 정제에 개선된 수행성에 상응하는 예상치 못한 경성의 중합체 구조를 갖는다.
본 발명에서 유용한 거대다공성 중합체의 제조에 사용될 수 있는 적합한 폴리비닐방향족 단량체는 예를 들어, 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 디비닐안트라센 및 디비닐자일렌으로부터 선택되는 하나 이상의 단량체를 포함하며; 상기된 가교제의 어떠한 다양한 위치 이성질체가 적합하며; 바람직하게는 상기 폴리비닐방향족 단량체는 디비닐벤젠인 것으로 이해된다. 일반적으로 상기 거대다공성 중합체는 50 내지 100%, 바람직하게는 65 내지 100%, 보다 바람직하게는 75 내지 100%의 폴리비닐방향족 단량체 유니트를 포함한다.
임의로, 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜 디비닐에테르 및 트리비닐시클로헥산과 같은 지방족 가교 단량체가 폴리비닐방향족 가교제와 함께 사용될 수 있다. 사용되는 경 우에, 상기 지방족 가교 단량체는 거대 다공성 공중합체의 제조에 사용되는 전체 단량체 중량을 기준으로, 일반적으로 중합 유니트로서, 거대다공성 중합체를 0 내지 20%, 바람직하게는 0 내지 10%, 보다 바람직하게는 0 내지 5%를 포함한다.
본 발명에서 유용한 거대 다공성 공중합체의 제조에 사용될 수 있는 적합한 단일 불포화 비닐방향족 단량체는 예를 들어, 스티렌, α-메틸스티렌, (C1-C4) 알킬-치환된 스티렌, 할로-치환된 스티렌(디브로모스티렌 및 트리브로모스티렌과 같은), 비닐나프탈렌 및 비닐안트라센을 포함하며; 바람직하게, 상기 단일불포화된 비닐 방향족 단량체는 스티렌 및 (C1-C4)알킬-치환된 스티렌 중 하나 이상으로부터 선택된다. 이중 적합한 (C1-C4)알킬-치환된 스티렌은 예를 들어, 에틸비닐벤젠, 비닐톨루엔, 디에틸스티렌, 에틸메틸스티렌 및 디메틸스티렌이며; 상기된 비닐방향족 단량체 각각의 어떠한 다양한 위치 이성질체가 적합하며; 바람직하게는 상기 단일 불포화된 비닐방향족 단량체가 에틸비닐벤젠인 것으로 이해된다. 일반적으로, 상기 거대다공성 중합체는 단일불포화 비닐방향족 단량체 유니트를 0 내지 50%, 바람직하게는 0 내지 35%, 보다 바람직하게는 0 내지 25%로 포함한다.
임의로, 지방족 불포화 단량체와 같은 비-방향족 비닐 단량체, 예를 들어, 비닐클로라이드, 아크릴로니트릴, (메트)아크릴산 및 (메트)아크릴산의 알킬에스테르(알킬(메트)아크릴레이트)가 비닐방향족 단량체와 함께 사용될 수 있다. 사용되는 경우에, 상기 비-방향족 비닐 단량체는 상기 거대 다공성 공중합체의 제조에 사 용되는 전체 단량체 중량을 기준으로 중합 유니트로서, 거대 다공성 공중합체를 0 내지 20%, 바람직하게는 0 내지 10%, 보다 바람직하게는 0 내지 5%로 포함한다.
바람직한 거대 다공성 중합체는 디비닐벤젠 공중합체, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 디비닐벤젠 에틸비닐벤젠 공중합체 및 스티렌-에틸비닐벤젠-디비닐벤젠 공중합체 중 하나 이상으로부터 선택되며; 보다 바람직하게는 디비닐벤젠-에틸비닐벤젠 및 스티렌에틸비닐벤진-디비닐벤젠 중합체이다.
본 발명의 거대다공성 중합체의 제조에 유용한 포로겐은 (C7-C10) 방향족 탄화수소 및 (C6-C12) 포화 탄화수소와 같은 소수성 포로겐; 및 (C4-C10)알칸올 및 폴리알킬렌글리콜과 같은 친수성 포로겐을 포함한다. 단일 포로겐 또는 혼합된 포로겐 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 (C7-C10)방향족 탄화수소는 예를 들어, 톨루엔, 에틸비닐벤젠, 오르쏘-자일렌, 메타-자일렌 및 파라-자일렌 중 하나 이상을 포함하며; 이는 상기된 탄화수소 중 각각의 어떠한 다양한 위치 이성질체가 적합한 것으로 이해된다. 바람직하게, 상기 방향족 탄화수소는 톨루엔 또는 자일렌 또는 자일렌들의 혼합물 또는 톨루엔과 자일렌의 혼합물이다. 적합한 (C6-C12)포화된 탄화수소는 예를 들어, 헥산, 헵탄 및 이소옥탄 중 하나 이상을 포함하며; 바람직하게는 상기 포화된 탄화수소는 이소옥탄이다. 적합한 (C4-C10) 알칸올은 예를 들어, 이소부틸알콜, tert-아밀알콜, n-아밀알콜, 이소아밀알콜, 메틸이소부틸카르비놀(4-메틸-2-펜탄올), 헥산올 및 옥탄올을 포함하며; 바람직하게, 상기 알칸올은 메틸이소부틸카르비놀 및 옥탄올과 같은 하나 이상의 (C5-C8) 알칸올로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 포로겐 혼합물은 하나 이상의 (C5-C8)알칸올로부터 선택되는 친수성 포로겐 및 하나 이상의 (C7-C10)방향족 탄화수소로부터 선택되는 소수성 포로겐을 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 개시된 기술을 사용하여, 본 발명의 중합체 제조에 사용되는 포로겐의 총량은 단량체의 중량을 기준으로 가장 바람직하게는 45 내지 100%이다. 100%이상의 포로겐 수준에서, 상기 중합체는 DAC 컬럼에서 높은 압력 조건(100바의 피스톤 압력)에서 불량한 흐름 저항값(높은 변형성)을 갖는다. 이는 45% 이하의 포로겐 수준에서, 상기 중합체가 소 인슐린 결합 시험(표 1을 참고)에 의해 측정된 바와 같이, 불량한 크로마토그래피 성질을 갖는 것으로 이해된다.
본 발명의 중합체 제조에 유용한 중합 개시제는 퍼옥사이드, 하이드로퍼옥사이드 및 관련된 개시제와 같은 단량체-가용성 개시제를 포함하며; 예를 들어, 벤조일 퍼옥사이드, tert-부틸하이드로퍼옥사이드, 큐멘 퍼옥사이드, 테트라린 퍼옥사이드, 아세틸 퍼옥사이드, 카프로일 퍼옥사이드, tert-부틸 퍼옥토에이트(또한, tert-부틸퍼옥시-2-에틸헥사노에이트), tert-아밀 퍼옥토에이트, tert-부틸 퍼벤조에이트, tert-부틸디퍼프탈레이트, 디시클로헥실 퍼옥시디카르보네이트, 디(4-tert-부틸시클로헥실)퍼옥시디카르보네이트 및 메틸에틸케톤 퍼옥사이드를 포함한다. 또한, 아조디이소프티로니트릴, 아조디이소프티르아미드, 2,2'-아조-비스(2,4- 디메틸발레로니트릴), 아조-비스(α-메틸-부티로니트릴) 및 디메틸-, 디에틸- 또는 디부틸 아조-비스(메틸발레레이트)와 같은 아조 개시제가 유용하다. 바람직한 퍼옥사이드 개시제는 벤조일 퍼옥사이드와 같은 디아실 퍼옥사이드 및 tert-부틸 퍼옥토에이트 및 tert-부틸퍼벤조에이트와 같은 퍼옥시에스테르이며; 보다 바람직하게는, 상기 개시제는 벤조일 퍼옥사이드이다. 적합한 퍼옥사이드 개시제의 사용수준은 비닐 단량체의 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 9%, 보다 바람직하게는 2 내지 7%, 가장 바람직하게는 3 내지 5%이다. 가장 바람직하게, 자유 라디칼 개시제는 단량체의 전체 중량을 기준으로 2 내지 7%로 존재하며, 하나 이상의 디아실 퍼옥사이드 및 퍼옥시에스테르로부터 선택된다.
본 발명의 거대다공성 중합체의 제조에 유용한 분산제 및 서스펜딩제는 하이드록시알킬셀룰로오스 백본, 탄소원자가 1 내지 24개, 평균 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 5개인 소수성 알킬 측쇄, 상기 하이드로알킬셀룰로오스 백본의 각 반복 유니트를 치환하는 에틸렌옥사이드기를 갖는 비이온성 계면활성제이며, 상기 알킬측쇄는 상기 하이드록시알킬 셀룰로오스 백본에서 100 반복 유니트 당 0.1 내지 10 개의 알킬기의 수준으로 존재한다. 상기 하이드록시알킬 셀룰로오스에서 알킬기는 1 내지 24개의 탄소를 함유할 수 있으며, 이는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 100 개의 안하이드로글르코스 유니트 당 0.1 내지 10(C16)알킬측쇄 및 각 안하이드로글루코스 유니트를 치환하는 약 2.5 내지 4개의 에틸렌 옥사이드기를 함유하는 하이드로에틸셀룰로오스가 보다 바람직하다. 분산제의 일반적인 사용수준은 상기 전체 수성상 중량을 기준으로 약 0.01 내지 4%이다.
본 발명의 거대다공성 중합체의 제조에 유용한 다른 분산제 및 서스펜딩제는 친수성 백본을 함유하는 중합체이며, 이는 단량체 상에 그 친유성 부분 및 두개의 상의 계면에서 수성상에 친수성 부분을 배향할 수 있다. 이러한 중합체 분산제는 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 전분등을 포함한다. 분산제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 이러한 다른 분산제는 덜 바람직한 경향이 있으며, 이들은 응집되거나 달리 바람직하지 않은 물질의 양을 증가시키는 경향이 있다.
임의로, 상기 거대다공성 중합체는 통상적인 술폰화, 클로로메틸화 및 아미노화와 같은 알려진 방법에 의해, 다양한 통상적인 이온성 작용기(카르복시산기와 같은 약-산 작용기; 1차, 2차 또는 3차 아민 작용기와 같은 약-염기 작용기; 술폰산기와 같은 강산 작용기; 4차암모늄 클로라이드 또는 하이드록시기와 같은 강염기 작용기)로 코팅되거나 또는 후작용화될 수 있다.
본 발명의 거대 다공성 중합체는 개선된 경성 중합체 구조 및 중합 도중에 중합체에 도입되는 선택된 다공성의 결과인 개선된 침투성(낮은 흐름 저항성)에 의해 특징화된다. 침투성(K)은 Darcy의 법칙(방정식 1)으로 컬럼내에 발생하는 역압과 상관관계된다:
ΔP/L = μV[K(dp)2] 방정식 1
상기 식에서: μ = 점도(밀리파스칼 ㆍ초 또는 센티포이스)
V = 선형속도(cm/hr)
ΔP = 압력저하(바)
L = 층 높이(cm)
dp = 중합체의 평균입자크기 (마이크론)이다.
상기 변수의 유니트는 일반적인 형태로 표시되며; 유니트 변환은 방정식 1을 치수화하지 않도록 요구되는 것으로 이해된다. 중합체가 보다 경성(즉, 덜 압축성)일수록, 중합체의 침투성은 증가되며, 주어진 어떠한 용매 점도, 선형 속도 및 입자 크기의 조합의 경우에 역압을 낮추도록 변형된다. 선형 흐름 조건하에서, 이는 크로마토그래피 분리 및 정제 적용에 일반적이며, 컬럼내의 역압은 Carman-Kozeny 방정식(방정식 2)로 표시될 수 있다:
ΔP/L = 150ㆍ[(1-ε)2/ε3]ㆍμV(dp)2 방정식 2
상기 식에서, ε= 내부입자 공극 부피(cm3/cm3)
Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography, G.Guiochons, S. Goshan Shirazi and A. Katti; Academic Press(1994) 및 Unit Operations in Chemical Engineering, W.L. McCabe, J.C. Smith 및 P. Harriott; McGraw Hill(1985)와 같은 참고문헌에서 Darcy의 법칙 및 Carman-Kozeny 방정식(방정식 1 및 2)에 대하여 보다 일반적이며 상세하게 설명될 수 있다.
방정식 1 및 2를 결합하여, 크로마토그래피 컬럼내의 침투성(또는 흐름 저항성)이 중합체 수지층의 내부입자 공극부피(즉, 중합체 입자 사이의 부피)와 관련되는 것으로 여겨지며; ε은 중합체 층의 유니트 부피 당 공극의 부피로 표시된다. 이러한 관계는 다음 방정식 3으로 나타내어진다:
1/K = 150ㆍ[(1-ε)2/ε3] 방정식 3
본 발명의 목적에 있어서, 중합체의 특징적인 "흐름 저항성" 값은 침투성의 역인 것으로 정의된다. 특징적인 "흐름 저항성" 값은 중합체가 매질아래에서 높은 압력 조건에 대하여 얼마나 잘 수행되는지에 대한 표시이며: 낮은 흐름 저항성 값은 낮은 압축성을 나타내며 높은 흐름 저항성 값은 불량한 압축성을 나타낸다.
또한 Darcy의 법칙에 따라서, 삼투압 또는 흐름 저항성에 대한 표현은 일반적으로 입자크기 영향(방정식 1에서 dp)을 포함한다. 본 발명의 일 목적은 입자크기 영향에 독립적인, 증가된 중합체 경성에 의해 개선된 흐름 저항성을 제공하는 것이다. 감소된 입자크기는 방정식 1 및 2에 주어진 바와 같이, 주어진 중합체의 경우 에 보다 높은 역압을 제공하는 것으로 이해된다.
일반적으로, 본 발명의 일 변형에 있어서, 거대 다공성 중합체는 10바의 조작 압력(매질압력)에서 흐름 저항값(즉, 1/K)이 700 내지 1800미만, 바람직하게는 700 내지 1500 미만, 보다 바람직하게는 1300미만이다. 보다 높은 압력 조작(60바로 나타냄)에서, 상기 거대 다공성 중합체는 1500 내지 7000미만, 바람직하게는 1500 내지 5000미만, 보다 바람직하게는 4500미만의 흐름 저항값을 갖는다. 가장 높은 압력 조작에서(100바로 나타내어짐),상기 거대 다공성 중합체는 흐름저항성 값이 1500 내지 7000미만, 바람직하게는 1500 내지 5000미만, 보다 바람직하게는 4500미만이다. RPC에 사용하기 적합한 거대 다공성 중합체는 (ⅰ)10바의 압력에서 1800미만 및 (ⅱ)60바의 압력에서 7000미만의 흐름 저항성 값을 갖는다. 상기된 제한보다 높은 흐름 저항성 값을 갖는 중합체는 상업적인 RPC 컬럼에서 발생하는 높은 압력에 대하여 매질에서 압축에 대한 충분한 저항성을 제공하지 않으며 결과적으로 처리량이 감소되며 조작 도중에 컬럼 압력 증가가 발생한다.
본 발명의 거대 다공성 중합체는 중합체의 제조에 사용되는 포로겐 종류 및 비율에 의해 생성되는 선택된 다공성 및 공극 크기 분포에 의해 특징화된다. 다공성은 MicrometreticsTMASAP-2400 질소 Porosimeter를 사용하여 측정되었다. IUPAC 명명법에 따른 다공성은 다음과 같다:
미세다공성 = 20옹스트롬 유니트 미만의 공극
중간다공성 = 20 내지 500 옹스트롬 유니트 사이의 공극
거대다공성 = 500 옹스트롬 유니트 이상의 공극
본 발명의 목적에 있어서, "조작가능한(operational)" 미세다공성은 50옹스트롬 유니트 미만의 직경을 갖는 공극으로 정의되며, "조작가능한" 중간 다공성은 50 내지 500 옹스트롬 유니트 사이의 직경을 갖는 공극으로 정의된다. 본 발명에서, "조작 가능한" 다공성 및 IUPAC 명명법에 따라 정의된 다공성 사이의 약간의 차이는 본 발명의 거대 다공성 중합체에서 중요한 생체분자의 흡수를 증가시키기 위해 50옹스트롬 유니트가 보다 적합하며 적합한 컷오프 포인트(20옹스트롬 유니트와 비교하여)로부터 기인하는 것이다.
일 변형에 있어서, 본 발명의 거대 다공성 중합체는 전체 다공성이 0.7 내지 2, 0.9 내지 1.8, 1.0 내지 1.7cm3/g이다. 다른 변형에 있어서, 상기 거대 다공성 중합체는 0.7 내지 1.9, 0.8 내지 1.7, 바람직하게는 0.9 내지 1.4 cm3/g의 조작 가능한 중간 다공성을 갖는다. 상기 거대 다공성 중합체는 0 내지 0.5, 0 내지 0.3, 0 내지 0.2, 0 내지 0.1cm3/g의 조작 가능한 미세다공성을 갖는다. 상기 거대 다공성 중합체는 임의로, 0 내지 0.6, 바람직하게는 0 내지 0.5, 보다 바람직하게는 0 내지 0.3cm3/g의 거대 다공성을 갖는다.
인슐린 정제성능은 유사한 크기 및 분자 배열의 생체분자의 대형 스케일 분리 및 정제를 위한 적합한 매질로서 중합체 매트릭스의 혼화성을 나타내는 것이다. 본 발명의 일부 구현을 다음 실시예에 보다 상세하게 설명하고자 한다. 모든 비율, 부 및 퍼센트는 달리 명시하지 않는한 중량부로 표시되며, 사용되는 모든 시약은 달리 명시하지 않는 한, 우수한 상업용 품질의 것이다. 실시예 및 표에서 사용되는 약어는 다음과 같다:
MIBC = 메틸이소부틸 카르비놀 (4-메틸-2-펜탄올)
DVB = 디비닐벤젠 (메타/파라 이성질체의 혼합물)
EVB = 에틸비닐벤젠 (메타/파라 이성질체의 혼합물)
BPO = 벤조일 퍼옥사이드
rpm = 분당 회전수
v/v = 부피/부피
w/v = 중량/부피
㎛ = 마이크론
nm = 나노미터
g/L = 그램/리터
cm3/g = 그램 당 입방 센티미터
㎕ = 마이크로리터
NA = 분석되지 않음
실시예 1
본 발명에서 사용되는 단일크기의, 1마이크론 미만의 폴리스티렌 입자 및 단일크기의 3.0마이크론 올리고머 시드를 제조하기 위해 다음 방법을 사용하였다. 0.25 마이크론의 폴리스티렌 입자를 Frazza et al.,에 의해 개발된 에멀젼 중합 공정을 사용하여 합성하였다. (미국 특허 제 5,147,937호). 이 방법은 마이셀 및 수용성 개시제(암모늄 퍼술페이트)의 안정화를 위해 계면활성화제, AEROSOL MA-80(소디움 디헥실 술포숙시네이트)를 사용하는 것을 포함한다. 반응의 초기에 캐틀에 단량체와 개시제를 전체 장입하고 비활성성 분위기에서 반응을 수행한다. 소디움 디헥실 술포숙시네이트는 물에서의 용해도가 제한되나, 결과적으로, 수성상에서 잘 분산되며, 약간 불투명한 수성 혼합물은 1%의 농도를 갖는 것으로 관찰된다. 0.25마이크론의 입자크기를 갖는 안정한 옅은 남색 라텍스가 중합 후에 거의 100%의 수득율로 얻어진다. 상기 입자크기는 BI-90 또는 BI-90 플러스 또는 CHDF-2000에 의해 측정된다(모세관 유체역학 분별).
0.6㎛의 올리고머 시드의 합성
0.5마이크론의 올리고머 시드를 시드 에멀젼 중합을 기초로 하여 0.25 마이 크론의 중합체 시드로부터 합성하였다 (미국특허 제 5,846,657)
혼합물 화합물 중량부
A 물 185
0.25㎛의 중합체 입자 에멀젼 30.3
B 부틸아크릴레이트 82
스티렌 18
10% 수성 소디움 도데실벤젠술포네이트 2.5
물 32
C 1-헥산티올 18.8
10% 수성 소디움 도데실벤젠 술포네이트 2.8
물 11
D 포타슘 퍼술페이트 0.11
물 18
E t-부틸 하이드로퍼옥사이드 0.18
물 3.7
F 3% 수성 소디움 포름알데히드 술폭실레이트 0.41
혼합물 A를 반응기에 첨가하고 교반과 함께 88℃로 가열하였다. 교반과 함께 90분동안 88℃의 온도에서 유지한 후에 혼합물 B, C, 및 D를 교반과 함께 반응기에 3시간에 걸쳐서 첨가하였다. 상기 반응기 장입물을 교반과 함께 1시간동안 65℃로 냉각시키고, 상기 반응기 장입물을 상온으로 냉각시켰다. 결과 에멀젼 중합체 입자는 Brookhaven Instruments BI-90으로 측정하여 0.5 마이크론의 직경을 가졌다.
3㎛의 올리고머 시드의 합성
혼합물 A를 교반과 함께 반응기에 장입하였다. 혼합물 B를 균질화하고 상기 반응기에 장입하였다. 헥산티올을 올리고머 시드에 의해 완전히 흡착시킨 후에, 에멀젼 C를 반응기에 장입하였다. 그 다음 상기 반응기를 20시간동안 상온에서 교반시킨 다음 1시간동안 85℃로 가열하고 추가로 95℃로 가열하였다. 상온으로 냉각시 키고 3마이크론의 균일한 올리고머 입자 크기가 얻어졌다.
혼합물 성분 중량부
A 물 185
10%의 수성 소디움 도데실벤젠술포네이트 0.5
0.6㎛의 올리고머 시드 2.67
B 1-헥산티올 18.8
10%의 수성 소디움 도데실벤젠술포네이트 2.8
물 11
C 부틸아크릴레이트 82
스티렌 18
t-부틸 퍼옥토에이트 3.0
10%의 수성 소디움 도데실벤젠술포네이트 2.5
물 32
실시예에서 제조된 다양한 시드 및 수지는 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 건조될 수 있는 것으로 여겨진다.
실시예 2
생체분자/약학적 분리 및 엔드-폴리싱에서 패킹으로 사용될 수 있는, 본 발명의 역상 중합체 수지의 제조를 다음 실시예에서 설명한다. 이러한 역상 중합체 수지는 본 발명에 개시된 새로운 건조 방법을 사용하여 건조될 수 있다. 또한, 본 발명의 건조 공정은 수지 및 흡착제가 사용되는 물오염물 제거 및 다른 산업 공정에서 사용되는 다른 수지의 제조에 사용될 수 있다.
시드 장입물은 다음 성분을 합하여 500ml의 비이커에서 제조되었다: 30.1%의 고형분으로, 실시예 1의 3.0마이크론의 올리고머 시드 21.3g, 1%의 솔루솔 (solusol) 용액 8.5g 및 탈이온수 105.5g. 상기 시드 용액을 기계적 교반기 및 열전쌍이 장착된, 1.8리터의 Buchi 스테인레스강 반응 플라스크("반응기")에 장입하였다. 여기에 탈이온수 46.4g을 첨가하여 이동라인을 헹구었다. 교반기를 150rpm으로 설정하였다.
단량체/포로겐 에멀젼을 다음 성분을 첨가하여 500ml의 비이커에서 제조하였다: 디비닐벤젠(80% DVB/20%EVB) 116.1g, MIBC 69.7g, 탈이온수 142.0g 및 75wt%의 솔루솔-물 용액 1.49g. 상기 성분을 비이커에서 혼합하여 에멀젼을 형성하였다. 이러한 에멀젼을 Silverson ILE 에멀젼화제(50% 아웃풋으로 설정)을 통해 40분동안 비이커에서 반응기로 펌프하였다.
상기 반응기를 1시간동안 60℃로 가열하고 이 온도에서 2시간동안 유지하여 올리고머 시드를 단량체 및 포로겐 에멀젼과 함께 팽창시켰다.
두시간동안 60℃에서 유지한 후에 에멀젼화된 개시제 용액을 첨가하였다. 이러한 에멀젼을 50ml의 비이커에 tert-부틸 퍼옥토에이트 1.29g을 첨가하여 1% 솔루솔 용액을 제조하였다. 이러한 성분을 균질화하여 에멀젼을 형성하고 비이커에서 반응기로 한번에 이동시켰다. 이동시킨 후에 탈이온수 24.1g을 사용하여 이동라인을 헹구었다. 그 다음 상기 반응기를 추가로 2시간동안 60℃에서 유지하였다.
K4MP(메틸하이드록시에틸 셀룰로오스, Dow Chemical Company에서 이용가능) 2.4g을 탈이온수 334.9g에 혼합하여 수용액을 제조하였다. 2시간동안 유지한 후에, 수용액을 반응기에 이동시키고 탈이온수 15.8g으로 이동라인을 헹구었다.
반응 혼합물(합한 유기 및 수성상)을 120rpm에서 60℃의 온도에서 30분동안 교반시킨 다음 80℃에서 60분동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 80℃에서 12시간동안 유지하여 반응물을 중합시켰다.
중합 반응이 완료된 후에, 상기 반응 혼합물의 온도를 교반하면서 50℃로 조절하였다. 수성/중합체 혼합물의 수성상의 pH를 최종 pH에 도달할 때까지 10%의 황산을 수성상에 천천히 첨가하여 5.0으로 조절하였다.
β-1,4-글루칸-4-글로칸하이드로라아제 효소(Cellulase®4000, Valley Research, Inc로부터 이용가능) 14.4그램의 혼합물을 탈이온수 134.5g에 혼합한 다음 반응기에 장입하였다. 상기 온도를 50℃에서 12시간동안 유지하였다. 수성/중합체 혼합물의 수성상의 pH를 50% 수성 수산화나트륨 용액으로 12.0으로 조절하고, 반응기의 온도를 90℃로 증가시켰다. 반응기를 이 온도에서 5시간동안 유지하였다.
수성/중합체 혼합물을 상온으로 냉각시키고, 반응기에서 제거하고 1리터의 크로마토그래피 컬럼에 위치시켰다. 수성상을 중합체에서 여과한 다음 중합체의 패 킹된 층을 2리터의 탈이온수로 세척한 다음 아세톤 3.5리터 최종적으로 3.5리터의 메탄올로 세척하였다. 상기 습윤 중합체를 2.5mm(0.1인치)의 수은진공하에서 16시간동안 100℃의 온도에서 건조시켰다.
실시예 3
이 실시예는 인슐린 결합 용량에 대한 본 발명의 거대다공성 중합체를 평가한 것이다. 이러한 중합체는 본 발명에 개시된 신규한 건조기술이 아닌 표준 건조 기술을 사용하여 건조되었다. 본 발명에 개시된 신규한 건조 기술의 사용은 거대 다공성 중합체에 개선된 수행성을 제공하는 것으로 여겨진다. 약 5ml 부피의 샘플을 소형-스케일의 시험 컬럼(10cm의 내부직경 X 6.3cm의 길이)에 패킹하고 수용액으로부터 소 인슐린의 전두부 흡수를 평가하였다; 이 시험은 중합체 매트릭스가 일반적인 사용조건에서 타겟 프로브 분자(소인슐린)에 대하여 빠르고 효율적으로 질량을 전이시키며 용량이 높은 경우에 측정되도록 고안되었다.
건조된 중합체 수지(달리 명시하지 않는 한 실시예 2에 따라 제조됨) 5그램을 20% 에탄올/물(v/v) 35ml와 혼합하고, 최소 2시간동안 상온에서 유지시켰다. 그 다음, 중합체 슬러리를 160cm/hr의 선형 속도로 20% v/v 에탄올/물 용액으로 플로우 패킹에 의해 스테인레스강 컬럼(치수: 10mm I.D.X 100mm 길이, Alltech Corp.에서 이용가능)에 패킹하였다. 컬럼패킹의 품질은 컬럼내에 탈이온수에 용해된 1% 소디움 클로라이드 용액을 50 ㎕펄스를 주입하면서 40cm/hr의 선형 속도로 20% v/v 에탄올/물 용리액을 흘려주면서 확인되었다. 컬럼의 효율성(단수/미터) 및 비대칭을 Hewlett Packard Chemstation® Software를 사용하여 계산하였다. 컬럼 패킹 변수에 수용가능한 타겟값은 0.8 내지 1.8의 비대칭을 갖는 효율성이 최소 5000 단수/미터였다.
물 1리터 당 5그램의 농도로 소 인슐린의 용액(Sigma-Aldrich Chemical Co,로부터 이용가능)을 제조하였다. 이 용액 총 200ml를 150cm/hr의 선형 속도로 컬럼에 펌프하고, 파장 291nm로 고정된 UV 분광 검출기(Spectraflow®783, ABI Analytical, Kratos Division으로부터 이용가능)를 사용하여 유출물에서 소 인슐린을 모니터하였다.
상기 중합체 수지의 역학적 용량(g/L)은 UV-반응곡선에서 1% 인슐린의 급등점에서 중합체 수지에 흡수된 인슐린의 양(중합체(수지)에 흡수된 인슐린의 전체 양에 대하여)을 기록하여 얻어졌다. 수지의 전체 용량(g/L)을 UV 분광기에 의해 유입물 및 유출물 용액의 인슐린 농도를 측정한 다음 질량 밸런스를 수행하여 측정되었다.
소 인슐린 결합 용량은 사용시 수행성을 측정하기 위한 스크린 테스트로서 사용된다. 이러한 용량 시험의 결과를 표 1에 나타내었다. 실시예 2의 수지는 이 표에서 샘플 번호 1 - 3으로 표시되며, 샘플 번호 1-1, 1-2, 1-4 및 1-5는 배합물 에서 포로겐의 변화를 나타낸다. 생성물 수행성을 최대화하기 위해서, 높은 결합용량은 최소의 포로겐 수준을 갖는 것이 바람직하다.
샘플 번호 1-6, 1-7 및 1-8은 미국특허 제 6,387,974호에 개시된 기술에 의해 제조된 수지를 나타낸다. 미국 특허 제 6,387,974호에서 제조된 수지와 비교하여, 본 발명에 개시된 기술에 의해 제조된 샘플은 훨씬 낮은 수준의 포로겐으로 높은 인슐린 결합 용량이 예상치 못하게 결과됨을 나타낸다. 다음 실시예에서 바람직한 엔드-폴리싱 수행성을 가지며 100 바의 압력에서-안정한 역상 중합체 수지를 제조하는 것이 다음 실시예에 개시되어 있다.
실시예 4
다음 실시예에서는 실시예 2의 중합체 수지를 사용하여 소 인슐린의 엔드 폴리싱을 설명하고자 한다. 실시예 2의 수지는 4.6mm의 I.D. X 250mm 길이의 치수를 갖는 스테인레스강 크로마토그래피 컬럼에 패킹되었다. 다음 이동상을 이 실시예에 사용하였다: "버퍼 A"= pH 4.0의 탈이온수에 용해된 100mM의 글리신; "버퍼 B" = 100% HPLC-그래이드 아세토니트릴.
이 실시예에서 사용되는 인슐린은 조순도가 92%인 소인슐린(Sigma-Aldrich Company에서 구입)이었다. 소 인슐린 용액을 탈이온수에 용해된 10% v/v 아세토니트릴에 용해된 0.1%의 글리신을 함유되된, 12.5mL의 "로딩버퍼"에 총 인슐린 75mg 을 용해하여 제조하였으며, TFA 30ml로 pH 2로 조절되었다. 충분한 양의 인슐린 용액을 컬럼에 0.27ml/min(100cm/hr)의 속도로 장입하여 18mg 인슐린/ml 컬럼 농도를 이루었다.
장입 후에, 상기 컬럼을 로딩버퍼 1 컬럼부피(4.15ml), 또한 유속 0.27ml/min으로 세척하였다. 상기 인슐린을 용매 32.5컬럼 부피(135ml)에 대하여 버퍼 B를 17.5%에서 30%로 증가시켜 선형 기울기를 사용하여 컬럼으로부터 유출시켰다. 유출 도중에 용매 유속은 0.27ml/min이었다. 유출물을 280nm에서 UV로 모니터하고 분율을 매 2분마다 1의 속도를 측정하였다.
분율을 Zorbax 300SB-C8, 300A, 5마이크론의 수지로 채워진 Agilent Technologies의 역상 HPLC 컬럼(4.6mm I.D. x 250 mmL)을 사용하여 분석하였다. 다음 용매 조건을 분율 분석에 사용하였다: 버퍼 A: HPLC 등급수에 용해된 0.1v/v% TFA; 버퍼 B: HPLC 등급 아세토니트릴에 용해된 0.1 v/v% TFA. Agilent 1100 HPLC를 사용하여 분석하였으며, 이는 컬럼온도가 25℃, 유속이 0.8ml/min으로 수행되었다. 용리조건은 3분동안 25%의 버퍼 B의 유지 후에 25 내지 35%의 버퍼 B를 30분동안 유지하는 것을 포함한다.
소 인슐린 예비정제 결과를 표 2에 나타낸다. 실시예 2의 수지는 표에서 샘 플 번호 1-3으로 나타내어진다. 다른 상업적 중합체 수지는 샘플 1-10(AmberchromTM CG300S) 및 샘플 1-9(AmberchromTMXT20, 미국특허 6,387,974호에 의한 상업적인 물질)을 포함한다. 샘플 1-11은 고품질의 역상 실리카 패킹(KromasilTM 100A, 13마이크론 실리카, Eka Chemicals로부터 이용가능)를 나타내며, 이는 수행성의 참고기준이다. 표 2의 결과는 본 발명의 역상 중합체 수지만이 고품질의 역상 실리카와 비교하여 엔드-폴리싱 정제 수행성을 제공하는 것을 나타낸다.
실시예 5
다음 실시예는 실시예 2의 중합체 수지를 사용하여 인슐린 또는 인슐린 형 분자의 최종-폴리싱을 설명하는 것이다. 실시예 2의 수지를 4.6mm I.D. X 250mm 길이의 치수를 갖는 스테인레스-강 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 다음 이동상을 실시예에 사용하였다: "버퍼 A"= pH 4.0의 탈이온수 에 용해된 100mM 글리신; "버퍼 B" = 100% HPLC 등급 아세토니트릴.
이 실시예에서 사용되는 인슐린은 Sigma에서 구입한, 92%의 순도를 갖는 재조합된 인간 인슐린이었다. 탈이온수에 용해된 10% v/v 아세토니트릴에 0.1% 글리신을 함유하며, 30ml의 TFA로 pH 2로 조절된 "로딩 버퍼" 12.5ml에 이 인슐린 총 75mg을 용해하여 제조되었다. 충분한 인슐린 용액을 0.27ml/min(100cm/hr)의 속도로 컬럼에 장입하여 18mg 인슐린/mL 컬럼의 컬럼 농도를 이루었다. 장입 후에, 상 기 컬럼을 로딩버퍼 1컬럼부피(4.15ml), 또한 유속 0.27ml/min으로 하여 세척하였다.
상기 인슐린을 용매 32.5컬럼 부피(135ml)에 대하여 버퍼 B를 17.5%에서 30%로 하여 선형 기울기를 사용하여 컬럼으로부터 유출시켰다. 유출 도중에 용매 유속은 0.27mL/min이었다. 유출물을 280nm에서 UV로 모니터하고 분율을 매 2분동안 1의 속도로 하여 수집하였다.
분율을 Zorbax 300SB-C8, 300A, 5마이크론 수지로 채워진 Agilent Technologies의 역상 HPLC 컬럼(4.6mm I.D. x 250 mmL)을 사용하여 분석하였다. 다음 용매 조건을 분율 분석에 사용하였다: 버퍼 A: HPLC 등급수에 용해된 0.1v/v% TFA; 버퍼 B: HPLC 등급 아세토니트릴에 용해된 0.1 v/v% TFA. Agilent 1100 HPLC를 사용하여 분석하였으며, 컬럼온도 25℃, 유속 0.8ml/min으로 수행되었다. 용리조건은 3분동안 25%의 버퍼 B의 유지 후에 25 내지 35%의 버퍼 B를 30분동안 유지하는 것을 포함한다.
소 인슐린 정제 결과를 표 3에 나타낸다. 실시예 2의 수지는 표에서 샘플 번호 1-3으로 나타내어진다. 다른 상업적 중합체 수지는 샘플 1-10(AmberchromTM CG300S) 및 샘플 1-9(AmberchromTMXT20, 미국특허 6,387,974호에 의한 상업적인 물 질)을 포함한다. 샘플 1-11은 고품질의 역상 실리카 패킹(KromasilTM 100A, 13마이크론 실리카, Eka Chemicals로부터 이용가능)를 나타내며, 이는 수행성의 참고기준이다. 표 2의 결과는 본 발명의 역상 중합체 수지만이 고품질의 역상 실리카와 비교할 만한 엔드-폴리싱 정제 수행성을 제공하는 것을 나타낸다.
이러한 기술을 사용하여, 인간의 인슐린은 불순물이 분리된 매우 만족스러운 것이다. 70%의 인슐린 수득율을 99.5%의 순도 수준으로 얻었다. 장입된 인슐린의 전체 회수율을 >90이었다.
실시예 6
이 실시예는 거대 다공성 중합체(표준 기술을 사용하여 건조됨)는 그 삼투압 특성, 즉, 내압축성에 대하여 설명하는 것이다. 중합체는 "흐름 저항성" 또는 1/K값에 의해 특징화된다(방정식 3 참고).
산업용 고압 액체 크로마토그래피에서, 수지에 바로 힘(압력)을 발생하는 피스톤이 장착된 컬럼을 사용하는 것이 일반적이다. 크로마토그래피 사이클 전체에 걸쳐 최대의 기대되는 흐름 압력 이상의 압력에서 층을 압축하는 피스톤을 유지하는 것이 바람직하다. 본 발명의 중합체의 삼투압 성질의 시험을 위해, 중합체 수지 를 ProChromTMDynamic Axial Compression 컬럼(Model LC.50, Novasep로부터 이용가능)에 패킹하고 100 바의 압축압력으로 설정된 피스톤으로 압축하였다. 이 시험의 목적은 각 샘플의 침투성(내압축성)을 특징화하는 것이다. 상세한 설명은 다음과 같다:
일반적으로, 폴리비닐방향족 중합체 층의 내부입자 공극부피(또는 삼투성)를 측정하기 위하여, 이동상은 이들이 폴리비닐방향족 중합체의 소수성 표면을 갖는 프로브 분자와의 상호작용을 제거하거나 또는 감소시키도록 프로브 분자와의 혼화성을 위해 선택되어야 한다. 선형 폴리스티렌, 블루덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 통상적인 프로브 분자가 사용될 수 있으나, 비-극성 이동상(테트라하이드로퓨란 및 톨루엔)의 사용이 요구된다. 그러나, 다음에 개시된 본 발명에 사용되는 프로브 분자는 비-극성 용매의 사용이 요구되지 않으며, 어떠한 수성-유기 용매 시스템 예를 들어, 20% 에탄올에서 사용될 수 있다.
컬럼내의 전체 공극부피(외부 입자 및 내부입자 모두)를 측정하기 위해서, 1% 소디움 클로라이드(20% 수성 에탄올로 w/v) 2ml를 상기 시스템에 주입하였다. 상기 염을 전도성 검출기에 의해 검출하였다. 단지 내부입자 공극 부피의 측정을 위해서, 1%(w/v)의 0.1~0.9㎛의 이온 하전된 에멀젼 중합체 또는 미세하게 분쇄된 이온 하전된 중합체(예를 들어, 약-산 작용기(카르복실레이트기), 강산 작용기(술 포네이트) 또는 4차 암모늄 클로라이드기와 같은 이온화 가능한 작용기를 갖는 가교된 폴리스티렌)을 함유하는 20% 에탄올의 용액을 층을 통해 흐르는 20% 에탄올(수성)의 스트림에 주입하였다. 입자를 280nm로 설정된, UV 검출기로 검출하였다. 이온 하전된 중합체 프로브 입자의 크기로 인해, 상기 입자들은 본 발명의 중합체 수지의 공극을 침투하지 않는다. 이온하전된 중합체 프로브 입자의 표면 특성으로 인해(이러한 입자는 방향족 구조 및 표면 전체에 분포된 높은 농도의 이온화기를 갖는다.), 본 발명의 중합체 수지에 대한 소수성 인력/유지가 방지되었다.
중합체 층의 전체 공극부피(염 프로브 용출부피)를 측정하고 중합체 입자(이온-하전된 에멀젼 또는 분홰된 중합체 용리액 부피)의 외부에 있는 공극 부피와 합하였다. 상기 측정된 층 부피와 함께, 이러한 값을 사용하여 방정식 2 및 3에서 ε을 계산하였다.
소 인슐린의 예비정제 결과를 표 4에 나타낸다. 실시예 2의 수지는 이 표에서 샘플번호 1-3으로 나타내어진다. 다른 상업적인 중합 수지는 대조군이며 샘플 1 - 10(AmberchromTMCG300S), 샘플 1-9(U.S. 6,387,974호에 의해 상업적인 물질, AmberchromTMXT20), 샘플 1-12(General Electric에서 상업적으로 이용가능한, SourceTM30 RPC) 및 샘플 1-13(Polymer Labs에서 상업적으로 이용가능한, PLRPTM1-15 마이크론)을 포함한다. 샘플 1-11은 기준 표준의 수행성을 나타내는 고-품질 역상 실리카 패킹(KromasilTM100A, 13 마이크론 실리카, Eka Chemicals에서 상업적으로 이용가능)을 나타낸다. 표 4의 결과는 100바의 피스톤 압력에서, 본 발명의 역상 중합체 수지만이 실질적으로 변형되지 않으며; 모든 다른 역상 중합체 패킹은 실질적으로 변형되며 흐름 저항성이 증가됨을 나타낸다.
실시예 7
다음 실시예는 다양한 건조 방법을 설명하는 것이다. 건조되는 샘플은 다음과 같이 제조되었다: 물 습윤(20% 고형분) 실험용 10㎛ 폴리비닐벤젠 다공성 수지 335g을 2000ml의 비이커에서 칭량하였다. 상기 비이커에 D.I 수 1500ml를 첨가한 다음 온화하게 교반하였다.
분무 건조를 샘플에 다음과 같이 수행하였다: BuchiTM Mini 분무 건조기 B-91을 설치하여 수지 슬러리를 수행하였다. 상기 분무 건조기 유속을 탈 이온수("DI")와 함께 10ml/min으로 설정하여 분무 건조기가 사용되는 다음 조건하에서: 분무 유속:10ml/min, 도입구 온도:140℃ 및 배출구 온도 80℃로 설정하였다. 공급 호스를 수지 슬러리가 채워진 비이커에 침지시키고 그 다음 상기 수지 슬러리를 10ml/min으로 분무 건조기에 공급하였다. 분무 건조 2.5시간 후에, 수지 67g을 99.5%의 고형분과 함께 수집하였다. 생성물은 현미경을 사용하여 1x X 100x에서 육안시험으로응집이 없는 유리 흐름성 분말이었다.
비교예 7A
다음 실시예는 진공 오븐 건조를 이용한 비교예를 설명하는 것이다. 건조되는 샘플은 다음과 같이 제조되었다: 물 습윤(20% 고형분) 실험용 10㎛ 폴리비닐벤젠 다공성 수지를 335g을 9: x 11"SS Pan에 위치시켰다. 상기 수지를 바닥에 얇은 층을 형성하도록 팬에 적용하였다. 그 다음 상기 팬을 상온에서 진공 오븐에 위치시키고 Hg 40mm의 진공을 적용하였다. 그 다음 상기 오븐을 4시간동안 99℃로 가열하고 18시간동안 유지하였다. 상기 진공 오븐을 상온으로 냉각시키고 오븐을 상온으로 질소와 함께 가압하였다. 상기 팬을 오븐에서 제거하고 샘플을 재칭량하여 99.8%의 고형분%를 갖는 수지 68g을 얻었다.
상기 샘플은 팬에서 응집되었으며, 응집물은 각각 10㎛ 입자로 파쇄되기에 매우 어려웠다. 그 다음 상기 샘플을 20㎛ 스크린 메쉬를 사용하여 건조 스크린하여 유리 흐름성 분말 10g을 얻었다.
실시예 8
다음 실시예는 수지에 개선된 수행성을 제공하는 본 발명에 개시된 건조 공정을 사용하여 제조된 물질을 사용하는 컬럼 패킹을 설명하는 것이다. 건조 수지를 60% 이소프로판올/40% 물로 구성된 용매 용액을 사용하여 수화하였다. 1cm I.D x 25cm L 컬럼(19.625mL 부피)를 패킹하기 위해서, 건조 수지 14g을 100ml의 용매 용 액에 첨가하였다. 0.35g/mL의 수지 밀도를 기준으로, 40% 수지 슬러리(부피/부피)가 제공된다. 상기 물질을 패킹 전에 최소 2시간동안 수화하였다.
상기 수지 슬러리를 오버헤드 교반을 사용하여 재-서스펜드시킨 다음 약 2분동안 초음파 처리하여 균질화하였다. 그 다음 상기 슬러리를 스테인레스 강 패킹 장치에 부었다. 상기 패킹 장치는 패킹 저장소 및 스테인레스 강 1cm I.D x 25cm L 컬럼으로 이루어졌다. 그 다음, 상기 패킹 장치를 수화 용액과 동일한 패킹 용액을 사용하여 HPLC 펌프에 연결하였다. 타겟 유속에 2-3분 동안 흐름을 천천히 램프하였다. 압력을 인-라인 압력 게이지를 사용하여 모니터하고 적용된 최대 압력 패킹은 1000psi였다. 유속을 감소시켜 압력을 패킹 도중에 일정하게 유지하였다. 안정한 압력 및 유속이 이루어지면(15-20분), 패킹이 완료된 것으로 여겨진다. 그 다음 상기 컬럼을 패킹 저장소에서 제거하고 컬럼의 상부에 최종 피팅(endfitting)을 완료하였다.
소디움 클로라이드 컬럼 평가를 다음과 같이 수행하였다: 상기 컬럼을 전도계가 장착된 HPLC 시스템에 위치시켰다. 상기 컬럼을 20% 에탄올/80% 물 이동상과 함께 2mL/min으로 20분동안 평형화시켰다. 평형화 후에, 상기 유속을 0.5ml/min으로 감소시키고, 1% 소디움 클로라이드 용액 50㎕를 컬럼에 주입하였다. 컬럼 효율성(플레이트/M)을 용리된 염 피크로부터 계산하였다.
본 발명의 공정을 사용하여 건조된 물질에 대한 인간의 인슐린 평가를 다음과 같이 수행하였다: 분무-건조된 10㎛ 물질의 효율성을 비-보존된 조건하에서 인간의 인슐린(Sigma)을 사용하여 경쟁적인 10㎛의 실리카 컬럼(벤더에 의해 패킹)과 비교하였다. 상기 컬럼을 먼저 50% 아세토니트릴/50% 물/0.1% TFA 이동상에서 평형화한 다음, 5mg/mL의 인간 인슐린 50㎕를 컬럼에 주입하였다. 5개의 상이한 유속: 0.25, 0.50, 1.0, 2.0 및 3.0mL/min에서 평가를 이중으로 수행하였다. 280nm에서 UV 검출기로 검출하였다. 컬럼 효율성(플레이트/M)을 용리된 인간 인슐린 피크로 계산하였다.
분무-건조된 물질의 정성 패킹 프로파일을 통상적으로 건조된 물질의 것보다 더 재생성이었다. 통상적으로 건조된 수지의 압력 저하는 분무 건조된 물질의 압력 저하 보다 높은 변이성에 적용되었다. 또한, 통상적으로 건조된 물질의 최종 유속은 분무-건조된 물질의 것보다 낮았다.
소디움 클로라이드 평가의 결과를 표 5에 나타내었다. 랩, 파이로트 및 프로덕션 스케일로 통상적으로 건조된 수지는 40,000 내지 47,000 플레이트/M 범위의 효율성을 제공하였다. 또한, Polymer Lab 및 Hamilton에서 상업적으로 이용가능한 다른 10㎛의 중합체 물질은 52,000 내지 59,000의 효율성 범위를 제공한다. 물론, 건조 형태를 조절하거나 또는 플레이트/M 범위 값을 모듈하는 다양한 건조 방법을 결합할 수 있다.
패킹 효율성을 계산하는 방법은 다음과 같다: 패킹 효율성은 Agilent Chemstation 소프트웨어를 기초로 하여 계산되며 컬럼 길이 미터 당 전체 플레이트를 기준으로 한다. 다음과 같이 계산되어야 한다:
N = 5.54(Tr/W1/2)2
상기 식에서,
Tr=유지시간(분) 및 W1/2=피크높이의 절반에서 측정된 피크 너비(분)
이는 그 다음 미터 당 전체 플레이트를 얻기 위해 미터의 컬럼 길이로 나누어진다. 상기 컬럼 길이는 25cm이며, 각 효율성은 0.25M로 상기 방정식을 나누어 계산되었다.
인간의 인슐린 평가 비교 결과를 다음 표 7에 나타낸다. 표에 개시된 바와 같이, 상기 분무 건조된 10㎛의 중합체 물질은 평가되는 유속의 전체 범위에 대하여 경쟁적인 10㎛ 실리카 생성물의 것과 유사한 효율성을 제공한다.
표 1
소 인슐린의 컬럼 결합 용량에 대한 포로겐 수준의 영향
샘플 번호* 포로겐 수준(%) 인슐린 용량(mg/ml) 1% 전체
1-1 43% 9 13
1-2 54% 51 55
1-3 60% 56 71
1-5 67% 44 50
1-6 100% 79 88
1-7 67% 5 15
1-8 100% 7 52
1-9 122% 80 100
샘플 1-1 내지 1-6은 실시예 2에 개시된 본 발명에 따라 제조된 물질을 나타내며, 샘플 1-7 내지 1-9는 미국 특허 제 6,387,974호에 따라 제조된 물질을 나타낸다.
표 2
소 인슐린의 엔드-폴리싱 크로마토그래피
상업적 명칭 샘플 번호 98.0% 순도의 인슐린 수득율 99.0% 순도의 인슐린 수득율
AmberchromTMCG300 1-10 76% 4%
AmberchromTMXT20 1-9 92% 80%
비상업용 1-3 94% 92%
KromasilTM100A실리카 1-11 96% 89%
표 3
인간 인슐린의 엔드-폴리싱 크로마토그래피
상업적 명칭 샘플 번호 98.0% 순도의 인슐린 수득율 99.0%의 순도의 인슐린 수득율
AmberchromTMCG300 1-10 76% 4%
AmberchromTMXT20 1-9 92% 80%
비상업용 1-3 94% 92%
KromasilTM100A실리카 1-11 96% 89%
표 4
DAC 컬럼에서 100바의 피스톤 압력에서 다양한 역상 수지의 가압 시험
상업적 명칭 샘플 번호 공극 부피 ε(cc/cc) 흐름 저항성 1/κ 상대적인 흐름속도
AmberchromTMCG300 1-10 0.18 17,294 6
Source TM 30 RPC 1-12 0.21 10,109 10
PLRPTM 1-13 0.24 6,267 17
AmberchromTMXT20 1-9 0.28 3,542 30
비-상업용 1-3 0.34 1,662 63
KromasilTM100A실리카 1-11 0.38 1,051 100
표 5
컬럼 효율성의 비교
설명 플레이트 수 (플레이트/M)
생성물질 - 통상적인 건조 A 40,428
파이로트 물질 - 통상적인 건조 B 62,016
파이로트 물질 - 통상적인 건조 C 40,372
파이로트 물질 - 통상적인 건조 D 47,992
파이로트 물질 - 통상적인 건조 E 40,776
파이로트 물질 - 통상적인 건조 F 45,224
랩물질 - 통상적인 건조 8마이크론 - G 46,680
Hamilton PRP-1 10마이크론 44,944
Polymer Lab PLRP-S 10마이크론 47,492
랩 물질 - 분무건조 H 57,016
랩물질- 분무건조 I 59,276
랩 물질 -분무건조 J 52,644
표 7
선형속도 (cm/hr) Kromasil C4 Kromasil C8 Kromasil C18 YMC C4 Supelco C5 Supelco C8 HP10
228 3516 2927 2614 1833 4457 4113 4110
228 3525 3006 2723 1830 4319 4116 4110
152 4648 3938 3003 2387 5466 5285 5586
152 4645 3817 3010 2442 5596 5429 5308
76 7087 6048 3974 3877 7809 7966 7932
76 7081 6248 3963 3868 7579 8313 7442
38 8807 8154 4617 5770 10343 10518 10205
38 8643 8169 4626 5885 10214 10543 10233
19 10202 10844 5434 7488 13710 10974 13516
19 9983 5434 7502 13850 10811 13258
본 발명에 따라 제공되는 거대 다공성 중합체의 건조방법으로 제공되는 중합 체는 패킹에 용이하며 거대 스케일의 크로마토그래피 컬럼에 유용하다.

Claims (12)

  1. 비드의 내부공극 구조를 방해하지 않고 상기 비드 주위의 용매를 제거하는 단계를 포함하되, 상기 용매의 제거는 플래시 건조, 전자기파 건조, 분무건조 및 냉동건조로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 이루어지고, 상기 비드는 하나 이상의 폴리비닐방향족 단량체 단위를 포함하는 중합체를 함유하는, 다수의 거대 다공성 크로마토그래피 수지 비드의 개선된 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 용매는 물을 포함하며, 상기 제거단계는 상기 비드에서 상기 물을 건조 제거하는 플래시 건조 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제거 단계는 전자기파 건조를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제거 단계는 분무건조를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 제거 단계는 냉동건조를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 비드의 내부 공극 구조를 방해하지 않고 상기 비드 주위의 용매를 제거하는 단계를 사용하는 공정으로 제조된 다수의 거대 다공성 비드를 사용하되, 상기 용매의 제거는 플래시 건조, 전자기파 건조, 분무건조 및 냉동건조로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 이루어지고, 상기 비드는 하나 이상의 폴리비닐방향족 단량체 단위를 포함하는 중합체를 함유하는, 개선된 크로마토그래피 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 제거단계는 상기 용매의 플래시 건조 제거, 상기 용매의 냉동건조 제거 및 상기 용매의 전자기파 건조 제거로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서, 상기 비드는 시드 팽창에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 비드는 시드 팽창에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 제 7항의 크로마토그래피 방법을 사용하여 생물학적 분자, 약물, 또는 약물 또는 생물학적 분자의 전구체를 다른 화합물로부터 분리하는 방법.
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