JP2005336487A - マクロポーラスポリマーの乾燥方法、および調製方法、ならびに当該方法を使用して製造したマクロポーラスポリマーの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】マクロポーラスポリマーの乾燥方法、および調製方法、ならびに当該方法を使用して製造したマクロポーラスポリマーの使用
【解決手段】本発明は、改良された性能特性を提供するマクロポーラスポリマーのための乾燥方法を提供する。ポリマーを充填することが容易であり、大規模なクロマトグラフィーカラムに特に有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、選択された細孔率および浸透特性を有するマクロポーラスポリマーであって、剛性で、媒体中および高圧逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ）での使用に好適な高性能ポリマー充填剤を提供する、新規なマクロポーラスポリマーを作り出す乾燥方法に関する。本明細書に記載された乾燥方法を使用して製造した、本明細書に開示されたポリマーは、生体分子、たとえばインスリンおよびインスリン類似化合物のカラムクロマトグラフィーによる分離および精錬において特に有用である。

本発明を使用して製造したポリマー性樹脂は、現行技術の重大な欠点を克服する。現行技術の欠点は、ポリマー性樹脂の充填効率が、典型的に逆相シリカ充填剤の効率より低いことである。生体分子の精錬に大変有用であるためには、ポリマー性充填剤は、逆相シリカ充填剤と同じもしくはより高いレベルでクロマトグラフィーカラムに充填することができなければならない。加えて、充填剤の細孔径は、物質の中へのおよび物質の中から外への、生体分子の制限のない拡散を可能とするのに適していなければならない。個々のビーズに機械的な圧力を用いる乾燥技術の使用は、細孔および内部細孔構造を劣化させる。

大規模の処理に有用な充填剤の粒子サイズは、可能な限り最も高い収率で、および最小限のサイクルタイムで、混合物から高い純度で精製された生成物の回収を可能とするため、充分に小さくなければならない。しかし、粒子サイズは、クロマトグラフィーカラムにおいて極端な圧力低下が発生するほど小さくてはならない。ＲＰＣ生産クロマトグラフィーにおいて、これらの要件に合う粒子サイズは、典型的には５〜５０ミクロンの範囲、最も典型的には１０〜２０ミクロンの範囲である。

生産プロセスにおいて経験される条件下で有用であるために重要なのは、ＲＰＣ充填剤が、典型的に２〜１００センチメートルの内部直径を有するクロマトグラフィーカラム内で発生する高い作動圧力に耐えるために機械的に剛性でなければならいことである。カラムは、小さな粒子サイズ、高い流速、およびクロマトグラフィープロセスにおいて使用される粘性有機溶媒の組み合わせに起因する高い背圧のために、通常２０〜１００バールの圧力で作動される。工業用高圧液体クロマトグラフィーにおいては、動力の力を直接樹脂上に与えるピストンを備えているカラム使用することが一般的である。ピストンの作用が、クロマトグラフィーのカラムにおける動圧と同じか、またはより高い力（圧力）を与え続けることが好ましい。一例として、Ｎｏｖａｓｅｐ社により作られたダイナミック・アキシャル・コンプレッション（ＤＡＣ）カラム（Ｎｏｖａｓｅｐ社、フランス、Ｐｏｍｐｅｙ、ＢＰ−５０ ５４３４０から商業的に入手可能）は、大規模ＨＰＬＣプロセスにおいて使用される。

合成ポリマーを基本としたクロマトグラフィー充填剤は、強塩基条件でも化学的に侵されない。この物質は、典型的に大変広範なｐＨ条件にわたって作動させることができ、生体分子の分離においてシリカベースの物質よりも高い有用性を提供する。ポリマー性樹脂は、高いｐＨ溶液を積極的に使用して洗浄することができ、このためカラムの寿命が伸び、その結果、生物医薬品の製造プロセス全体の経済性を改善することができる。さらに、ポリマー性充填剤では、シリカベースの充填剤では不可能な方法である、高いｐＨの移動相の使用が可能であるため、開発科学者は、効果的な生物医薬品の製造プロセスの設計における研究のためのより多くの手段を有することとなる。特定の分子は高いｐＨ条件下における溶解性を改善することができ、プロセスにおけるカラムのロード可能性およびクロマトグラフィーの選択性が同様に改善され得る。

しかし、既存のポリマー性物質の欠点は、最新技術のＲＰＣシリカゲルによって提供される優れたクロマトグラフィー性能と、圧力安定性の組合わせを同時に有さないことである。「優れたクロマトグラフィー性能」とは、ここでは、最小限のサイクルタイムで、高い処理能力において高収率、高純度を達成することを意味する。「圧力安定性」とは、プロセス中に直面する高圧条件下での著しい変形に耐える充填剤の能力を意味する。ゲル粒子が著しく変形すると、充填床の空隙容量（したがって、媒体の浸透性）が減少し、背圧が増加し、従ってカラムを通る溶媒の許容される流速が減少する原因となる。これは、プロセスにおける、サイクルタイムおよび処理能力の低減の原因となる。
米国特許第４，３３６，１７３号明細書

インスリンをはじめとする化合物の最終精錬のためのクロマトグラフィー性能は、しばしば高収率、高純度、早いサイクルタイム、および高い処理能力を意味する４つの頂点を有する四面体として、記載されまたは描かれる。（処理能力は、収率、カラムローディング、およびサイクルタイムの組合わせである。）本発明によって扱われる問題は、上記の４つの基準を満たすことにより、最終精錬工程でのクロマトグラフィー性能を達成し、さらに、１００バールまでの圧力に曝露した場合の著しい変形に耐える能力を同時に示すポリマー性樹脂を提供することである。

本発明によって扱われる問題は、容易に充填されるマクロポーラスポリマー物質を提供することである。この物質およびこの物質が充填されたカラムは、生体分子、たとえばインスリンおよびインスリン類似化合物のクロマトグラフィーおよび最終精錬に好適である。

本発明は、複数のマクロポーラスクロマトグラフィー樹脂ビーズを製造する改良された方法を提供する。改良には、ビーズの内部細孔構造を乱すことのない方法でビーズの周りから溶媒を除去することが含まれる。従来の乾燥技術では、結果として、ビーズの内部細孔構造を破損し、それ故に、結果としてカラムにおけるビーズの貧弱な性能および粗悪な充填をもたらしている。本発明はその中にビーズを含む溶媒、たとえば水をすばやく除去することによって、この問題を解決する。実際には、複数のビーズは、溶媒、たとえば水によって包囲され、そして水滴中に複数のビーズが含まれるように噴霧される。本発明の一態様において、水滴中のビーズは次いで、ビーズを囲む水が瞬時に取り除かれる（ｆｌａｓｈ ｏｆｆ）ような、すばやい乾燥条件に付される。この水を約１秒より短い時間で瞬時に取り除くことができる。次いでビーズはそれらの内部細孔構造を破損することなく水滴から解放される。それに反して、以下の実施例においてみられるように、従来乾燥技術を使用して乾燥したビーズは固まってしまい、結果として生じた固まりからビーズを自由にするために機械的な撹拌または他の機械的な技術に付さなければならない。この機械的な撹拌もまた、結果としてビーズの細孔構造の破損を生じさせる。

本発明の一態様において、溶媒には水が含まれる。この態様において、水（または他の溶媒）は、瞬時にビーズから取り除かれ乾燥される。瞬時乾燥は、表６に示し、かつ以下で述べるような、改良された性能特性を与える。

さらに他の態様において、除去工程は、ビーズのマイクロ波乾燥を包含する。マイクロ波がビーズに提供され、ビーズの内部細孔構造またはビーズの表面を破損することなく、溶媒がビーズからすばやく取り除かれる。さらに他の態様において、除去工程は、ビーズの凍結乾燥を包含する。ビーズの凍結乾燥はビーズの細孔構造を破損することなく、溶媒をすばやく取り除く働きをする。

本発明は、ビーズの内部細孔構造を乱すことのない方法でビーズの周りから溶媒を取り除く工程を利用する方法を使用して作られるマクロポーラスビーズを提供すると理解される。

これらのタイプのビーズには、多くの用途がある。使用の一例にはクロマトグラフィーが含まれる。一例としてクロマトグラフィーの改良された方法には、ビーズの内部細孔構造を乱すことない方法で前記ビーズの周りから溶媒を取り除く工程を利用するプロセスを用いて作られる複数のマクロポーラスビーズを使用することが含まれる。除去の工程には、溶媒の瞬時除去、溶媒の凍結乾燥、溶媒のマイクロ波による除去、からなる群から選択される。溶媒、たとえば水の他の瞬時除去の方法もまた本明細書で与えられた実施例に加えて使用することができると理解される。

他の態様において、本発明は、本明細書に記載されたクロマトグラフィー法を使用して、他の化合物から分離された生体分子または医薬品を提供する。

本発明を使用して乾燥することができるマクロポーラスポリマーの例としては、５０〜１００重量パーセントの１以上の多ビニル芳香族モノマーおよび０〜５０重量パーセントの１以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー、の重合されたモノマー単位を含むポリマーが包含される。ポリマーは、本発明の一態様において、ｉ）１グラム当たり０．７〜２立方センチメートルの全細孔率；ｉｉ）１グラム当たり０．７〜１．９立方センチメートルの使用可能なメソ細孔率；ｉｉｉ）５〜５０ミクロンの平均粒子サイズ直径；ｉｖ）１グラム当たり２００〜１５００平方メートルの表面積；ｖ）１００バールの圧力で、２，０００未満の流動抵抗値；ｖｉ）１リットルのポリマー当たり６０〜１５０グラムのインスリンの全インスリン容量、および１リットルのポリマー当たり５０〜１５０グラムのインスリンの動的インスリン容量（ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する。ポリマーが、生体分子、たとえばインスリンおよびインスリン類似分子の処理に使用される場合、ポリマーは、インスリンまたはインスリン類似分子を７０〜９９．９％の範囲の収率、および任意に９５〜１００％の範囲のインスリンまたはインスリン類似分子の純度を達成することができる。本発明の他の態様において、マクロポーラスポリマーはシード拡張ポリマー（ｓｅｅｄ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）である。

本発明の一態様において、シード拡張ポリマーまたは他のポリマーは、ビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセンおよびジビニルキシレンの１以上から選択される多ビニル芳香族モノマーを含む。モノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、スチレン、および（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル置換スチレンの１以上から選択される。

他の態様において、ポリマーは１以上の次の特性を有する。すなわちａ）１グラム当たり４００〜１０００平方メートルの表面積；ｂ）１グラム当たり０．９〜１．４立方センチメートルの使用可能なメソ細孔率；ｃ）５〜２０ミクロンの平均粒子サイズ直径；ｄ）１００バールの圧力で、２，０００未満の流動抵抗値；ｅ）１リットルのポリマー当たり６０〜１５０グラムのインスリンの全インスリン容量、および１リットルのポリマー当たり５０〜１５０グラムのインスリンの動的インスリン容量を有する。

さらに他の態様において、ポリマーは、ａ）７５〜１００重量パーセントの１以上の多ビニル芳香族モノマー、およびｂ）０〜２５重量パーセントの１以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー、の重合されたモノマー単位を含む。任意に、ポリマーはジビニルベンゼンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼンコポリマーおよびスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマーの１以上から選択される。

他の態様において、本明細書の乾燥された物質の充填剤は、１００バールまでの圧力に曝露した場合の圧力安定性および低い変形性；高い分離能のための小さい粒子サイズおよび圧力低下を最小限にするための均一な粒子サイズ分布；目的分子の高いロード可能性；および最小限のサイクルタイムで目的分子の高収率、高純度を達成する能力、を同時に提供する。高収率、高純度を達成する小さい粒子サイズの充填剤は本来的に高い背圧を発生するので、１００バールまでの圧力安定性は、小さく均一な粒子サイズの充填剤をも容易にする。

一態様において、樹脂の細孔サイズは２００〜８００オングストロームであり、細孔容積は０．８〜２．４ｃｃ／ｃｃである。充填されたベッドの「流動抵抗」により測定された樹脂の圧力安定性は、１００バールの圧力で２，０００以下である。（用語「流動抵抗」は、媒体の浸透性に反比例し、後の節で定義される。）

さらに本発明の他の態様において、クロマトグラフィーは、小さい、均一な粒子サイズの、圧力安定な、シード拡張プロセスによって製造された逆相ポリマー性樹脂で行われる。この技術を使用して、０．５ミクロン〜２００ミクロンより大きい均一なポリマービーズを作ることができる。５〜５０ミクロンのサイズの粒子は特に有用であり、５〜２０ミクロンのサイズの粒子は、最終精錬に最も有用である。カラムクロマトグラフィー用途において、狭い範囲の粒子サイズのビーズは、カラム分離能（すなわち収率−純度）を劇的に改善させる。本明細書に記載した方法を使用して乾燥した、単分散性の粒子サイズに関する他の利点には、カラムの効率的な充填、均一な流れ、および低い背圧が含まれる。粒子形態、細孔サイズおよび表面積は、本明細書に記載した技術の使用で有利に制御される重要な物理特性の他の群である。これらの技術は、最終精錬工程のための優れたクロマトグラフィー分離、高い圧力条件下での変形耐性、ならびに低い背圧および高い分離能のための均一な粒子サイズ、を有するポリマー性樹脂の形成を可能にする。本明細書に記載した技術を使用して、小さく、単一のサイズ、圧力安定な粒子を形成する能力は、本発明の重要な利点である。

シード拡張重合プロセス（ｓｅｅｄｅｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）において、膨潤可能な単分散シードは、連続水性相中で安定剤と共に最初に懸濁される。次いで、モノマー含有開始剤（通常はエマルジョン形態において）が添加され、シードはより大きなサイズへ膨潤する。シードは均一なサイズであり、および全く同一の組成を有することから、それらは同じ膨潤能力を有しており、それらは、それぞれ個々のシードについて同じ量のモノマーを熱力学的に吸収する。このように均一なモノマー小滴が得られる。加熱温度での懸濁重合後、均一なポリマー粒子が形成される。

シードは、テンプレートとしての役割をはたし、かつモノマーを容易に吸収することができるポリマーおよび／またはオリゴマーを含有する均一な粒子である。結果として得られた最終的なポリマーの粒子のサイズは、初期シードの以下の特性によって主に決定される。すなわち、サイズ、サイズ分布、および膨潤可能性である。シード粒子のためには、多くの要件がある。第一に、シードはテンプレートとして使用されるので、そのサイズ分布は、最終的な増大したポリマー粒子の粒子サイズの分布が、等しく均一であることを可能とするために、均一でなければならない。第二に、シードは溶媒（ポロゲン）をも含むモノマーをすばやく均一的に吸収しうるべきである。膨潤プロセスは、多くの場合、ポリマープロセス全体の中で最も時間がかかる工程であるため、すばやい膨潤が特に望まれる。第三に、シードは吸収されるポリマーおよび最終ポリマーのいずれとも化学的に相溶可能であり、さもなければ、シードは重合中に追い出され、最終製品中に穴を残す場合がある。最後に、シードは最終ポリマー性樹脂製品の化学的、物理的、および性能特性上の不利な効果を有してはならない。本発明の一態様において、シードは、単分散性であり、組成中のオリゴマーであり、最少の回数拡張して目的とするポリマー性樹脂生成物のサイズを満たすことを可能にするのに最適なサイズ、かつ高膨潤能力を有するものである。本発明の他の態様において、本発明に使用する樹脂の作成プロセスは、連載移動剤としてチオールの使用を含む。

ポリマー粒子を生産するため、シード拡張重合のアプローチがいくつかあり、これらはそれぞれ、記載された発明とともに組み合わせて使用することができる。かかるプロセスの一つは、二工程「活性化」シード拡張重合（「Ｕｇｅｌｓｔａｄプロセス」）と呼ばれる。米国特許第４，３３６，１７３号。このプロセスは組成中の重合体であるシードから開始する。全体の膨潤能力を増加させるために、この重合体シードを、まず、高い水不溶性有機化合物もしくは膨潤剤を使用して「軟化」または予備膨潤しなければならない。次いで、結果として得られたシード（膨潤剤を含む）は、純粋なポリマーシードそれ自身の場合よりもより大きな体積のモノマーを吸収することができる。

本発明の他の態様において、樹脂は、組成中のオリゴマーであるシードを使用する、改良された一工程膨潤／重合プロセスを使用して作られる。本発明により教示されるように、オリゴマーシードが容易に入手可能である場合は、膨潤プロセスは、Ｕｇｅｌｓｔａｄの二工程膨潤プロセスよりもより容易であり、およびサイクルタイムが大幅に短縮する。オリゴマーシードを使用する本発明の一工程膨潤／重合プロセスは、上記の性能特性を有する最終精錬に好適な逆相ポリマー粒子の合成を可能にするために重要なものである。

これらの技術が使用されて、一態様において最終精錬の精製に好適なマクロポーラス逆相ポリマー性樹脂を提供することにより、本発明によって扱われる問題を解決する。ポリマー性樹脂は、最終精錬工程において、高品質ＲＰＣシリカゲルと比べて遜色ないクロマトグラフィー性能を達成し、同時に１００バールまでの圧力に暴露された場合にＤＡＣカラム中で著しい変形に耐える能力を示す。

関連して、本発明は、（ａ）５０〜１００重量パーセントの１以上の多ビニル芳香族モノマー、および（ｂ）０〜５０重量パーセントの１以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー、の重合されたモノマー単位を含むマクロポーラスポリマーを提供し、ここでポリマーは（ｉ）１グラム当たり０．７〜２立方センチメートルの全細孔率；（ｉｉ）１グラム当たり０．７〜１．９立方センチメートルの使用可能なメソ細孔率；（ｉｉｉ）２〜５０ミクロンの平均粒子サイズ直径；（ｉｖ）１グラム当たり２００〜１５００平方メートルの表面積；（ｖ）１００バールの圧力で、２，０００未満の流動抵抗値；（ｖｉ）１リットルのポリマー当たり５０〜１５０グラムのインスリンの全インスリン容量、および１リットルのポリマー当たり５０〜１５０グラムのインスリンの動的インスリン容量を有し、ならびに（ｖｉｉ）前記インスリンまたはインスリン類似分子を７０〜９９．９％の範囲の収率、および任意に９５〜１００％の範囲の前記インスリンまたはインスリン類似分子の純度を達成する。（異なるソースからのインスリン混合物は、異なる不純物プロフィールを有し、それ自体、収率−純度の相違を生じ得ると理解される。従って本発明との比較のために参考標準として高品質シリカゲルを示している。）

本発明はまた、水性懸濁液中において、４０〜１００パーセントのポロゲン、および０．５〜１０パーセントのフリーラジカル重合開始剤の存在下、０〜５０パーセントのモノビニル芳香族モノマーおよび５０〜１００パーセントの多ビニル芳香族モノマーを重合すること（ここにおいて、全てのパーセント量はモノマーの全重量を基準とする）を含む、マクロポーラスポリマーの調製のためのシード拡張重合プロセスを提供する。

本発明はさらに、水性溶液と、本明細書に記載した方法を使用して乾燥した前述のマクロポーラスポリマーとを、１０〜１００バールの圧力で作動される２〜１００センチメートルの内径を有する液体クロマトグラフィーカラム中において接触させることを含む、生体分子混合物、たとえばインスリンまたはインスリン類似分子の水性溶液の最終精錬のための方法を提供する。

明細書全体を通して使用される場合、文中明確に他を示していない限り、以下の用語は以下の意味を有するものとする。

用語「アルキル（メタ）アクリレート」は、対応するアクリレートまたはメタクリレートエステルのいずれかを意味する。同様に用語「（メタ）アクリル」は、アクリルまたはメタクリル酸および対応する誘導体、たとえばエステルまたはアミドを意味する。全てのパーセンテージは、別に明確に記載されていない限り、関係するポリマーまたは組成物の全重量を基準にして、重量パーセント（％）で表されている。用語「コポリマー」は、２以上の異なるモノマー（位置異性体を含む）単位を含むポリマー組成物を意味する。次の略語がここで使用される：ｇ＝グラム；ｐｐｍ＝重量／体積百万分率、ｃｍ＝センチメートル、ｍｍ＝ミリメートル、ｍｌ＝ミリリットル、Ｌ＝リットル。別に明確に記載されていない限り、列挙された範囲は、境界値を含み、かつ組み合わせ可能であると解釈され、ならびに温度は摂氏度（℃）である。

高性能逆相液体クロマトグラフィー（たとえば２〜１００ｃｍの直径のカラムにおいて）による生体分子の最終精錬に有用な本発明のポリマーは、典型的には２〜１５０、好ましくは５〜１００、より好ましくは１０〜７５、最も好ましくは５〜２０μｍの平均粒子サイズ直径を有する。しかしながら、これらのポリマーの使用以外もまた、ここで意図される。

本発明のマクロポーラスポリマーは、典型的にシード拡張重合により生産され、ならびに１グラム当たり、２００〜１５００、好ましくは３００〜１２００、より好ましくは４００〜１０００平方メートル（ｍ^２／ｇ）の表面積を有する。マクロポーラスポリマーは、好ましくは、米国特許第４，３８２，１２４号に記載された種類のマクロポーラスポリマーであり、たとえば、この中で多孔性が、ポリマービーズ内へ、ポロゲン（「相拡張剤（ｐｈａｓｅ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）」および「沈殿剤」としても知られている）、すなわち、モノマーの溶媒であるがポリマーの非溶媒、の存在により導入される。従来のマクロポーラスポリマー、たとえば、米国特許第４，３８２，１２４号に従って調製されたポリマーは、典型的には広範な、ポロゲンの種類、モノマー相に対するポロゲンの濃度、モノマーの種類、架橋するモノマーの種類、架橋剤のレベル、重合開始剤、開始剤の濃度、を使用することを包含する。しかし、本発明は、以下のシード拡張重合技術（特定の選択されたポロゲンの種類およびモノマー相に対する濃度と、特定のモノマーおよび選択された架橋レベルと、ならびに選択された重合開始剤の濃度とを組み合わせて）を使用して調製されたマクロポーラスポリマーが、予想外にも剛性なポリマー構造を有し、これが高性能逆相液体クロマトグラフィーによる生体分子の分離および精製における改良された性能に相応することを見出したことに基づいている。

本発明において有用なマクロポーラスポリマーの調製に使用することができる好適な多ビニル芳香族モノマーとしては、たとえば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセンおよびジビニルキシレンから選択される１以上のモノマーが挙げられる。そして後述する架橋剤のそれぞれの、任意の様々な位置異性体が好適であると理解される。好ましくは、多ビニル芳香族モノマーは、ジビニルベンゼンである。典型的には、マクロポーラスポリマーは５０〜１００％、好ましくは６５〜１００％、より好ましくは７５〜１００％の多ビニル芳香族モノマー単位を含有する。

任意に、脂肪族架橋モノマーたとえばエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、グリシジルメタクリレート、ジエチレングリコールジビニルエーテルおよびトリビニルシクロヘキサンもまた、多ビニル芳香族架橋剤に加えて使用することができる。使用する場合、脂肪族架橋モノマーは典型的に重合単位として、マクロポーラスコポリマーを形成するために使用される全モノマー重量を基準として、マクロポーラスポリマーの０〜２０％、好ましくは０〜１０％、より好ましくは０〜５％を含有する。

本発明に有用なマクロポーラスコポリマーの調製に使用することができる好適なモノ不飽和ビニル芳香族モノマーとしては、たとえばスチレン、α−メチルスチレン、（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル−置換スチレン、ハロ−置換スチレン（たとえば、ジブロモスチレンおよびトリブロモスチレン）、ビニルナフタレン、およびビニルアントラセンが挙げられる。好ましくは、モノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、スチレンおよび（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル−置換スチレンの１以上から選択される。好適な（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル−置換スチレンに含まれるものは、たとえばエチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレンおよびジメチルスチレンである。上述のビニル芳香族モノマーのそれぞれの、任意の様々な位置異性体が好適であると理解される。好ましいモノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、エチルビニルベンゼンである。典型的には、マクロポーラスポリマーは０〜５０％、好ましくは０〜３５％、より好ましくは０〜２５％のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー単位を含有する。

任意に、非芳香族ビニルモノマー、たとえば脂肪族不飽和モノマー、たとえば塩化ビニル、アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸および（メタ）アクリル酸のアルキルエステル（アルキル（メタ）アクリレート）をビニル芳香族モノマーに加えて使用することもできる。使用する場合、非芳香族ビニルモノマーは典型的に重合単位として、マクロポーラスコポリマーを形成するために使用される全モノマー重量を基準として、マクロポーラスコポリマーの０〜２０％、好ましくは０〜１０％、より好ましくは０〜５％を含有する。

好ましいマクロポーラスポリマーは、ジビニルベンゼンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼンコポリマーおよびスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマーの１以上から選択され、より好ましくは、ジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼンおよびスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンポリマーである。
本発明のマクロポーラスポリマーの調製に有用なポロゲンとしては、疎水性ポロゲン、たとえば（Ｃ_７−Ｃ_１０）芳香族炭化水素および（Ｃ_６−Ｃ_１２）飽和炭化水素；ならびに親水性ポロゲン、たとえば（Ｃ_４−Ｃ_１０）アルカノールおよびポリアルキレングリコールが挙げられる。単一のポロゲンまたは混合されたポロゲン系のいずれをも使用することができる。好適な（Ｃ_７−Ｃ_１０）芳香族炭化水素としては、たとえば、１以上の、トルエン、エチルベンゼン、オルト−キシレン、メタ−キシレン、およびパラ−キシレンが挙げられる。上述の炭化水素のそれぞれの、任意の様々な位置異性体が好適であると理解される。望ましい芳香族炭化水素は、トルエンまたはキシレンまたはキシレン類の混合物またはトルエンとキシレンの混合物である。好適な（Ｃ_６−Ｃ_１２）飽和炭化水素としては、たとえば、１以上の、ヘキサン、ヘプタンおよびイソオクタンが挙げられる。好ましくは、飽和炭化水素はイソオクタンである。好適な（Ｃ_４−Ｃ_１０）アルカノールとしては、たとえば１以上の、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、ｎ−アミルアルコール、イソアミルアルコール、メチルイソブチルカルビノール（４−メチル−２−ペンタノール）、ヘキサノール、およびオクタノールが挙げられる。好ましくは、アルカノールは、（Ｃ_５−Ｃ_８）アルカノール、たとえばメチルイソブチルカルビノールおよびオクタノールの１以上から選択される。好ましくは、ポロゲン混合物は、１以上の（Ｃ_５−Ｃ_８）アルカノールから選択される親水性ポロゲンおよび、１以上の（Ｃ_７−Ｃ_１０）芳香族炭化水素から選択される疎水性ポロゲンを含む。

典型的には、本明細書に記載される技術を使用する場合、本発明のポリマーを調製するために使用されるポロゲンの全量は、最も好ましくは、モノマーの重量を基準として、４５〜１００％である。ポロゲンのレベルが１００％を超える場合には、ポリマーは、ＤＡＣカラム中、高圧条件（１００バールのピストン圧）下で、不良な流動抵抗値（高い変形可能性）を有する。これは、ポロゲンレベルが４５％より下の場合に見受けられ、ウシインスリン結合試験による測定によると、ポリマーが不良なクロマトグラフィー性能を有する（表１参照）。

本発明のポリマーの調製に有用な重合開始剤としては、モノマー可溶性開始剤、たとえばペルオキシド類、ヒドロペルオキシド類および関連する開始剤；たとえば、ベンゾイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンペルオキシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシド、カプロイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエート（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエートとしても知られている）、ｔｅｒｔ−アミルペルオクトエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルジペルフタレート、ジシクロへキシルペルオキシジカーボネート、ジ（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロへキシル）ペルオキシジカーボネートおよびメチルエチルケトンペルオキシドが挙げられる。アゾ開始剤、たとえばアゾジイソブチロニトリル、アゾジイソブチルアミド、２，２’−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾ−ビス（α−メチル−ブチロニトリル）およびジメチル−、ジエチル−またはジブチルアゾ−ビス（メチルバレレート）もまた有用である。好ましいペルオキシド開始剤はジアシルペルオキシド類、たとえばベンゾイルペルオキシド、ならびにペルオキシエステル類、たとえばｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエートおよびｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエートが挙げられ、さらに好ましくは、開始剤は、ベンゾイルペルオキシドである。ペルオキシド開始剤の好適な使用レベルは、ビニルモノマーの全重量を基準として、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜９％、より好ましくは２％〜７％、最も好ましくは３％〜５％である。最も好ましくは、フリーラジカル開始剤が、モノマーの全重量を基準にして、２〜７パーセント存在し、そして１以上のジアシルペルオキシドおよびペルオキシエステルから選択される。

本発明のマクロポーラスポリマーの調製に有用な分散剤および懸濁化剤は、ヒドロキシアルキルセルロース骨格と１〜２４個の炭素原子を含有する疎水性アルキル側鎖を有し、およびヒドロキシアルキルセルロース骨格のそれぞれの繰り返し単位に平均１〜８、好ましくは１〜５のエチレンオキシド基置換を有し、アルキル側鎖はヒドロキシアルキルセルロース骨格において、１００繰り返し単位当たり０．１〜１０のアルキル基のレベルで存在する非イオン性界面活性剤である。ヒドロキシアルキルセルロースにおけるアルキル基は、１〜２４個の炭素を含有することができ、および線状、分岐状または環状でもよい。より好ましいものは、１００アンヒドログルコース単位当たり、０．１〜１０の（Ｃ_１６）アルキル側鎖および、それぞれのアンヒドログルコース単位に約２．５〜４のエチレンオキシド基置換を含有するヒドロキシエチルセルロースである。分散剤の典型的な使用レベルは、全水性相重量を基準として、約０．０１〜約４％である。

本発明のマクロポーラスポリマーの製造に有用な他の分散剤および懸濁化剤は、親水性骨格を有し、二相の界面でそれらの親油性部分をモノマー相に向け、かつそれらの親水性部分を水相に向けることができるポリマーである。これらのポリマー分散剤としては、セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、澱粉、等があげられる。分散剤の混合物もまた使用することができる。これらの他の分散剤は、それらが若干多量の凝集を生成し、あるいは望ましくない物質を生成する傾向にあるので、どちらかといえば好ましくはない。

任意に、マクロポーラスポリマーはコーティングすることができ、または、たとえば従来のスルホン化、クロロメチル化およびアミノ化などの公知の方法により、様々な従来のイオン化可能官能基（弱酸官能基、たとえばカルボン酸基；弱塩基官能基、たとえば一級、二級、三級アミン官能基；強酸官能基、たとえばスルホン酸基；強塩基、たとえば四級アンモニウムクロライドまたはヒドロキシド基）により後官能化をすることができる。

本発明のマクロポーラスポリマーは、強化された剛性のポリマー構造および重合中にポリマー中へ導入される選択された細孔率の結果である改良された浸透性（低い流動抵抗）によって特徴付けられる。浸透率（Ｋ）はダルシーの法則（式１）によってカラムにおいて発生する背圧と関係付けられる。

ΔＰ／Ｌ＝μＶ／［Ｋ（ｄ_ｐ）^２］ 式１
式中：μ＝粘度（ミリパスカル・秒またはセンチポイズ）
Ｖ＝線速度（ｃｍ／時）
ΔＰ＝圧力低下（バール）
Ｌ＝床高さ（ｃｍ）
ｄ_ｐ＝ポリマーの平均粒子サイズ（ミクロン）

上記変数の単位はその一般形式で表されている。式１を無次元にするために、単位変換をすることが必要であると理解される。ポリマーが剛性（すなわち圧縮性の少ない）であるほど、ポリマーの浸透性は大きくなり、言いかえると、溶媒粘度、線速度および粒子サイズの任意の所与の組み合わせについての背圧が低くなる。クロマトグラフィー分離および精製の適用に典型的な層流条件下、カラムにおける背圧はＣａｒｍａｎ−Ｋｏｚｅｎｙ式（式２）によって表すこともできる。

ΔＰ／Ｌ＝１５０・［（１−ε）^２／ε^３］・μＶ／（ｄ_ｐ）^２ 式２
式中：ε＝粒子間空隙の体積（ｃｍ^３／ｃｍ^３）

参考文献、たとえば「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｇ．Ｇｕｉｏｃｈｏｎ、Ｓ．Ｇｏｓｈａｎ ＳｈｉｒａｚｉおよびＡ．Ｋａｔｔｉ著、アカデミックプレス（１９９４）、ならびに、「Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｗ．Ｌ．ＭｃＣａｂｅ、Ｊ．Ｃ．ＳｍｉｔｈおよびＰ．Ｈａｒｒｉｏｔｔ著、マグローヒル（１９８５）を、ダルシーの法則およびＣａｒｍａｎ−Ｋｏｚｅｎｙ式（式１および式２）の概略および具体的な詳細のさらなる参考とすることができる。

式１および式２の組み合わせにより、クロマトグラフィーカラム中における浸透性（または流動抵抗）は、ポリマー樹脂床の粒子間空隙の体積（すなわち、ポリマー粒子間の体積）と関連すると見ることができ、εは、ポリマー床の単位体積当たりの空隙の体積として表される。この関係は、式３によって表される。

１／Ｋ＝１５０・［（１−ε）^２／ε^３］ 式３

本発明の目的のため、発明者らは浸透性の逆数である、ポリマーの固有の「流動抵抗」値を定義する。この固有の「流動抵抗」値は、中〜高圧条件下でポリマーがいかに良く機能するかを示すものであり、低い流動抵抗値は低い圧縮性を表し、および高い流動抵抗値は不良な圧縮性を表す。

加えて、ダルシーの法則によれば、浸透性または流動抵抗のいずれかの表示は、粒子サイズ効果（式１のｄ_ｐ）を含む。本発明の一つの目的は、粒子サイズ効果と無関係に、ポリマーの剛性を増すことによって、改良された流動抵抗を提供することである。与えられたポリマーについて、粒子サイズのみの減少は、式１および式２により与えられるように、より高い背圧を発生させると理解される。

典型的には、本発明の一態様において、マクロポーラスポリマーは、１０バールの作動圧（中圧力）において、７００から１，８００未満まで、好ましくは７００から１，５００未満まで、より好ましくは１，３００未満までの流動抵抗値（すなわち、１／Ｋ）を有する。高圧の作動（６０バールによって代表される）において、マクロポーラスポリマーは、１，５００から７，０００未満まで、好ましくは１，５００から５，０００未満まで、より好ましくは４，５００未満までの流動抵抗値を有する。最も高圧の作動（１００バールによって代表される）においては、マクロポーラスポリマーは、１，５００から７，０００未満まで、好ましくは１，５００から５，０００未満まで、より好ましくは４，５００未満までの流動抵抗値を有する。ＲＰＣにおける使用に好適なマクロポーラスポリマーは、（ｉ）１０バール圧の圧力において１，８００未満、および（ｉｉ）６０バール圧において７，０００未満の流動抵抗値を有する。上で示した制限より大きい流動抵抗値を有するポリマーは、市販のＲＰＣカラムにおいてみられる中〜高圧での圧縮に対して充分な耐性を提供せず、故に処理能力の減少および作動中のカラム圧の増加を被る。

本発明のマクロポーラスポリマーは、ポリマーの調製に使用されるポロゲンの種類および比率により形成される、選択された細孔率および細孔サイズ分布によって特徴付けられる。細孔率はＭｉｃｒｏｍｅｒｅｔｉｃｓ（商標）ＡＳＡＰ−２４００窒素ポロシメーターを使用して決定される。ＩＵＰＡＣ命名法による細孔は次の通りである。
ミクロ細孔 ＝ ２０オングストローム単位未満の細孔。
メソ細孔 ＝ ２０〜５００オングストローム単位の細孔。
マクロ細孔 ＝ ５００オングストローム単位より大きい細孔。

本発明の目的について、「使用可能な」ミクロ細孔は、細孔が５０オングストローム単位未満の直径を有する細孔として、「使用可能な」メソ細孔は、５０〜５００オングストローム単位の直径を有する細孔として定義される。本明細書において使用される場合の「使用可能な」細孔とＩＵＰＡＣ命名法により定義される細孔の間のわずかな差は、本発明のマクロポーラスポリマーの対象である生体分子の吸着に対応するためには、（２０オングストローム単位と比較して）５０オングストローム単位がより好適であり、適合する区切り点である事実によるものである。

本発明のマクロポーラスポリマーは、一態様において、０．７〜２、０．９〜１．８および１．０〜１．７ｃｍ^３／ｇの全細孔率を有する。なお他の態様において、マクロポーラスポリマーは０．７〜１．９、０．８〜１．７および好ましくは０．９〜１．４ｃｍ^３／ｇの使用可能なメソ細孔率を有する。マクロポーラスポリマーは、０〜０．５、０〜０．３、０〜０．２および０〜０．１ｃｍ^３／ｇ未満までの使用可能なミクロ細孔率を有する。マクロポーラスポリマーは、任意に０〜０．６、好ましくは０〜０．５、より好ましくは０〜０．３ｃｍ^３／ｇのマクロ細孔率を有することができる。

インスリン精製能力は、同様のサイズおよび分子構造を有する生体分子の大規模分離および精製について好適な媒体であるかの、ポリマーマトリックスの能力の指標である。本発明のいくつかの態様は、以下の実施例において詳しく記載されている。すべての比率、部およびパーセンテージは他に特に指定されていない限り重量によって表され、全ての使用される試薬は他に特に指定されていない限り良好な市販品質である。実施例および表で使用される略称は以下の対応する説明で記載されている。
ＭＩＢＣ ＝ メチルイソブチルカルビノール（４−メチル−２−ペンタノール）
ＤＶＢ ＝ ジビニルベンゼン（メタ／パラ異性体混合物）
ＥＶＢ ＝ エチルビニルベンゼン（メタ／パラ異性体混合物）
ＢＰＯ ＝ ベンゾイルペルオキシド
ｒｐｍ ＝ 分当たりの回転数
ｖ／ｖ ＝ 体積／体積
ｗ／ｖ ＝ 重量／体積
μｍ ＝ ミクロン
ｎｍ ＝ ナノメートル
ｇ／Ｌ ＝ グラム／リットル
ｃｍ^３／ｇ ＝ グラム当たりの立方センチメートル
μｌ ＝ マイクロリットル
ＮＡ ＝ 未分析

実施例１
以下の手順が使用され、単一サイズ化されたサブミクロンのポリスチレン粒子、および単一サイズ化された３．０ミクロンのオリゴマーシードを作成する。これは本発明において使用される。０．２５ミクロンのポリスチレン粒子は、Ｆｒａｚｚａらにより開発されたエマルジョン重合プロセス（米国特許第５，１４７，９３７号）を用いて合成された。このプロセスは、ミセルの安定のため界面活性剤、ＡＥＲＯＳＯＬ ＭＡ−８０（ジへキシルスルホコハク酸ナトリウム）および水溶性開始剤（過硫酸アンモニウム）を使用することを含む。この反応は、不活性雰囲気下、反応の開始時にモノマーおよび開始剤をケトル中へ全て装填することによって行われる。ジへキシルスルホコハク酸ナトリウムは水中における溶解性に制限を有するが、しかし水性相中に良く分散され、結果としてわずかに不透明の水性混合物が観測され、１％に達する濃度を伴う。０．２５ミクロンの粒子サイズで安定な青みがかったラテックスがほぼ１００％の収率で重合後に得られる。粒子サイズはＢＩ−９０またはＢＩ−９０プラスまたはＣＨＤＦ−２０００（キャピラリーハイドロダイナミックフラクションネーション）により測定された。

０．６μｍのオリゴマーシードの合成
０．５ミクロンのオリゴマーシードを、シードエマルジョン重合（米国特許第５，８４６，６５７号）をベースとして、０．２５ミクロンのポリマーシードから合成した。

混合物Ａをリアクターに添加し、撹拌しながら８８℃に加熱した。混合物Ｂ、ＣおよびＤを、３時間にわたってリアクターに撹拌しながら添加し、その後撹拌しながら９０分間温度を８８℃に維持した。リアクター内容物を、撹拌しながら１時間、６５℃に冷却し、その後リアクター内容物を室温まで冷却した。結果として得られたエマルジョンポリマー粒子を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＢＩ−９０によって測定すると０．５ミクロンの直径を有していた。

３μｍのオリゴマーシードの合成
混合物Ａを、撹拌しながらリアクター中に装填した。混合物Ｂを、均一化し、上記リアクター中に装填した。ヘキサンチオールがオリゴマーシードに完全に吸収された後、エマルジョンＣをリアクター中に装填した。リアクターを次いで室温で２０時間撹拌し、次いで１時間、８５℃に加熱し、次いでさらに１時間、９５℃に加熱した。室温に冷却し、３ミクロンのサイズの均一なオリゴマー粒子が得られた。

実施例１で作られた種々のシードおよび樹脂を、本発明に記載された方法を使用して乾燥することができると理解される。

実施例２
以下の実施例は、生体分子／医薬品の分離および最終精錬における充填剤として使用することができる本発明の逆相ポリマー性樹脂の調製について例証する。この逆相ポリマー性樹脂を、本明細書に記載された新規の乾燥プロセスを使用して乾燥することができると理解される。さらに、本明細書の乾燥プロセスを使用して、水汚染物の除去ならびに樹脂および吸着剤が使用される他の工業プロセスに用いられる他の樹脂を製造することができると理解される。

シード装填物を５００ｍｌのビーカー中で次の成分を組合わせることにより調製した：２１．３ｇの固形分３０．１％の実施例１からの３．０ミクロンオリゴマーシード、８．５ｇの１％ｓｏｌｕｓｏｌ溶液、および１０５．５ｇの脱イオン水。
シード溶液を、メカニカルスターラーおよび熱電対の装備された１．８リットルのブッチ（Ｂｕｃｈｉ）ステンレススチール製反応フラスコ（「リアクター」）中に装填した。続いて、４６．４ｇの脱イオン水を装填することによって移送ラインを洗浄した。スターラーは１５０ｒｐｍに設定した。

モノマー／ポロゲンエマルジョンを、５００ビーカーにおいて、以下の成分を添加することにより調製した：１１６．１ｇのジビニルベンゼン（８０％ＤＶＢ／２０％ＥＶＢ）、６９．７ｇのＭＩＢＣ、１４２．０ｇの脱イオン水、および１．４９ｇの７５重量％Ｓｏｌｕｓｏｌ−水の溶液。
成分をビーカー中において混合してエマルジョンを形成した。このエマルジョンを次いでＳｉｌｖｅｒｓｏｎ ＩＬＥ ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ（５０％出力に設定）によってビーカーからリアクター中へ４０分間にわたって注入した。

リアクターを１時間かけて６０℃に加熱し、この温度で２時間保持し、オリゴマーシードをモノマーおよびポロゲンエマルジョンで膨潤させた。

乳化された開始剤溶液を次いで、上記６０℃での２時間の保持の後に、添加した。このエマルジョンは、５０ｍｌのビーカーにおいて、１．２９ｇのｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエートを１８．７ｇのＳｏｌｕｓｏｌの１％溶液へ添加することにより調製した。これらの成分を均一化してエマルジョンを形成し、ビーカーからリアクターへ一回で移送した。この移送に続いて、２４．１ｇの脱イオン水を使用することにより、移送ラインを洗浄した。リアクターを次いで、６０℃において追加で２時間保持した。

水性溶液は、２．４ｇのＫ４ＭＰ（メチルヒドロキシエチルセルロース、ダウケミカル社より入手可能）を３３４．９ｇの脱イオン水に混合することによって調製した。２時間の保持後、水性溶液をリアクター中へ移送し、続いて１５．８ｇの脱イオン水により移送ラインを洗浄した。

反応混合物（有機相および水性相の組み合せ）を、６０℃の温度で３０分間、１２０ｒｐｍで撹拌し、次いで６０分かけて８０℃に加熱した。反応混合物を８０℃に１２時間保持して、反応物質を重合した。

重合反応の完了後、反応混合物の温度を撹拌しながら５０℃に調整した。水／ポリマー混合物の水性相のｐＨを、最終的なｐＨに達するまで水に１０％硫酸をゆっくりと添加することにより、５．０に調整した。

１４．４ｇのβ−１，４−グルカン−４−グルカンヒドロラーゼ酵素（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（登録商標）４０００、Ｖａｌｌｅｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃより入手可能）の混合物を１３４．５ｇの脱イオン水中に混合し、次いでリアクター中に装填した。温度は５０℃に１２時間保持した。水／ポリマー混合物の水性相のｐＨを次いで、５０％水酸化ナトリウム水溶液で１２．０に調整し、リアクター中の温度を９０℃に加熱した。リアクターをこの温度で５時間維持した。

水／ポリマー混合物を室温まで冷却し、リアクターから取り出し、１リットルのクロマトグラフィーカラム中に配置した。水性相をポリマーから濾過し、次いでポリマーの充填床を２リットルの脱イオン水、続いて３．５リットルのアセトン、そして最後に３．５リットルのメタノールで洗浄した。濡れたポリマーを１００℃の温度で、２．５ｍｍ（０．１インチ）マーキュリー真空下で１６時間かけて乾燥した。

実施例３
本実施例は、本発明のマクロポーラスポリマーのインスリンの結合容量についての評価を記載する。これらのポリマーを、本明細書に記載された新規の乾燥技術ではなく、標準の乾燥技術を使用して乾燥した。本明細書に記載された新規の乾燥技術の使用は、マクロポーラスポリマーに改良された性能特性を与えると理解される。おおよそ５ｍｌの体積の試料が小規模の試験カラム（内径１．０ｃｍ×長さ６．３ｃｍ）中へ充填され、水性溶液からのウシインスリンの初期吸着の評価を行った。この試験は、ポリマーマトリックスが、典型的な使用条件下で、目的プローブ分子（ウシインスリン）についてすばやく効率的な質量移送、および高い容量が可能であるかを決定するために設計した。

５グラムの乾燥したポリマー樹脂（他に示した場合を除き、実施例２により調製された）を、３５ｍｌの２０％エタノール／水（ｖ／ｖ）に混合し、周囲温度で少なくとも２時間静置した。ポリマースラリーを次いで、１６０ｃｍ／時の線速度の２０％ｖ／ｖのエタノール／水の溶液中でフロー充填によりステンレススチール製のカラム（寸法：内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ、Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃｏｒｐより入手可能）中に充填した。カラム充填の品質を、４０ｃｍ／時の線速度で、２０％ｖ／ｖのエタノール／水溶離液を流しながら、５０μｌのパルスの脱イオン水中１％塩化ナトリウム溶液をカラム中に注入することによって確認した。カラムの効率（プレート／メートル）および非対称性をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウエアを用いて計算した。許容可能なカラム充填パラメーターの目標値は、最少でも５，０００プレート／メートルの効率、および０．８〜１．８の非対称性であった。

ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏより入手可能）の水１リットル当たり５グラムの濃度の溶液を調製した。この溶液の２００ｍｌすべてを、１５０ｃｍ／時の線速度でカラムに注入し、波長２９１ｎｍに設定されたＵＶ分光光度検出器（Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｏｗ（登録商標）７８３、ＡＢＩ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｋｒａｔｏｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手可能）を使用して、流出物中のウシインスリンを観察した。

ポリマー樹脂の動的容量（ｇ／Ｌ）が、ＵＶ−応答曲線における１％インスリン破過点（ポリマー樹脂上に吸着されたインスリンの全量と関連する）においてポリマー樹脂の上に吸収されるインスリンの量を記録することによって得られた。樹脂の全容量（ｇ／Ｌ）は、流入および流出する溶液のインスリン濃度をＵＶ分光光度検出器により測定し、次いで物質収支を行うことによって決定する。

ウシインスリン結合容量は、使用における性能を測定するためのスクリーニングテストとして用いられる。この容量試験の結果を表１に示す。実施例２からの樹脂は、この表において試料番号１−３により表されており、さらに１−１、１−２、１−４および１−５の番号が付けられた試料は、処方物においてポロゲンレベルが変動しているものを表す。製品性能を最大にするためには、最小限のポロゲンレベルでの高い結合容量が望ましい。

１−６、１−７および１−８の番号が付けられた試料は、米国特許第６，３８７，９７４号において開示された技術によって調製された樹脂を表す。米国特許第６，３８７，９７４号によって調製された樹脂との比較において、本明細書に記載された技術によって調製された試料は、非常に低いポロゲンのレベルで高いインスリン結合容量という予想外の結果を示す。このことが、所望の最終精錬性能を有し、同時に１００バールで圧力安定性である逆相ポリマー樹脂の作成についての、重要な実施可能要件であることが、以下の実施例において示される。

実施例４
以下の実施例は、実施例２からのポリマー樹脂を用いたウシインスリンの最終精錬を例証する。実施例２からの樹脂を内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍの寸法のステンレススチール製クロマトグラフィーカラム中に充填した。以下の移動相をこの実施例において使用した：「バッファーＡ」＝ｐＨ４．０の脱イオン水中の１００ｍＭグリシン、「バッファーＢ」＝１００％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル。

この実施例に使用されるインスリンは、粗製純度９２％を有するウシインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙより購入）であった。ウシインスリン溶液を、全量７５ｍｇのこのインスリンを、１２．５ｍＬの「ローディングバッファー」（脱イオン水中の１０％ｖ／ｖアセトニトリル中に０．１％のグリシンを含有する）中に溶解することにより調製し、３０ｍＬのＴＦＡでｐＨ２に調製した。１８ｍｇインスリン／ｍＬカラムのカラム濃度を達成するのに充分なインスリン溶液を、０．２７ｍｌ／分（１００ｃｍ／時）の速度でカラムにロードした。

ロード後、カラムを１カラム体積（４．１５ｍＬ）のローディングバッファーで、同様に０．２７ｍｌ／分の流速で洗浄した。１７．５％〜３０％のバッファーＢで直線的に濃度勾配を拡大させるものを３２．５カラム体積（１３５ｍＬ）にわたって使用することにより、インスリンをカラムから溶出させた。溶出中の溶媒流速は０．２７ｍＬ／分であった。流出物を２８０ｎｍのＵＶで観察し、画分を２分に１回の割合で回収した。

画分を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８、３００Ａ、５ミクロン樹脂で充填された逆相ＨＰＬＣカラム（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を使用して分析した。以下の溶媒条件を画分分析に使用した：バッファーＡ：ＨＰＬＣグレードの水中に０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ；バッファーＢ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中に０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ。２５℃のカラム温度において０．８ｍｌ／分の流速で作動させたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣを分析に使用した。溶出条件は、２５％のバッファーＢを３分間維持し、次いでバッファーＢの２５％から３５％への勾配を３０分かけて行うことを含んでいた。

ウシインスリンの予備精製の結果を、表２に示す。実施例２からの樹脂を、この表において試料番号１−３として示す。他の市販のポリマー樹脂を、比較のために示しており、試料１−１０（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＣＧ３００Ｓ）、および試料１−９（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＸＴ２０、米国特許６，３８７，９７４により得ることができる市販物質）を含む。試料１−１１は高品質逆相シリカ充填剤（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００Ａ、１３ミクロンシリカ、Ｅｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより商業的に入手可能）を示しており、性能の参考標準としてここに示す。表２における結果は、本発明の逆相ポリマー性樹脂のみが高品質逆相シリカに匹敵する最終精錬の精製能力を提供することを示す。

実施例５
以下の実施例は、実施例２からのポリマー性樹脂を使用するインスリンまたはインスリン類似分子の最終精錬を例証する。実施例２からの樹脂を、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍの寸法のステンレススチール製クロマトグラフィーカラム中に充填した。以下の移動相をこの実施例において使用した：「バッファーＡ」＝ｐＨ４．０の脱イオン水中の１００ｍＭグリシン、「バッファーＢ」＝１００％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル。

この実施例で使用されるインスリンは、Ｓｉｇｍａより購入した９２％の純度を有する組み換えヒトインスリンであった。全量７５ｍｇのこのインスリンを１２．５ｍＬの「ローディングバッファー」（脱イオン水中の１０％ｖ／ｖアセトニトリル中に０．１％のグリシンを含有する）中に溶解することにより溶液を調製し、３０ｍＬのＴＡＦでｐＨ２へ調整した。１８ｍｇインスリン／ｍＬカラムのカラム濃度を達成するのに充分なインスリン溶液を０．２７ｍｌ／分（１００ｃｍ／時）の速度でカラムにロードした。ロード後、カラムを１カラムの体積（４．１５ｍＬ）のローディングバッファーで、同様に０．２７ｍｌ／分の流速で洗浄した。

１７．５％〜３０％のバッファーＢで直線的に濃度勾配を拡大するものを３２．５カラム（１３５ｍＬ）かけて使用することにより、インスリンをカラムから溶出させた。溶出中の溶媒流速は０．２７ｍＬ／分であった。流出物を２８０ｎｍのＵＶで観察し、画分を２分に１回の割合で回収した。

画分は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８、３００Ａ、５ミクロン樹脂で充填された逆相ＨＰＬＣカラム（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を使用して分析した。以下の溶媒条件を画分分析に使用した：バッファーＡ：ＨＰＬＣグレードの水中に０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ；バッファーＢ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中に０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ。２５℃のカラム温度において０．８ｍｌ／分の流速で作動させたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣを分析に使用した。溶出条件は、２５％のバッファーＢを３分間維持し、次いでバッファーＢの２５％から３５％への勾配を３０分かけて行うことを含んでいた。

ヒトインスリンの予備精製の結果を表３に示す。実施例２からの樹脂を、この表において試料番号１−３として示す。他の市販のポリマー樹脂を比較のために示しており、試料１−１０（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＣＧ３００Ｓ）、および試料１−９（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＸＴ２０、米国特許第６，３８７，９７４号により得ることができる市販物質）を含む。試料１−１１は高品質逆相シリカ充填剤（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００Ａ、１３ミクロンシリカ、Ｅｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより商業的に入手可能）を示しており、性能の参考標準としてここに示す。表３における結果は、本発明の逆相ポリマー性樹脂のみが高品質逆相シリカに匹敵する最終精錬の精製能力を提供することを示す。

この技術を使用すると、不純物からヒトインスリンを充分に分離することができる。９９．５％の純度レベルで、７０％のインスリン収率が得られた。ロードされたインスリンの全回収率は９０より大きかった。

実施例６
この実施例では、マクロポーラスポリマー（標準技術を使用し乾燥させた）が、それらの浸透特性、すなわち圧縮耐性についてどのように評価されたかを記載する。ポリマーは、それらの「流動抵抗」または１／Ｋ値（式３参照）によって特徴付けられる。

工業的な高圧液体クロマトグラフィーにおいて、樹脂上へ直接の力（圧力）を加えるピストンが装備されたカラムを使用することが一般的である。クロマトグラフィーのサイクルを通して予想される流圧の最大値と等しいかそれより大きい圧力で、ピストンが床を積極的に圧縮するようにしておくことが好ましい。本発明のポリマーの浸透特性の試験をするために、ポリマー樹脂は、ＰｒｏＣｈｒｏｍ（商標）ダイナミック・アキシャル・コンプレッションカラム（ＬＣ．５０型、Ｎｏｖａｓｅｐより商業的に入手可能）中に充填され、最初に１００バールの圧縮圧力に設定されたピストンで圧縮した。この試験の目的は、それぞれの試料の浸透特性（圧縮耐性）を特徴付けることであった。詳細を以下に記す。

一般に、多ビニル芳香族ポリマー床の粒子間空隙の体積（または浸透性）を決定するためには、移動相をプローブ分子と相溶性であるように選択しなければならず、それによりそれらが、プローブ分子と多ビニル芳香族ポリマーの疎水性表面との相互作用を排除または減少させる。従来のプローブ分子、たとえば線状ポリスチレン、ブルーデキストラン、およびポリエチレングリコールを使用することができるが、しかし、非極性の移動相（たとえばテトラヒドロフランおよびトルエン）の使用が必要とされる。しかしながら以下に記載した方法に使用されるプローブ分子は、非極性溶媒の使用を必要とせず、たとえば２０％エタノールのような任意の水性−有機溶媒系に使用することができる。

カラム中の空隙（粒子内および粒子間の両方）の全体積を決定するために、２ｍｌの１％塩化ナトリウム（２０％水性エタノール中ｗ／ｖ）をシステム中に注入した。塩を電導度検出器で検出した。粒子間空隙の体積のみを決定するために、１％（ｗ／ｖ）の０．１〜０．９μｍのイオン荷電されたエマルジョンポリマーまたは細かく砕いたイオン荷電されたポリマー（たとえば、イオン化可能官能基、たとえば弱酸官能基（カルボキシレート基）、強酸官能基（スルホネート）または四級塩化アンモニウム基を有する架橋されたポリスチレン）を含有する２０％エタノール（水性）の溶液を、床を通過して流れる２０％エタノール（水性）の流れ中に注入した。粒子を２８０ｎｍに設定されたＵＶ検出器により検出した。イオン荷電されたポリマープローブ粒子のサイズにより、粒子は本発明のポリマー樹脂の細孔に浸入しなかった。イオン荷電されたポリマープローブ粒子（これらの粒子は、芳香族構造および表面全体に分布している高濃度のイオノゲン性基を有していた）の表面の性質により、本発明のポリマー樹脂への疎水性による吸引／保持が回避された。

ポリマー床の全空隙体積（塩プローブ溶出体積）を決定し、ポリマー粒子の外側の空隙体積（イオン荷電されたエマルジョンまたは細かいポリマー溶出体積）と組み合わせた。これらの値を測定された床体積と共に、式２および３におけるεの計算に使用した。

ウシインスリンの予備精製の結果を表４に示す。実施例２の樹脂をこの表の試料番号１−３により示す。他の市販ポリマー樹脂を比較のために示し、試料１−１０（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＣＧ３００Ｓ）、および試料１−９（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＸＴ２０、米国特許第６，３８７，９７４号により得ることができる市販物質）、試料１−１２（Ｓｏｕｒｃｅ（商標）３０ ＲＰＣ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃより商業的に入手可能）、および試料１−１３（ＰＬＲＰ（商標）１０−１５ミクロン、ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓから商業的に入手可能）を含む。試料１−１１は、高品質逆相シリカ充填剤（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００Ａ、１３ミクロンシリカ、Ｅｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより商業的に入手可能）を示しており、性能の参考標準としてここに示す。表４における結果は、１００バールのピストン圧において本発明の逆相ポリマー樹脂のみが実質的に変形することなく、全ての他の逆相ポリマー充填剤が実質的な変形を受け、流動抵抗が増加していることを示す。

実施例７
以下の実施例は、様々な乾燥の方法を例証する。次のようにして乾燥した試料を調製した。水で湿らせた（２０％固形分）実験用の１０μｍポリジビニルベンゼンポーラス樹脂３３５ｇを２０００ｍｌビーカー中に秤り取った。１５００ｍｌのＤ．Ｉ水をビーカーに添加し、次いでゆっくり混合した。

スプレー乾燥を次のようにして試料に対し行った。Ｂｕｃｈ（商標）Ｍｉｎｉ ＳｐｒａｙドライヤーＢ−１９１を樹脂スラリーを実行するために設定した。スプレードライヤーの流速を、脱イオン（「ＤＩ」）水で１０ｍｌ／分に設定し、スプレードライヤーを使用した次の操作条件：スプレー流速：１０ｍｌ／分、入口温度：１４０℃、および出口温度：８０℃：に設定した。供給ホースを樹脂スラリーで充填したビーカー中に浸せきし、次いで樹脂スラリーをスプレードライヤー中に１０ｍｌ／分で供給した。２．５時間のスプレー乾燥後、樹脂６７ｇを９９．５％の固形分パーセントで回収した。生成物は、顕微鏡を用いた１倍または１００倍の可視的な試験下において、凝集する兆候のない自由に流れる粉末であった。

比較実施例７Ａ
以下の実施例は真空オーブン乾燥を用いた比較例を例証する。乾燥した試料を次のように調製した。すなわち、水で湿らせた（２０％固形分）実験用の１０μｍポリジビニルベンゼンポーラス樹脂３３５ｇを９：×１１”ＳＳの鍋中に配置した。底に薄層を形成する方法で、樹脂を鍋中に適用した。鍋を次いで、室温において真空オーブン中へ配置し４０ｍｍＨｇの真空を適用した。次いで、オーブンを４時間かけて９９℃に加熱し、次いで１８時間そこで保持した。真空オーブンを室温に冷却し、オーブンを窒素で大気圧へ加圧した。鍋をオーブンから取り出し、試料を、再秤量し、９９．８％の固形分％で６８ｇの樹脂を回収した。

試料は、鍋中において目に見えて凝集した状態であり、そして、凝集を個々の１０μｍの粒子に分けることは極めて困難であった。試料を次いで、２０μｍスクリーンメッシュを用いてドライスクリーンし、１０ｇの自由に流れる粉末を回収した。

実施例８
以下の実施例は、樹脂に性能の改善を与える本発明において記載された乾燥方法を用いて製造された物質を使用したカラム充填剤を例証する。乾燥樹脂を６０％のイソプロパノール／４０％の水からなる溶媒溶液を用いて水和した。内径１ｃｍ×長さ２５ｃｍのカラム（１９．６２５ｍＬ容積）に充填するため、１４ｇの乾燥樹脂を１００ｍＬの溶媒溶液に添加した。０．３５ｇ／ｍＬの樹脂密度を基準にして、これを４０％の樹脂スラリー（体積／体積）に提供した。物質は、充填される前に少なくとも２時間水和させておいた。

樹脂スラリーをオーバーヘッド混合機を使用して再懸濁し、次いで約２分間、超音波にかけられ均一化を確実にした。スラリーを次いで、ステンレススチール製の充填装置中へ慎重に移した。充填装置は、充填リザーバおよびステンレススチール製の内径１ｃｍ×長さ２５ｃｍのカラムから成る。充填装置を次いで、水和溶液と全く同じ充填溶液を使用するＨＰＬＣポンプへ接続した。流れは、目標の流速へ２〜３分にわたってゆっくりと直線的に増加した。圧力をインライン圧力ゲージを用いて観察し、適用された充填圧の最大は１０００ｐｓｉであった。圧力は、充填中、流速を下げることにより一定に保たれた。安定した圧力および流速に到達（１５〜２０分）したときに、充填が完了したと見なした。次いでカラムを充填リザーバから取り出し、エンドフィッティングをカラムの頂部に取り付けた。

塩化ナトリウムカラム評価を次のように行った。次いでカラムを導電率計を備えたＨＰＬＣシステムに取り付けた。カラムを、２ｍＬ／分で２０％エタノール／８０％水の移動相により２０分間平衡化した。平衡化後、流速を０．５ｍＬ／分に下げ、５０μｌの１％塩化ナトリウム溶液をカラムに注入した。カラム効率（プレート／Ｍ）を溶離された塩のピークから計算した。

本発明の方法を使用して乾燥した物質のヒトインスリン評価を次のように行った。すなわち、スプレー乾燥した１０μｍの物質の効率は、競合する１０μｍのシリカカラム（ベンダーによって充填された）と、非保持条件下でヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）を使用して比較した。カラムを最初に５０％アセトニトリル／５０％水／０．１％ＴＦＡ移動相において平衡化し、次いで５０μｌの５ｍｇ／ｍＬヒトインスリンをカラムに注入した。平衡化を５つの異なる流速：０．２５、０．５０、１．０、２．０、および３．０ｍＬ／分で、２回行われた。検出を２８０ｎｍのＵＶ検出器により行われた。カラム効率（プレート／Ｍ）を溶離されたヒトインスリンのピークから計算した。

スプレー乾燥した物質の品質的な充填プロフィールは、従来型で乾燥した物質の場合よりも、より再現性があった。従来型で乾燥した物質の圧力低下は、スプレー乾燥した物質の圧力低下よりも、より大きな変動を受けた。加えて、従来型で乾燥した物質の最終的な流速は、スプレー乾燥した物質のそれより低かった。

塩化ナトリウム評価の結果を表５に示す。研究室規模、生産準備規模、および製造規模で、従来的に乾燥した樹脂は、４０，０００〜４７，０００プレート／Ｍの範囲の効率を提供した。加えて、他の、Ｐｏｌｙｍｅｒ ＬａｂｓおよびＨａｍｉｌｔｏｎから商業的に入手可能な１０μｍのポリマー物質は、４０，０００〜４５，０００プレート／Ｍの範囲の効率を提供した。スプレー乾燥した１０μｍの樹脂は、５２，０００〜５９，０００プレート／Ｍの範囲の効率を提供した。もちろん、当業者は乾燥の種類を調整し、または様々な乾燥方法を組み合わせることができ、プレート／Ｍの範囲の値を調節することができる。

充填効率の計算方法は次の通りである。すなわち、充填効率をＡｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ ソフトウエアをベースに計算し、かつカラムの長さ１メートル当たりの合計プレートをベースにする。計算は以下のようにすべきである。

Ｎ＝５．５４（Ｔ_ｒ／Ｗ_１／２）^２
式中、Ｔ_ｒ＝保持時間（分）、およびＷ_１／２＝ピークの高さの半分の位置で測定されたピーク幅（分）

次いでこれは、カラムの長さ（メートル）を除算し、１メートル当たりの合計プレートを得る。カラムの長さは２５ｃｍであり、それぞれの効率を上式を０．２５Ｍで除算することにより計算した。

ヒトインスリンの効率比較の結果を表７に示す。表において実証しているように、スプレー乾燥した１０μｍポリマー物質は、評価された全ての流速範囲にわたって、競合する１０μｍシリカ製品の効率と同様の効率を提供した。

試料１−１ないし１−６は、実施例２において記載された発明に従って調製された物質を表示し、さらに試料１−７ないし１−９は、米国特許第６，３８７，９７４号に従って調製された物質を表示する。

Claims (11)

1. 複数のマクロポーラスクロマトグラフィー樹脂ビーズを製造する改良された方法であって、該改良が、ビーズの内部細孔構造を乱すことのない方法において、ビーズの周りから溶媒を除去することを含む方法。
2. 溶媒が水を含み、かつ除去が水をビーズから取り除き瞬時に乾燥させることを含む請求項１に記載の方法。
3. 除去が、マイクロ波乾燥を含む請求項１に記載の方法。
4. 除去が、スプレー乾燥を含む請求項１に記載の方法。
5. 除去が、凍結乾燥を含む請求項１に記載の方法。
6. ビーズの内部細孔構造を乱すことのない方法において、ビーズの周りから溶媒を除去する工程を利用する方法を使用して製造されるマクロポーラスビーズ。
7. クロマトグラフィーの改良された方法であって、該改良が、ビーズの内部細孔構造を乱すことのない方法において、ビーズの周りから溶媒を除去する工程を利用するプロセスを使用して製造される複数のマクロポーラスビーズを使用することを含む方法。
8. 除去が、溶媒を瞬時に取り除くこと、溶媒を凍結乾燥させ取り除くこと、および溶媒をマイクロ波で取り除くことから成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 請求項７記載のクロマトグラフィーの方法を使用して他の化合物から分離された、生体分子、医薬品、または医薬品もしくは生体分子の前駆物質。
10. ビーズが、シードの拡張により製造される請求項１に記載の方法。
11. ビーズが、シードの拡張により製造される請求項８に記載の方法。