CN1218181C - 颗料及其制备方法和在分子刻印上的使用 - Google Patents

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Abstract

能特定地结合到刻印分子的颗粒，包括含有与刻印分子相符合的空腔的外壳，和一基本上不含这种空腔的内核。这样的颗粒可用作为各种技术，包括分离靶分子的介质。

Description

颗粒及其制备方法和在分子刻印上的使用
技术领域
本发明涉及颗粒及其在分子刻印上的使用。特别是，本发明涉及适合用作分离介质的颗粒，及其由分子刻印的制备。
背景技术
已知很多方法，例如，液相色谱-质谱法(LC-MS)和高效液相色谱(HPLC)，可分离、分析不纯混合物中的靶分子(targetmolecule)。但这两种方法均无特定性(non-specific)。即某些参数(例如紫外线波长和流速)必须设定与保持才能鉴定某一特定化合物。
分子刻印(molecular imprinting)可用来制造对某特定靶分子有选择性的聚合物。产品是经由一系列阶段制备的。第一，经过挑选的可共聚合单体和靶分子混合。第二，此混合物进行聚合反应，靶分子因而被捕获在聚合体里。第三，靶分子被抽提出而留下一空洞，或与靶分子相符合的刻印。因而产生的聚合产品对靶分子有选择性。
然而此技术有许多缺点。在大多数的情况，单体和靶分子的聚合反应产出一固体物质，该物质必须，例如，在磨机中打碎研磨以准备大小适当的颗粒。采用此方法很难制造出形状均一的颗粒，而其，例如，是使用分离柱或分离管的典型需要以避免有明显的反压发生。HPLC管柱，例如，要求颗粒有窄小范围的直径分布，典型地，80％的颗粒有±20％的平均直径。因此如果需要有相当均一的颗粒，就要对颗粒进行筛分。用任何或所有这些方法由于颗粒磨得过细而造成很大的材料损失。例如，打碎研磨可造成50％制备材料的损失，而筛分可造成95％之多的制备材料损失。显然的，这在经济上有很大的不利。
现有技术的另外缺点是经常有很高比例的靶分子捕获在聚合体基质里。一般了解是，虽然有些靶分子可给除掉(例如用有机溶剂洗)，但是仍有一部份会捕获在基质里。
这有两个不想要的结果。第一，靶分子常常是昂贵的。他们可能，例如，是特别制造试验其功效的候选药品。在此情况下，希望能移走且再用靶分子。第二，任何仍遗留于基质中的靶分子对其在微量分析(trace analysis)与定量分析上的实用性有不利的影响。刻印分子会漏出且掩蔽靶分子的吸收。
这是一严重问题，而且已经在先前技术中提出。已发展出一套利用靶分子的类似物作为刻印的策略。如果类似物形成的空腔能选择性被靶分子填充，并且类似物可用，例如，HPLC，与靶分子分开，那么基质可适用于微量分析及定量分析。
另外一缺点典型地产生于单体的低水溶性。所以聚合反应是在有机溶剂中进行。除了有机溶剂比水价格贵，以及顾虑有机溶剂对环境的影响更大之外，有机系统和生物系统不相调和。对许多生物测定可能有用的刻印聚合物(imprinted polymers)应在水里进行以仿照自然系统。由于需要高度的交联以维持空腔的形状，一般认为用水取代有机溶剂是不可行的。
发明内容
按照本发明，一颗粒能特定地结合到刻印分子(imprintmolecule)。该颗粒具有一外壳其中含有和刻印分子相符合的空腔，并且具有一内核大体上不含这种空腔。
该颗粒可由下面步骤制造：
a)在一核心周围聚合一刻印分子与可聚合材料的混合物，以形成一含刻印分子的外壳；并且
b)用，例如清洗，移走该刻印分子以留下一相符合的空腔。
本发明的优点是容许选择测定在水性环境中进行。本发明颗粒进一步的优点是颗粒很容易制备，且有均一大小。本发明提供一根据分子形状、大小、及化学成分来分离分子的通用方法。
附图说明
图1图示了制作颗粒的步骤；
图2图示了制作颗粒步骤的两种选择；
图3表示用于两个制造颗粒的化合物结构；
图4图示了本发明可能形成的非特定性和特定性空腔；并且
图5说明pH值对咖啡因(coffeine)和茶碱(Theophylline)结合到刻印壳-核颗粒的影响。
具体实施方式
本发明的颗粒可用已知的材料制造。主要由两个阶段来制造颗粒。第一，可聚合材料与刻印分子的混合物(在下文中称可聚合混合物)在一核心周围聚合形成一含刻印分子的壳。第二，移去该刻印分子，留下对刻印特定的空腔。
颗粒的核心可由市场上购买，或可在原位制造。譬如，可由可聚合的单体像二乙烯基苯(DVB)/苯乙烯之类合成。
壳由任何合适的可聚合材料合成。这个可能是，例如，甲基丙烯酸甲酯(MMA)或二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，或是这些的组合。然后加入刻印分子，这个可是任何希望测试的合适配体。最后洗掉刻印分子。清洗溶液可以是，例如，水/丙酮溶液、磷酸(H3P04)、或甲醇。
为了加强其润湿性，颗粒优选在其外表面有极性基团。颗粒可包含一两亲性分子(amphipathic molecule)以达此目的。这样的两亲性分子也可增强孔洞的形成及与刻印分子非共价键的相互作用。两亲性分子可含于可聚合混合物里，或者核心可环绕一含有两亲性分子的“分子支架(molecular scaffold)”形成。例如，两亲性分子磷酸苯氢油基酯(oleyl phenyl hydrogen phosphate(OPHP))可含在可聚合混合物里，或可形成一胶束(micelle)而核心在该胶束周围形成。
本发明的颗粒典型地比在本文中的实施例所述小或大10、50、及100倍之间，而优选其大小的分布和实施例所述类似。本发明颗粒的壳典型地构成高达10％、20％、30％、40％或50％的颗粒横截面大小，且可能比实施例所述薄或厚10、50、和100倍之间。壳越薄，刻印分子越容易给洗出来，由于它们较接近外表面。
本发明现将用实施例描述且仅只参考附图。
参考图1，交联的聚苯乙烯核心是由苯乙烯与二乙烯基苯(DVB)制成的。该核心被OPHP与EGDMA(图3)的组合包盖形成一“壳-核”颗粒。然后加入模板分子或刻印分子，并且随后用水溶性引发剂开始EGDMA的聚合反应。用溶剂，例如丙酮，提取抽出该刻印分子，而在颗粒的壳留下对靶特定的空腔。
参考图2，颗粒核心可由苯乙烯与二乙烯基苯(DVB)的混合物制造，而颗粒的外壳可由MMA/EGDMA制成。其中，包括OPHP在内以提供颗粒上的极性表面基团。另外，含苯乙烯/二乙烯基苯的颗粒核心也可围绕一OPHP胶束形成，然后可再加入MMA以形成颗粒外壳。
以下实施例说明本发明。
实施例1
i.制备以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯核心颗粒
用去离子水(52.5ml)制备4-吗啉乙磺酸一水合物的水缓冲液(0.6398g，3.00mmol，50mM)，然后用氮气吹洗15分钟。加入十二烷基硫酸钠[BDH来源，特纯’](1.50g，5.20mmol)，然后搅拌溶解该混合物并在室温下超声波处理10分钟，然后加入1M NaOH调整其pH值为6.0。在定温(60℃)与氮气环境下搅拌(300-350r.p.m.)该溶液，然后在30分钟内滴加入苯乙烯(4.0173g，38.57mmol)/二乙烯基苯(5.0217g，38.57mmol)混合物。一次加入4，4′-偶氮二-(4-氰戊酸)(0.5460g，1.95mmol)引发聚合反应并且继续搅拌16小时以产生核心颗粒的乳液。
ii.表面分子刻印
于60℃下在乳液中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯(0.4520g，2.28mmol)[5％质量比例]与磷酸苯氢油基酯(0.4080g，0.9611mmol)的混合水溶液(去离子水，7.5ml)，并且继续搅拌30分钟。接着进行以下步骤以得到咖啡因刻印(caffeine imprint)：加入咖啡因(0.3735g；1.92mmole；2.0摩尔当量)并且继续搅拌30分钟以达到平衡；然后一次加入4，4′-偶氮二-(4-氰戊酸)(0.5460g，1.95mmol)以引发表面聚合反应。在60℃下继续反应105分钟，然后用冰水浴降低温度到0℃使反应停止。
依上述的标准方法用咖啡因做聚合物胶态颗粒的表面分子刻印，当EGDMA在外层的质量比例增加到20％以及减低到1％时都形成稳定的乳液。
实施例2
除了咖啡因被别的刻印分子取代之外，依照实施例1的步骤制备了各种表面分子刻印的壳-核颗粒。取代的分子，包括茶碱、codine、吗啡、哌嗪、咪唑、哈尔明、咔啉、萘心安、以及阿替洛尔。其中，取代的刻印分子的相对浓度在1.0到2.0摩尔当量之间。这些全部都得到稳定的刻印壳-核颗粒乳液。
实施例3
合成具有低交联密度的外壳的壳-核颗粒
如图2(a)所示制备具有5％(w/w)总外壳质量的颗粒。该外壳由甲基丙烯酸甲酯(90％)与EGDMA(10％)组成。
i.制备以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯核心颗粒
用去离子水(350ml)制备4-吗啉乙磺酸一水合物的水缓冲液(4.265g，20mmol，50mM)，然后用氮气吹洗15分钟。加入十二烷基硫酸钠(10.0g，34.6mmol)，然后搅拌溶解该混合物，并在室温下超声波处理10分钟。然后加入1M NaOH调整该溶液pH值为6.0。在定温(60℃)与氮气环境下搅拌(300-350r.p.m.)该溶液，然后在该混合物中在30分钟内滴加入苯乙烯(26.782g，0.257mol)/二乙烯基苯(33.478g，0.257mol)混合物。一次加入4，4′-偶氮二-(4-氰戊酸)(3.640g，11.8mmol)引发聚合反应并且继续搅拌16小时以产生核心颗粒的乳液。
ii.表面分子刻印以形成具有低交联密度外壳的颗粒
然后加入甲基丙烯酸甲酯(3.013g，30.1mmole)、磷酸苯氢油基酯(4.260g，10.0mmol)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(0.3013g，1.52mmole)、以及己烷(1.0g)的混合水溶液(50ml)，并且继续搅拌30分钟。加入模板分子，于此例是咖啡因(3.883g，20mmole，2.0摩尔当量相对于OPHP)，并且继续搅拌30分钟以达到平衡。然后一次加入4，4′-偶氮二-(4-氰戊酸)(3.64g，11.8mmol)引发表面聚合反应。在60℃温度下继续反应105分钟，然后用冰水浴降低温度到0℃使反应停止。
实施例4
合成具有二乙烯基苯/磷酸苯氢油基酯交联的核心的壳-核颗粒
i.制备以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯/磷酸苯氢油基酯核心颗粒
用去离子水(35ml)制备4-吗啉乙磺酸一水合物(0.4265g，2mmol)的水缓冲液，然后用氮气吹洗15分钟。加入十二烷基硫酸钠(1.0g，3.46mmol)，然后搅拌溶解该混合物，并在室温下超声波处理10分钟。然后加入1M NaOH调整该溶液pH值为6.0。在定温(60℃)与氮气环境下搅拌(300-350r.p.m.)该溶液。加入磷酸苯氢油基酯(0.4260g，1.0mmol)并且继续搅拌30分钟。然后在30分钟内滴加入苯乙烯(2.677g，25.7mmol)/二乙烯基苯(3.349g，25.7mmol)混合物。一次加入4，4′-偶氮二-(4-氰戊酸)(0.3640g，1.18mmol)引发聚合反应并且继续搅拌6小时。
ii.使用甲基丙烯酸甲酯做表面分子刻印
于60℃下在该乳液中加入甲基丙烯酸甲酯(0.3013g，3.0mmole)在去离子水(5.0ml)中的悬浮液，并且继续搅拌30分钟。加入模板分子，于此例是咖啡因(0.3883克，2.0mmole)，并且继续搅拌30分钟以达到平衡。然后一次加入4，4′-偶氮二-(4-氰戊酸)(0.3640g，1.18mmol)引发表面聚合反应。在60℃下继续反应105分钟，然后用冰水浴降低温度到0℃使反应停止。图2(b)表示这些反应。
实施例5
制备研究结合的刻印壳-核颗粒
在室温下快速搅拌2.0毫升等分的核-壳颗粒乳液，并且在2分钟内滴加入丙酮(1.4-1.8ml)直到形成一浓稠悬浮液。将该悬浮液倒入一具有5.0毫升容量的空间排阻色谱(SEC)容器内(预先插入一真空歧管)，并且让其静置30分钟后在真空下排干。加入2比1的丙酮/去离子水溶液(2.0ml)到此空间排阻色谱(SEC)容器中，并且搅拌使成一悬浮液，然后排干。重复此步骤(6×2.0ml)直到滤液用紫外线吸收光谱测不到SDS，并且用液相色谱-质谱仪(LC-MS)测不到剩余的模板。此空间排阻色谱(SEC)容器装配有20毫升的溶剂贮存器，而且按照表1的步骤顺序清洗刻印树脂。依照这个方法程序，可直接使用制备的刻印树脂或将其空气干燥、储存供将来使用。
另外一替代的过滤洗清法，本发明的刻印聚合物颗粒可用异丙醇沉淀，然后离心分离。在表1所述溶剂中使颗粒重复悬浮进行清洗，并且每次洗清之间离心分离颗粒。这个过程发现是一特别快速而且有用的洗清刻印聚合物颗粒的方法。
          表1：制备刻印树脂的清洗步骤程序
清洗编号 洗液 体积/毫升 评注
1 丙酮/水(2∶1) 7×2.0 测定多余的模板
2 丙酮/水(2∶1) 2×20.0 洗掉多余的非结合
3 磷酸(1M) 2×20.0 洗掉结合的模板
4 水 2×2.0 洗掉酸
5 甲醇 2×20.0 非特定性洗液清洗
6 水 2×2.0 洗掉甲醇
7 磷酸(1M) 1×2.0 平衡用
8 水 1×2.0 水性结合研究用
实施例6
结合咖啡因与茶碱到刻印壳-核颗粒
把依照实施例1和实施例2合成的并且依照实施例5制备使用的刻印以及非刻印壳-核颗粒(2ml)，加到一具有220毫升容量且含有100,000道尔顿分级滤膜(cut-off membrane)的超速离心容器中，而且用3毫升异丙醇沉淀。该样品依顺序用70％异丙醇/水(3×15ml)、磷酸(1M，2×20ml)、甲醇(2×20ml)、及水(2×20ml)洗，并且每次清洗之间在温度10℃下离心(8000×g)。
准备1比1的咖啡因(57.5μg/ml)与茶碱(53.5μg/ml)的混合水溶液，并且调整其pH值为7.0。将该样品(2ml)加到洗过的咖啡因刻印、茶碱刻印、及无刻印的壳-核颗粒，并且彻底地混合其悬浮液，然后放置30分钟，其间每10分钟搅动一次。在真空下排干该混合物，过滤，并且用LC-MS分析其上清液(使用一Waters 2690分离组件，和一Micromass LCZ platform在其ESI模式连同一具有4000道尔顿范围的四倍质量分析仪(mass analyser)下操作)。由峰面积测定分级摄取物(U)。其中，U＝(A1-A2)/A1，而A1是加入树脂前溶液的峰面积，A2是接触树脂后上层清液的峰面积。在表2报告这些结合研究的结果。
               表2：聚合体刻印树脂对咖啡因和茶碱的分级摄取
  外层厚度/核心质量的百分比％和深度/nm                                            刻印树脂的分级摄取(U)P(caff)                             P(theo)                              P(空白)Ucaff             Utheo             Ucaff             Utheo             Ucaff             Utheo
  5％(10nm)   0.94   0.51   0.57   0.48   0.56   0.51
  1％(2nm)   0.59   0.72   0.81   0.91   0.73   0.88
  20％(40nm)   0.85   0.95   0.92   0.95   0.89   0.98
从这些研究发现只有当外壳厚度是最理想值5％时(即使用的EGDMA质量是核心颗粒质量的5％)，观察到对咖啡因的摄取选择性超过茶碱。该值也表示是一层10nm的厚度  相当于使用的模板分子，于此例是咖啡因或茶碱，的分子大小。
观察到当外壳是20％的核心质量时对咖啡因没有选择性，暗示颗粒表面模板分子仅给交联的EDGMA完全包围住，即没有磷酸盐首基参与。
观察到当外壳是1％的核心质量时对咖啡因没有选择性，并且观察到咖啡因-模板树脂对咖啡因和茶碱两者的摄取比茶碱-模板树脂和空白-模板树脂对它们的摄取低14-20％。该缺少选择性的现象暗示由于浅层的厚度，磷酸盐首基的亲水结合力比任何在胶体表面的疏水作用占强势。
实施例7
pH值对竞争结合到刻印树脂的影响
于pH4.0到9.0范围测定pH值对咖啡因与茶碱1比1混合物(57.5/53.5μg/ml；0.1M磷酸钠缓冲液)竞争结合到咖啡因和茶碱刻印壳-核颗粒，以及空白模板树脂的影响。三个系列的固相抽提容器(咖啡因和茶碱模板树脂以及空白-树脂各九个)，其中每个容器含300毫克依实施例5制备的树脂。制备pH范围为4.0到9.0的1比1咖啡因与茶碱(57.5/53.5μg/ml)在0.1M磷酸钠缓冲液中的溶液。依实施例6的方法，分析这些溶液于加到树脂前和树脂后咖啡因与茶碱的含量。测定咖啡因-刻印树脂[P(caff)]、茶碱刻印树脂[P(theo)]、以及空白对照树脂，对1比1咖啡因与茶碱溶液在pH4.0到9.0咖啡因的摄取(Uc)。同样的，测定咖啡因-刻印树脂[P(caff)]、茶碱-刻印树脂[P(theo)]、以及空白对照树脂，对1比1咖啡因与茶碱溶液在pH4.0到9.0茶碱的摄取(Ut)。如图5摄取值(相对于空白对)对pH值作图。
这些研究显示(i)在pH为8.0的磷酸钠缓冲溶液中，咖啡因-模板树脂对1比1咖啡因与茶碱混合物中咖啡因的选择性摄取比茶碱-模板树脂对咖啡因的选择性摄取显著；(ii)在pH为8.0的磷酸钠缓冲溶液下，咖啡因-模板树脂对1比1咖啡因与茶碱混合物中茶碱的选择性摄取比茶碱-模板树脂对茶碱的选择性摄取显著；以及(iii)在pH为8.0的磷酸钠缓冲溶液下，咖啡因-模板树脂对茶碱的选择性摄取比其对咖啡因的选择性摄取显著。
实施例8
用1比1成分结构类似的混合物探讨分子刻印壳-核颗粒的选择性
依实施例1叙述的方法，用水溶性化合物分子刻印各种壳-核颗粒表面。制备刻印分子与其结构类似之一化合物的1比1混合水溶液，并且用1M NaOH/1M HCl调整该溶液pH值到7.0。依实施例6描述的方法分析该混合物内，于加入树脂前和树脂后，每一成分的含量。又在加入树脂后，测定各刻印有类似化合物1和2树脂(P)以及空白(无刻印)树脂，对1比1混合物内每一成分的分级摄取值(U1与U2)。结果简述于表3，显示对用来形成刻印的分子，与其结构相似化合物比较，有增强选择性。这些结果肯定本发明的分子刻印壳核颗粒可用来分离结构类似的化合物。
                            表3：类似物配对的分级摄取值(U)
竞争结合物 刻印聚合物     U1     U2   选择性比率
咖啡因/茶碱 P(caff) Ucaff＝0.94 Utheo＝0.51     1.84
咖啡因/茶碱 P(non-imprint) Ucaff＝0.56 Utheo＝0.51     1.10
咪唑/哌嗪 P(imid) Uimid＝1.00 Upip＝0.20     5.00
咪唑/哌嗪 P(non-imprint) Uimid＝0.85 Upip＝0.56     1.52
萘心安/阿替洛尔 P(prop) Uprop＝0.94 Uaten＝0.27     3.48
萘心安/阿替洛尔 P(non-imprint) Uprop＝1.00 Uaten＝1.00     1.00
实施例9
依实施例1描述的两步骤乳液聚合方法，以咖啡因和茶碱模板分子进行表面分子刻印来探讨组成壳-核颗粒乳液外壳的单体种类的影响。
于4-吗啉乙磺酸一水合物缓冲液(pH6.0)中形成一含SDS表面活性剂的DVB交联的聚苯乙烯(1∶1)核心以制备核心颗粒。在磷酸苯氢油基酯(OPHP)与一单体，选自二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、甲基丙烯酸(MA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)和苯乙烯(ST)，存在下进行咖啡因和茶碱表面模板聚合作用以制成壳-核颗粒乳液。也在无模板分子存在下进行该两步骤乳液聚合以制备空白(无刻印)颗粒。依实施例5的叙述方法制备固相萃取容器含刻印壳-核颗粒，并且依实施例6的叙述测定咖啡因和茶碱的结合。这个研究的发现在表4报告。只有当外壳成分是EGDMA/OPHP时才观测得到一高选择性比率(1.84)，而且当用其它成分时选择性接近零。因而由EGDMA与OPHP构成的外壳聚合物层有利于本发明分子刻印的壳-核颗粒的构成。
表4：外壳成分对咖啡因与茶碱在壳-核颗粒树脂中选择性摄取
                           的影响
外壳(10nm)的单体成分                                   刻印树脂的分级摄取(U)P(caff)                        P(theo)                      P(空白)Ucaff          Utheo          Ucaff           Utheo          Ucaff          Utheo
EGDMA/OPHP(SDS)   0.94   0.51   0.57   0.48   0.56   0.51
MA/OPHP(SDS)   0.85   0.71   0.94   0.80   0.86   0.71
MMA/OPHP(SDS)   0.93   0.92   0.88   0.85   0.69   0.71
ST/OPHP(SDS)   0.90   0.81   0.91   0.79   0.90   0.80

Claims (10)

1.一颗粒，能特定地结合到一刻印分子，该颗粒具有一外壳其中含有和刻印分子相符合的空腔，而且具有一基本不含这种空腔的内核，以及颗粒中含有一两亲性物质。
2.按照权利要求1的颗粒，带有极性表面基团。
3.按照权利要求1或2的颗粒，其中其壳可由二甲基丙烯酸乙二醇酯与磷酸苯氢油基酯的聚合反应得到。
4.按照权利要求1或2的颗粒，其中其空腔是用可以溶解的刻印分子形成的。
5.按照权利要求1或2的颗粒，其中其外壳有1到100nm的厚度。
6.权利要求1到5任一项的颗粒作为分离一由该颗粒结合的靶分子的介质的用途。
7.权利要求1到5任一项的颗粒作为鉴定、纯化、定量或表征一由该颗粒结合的靶分子的介质的用途。
8.制备按照权利要求1到5任一项的颗粒的方法，包括步骤：
(a)在核心周围聚合刻印分子与聚合材料的混合物，以形成含刻印分子的外壳；并且
(b)移去该刻印分子以留下一相符合的空腔，
其中在所述混合物中含有所述两亲性物质，或该核心环绕包含所述两亲性物质的分子支架形成。
9.按照权利要求8的方法，其中步骤(a)在水介质中进行。
10.按照权利要求8或9的方法，其中步骤(b)包含清洗。
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