CZ295117B6

CZ295117B6 - Polymerní nosiče s vázanými sacharidy pro imobilizaci biologických systémů

Info

Publication number: CZ295117B6
Application number: CZ2003251A
Authority: CZ
Inventors: Jiří Ing. Csc. Labský
Original assignee: Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr
Priority date: 2003-01-27
Filing date: 2003-01-27
Publication date: 2005-05-18
Also published as: WO2004067732A2; WO2004067732A3; CZ2003251A3

Abstract

Polymerní nosiče s vázanými sacharidy pro imobilizaci biologických systémů, obecného vzorce PM-[R-X-(R.sup.1.n.-Y).sub.p.n.-Z].sub.n.n., kde PM je hydrofilní síťovaný polymer připravený radikálovou polymerizací a -[R-X-(R.sup.1.n.-Y).sub.p.n.-Z].sub.n.n. je obecně formulovaná struktura kde R je vybráno ze skukpiny: kovalentní vazba, -(CH.sub.2.n.).sub.a.n.-, -OCH.sub.2.n.CH.sub.2.n.-, -(OCH.sub.2.n.CH.sub.2.n.).sub.b.n.-, -C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -C.sub.6.n.H.sub.4.n.-CO-, -NH-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-CO-, -C.sub.6.n.H.sub.4.n.-NH-, -O-C.sub.6.n.H.sub.6.n.-O-CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.O-, X je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -O-, -.NY.(R.sup.2.n.)-, -CO-O-, -CO-NH-, -NH-CO-, -O-CO-O-, -NH-CS-NH-, -NH-CO-NH-, -O-NH-CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.CONH-, kde R.sup.2.n. je -H, alkyl C.sub.1.n. až C.sub.4.n. nebo acetyl, R.sup.1.n. je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -(CH.sub.2.n.).sub.a.n.-, -OCH.sub.2.n.CH.sub.2.n.-, -C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -(OCH.sub.2.n.CH.sub.2.n.).sub.b.n.-O-, -C.sub.6.n.H.sub.4.n.-CO-, -NH-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-CO-, Y je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -N(COCH.sub.3.n.)-, -NH-CS-NH-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -NH-CS-NH-(CH.sub.2.n.).sub.a.n.-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -NH-CS-NH-(CH.sub.2.n.).sub.a.n.-O-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -NH-CS-NH-(CH.sub.2.n.).sub.a.n.-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -NH-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-O-, -NH-C.sub.6.n.H.sub.4.n.-CO- a je 1 až 12, b je 1 až 200, p je 0 až 20, index n má takovou hodnotu, která zajišťuje koncentraci sacharidů v rozsahu 1x10.sup.-4.n. až 0,3 g na gram polymerní matrice, Z je vybráno z derivátů mannosy, derivátů galaktosy nebo derivátů laktosy. Polymerní nosiče s vázanými sac

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polymerních nosičů s kovalentně vázanými sacharidy pro dočasnou imobilizaci buněk s receptory pro manózu resp. galaktózu. Dále je vynález zaměřen na techniku přípravy těchto polymerních nosičů. Hlavní použití je využití receptorů keratinocytů pro kultivaci těchto buněk a přenos těchto buněk na popáleniny. Vynález navazuje na patenty J. Labský a kol.: „Polymerní nosič pro kultivaci keratinocytů“ (J. Labský a kol.: Pat. 292 883, J. Labský a kol: Pat. 292 491, J. Labský a kol.: Pat 292 570, J. Labský et al.: WO 9964563 (PCT/CZ/99/00017)).

Dosavadní stav techniky

Biologické systémy, jako jsou některé typy buněk, lektiny, buněčné toxiny, mají receptory, které umožňují dočasnou imobilizaci na povrchu polymerní matrice, která má na povrchu kovalentně vázané vhodné ligandy. Dočasně vzniklá vazba receptor-ligand umožňuje manipulaci s takto vzniklým komplexem, např. separaci, čištění, kultivaci nebo transport. Jedním z vhodných ligandů pro biologické receptory jsou chemicky vázané sacharidy např. manóza, galaktóza nebo disacharidy (laktóza). Téměř identické hydroxylové skupiny v molekule monosacharidů resp. disacharidů vyžadují speciální techniky pro přípravu polymerizovatelných derivátů respektive aktivaci sacharidových molekul pro modifikaci vhodných polymerních nosičů.

Nejčastěji se používají polymerizovatelné deriváty monosacharidů resp. disacharidů, kde hydroxylové skupiny jsou chráněny např. acetylací, benzoylací, benzylací, je možno využívat acetalové deriváty sacharidů resp. analogické izopropylidenové deriváty vzniklé kondenzací s ketony (aceton) a vhodnou chemickou modifikací je lze převést na polymerizovatelné deriváty. Polymery s kovalentně vázanými sacharidy, kde polymerizovatelné deriváty sacharidů vytvářejí homopolymery nebo jsou kopolymerizovány s hydrofilními monomery (2-hydroxyethyl methakrylát, akrylamid, methakrylamid, l-vinylpyrrolidin-2-on) nebo s monomery hydrofobními (styren, methyl methakrylát), je popsána celá řada. Některé typy sacharidových monomerů jsou uvedeny v následujícím stručném přehledu. V literatuře jsou popsány deriváty sacharidů, kde polymerizovatelná skupina je vázána přímo na molekulu sacharidu v poloze 1 (T. Kawasaki: US 4 465 827, 1984, D. K. Ray-Chaudhuri: US 3 356 652, 1967, Iwakura et al; J. Polym. Sci., Part A/l, vol. 6, 1625-32, 1968, T. Kawasaki: US 4 465 827, 1984).

Jsou popsány monomery, kde polymerizovatelné skupina je vázána na molekulu sacharidu v poloze 2, 3 (S. Kimura et al: Makromol. Chem. 58, 232, 1962, S. Kimura et al: Makromol. Chem. 50, 155, 1961) nebo 6 (M. Imoto et al: Makromol. Chem. 53, 210, 1962, N. P. Ivanova et al.: Zh. Prikl. Khim. (S.-Peterburg), 71(1), 114-118, 1998, W. A. P. Black et al: Makromol. Chem. 117, 210-14, 1968, W. A. P. Black: Carbohydr. Res. 5, 362-5, 1967, J. Klein: Makromol. Chem., Rapid Commun., 6, 675, 1985, S. Kimura, M. Imoto: Makromol. Chem. 50, 155 (1961), 53,210,(1962).

Aminoderiváty sacharidů, kde aminoskupina je vázána v poloze 2 nebo 6, jsou také často použity pro přípravu polymerizovatelných derivátů (E. Fanton, C. Fayet: Carbohydr. Res., 240, 143-52, 1993, J. Klein: Makromol. Chem., Rapid Commun. 6, 675, 1985, B. Badley et al: Macromol.

Chem. Phys. 198, 945-57, 1997, Suk Hyeong Cho et al: Korea polym. J. 6, 188-192, 1998, R. L. Whistler et al: J. Org. Chem. 26, 1583, 1961).

V literatuře lze nalézt jak vinylické, tak i metakryloylované deriváty i glykofuranové deriváty (W. A. P. Black et al: J. Chem. Soc. 1963, 4433, W. A. P. Black: Makromol. Chem. 71, 189, 1964).

Další, velmi často uváděná skupina polymerizovatelných monomerů využívá glykosidické vazby, kde se často uplatní distanční spojka-spacer-mezi molekulou sacharidu a polymerizovatelnou skupinou. V následujících ilustračních příkladech může být n = 2 až 12 a X nebo Y může být -0-, nebo -NH-, m je 2 nebo 3 (K. S. Kim et al: Korea Polym. J. 4, 16-22, 1996, S. R. Sarfati et al: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1., 1990, 1065-70, B. Helferich, K. H. Jung, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 311, 54, 1958, R. L. Whistler et al: J. Org. Chem. 26, 1583, 1961, J. Klein, D. Herzog: Makromol. Chem. 188, 1217-32, 1987, Η. P. Panzer, H. J. Roberts: J. Org. Chem. 26, 1583, 1961, Spaltenstein et al: JACS, 113, 686-9, 1991, T. Nakaya et al: J. Macromol. Sci., Macromol. Reports A30, 349-55, 1993, J. Coulon et al.: Bioconjugate Chem: 9, 152-159, 1998).

o^R * _R/Y O-(CH₂)_n-X-CCH

O^R

R q -V-.

^R (0CH₂CH₂)_m-O^

O

Oxazoliny, které lze připravit z 2-acetamido-2-deoxy sacharidů, snadno přecházejí na 2-acetamido-2-deoxy glykosidy, kde v aglykonu je možné zabudovat polymerizovatelnou skupinu. Zde je uvedena konkrétní příprava o)-(akryloylamino)alkyl-2-acetamido-2-deoxy-3-D-glukopyranosidu z 2-methyl-4,5-dihydro(3,4,6-tri-0-acetyl-l,2-dideoxy-a-D-glukopyranoso)[2,ld]-l,3-oxazolu za katalýzy 10-kafrsulfonové kyseliny (n = 3, 6) (S. R. Sarfati et al: J. Chem. Soc. Perkin Trans 1., 1990, 1065-70).

— ·► o^R

,.-O O °O(CH₂)_nNH-(

R ŇH /

o

V literatuře je popsána řada derivátů sacharidů, kde oxazolinový skelet sacharidu je možné přeměnit na vhodný prekurzor pro přípravu polymerních glykosidů (M. Okada, K. Aoi Jpn. Kokai

Tokkyo Koho JP 08259587, 1996), Jun-Ichi Kadokawa et al: Macromolecules 30, 8212-17, 1997).

Jako příklad disacharidů s jednou nebo více polymerizovatelnými skupinami je uveden příklad sacharózy (T. Furuike et al: Macromolecules 1995, 28, 7241-7, J. Chen et al: WO 98/51694), N. D. Sachinvala et al: Carbohydr. Res. 218, 1991, 237-45).

ho·^¹

HO

Aminocukr je možno navázat na rozpustný polymerní systém reakcí s aktivovaným esterem, například podle J. F. Bridges, R. Duncan, J. Kopeček: Int. J. Pharm. 44, 213-223, 1988.

Již tento stručný výčet polymerizovatelných monomerů, který v žádném případě nevyčerpal ani zdaleka všechny možnosti, ukazuje velkou variabilitu při přípravě polymerních nosičů, kde sacharidová jednotka, zabudovaná jako homopolymer nebo kopolymer sjinými monomery, má plnit funkci ligandů pro receptory biologických systémů. Zde je nutno upozornit na některé nedostatky takto připravených polymerních systémů.

Chráněné hydroxylové skupiny sacharidů často nejdou kvantitativně odblokovat.

Změnou obsahu sacharidu v kopolymerů se podstatně mění botnací charakteristika polymeru, a tím i mechanické vlastnosti polymerního systému.

Zřetelná nevýhoda polymerních nosičů pro využití jako kultivačních podložek pro imobilizaci nebo separaci biologických systémů, které vznikly jako kopolymery sacharidových monomerů s chráněnými hydroxylovými skupinami a hydrofilních nebo hydrofobních komonomerů, je skutečnost, že je nutno odstranit chránící skupiny. Polymery nebo kopolymery připravené za použití sacharidů, kde chránící skupiny byly odstraněny již před polymerizací, mají obdobné problémy. Špatná rozpustnost sacharidových monomerů v organických rozpouštědlech a komonomerech, nutnost polymerizovat většinou ve vodě, špatné mechanické vlastnosti vzniklých kopolymerů.

Různý obsah sacharidových jednotek v polymeru výrazným způsobem ovlivňuje mechanické vlastnosti polymerních systémů až do té míry, že vzniklé polymery jako kultivační podložky nelze použít. Další nevýhoda je, že likvidace chránících skupin v polymemím systému často není kvantitativní a navíc může ovlivnit strukturu polymeru.

Předložený vynález navrhuje použít jako matrice hydrofilní materiály, jak syntetické, tak z přírodních zdrojů, kde specifické ligandy jsou vázány modifikací povrchu nosiče resp. aktivací vhodných sacharidových derivátů a následnou reakcí s matricí. Za těchto podmínek probíhá reakce v povrchových vrstvách matrice a mechanické vlastnosti vzniklého polymerního systému jsou téměř identické s výchozím materiálem a množství vázaných sacharidů na povrchu lze regulovat.

-3 CZ 295117 B6

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou polymerní nosiče s vázanými sacharidy manózou, galaktózou nebo disacharidy, kde na neredukujícím konci disacharidu je manóza nebo galaktóza, které jsou kovalentně vázány na polymerní matrici za použití různých typů distančních spojek, čímž vytvářejí polymerní matrice vhodné pro kultivaci keratinocytů nebo dočasnou imobilizaci biologických systémů s receptory pro manózu a galaktózu obecného vzorce

PM-[R-X-(R’-Y)_p-Z]_n, kde PM je hydrofílní síťovaný polymer připravený radikálovou polymerizaci polymerizační směsi obsahující a) 1 až 99 hmotn. % monomerů resp. směsi monomerů a b) 0,1 až 10 hmotn. % síťovadla nebo směsi síťovadel a c) 0,01 až 10 hmotn. % radikálového iniciátoru a/nebo d) 0,1 až 40 hmotn. % rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel a obecně formulovaná struktura

-[R - X - (R¹ - Y)_p - Z]_n vznikla dodatečnou modifikací polymerní matrice, kde

R je nezávisle vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -(CH₂)_a-, -OCH₂CH₂-, -(OCH₂CH₂)_b-, -C₆H₄-O-, -c₆h₄-co-, -NH-C₆H₄-CO_, -C₆H₄-NH-, -O-C₆H₆-O-CH₂CH₂O-,

X je nezávisle vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -O-, -N(R²)-, -CO-O-, -CO-NH-, -NH-CO-, -O-CO-O-, -NH-CS-NH-, -NH-CO-NH-, -O-NH-CH2CH2CONH_, kde R² je -H, alkyl C] až C4 nebo acetyl,

R¹ je nezávisle vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -(CH₂)_a-, -OCH₂CH₂-, -C₆H₄-O-, -(OCH₂CH₂)_b-O-, -C₆H₄-CO-, -NH-C₆H₄-CO-,

Y je nezávisle vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -N(COCH₃)-, -NH-CS-NH-C₆H₄-O-NH-CS-NH-(CH₂)_a-C₆H₄-O-, -NH-CS-NH-XCH^-O-C^-O-, -NH-CS-NH-(CH₂)_aC₆H₄-O-, -NH-C₆H₄-O-, -NH-C₆H₄-COkde index «je v rozsahu 1 až 12, b je v rozsahu 1 až 200, index p je 0 až 20, index n je volen tak, že zajišťuje koncentraci sacharidů v rozsahu lxl0“⁴ až 0,3 g na gram polymerní matrice,

Z je nezávisle vybráno ze skupiny derivátů manózy, galaktózy a laktózy, které jsou uvedeny jako strukturní vzorce, kde vlnovka ukazuje připojení molekuly sacharidu, přičemž deriváty manózy jsou

-4CZ 295117 B6

-5CZ 295117 B6 deriváty galaktózy jsou

-6CZ 295117 B6 a deriváty laktózy jsou

Základním materiálem polymemích nosičů podle vynálezu jsou hydrofilní polymemí matrice u nichž se provede aktivace povrchu a následně aktivace sacharidů.

Polymemí matrice

Aktivace povrchových vrstev polymemích nosičů je s výhodou spojena s aplikací distančních spojek, protože při interakci polymemích systémů s biologickým materiálem se ve většině případů uplatňuje anténový efekt, který umožňuje kontakt receptorů s ligandem polymeru. Polymemí nosiče, vhodné pro přípravu kultivačních podložek modifikací jejich povrchu, mohou být přírodního (celulóza, algináty) nebo synthetického původu [(poly(vinylalkohol), poly(HEMA), atd.]. Vhodnost polymerů je určena několika parametry jako je botnavost, mechanické vlastnosti a v neposlední řadě přítomností reaktivních skupin, jako je hydroxylová, aminová nebo karboxylová. Biokompatibilita, inertnost, stálost v biologickém prostředí, nerozpustnost, sterilizovatelnost, nulová extrahovatelnost polymemích matric jsou další nutné předpoklady pro jejich použití.

Vhodné monomery pro přípravu polymemích nosičů podle vynálezu jsou 2-hydroxyethyl akrylát, 2-hydroxyethyl methakrylát (HEMA), 2-(2-hydroxyethoxy)ethyl akrylát, 2-(2hydroxyethoxy)ethyl methakrylát (DEGMA), tri-, tetra- a polyethylenglykol monoakryláty a methakryláty, glycerin akrylát a methakrylát, 2-hydroxypropyl akrylát a methakrylát, ω-hydroxyalkyl akryláty a methakryláty, ω-hydroxyalkylakrylamidy a methakrylamidy, ω-aminoalkylakrylamidy a methakrylamidy, glycidyl akrylát a methakrylát, jV-[2-hydroxy-l,l-bis(hydroxymethyl)ethyl]akrylamid a methakrylamid, kyselina akrylová a methakrylová, ω-akryloylaminoa methakryloylaminoalkanové kyseliny, akrylované a methakrylované a-aminokyseliny, 4vinylbenzoová kyselina, akryloylamino- resp. methakryloylaminobenzoové kyseliny, vinyl acetát, jV-alkylakrylamidy a methakrylamidy. Tento výčet monomerů pochopitelně není úplný a nijak neomezuje použití jiných monomerů běžných v tomto oboru.

Pro přípravu polymemích matric podle vynálezu lze použít jako síťovatel ethylen diakrylát a dimethakrylát, diglykol a oligoglykol diakryláty a dimethakryláty, ethylendiamin diakrylát a dimethakrylát, divinylmočovinu, l,l'-divinyl-3,3'-(ethan-l,l-diyl)bis(pyrrolidin-2-on), 2,3dihydroxybutan-l,4-diyl diakrylát nebo dimethakrylát a i jiná síťovadla běžně používaná v tomto oboru.

Pro iniciační reakci jsou vhodné radikálové iniciátory tepelné jako jsou azoiniciátory, diacylperoxidy a jiné typy peroxosloučenin, světelné iniciátory generující radikály UV zářením nebo redox iniciátory, které generují radikály na základě redukčně oxidační reakce.

V některých případech je vhodné při přípravě polymerní matrice použít rozpouštědlo jako je voda, alkoholy (methanol, ethanol, glykol, glycerin), dimethylformamid, dimethylsulfoxid, polyethylenglykoly, estery alifatických kyselin, monomethyl resp. dimethyl ethery glykolu a i jiná rozpouštědla, běžně používaná v oboru.

Forma a tvar polymerních matric mohou být různé. Běžné kultivační podložky jsou připravovány ve formách pro odlévání fólií, kde lze polymerizovat i za přítomnosti rozpouštědel. Pro některé účely je vhodnější připravit houbovité polymery, pěny, mikročástice nebo kuličky. Tyto techniky jsou v oboru známé a běžně používané a nejsou zde dále diskutovány.

Aktivace povrchu matrice

Radikálovou polymerizaci vzniká polymerní matrice, která má idealizovanou strukturu PM(R^a)p, kde PM představuje strukturu síťovaného uhlíkatého řetězce, který vznikl radikálovou polymerizaci, a skupina R^a představuje jakoukoliv funkční skupinu, která je součástí použitého monomeru resp. komonomeru. Struktura této části matrice odpovídá složení polymerizační směsi a funkční skupiny odpovídají složení vstupních monomerů R^a je nejčastěji reprezentováno skupinou -OH, -COOH, -CH2CH₂OH, -CH₂CH(OH)CH₃, -NH₂, -CH₂-NH₂, -C₆H4-COOH, -C₆H₄-OH, -C₆H₄-O-CH₂CH₂OH, -CONH(CH₂)_nCOOH, -C₆H₄-NH₂-, -COO-(CH₂)_nCOOH, -CONH(CH₂)_nNH₂. Tento výčet reaktivních skupin je pouze ilustrativní, v oboru je k dispozici řada dalších možností, které je nutno zahrnout do tohoto přehledu.

Celkové množství funkčních skupin označených R^a není využito pro modifikační reakce vedoucí k navázání distančních spojek a k následné reakci s aktivovanými sacharidy. Tyto reakce se odehrávají v povrchových vrstvách matrice a neovlivňují významně mechanické vlastnosti matrice. Při využití dostupných reaktivních skupin matrice a následné reakci se sacharidy dochází často k povrchovému jevu zvanému „pomerančový efekt“. Tento efekt spočívá v tom, že navázáním molekul výrazně odlišného charakteru (sacharidu) od struktury matrice dojde při botnání k popraskání povrchu matrice vlivem odlišné botnací charakteristiky ligandů a struktury matrice.

Modifikovaná matrice má idealizovanou strukturu PM-(R^b-X^b)_x, kde obecné označení -R^b-X^bpředstavuje strukturu povrchu matrice po modifikační reakci a samozřejmě jejich koncentrace je nižší než původně zavedené skupiny obecně označené -R^a. Symbol X^b představuje reaktivní skupiny resp. distanční spojku, tak jak je popsáno dále. Případné opakování modifikační reakce stejnými sloučeninami nebo jinými sloučeninami (např. diazotace a kopulace, vznik aktivovaného esteru) je zahrnuto do tohoto obecného vyjádření.

Aktivace aminoskupiny a hydroxylové skupiny

Aktivaci hydroxylu resp. aminoskupiny lze uskutečnit reakcí s dvoufunkčními reaktivními systémy, např. dichloridem nebo chlorid-esterem dikarbonové kyseliny, jako jsou dikyseliny obecného vzorce HOOC-Q-COOH, kde Q představuje dvoj funkční alifatický řetězec, rozvětvený alifatický řetězec, cykloalkandiyl, cykloalkendiyl, benzendiyl, furandiyl, oxidi(2,l-ethandiyl), diizokyanáty obecného vzorce OCN-T-NCO a diizothiokyanáty SCN-T-NCS, kde T představuje dvoufunkční alifatický řetězec, 1,4-cyklohexandiyl, methandi(benzen-4,l-diyl), oxydi(benzen-4,l-diyl, methandi(cyklohexan-4,l-diyl). Jinou možností aktivace hydroxylové nebo aminoskupiny je bromkyan, fosgen, difosgen, chlorkarbonyl estery alifatických alkoholů, rozvětvených alifatických alkoholů, cyklických alkoholů, dále karbonyl diimidazol resp. jiné deriváty kyseliny uhličité běžně v oboru používané. Takto upravený povrch matrice reaguje v dalším kroku selektivně s alifatickou aminoskupinou (J. Drobník, J. Labský, H. Kudlvasrová, V. Saudek,

-8CZ 295117 B6

F. Švec: Biotechnol. Bioing. 2, 487, 1982, J. Drobník, J. Kálal, J. Labský, V. Saudek, F. Švec: AO 204 190, US 4 245 064, 1979, K. Takeda, H. Ogura: Synt. Commun. 12, 213, 1982, K. Takeda et al: Tetrahedron Letters 24, 4569, 1983, N. Nimura et al.: Anal. Chem. 58,2372, 1986).

Aktivaci povrchu lze opakovat, takže výsledné struktury mohou být např.:

^O°(CH₂)ř?-NH<CH2)n-NH-CO-O-^2)

O

0-^ΝΗ-(ΟΗ2)_η·ΝΗΟΟΟ0

- O-LNH-tCHJnNH-COCHíCI

O

Vznik a aktivace karboxylové skupiny

Karboxylové skupiny je možno zabudovat do polymerního nosiče za použití vhodného polymeio rizovatelného monomeru, jako je např. kyselina akrylová, methakrylová, maleinanhydrid, ωakryloylaminoalkanové kyseliny, ω-methakryloylaminoalkanové kyseliny nebo dodatečnou modifikací jiných reaktivních skupin. Modifikace polymerního povrchu reakcí cyklických anhydridů s aminoskupinou resp. hydroxylovou skupinou nosiče poskytuje karboxylové skupiny <·—NH₂ —

ÚOH-*

OH —

^NH-CO-NH-(CH₂)_n-NH

O •Lqh

Jinou možností je reakce polymemí matrice s vhodným derivátem dikarbonové kyseliny, jako je dichlorid nebo aktivovaný ester. Jako vhodné alkoholy pro tyto aktivované estery jsou např.

-9CZ 295117 B6

4-nitrofenol, pentachlorfenol, pentafluorfenol, 2,4-dinitrofenol, N-hydroxysukcinimid, Nhydroxyftalimid, l-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidin-3-sulfonová kyselina a jiné, v oboru používané sloučeniny. Při užití přebytku reagujícího činidla reaguje převážně jedna skupina dikarbonové kyseliny, druhou je možno využít pro reakci s alifatickou aminoskupinou, např. sacharidu.

F F

Aktivace samotného karboxylu má několik možností. Snadná je přeměna karboxylu na chlorid kyseliny působením např. thionylchloridu, chloridu fosforitého, chloridu fosforečného, oxalylchloridu aj. Podmínkou je, aby polymemí nosič byl inertní (A. K. Ghost et al.: Tetrahedron Letters 33, 2781, 1992, J. P. Greenstein. M. Winitz: Chemistry of the Aminoacids, J. Wiley, N.Y., 1961)

P O	j O
\|----O^vvwvvwJl—OH J\|	►· 5-----Ο'ΆΛΓΥΛΛΛτΙΙ--C\| f

Jiná možnost aktivace karboxylu je transformace esteru kyseliny na hydrazid kyseliny a dále přeměna na azid. Reakce se provádí působením hydrazinu nejčastěji na ester kyseliny a následnou reakcí s dusitanem sodným nebo nitrososloučeninou (J. P. Greenstein, M. Winitz: Chemistry of the Aminoacids, J. Wiley, N.Y., 1961). Hydrazid je také možno připravit reakcí kyseliny s hydrazinem za aktivace karbodiimidy (J. Drobník, J. Kálal, J. Labský, V. Saudek, F. Švec: AO 204 190, US 4 245 064, 1979).

Často používaná aktivace karboxylové skupiny, a také zřejmě nej šetrnější pro polymemí nosič, se provádí aktivací karbodiimidy nebo analogickými sloučeninami, kdy jako meziprodukt je aktivovaný ester. Tato technika je dokonale propracovaná, nabízí práci ve vodném i organickém prostředí a výtěžky kondenzační reakce se často pohybují nad 80 %. Jako příklad je zde uveden meziprodukt, vzniklý reakcí karboxylu s dicyklohexylkarbodiimidem za chlazení reakční směsi (Μ. K. Dhaon et al: J. Org. Chem. 47, 1962, 1982, J. C. Sheehan et al: J. Am. Chem. Soc. 95, 875, 1973).

Elegantní a s velmi dobrými výtěžky pracující je metoda směsného anhydridu, která spočívá v reakci alkyl chlorokarbonylesterů s karboxylem v přítomnosti terciárního aminu (J. P. Greenstein, M. Winitz: Chemistry of the Aminoacids. J. Wiley, N.Y., 1961). Acylace probíhá selektivně pouze s použitou kyselinou, deriváty kyseliny uhličité se reakce nezúčastní.

Jednou z výhod této reakce je to, že vedlejší produkty jsou alkohol (v případě R= ethyl je vedlejší produkt ethanol) a oxid uhličitý.

-10CZ 295117 B6

Moderní prostředky pro aktivaci karboxylů např. vodorozpustný N-(3-dimethylaminopropyl)N'-ethylkarbodiimíd (EDC) (R. R. Fischer: J. Biol. Chem. 256, 8963, 1981, Abdeloty et al: Lett. Pept. Sci., 1, 57, 1994, R. Knorr et al.: Tetrahedron Lett. 30, 1927, 1989, V. Dourtoglou et al.: Synthesis 572, 1984) nebo kondenzační činidla na bázi 0-(benzotriazol-l-yl)-7V,A/7V(7V-tetramethyluronium tetra- resp. hexafluorofosfátu (HBTU), O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'tetramethyluronium hexafluorofosfát (HATU), benzotriazol-l-yloxy(dipiperidinkarbenium hexafluorofosfát)HBPipU atd. jsou velmi účinné, pro větší rozšíření těchto kondenzačních metod je na závadu jejich vyšší cena. Za zmínku stojí i N-ethyl-5-fenylizoxazolium-3'-sulfonát (Woodwardovo činidlo), který snadno aktivuje karboxyl a je jednou z cest k vytváření amidové vazby (R. B. Woodward et al: J. Am. Chem. Soc. 83, 1007-9, 1961, R. B. Woodward et al: J. Am. Chem. Soc. 83, 1010-12, 1961) nebo 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolin (EEDQ) (B. Belleau et al: J. Am. Chem. Soc. 90, 1651, 1968, J. Klein, D. Herzog: Makromol. Chem. 188, 1217-32, 1987, R. Roy: Topics in Current Chemistry 187, 242-271, 1997), který reaguje analogicky. Výčet těchto činidel není konečný, lze použít i analogická činidla používaná v oboru.

Aktivace aromatickými aminy a fenoly

Pro aktivaci polymemí matrice aromatickými aminy nebo fenoly lze použít řadu reakcí, které umožní zabudovat aromatický systém vhodný pro diazotaci nebo kopulaci. Příklady těchto sloučenin jsou

takže výsledné polymemí matrice vhodné pro kopulaci s diazoniovými solemi mají následující strukturu, například

Aktivace sacharidů

D—manóza a D—galaktóza, resp. jejich 2—amino—2—deoxy deriváty se velmi často vyskytují v přírodních materiálech. Tyto sacharidové jednotky jsou často situovány na neredukujícím konci sacharidových řetězců a jsou klíčovými sacharidy pro interakci s aktivními centry biologických systémů. Sacharidy vázané na polymemí matrice mají strukturu α, β-, nebo je to nejčastěji směs

-11 CZ 295117 B6 izomerů v závislosti na charakteru použitých reakcí. Tyto strukturní podrobnosti není možné na matrici zjistit a nejsou na závadu použití matric.

Popisované modifikace sacharidových molekul často používají chránící skupiny pro hydroxylové skupiny sacharidů. Pro stručnou prezentaci jsou ve strukturních vzorcích vynechány. Konečná úprava povrchu matrice samozřejmě předpokládá odstranění těchto chránících skupin. Způsoby odstranění jsou v oboru běžné a nejsou zde uvedeny.

Redukující částí disacharidů je míněna ta část molekuly disacharidu, kde je pouze poloacetalová vazba v pyranovém cyklu sacharidu a která snadno podléhá hydrolýze a vzniklá aldehydická skupina podléhá následným reakcím, např. reduktivní aminaci.

Aminoderiváty manózy a galaktózy

Vedle komerčně dostupných 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranózy a galaktózy je možno použít mannósyl- laktosyl- a galaktosylamin, látky snadno připravitelné z manózy, laktózy resp. galaktózy reakcí s amoniakem, hydrogenuhličitanem amonným nebo uhličitanem amonným (L. M. Likhosherstov et al: Izv. Acad. Nauk, Ser. Khim. 8, 1461, 2000, R. Duncan et al: J. Control Rel. 10, 51-63, 1989, T. Rademacher, I. D. Manger: US 5 280 113).

Tyto aminoderiváty jsou poměrně nestálé, stabilizaci zajistí tvorba amidové vazby. Deriváty vhodné pro modifikaci polymerních nosičů jsou např. l-[(co-aminoalkyl)acylamino]-l-deoxyD-mannopyranosidy nebo l-(ú)-aminoalkanoylamino)-l-deoxy-D-mannopyranosidy (J. J. Garcia-Lopez et al: Chem. Eur. J., 5, 1775-1784, 1999, JA. Y. Chemyak et al.: Carbohydr. Res. 223, 303-9, 1992) resp. analogické deriváty galaktózy:

o

NH-^CH^nNHs

Mannosylamin, galaktosylamin a laktosylamin je možno připravit také redukcí příslušného azidu. Takto se připraví i O-acetylovaný nebo O-benzoylovaný derivát, který po redukci a navázání na polymerní matrici lze snadno deacetylovat methanolickým methanolátem sodným.

Pro mannosylační reakci byl také použít derivát methyl-6-amino-6-deoxy-D-mannopyranóza, který je dostupný z methyl-a-D-mannopyranosidu tosylací a následnou reakcí s azidem sodným a redukcí (A. L. Cimecioglu et al: Macromolecules, 30, 55-6, 1997, R. Roy et al: GlycoconjugateJ. 15,251-63, 1998).

- 12CZ 295117 B6

Často používaný derivát manózy je 2-aminoethyl-P-D-mannopyranosid, který lze připravit několika cestami, například (A. Y. Cherniak et al: Carbohydr. Res. 223, 303-9, 1992, A. Y.

Cherniak et al: Glycoconjugate J. 8, 82-9, 1991, Patel et al: J. Org. Chem. 2002, 79-86, 5 J. M. Kim, R. Roy: J. Carbohydr. Res. 16, 1281-92, 1997):

Reakci je možno rozšířit na halogenované alkoholy obecného vzorce

Jako vznik aminu na sacharidové jednotce lze považovat i reduktivní aminaci, kdy jako zdroj 10 aldehydu se použije redukující část disacharidů

R—NHj

Jiná možnost, v oboru dosti často používaná, je adice 2-aminoethanthiolu na dvojnou vazbu akrylamidových nebo allylových derivátů, např. (M. G. Baek et al: Biomacromolecules 1, 768-770, 2000):

- 13 15

Karboxyderiváty sacharidů

Byla připravena řada glykosidů, kde v aglykonu sacharidové molekuly je karboxylová skupina, např. methyl 8-[l-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-mannopyranosyl)]oktonát (Β. M. Pinto et al: Carbohydr. Res. 124, 313-18, 1983, K. Wada et al: J. Carbohydr. Chem. 13, 941-65, 1994). Ester lze přeměnit na deriváty vhodné pro reakci s aktivovanou matricí (karboxyl, aktivovaný ester, hydrazid, karbonylazid) (R. U. Lemieux, DA Baker: Can. J. Biochem. 55, 507-12, 1977).

Karboxylová skupina může být generována i na jiném místě molekuly sacharidu, např. reakcí aminoskupiny s cyklickým anhydridem dikarbonových kyselin:

Mannosylamin a galaktosylamin lze snadno transformovat na deriváty, které lze použít pro reakci s aktivovanou matricí, jako jsou (T. Rademacher: US 5 280 113, I. D. Manger: EP 0413675, H. Parot Lopez et al: Tetrahedron, Letters 33, 209-13, 1992, D. Vetter: Bioconjugate Chem. 6, 319-22,1995, J. R. Rasmussen: US 5 283 353):

N-sukcinimidyl-glykopyranosidy jsou deriváty sacharidů, které při reakci s aminoskupinou matrice vytvářejí rovnou distanční spojku (J. M. Kim, R. Roy: J. Carbohydr. Res. 16, 1281-92, 1997, S. Cao, F. D. Topper, R. Roy: Tetrahedron 51, 6679-86, 1985):

Izothiokyanáty sacharidů

Sacharidy modifikované izothiokyanátovou skupinou jsou velmi rozšířené pro tvorbu glykosylovaných derivátů. Paracetylovaná mannóza tvoří krystalický derivát (B. Konig et al: Tetrahedron Letters, 39, 2307-10, 1998, J. Kerekgyarto et al: Carbohydrate Res. 297, 1997, 107-15)

Z 4-nitrofenyl α-D-manopyranosidu lze připravit redukcí nitroskupiny a následnou reakcí s thiofosgenem 4-izothiokyanátofenyl α-D-mannopyranosid. Analogický derivát byl připraven z ω-aminoalkyl-a-D-manopyranosidu (C. R. Broom et al: Meth. Enzymol. 28, 212-19, 1972, D. F. Smith et al: Meth. Enzymol. 50, 163-75, 1978, S. Kotteer: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1., 2193, 1998)

Byly popsány izothiokyanáty, které mají mezi aromatickým jádrem a sacharidem distanční spojku, např. (M. Andersson et al: Bioconjugate Chem. 4, 246-9, 1993):

x = —o—

-^NH^ o

Trichloracetimidáty sacharidů

V chemii cukrů je věnována právem velká pozornost chemii trichloracetimidátů, kde vysoké výtěžky a jednoduchá příprava zaručují značné rozšíření této metody pro přípravu glykosidických derivátů (R. R. Schmid: Prep. Carbohydr. Chem., 283-312. Edited by: Hanessian, Stephen Dekker: New York, N. Y. 1997). Reakce s hydroxylovou skupinou matrice je naznačena schematicky:

Thioderiváty

Relativně snadná příprava a podstatně vyšší reaktivita-SH skupiny umožňují rozšířit paletu reaktivních derivátů sacharidů (P. H. Weigel et al: J. Biol. Chem, 254, 10830-8, 1979, S. Chipowsky et al: Carbohydrate Research 31, 339-346, 1973, G. Pastuch et al: Tetrahedron Letters 41, 9923, 2000, F. M. Ibatullin et al: Synthesis 419, 2001).

HO HO HO

Je nutno se zmínit i o amidinech, které lze snadno připravit reakcí 2-amino-2-methoxyethyl 1thioglykopyranosidů s aminy (Y. C. Lee, C. P. Stowell, M. J. Krantz: Biochemistry 15, 3956, 1976)

-15CZ 295117 B6

Thioderiváty v alkalickém prostředí reagují velice snadno s haloacetylderiváty, jako např. (H. W. I. Peerlings et al: Eur. J. Org. Chem., 1879-86,1998)

Laktony

O-p-galaktopyranosyl-(l->4)-D-glukono-í,5-lakton reaguje s alifatickou aminoskupinou za vzniku amidu (K. Aoi et al: Macromolecules 28, 5391, 1995). Analogicky reagují di- a oligosacharidy, které mají v neredukující části manózu.

Benzendiazonium deriváty

Aminofenyl deriváty sacharidů a disacharidů lze přeměnit na diazoniové sole, které je možno kopulovat s biologickým materiálem, který obsahuje skupiny (tyrosin) které podléhají kopulační reakci. Této skutečnosti je možno použít pro navázání vhodných derivátů na matrice, které mají navázané fenoly, např. (C. P. Stowell, Y. C. Lee: Advances Carbohydr. Chem. 37, 225-281, 1980, M. Wichek et al: PCT Int. Appl. WO 2000027814 Al, 2000):

Tento stručný výčet možností přípravy polymerních částic s vázanými mono- a di-sacharidy je pouze ilustrační, v žádném případě neomezuje použití analogických reakcí pro přípravu matric, které lze použít pro dosaženou imobilizaci buněk sreceptory pro manózu a galaktózu.

-16CZ 295117 B6

Příklady provedení

Příklad 1 g (0,5 mol) tetraethylenglykolu se smíchá za chlazení s methanolátem sodným (11,5 g sodíku v 200 ml methanolu) a methanol se odpaří za vakua, reakční směs se zředí 300 ml acetonu a za chlazení na 0 °C se přikape 50 g (0,5 mol) methakryloylchloridu během 30 min. Reakční směs se 24 hod nechá stát, usazený chlorid sodný se odfiltruje a těkavé podíly se odpaří za vakua. Složení: 59 % hmotn. tetraethylenglykolu, 34 % hmotn. monomethakryloyl tetraethylenglykolu, 5,9 % hmotn. dimethakryloyl tetraethylenglykolu.

Příklad 2 g (0,5 molu) triethylenglykolu se smíchá za chlazení s methanolátem sodným (11,5 g sodíku v 200 ml methanolu) a methanol se odpaří za vakua, reakční směs se zředí 300 ml acetonu a za chlazení na 0 °C se přikape 50 g (0,5 mol) methakryloylchloridu během 30 min. Reakční směs se 24 hod nechá stát, usazený chlorid sodný se odfiltruje a těkavé podíly se odpaří za vakua. Složení: 57 % hmotn. triethylenglykolu, 26 % hmotn. monomethakryloylderivátu, 5,1 % hmotn. dimethakrylátu.

Příklad 3 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 25 ml směsi obsahující monomethakryloyl tetraethylenglykolu (příklad 1.), 1 ml Darocur 1173 (CIBA) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Polymerizační směs byla osvětlována 20 min UV lampami Philips o celkovém výkonu 160 W ze vzdálenosti 20 cm. Fólie byla extrahována v 30 % směsi ethanol/destilovaná voda a následovně v destilované vodě a usušena.

Příklad 4 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 0,3 ml ethylen dimethakrylátu, 0,6 ml Darocuru 1173 (CIBA) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Polymerizační směs byla osvětlována 20 min UV lampami Philips o celkovém výkonu 120 W ze vzdálenosti 20 cm. Fólie byla extrahována 30% ethanolem a vodou.

Příklad 5 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 20 ml monomethakryloyl triethylenglykolu (příklad 2), 1 ml Darocuru 1173 (CIBA) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Polymerizační směs byla osvětlována 20 min UV lampami Philips o celkovém výkonu 120 W ze vzdálenosti 20 cm. Fólie byla extrahována 30% ethanolem a vodou. V nabotnalém stavu byla vysekána kolečka o průměru 21 mm.

Příklad 6 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 5 g kyseliny 7-methakryloylaminoheptanové, 0,2 g Irgacure 2959 (CIBA) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Polymerizační směs byla osvětlována 20 min UV lampami Philips

- 17CZ 295117 B6 ocelkovém výkonu 120 W ze vzdálenosti 20 cm. Fólie byly extrahovány 30 % methanolem a destilovanou vodou.

Příklad 7 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 10 ml 2,3-dihydroxypropyl methakrylátu, 5 ml dimethylakrylamidu, 0,4 g Irgacure 2929 (CIBA) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,8 mm. Polymerizační směs byla osvětlována 25 min UV lampami Philips o celkovém výkonu 120 W ze vzdálenosti 220 cm. Fólie po extrakci 25 % methanolem a vodou byly usušeny.

Příklad 8 ml 3-hydroxypropyl methakrylátu, 10 ml 2-methoxyethyl methakrylátu, 15 ml směsi obsahující methakryloyl tetraethylenglykol (příklad 1), 0,26 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrilu) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Polymerizační směs byla zahřívána postupně od 48 do 62 °C po dobu 11 hodin. Fólie před použitím byly extrahovány 30 % methanolem a vodou.

Příklad 9 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 20 ml monomethakryloyl diethylenglykolu, 0,38 g 4,4'-azobis(4-kyanovalerové kyseliny) bylo probubláno dusíkem (11 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Polymerizační směs byla postupně zahřívána od 50 do 63 °C po dobu 12 hodin, po vyjmutí z formy byla fólie extrahována 30 % methanolem, vodou a usušena.

Příklad 10 ml l-vinylpyrrolidin-2-onu, 20 ml 2-hydroxyethyl akrylátu, 15 ml 4-hydroxybutyl methakrylátu, 2 ml 2-{[(vinyloxy)karbonyl]oxy}ethyl methakrylátu, 1 ml Darocur 1173 (CIBA) bylo po probublání oxidem uhličitým (10 min) nalito do formy pro přípravu fólií (síla 1,8 mm) a osvětlováno 15 min zdrojem UV světla (120 W) ze vzdálenosti 22 mm. Připravené fólie byly extrahovány standardním způsobem.

Příklad 11 ml 2-hydroxypropyl methakrylátu, 25 ml HEMA, 3 ml triethylenglykol dimethakrylátu, 10 ml glycerin methakrylátu (směs izomerů), 10 ml 2-acetoxyethyl methakrylátu, 1 g Irgacure 2959 (CIBA) bylo probubláno 15 min. dusíkem, naplněno do forem pro přípravu fólií a osvětlováno 23 min zdrojem UV záření (100 W) ze vzdálenosti 25 mm. Připravené fólie byly extrahovány standardním způsobem.

Příklad 12 ml 2-hydroxypropyl methakrylátu, 20 ml HEMA, 10 g 6-aminohexyl methakrylamidu, 0,7 g Darikur 1173 (CIBA) se po probublání dusíkem (15 min) naplní do forem pro přípravu fólií (1,5 mm) a osvětluje se zdrojem UV záření (120 W) ze vzdálenosti 20 cm. Fólie se vyperou běžným způsobem.

-18GZ 295117 B6

Příklad 13 ml HEMA, 30 ml poly(ethylenglykol) monomethakrylátu (Polyscience, lne, n = 200), 2 ml diethylenglykol dimethakrylátu, 0,7 ml Darocur 1173 (CIBA) bylo po probublání argonem (15 min) naplněno do formy pro přípravu fólií (1,6 mm) a osvětlováno 20 min zdrojem UV záření (120 W) ze vzdálenosti 25 cm. Zbytky monomerů po polymerizaci byly odstraněny extrakcí fólie 30 % ethanolem a vodou.

Příklad 14 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 10 ml 2-methoxyethyl methakrylátu, 2 ml ΛζΑ-dimethylakrylamidu, 2.1 g V-{6-{[2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl}akrylamidu 0,4 g Darocur 1173 (CIBA) bylo probubláno argonem (10 min) a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm ozařováním UV světlem jako v příkladu 7.

Příklad 15 ml 2-hydroxyethyl methakrylátu, 15 ml 2-methoxyethyl methakrylátu, 2 g 7V—{12—[(l,3-dioxo-izoindolin-2-yl)oxy]-12-oxodecyl}methakrylamidu 0,6 ml Darocur 1173 (CIBA) bylo probubláno argonem a umístěno do formy, která umožnila přípravu fólií síly 1,6 mm. Směs monomerů byla ozařována UV světlem jako v příkladu 7.

Příklad 16

Polymer připravený podle příkladu 3 (kolečka vysekaná vnabotnalém stavu, průměr 21 mm, váha 5 g suchého polymeru) byla ponořena do roztoku 30 ml toluenu, 5 ml pyridinu, 10 ml acetonu a 3 g 4-nitrofenyl chlorokarbonátu na dobu 48 hodin. Polymer byl 3x opláchnut acetonem (celkem 200 ml) a usušen.

Příklad 17 g polymeru připraveného podle příkladu 9 se ponoří do roztoku 3,5 g 2-[(chlorokarbonyl)oxy]izoindolin-l,3-dionu v 50 ml směsi aceton-dioxan 1:1 a 5 ml triethylaminu. Za 24 hod. byla reakční směs odstraněna, produkt opláchnut postupně dioxanem, acetonem a usušen.

Příklad 18 g polymeru vzniklého z 2-hydroxyethyl methakrylátu (připraveno podle př. 4) bylo ponořeno do roztoku fosgenu (10 g) v toluenu (65 ml) na dobu 24 hod. Polymer byl po reakci opláchnut 3x acetonem a usušen.

Příklad 19 g polymeru podle příkladu 14 se smíchá s roztokem 1,1 g 2,2'-oxidiethylaminu dihydrochloridu, 1,2 g hydrogenuhličitanu sodného, 5 ml vody, 1,5 ml dimethylsulfoxidu a nechá se reagovat 24 hodin. Po skončení reakce se polymer opláchne vodou, ethanolem a vodou a usuší.

-19CZ 295117 B6

Příklad 20

Polymer připravený podle příkladu 18 (6 g, kolečka o průměru 11 mm) se ponoří do roztoku 5 g hexamethylendiaminu v 30 ml dioxanu. Za 24 hod se reakční směs odstraní a polymer se dokonale opláchne směsí 30 % methanolu s 0,5 % hydrogenuhličitanu sodného.

Příklad 21 ml HEMA, 10 ml vody, 0,3 g methylenbisakrylamidu, 2 ml 10 % roztoku persulfátu amonného, 2 ml roztoku tetramethylethylendiaminu (10 %) v methanolu se smíchá a nalije do formy pro přípravu fólií. Za 24 hod se gel vypere vodou a usuší.

Příklad 22 g polymeru připraveného podle př. 14 v podobě 1,3 mm silné fólie byl ponořen do roztoku 0,5 g 4-(2-aminoethyl)anilinu v 20 ml dioxanu. Reakční směs byla odstraněna za 48 hod., polymer byl extrahován (2 dny) v roztoku 30 % methanolu s přídavkem 5% hydrogenuhličitanu sodného.

Příklad 23

Fólie připravená ze směsi 10 g HEMA, 0,7 g kyseliny 6-methakryloylaminokapronové podle příkladu 6 (čtverečky 2x2 cm, síla 1,6 mm, váha 5 g), nabotnána ve směsi 5 ml izopropanolu a 15 ml vody, reakční směs byla ochlazena na 0 °C a bylo přidáno 1,5 g A-(3-dimethylaminopropylj-V-ethyl karbodiimidu. Za 1 hod. bylo přidáno 3 ml hexamethylendiaminu. Reakční směs za 24 hod (teplotě místnosti) byla odstraněna a polymer byl extrahován 30% methanolem s 1% kyseliny octové a nakonec 1% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a usušen.

Příklad 24

Kolečka (průměru 17 mm, váha 1,5 g) připravená podle příkladu 17 se pokryjí roztokem 0,35 g N-glycyl-l-amino-l-deoxy-a-D-mannopyranosidu v 3 ml vody a 1,5 ml dimethylsulfoxidu. Reakce byla zastavena za 2 dny opláchnutím v přebytku destilované vody.

Příklad 25

Podle př. 13 byla připravena kolečka (průměr 18 mm, 5 g) ke kterým se přidala směs 1 g 4-nitrofenyl chlorokarbonátu, 10 ml dioxanu, 1 ml pyridinu a 0,1 g 4-dimethylaminopyridinu. Za 24 hod se fólie opláchnou 3x acetonem, ethanolem a vodou, přidá se 0,5 g 6-aminohexyl-ot-Dmannopyranosidu ve směsi 5 ml vody a 3 ml dimethylsulfoxidu. Za dva dny je reakce zastavena opláchnutím 30 % methanolem a extrakcí 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 dny) a destilovanou vodou (dva dny).

Příklad 26

Polymerní kultivační podložky (síla 1,3 mm, 2,1 g) připravené podle příkladu 10 se pokryjí roztokem 1 g 4-nitrofenyl chlorokarbonátu, 10 ml dioxanu a 2 ml pyridinu. Za 2 dny se polymerní matrice opláchne dokonale směsí aceton, dioxan a dichlormethan. Matrice se nechá reagovat se

-20CZ 295117 B6 směsí 0,4 g 2-amino-2-deoxy-a-D-galaktózy ve směsi 3 ml vody a 1 ml dimethylformamidu. Reakce byla zastavena za dva dny opláchnutím vodou, směsí methanol-voda (1:1) a vodou.

Příklad 27

Polymemí matrice 2 x 2 cm připravené podle příkladu 22 (síla 1,8 mm, váha 5,6 g) byla navlhčena směsí thiofosgen (2 g) a aceton 10 ml. Reakce byla zastavena za 2 dny opláchnutím fólie 3 x acetonem a usušena.

Příklad 28

K polymemí matrici připravené podle příkladu 18 (kolečka průměru 16 mm, síla 1,3 mm, 5 g) byl přidán roztok 1,2 g methyl-6-amino-6-deoxy-a-D-mannopyranosidu a 0,2 g 4-dimethylaminopyridinu ve 12 ml vody a 3 ml dimethylsulfoxidu. Reakce byla ukončena za 2 dny opláchnutím fólie vodou a usušením.

Příklad 29

Roztok připravený z 1 g 7V-ethyl-/V'-(3-dimethylamino propyl) karbodiimidu, 0,5 g 1-hydroxybenztriazolu a 0,5 g (5-kaproxypentyl)-a-D-manopyranosidu v 20 ml (zpočátku chlazeno na 5 °C) se za 30 min. přidá k polymemí fólii připravené podle příkladu 19 (5 g, kolečka průměru 19 mm, síla 1,8 mm). Reakční směs stála za laboratorní teploty dva dny. Následovalo opláchnutí acetonem, methanolem a vodou.

Příklad 30

Polymemí fólie připravená podle příkladu 12 se převrství roztokem aceton/izopropanol 1:1 (10 ml) s 1,3 g (4-izothiokyanátofenyl)-a-D-mannopyranosidu. Za 2 dny byl polymemí film opláchnut 3x acetonem a 2x methanolem, vodou a usušen.

Příklad 31

Polymer připravený podle příkladu 20 (6 g, kolečka o průměru 11 mm) se pokryje roztokem 1,8 g 0-P~galaktopyranosyl-(l->4)-D-glukono-l,5-laktonu a 0,1 g 4-dimethylaminopyridinu v 10 ml směsi dioxan-voda 1:1. Reakce je zastavena za dva dny, fólie se opláchne dioxanem, methanolem a vodou.

Příklad 32

Polymemí podložka připravená podle příkladu 17 (kolečka průměru 15 mm, 5 g, síla 1,8 mm) se smíchají s 1,2 g 2-aminoethyl-a-D-mannopyranosidu ve směsi 5 ml dimethylformamid a 8 ml vody. Reakční směs stála 3 dny, pak byla opláchnuta vodou, 30 % methanolem a vodou.

Příklad 33 koleček suché polymemí fólie o síle 1,1 mm a průměru 11 mm, připravené radikálovou polymerizací podle příkladu 3, se vloží do roztoku 1 g 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-mannopyranosyl

-21 CZ 295117 B6 trichloroacetimidátu rozpuštěného v 12 ml acetonitrilu za chlazení na 5 °C a katalýzy 1 ml diethyl ether - bortrifluoridu. Reakční směs se chladí na 0 °C 2 hod za občasného protřepání. Reakce se ukončí přidáním 20 ml 5% roztoku hydrogenuhličitanu sodného, polymer se opláchne vodou a usuší.

Příklad 34

Fólie podle příkladu 12 (váha 3,7 g, průměr koleček 18 mm, síla 1,8 mm) se smíchá s roztokem 1,1 g 2,3,4,6-tetra-O-acetylmannopyranosyl izothiokyanátu v 15 ml dichlormethanu za laboratorní teploty. Za 24 hod byla fólie opláchnuta dichlormethanem, methanolem a vodou.

Příklad 35

Pět kusů fólie s připravené podle příkladu 19 (kolečka průměr 18 mm, síla 1,8 mm, váha 3,6 g) se převrství 15 ml dioxanového roztoku s 1,2 g 4-izothiokyanátofenyl-a-D-mannopyranosidu. Za 2 dny se fólie opláchnou dioxanem, methanolem a vodou.

Příklad 36

Polymemí fólie podle příkladu 20 (kolečka průměr 19 mm, síla 1,8 mm, váha 3,7 g) se dá do roztoku 1,8 g 2-izokyanátoethyl-a-D-mannopyranosidu ve směsi 10 ml aceton a 5 ml dioxan. Za dva dny se polymer opláchne dioxanem, acetonem a vodou.

Příklad 37

Fólie podle příkladu 10 (4,5 g, kolečka průměr 18 mm, síla 1,2 mm) byla ponořena do roztoku 0,3 g 5-karboxypentyl-a-D-mannopyranosidu, 0,3 g ÝV-ethyl-M-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu a 0,2 g 1-hydroxybenztriazolu ve směsi 15 ml dimethylformamid a 5 ml vody. Za dny byla reakční směs odstraněna, fólie byly postupně opláchnuty dioxanem, 5% kyselinou octovou, 5% hydrogenuhličitanem sodným a vodou.

Příklad 38

Polymemí fólie podle příkladu 36 (kolečka průměr 20 mm, síla 0,9 mm, 3 g) byla pokryta roztokem 2 g 4-nitrofenyl chlorokarbonátu v 10 ml dichlormethanu. Za dva dny byly fólie opláchnuty x 50 ml dichlormethanu a usušeny.

Příklad 39

Fólie připravené podle příkladu 38 (kolečka průměr 20 mm, síla 0,9 mm, 1 g) byly ponořeny do roztoku 1 g 3,3'-oxidi(aminopropanu) v 10 ml směsi dioxan izopropanol 1:1. Za dva dny byl produkt opláchnut 3 x dioxanem.

Příklad 40

Kolečka z fólií připravených podle příkladů 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 a 36 byla použita pro orientační kultivaci keratinocytů [1-4], Ve všech případech byla kultivace úspěšnější

-22CZ 295117 B6 než standardní fólie připravená z 2-hydroxyethyl methakrylátu. Fólie z příkladů 24, 25, a 28 byly v rozsahu 50 až 80% lepší, ostatní převyšovaly výrazně 100 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polymerní nosič s vázanými sacharidy pro kultivaci keratinocytů nebo dočasnou imobilizaci biologických systémů obecného vzorce

PM-[R-X-(R'-Y)p-Z]_n, kde PM je hydrofilní síťovaný polymer připravený radikálovou polymerizací polymerizační směsi obsahující 1 až 99 hmotn. % monomerů nebo směsi monomerů a 0,1 až 10 hmotn. % síťovadla nebo směsi síťovadel a 0,01 až 10 hmotn. % radikálového iniciátoru a/nebo 0,1 až 40 hmotn. % rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel a

-[R - X-(R¹ - Y)_p - Z]_n je obecně formulovaná struktura, kde

R je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -(CH₂)_a-, -OCH₂CH₂-, -(OCH₂CH₂)_b-, -C₆H₄O-, -C₆H₄-CO_, -NH-C₆H₄-CO-, -C₆H₄-NH_, -O-C₆H₆-O-CH₂CH₂O-,

X je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -O-, -N(R²)-, -CO-O-, -CO-NH-, -NH-CO-, -O-CO-O-, -NH-CS-NH-, -NH-CO-NH-, -O-NH-CH2CH2CONH-, kde R² je -H, alkyl Ci až C4 nebo acetyl,

R¹ je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -ÍCH₂)_a-, -OCH₂CH₂-, -C₆H₄-O-(OCH₂CH₂)_b-O_, -C₆H₄-CO-, -NH-C₆H₄-CO-,

Y je vybráno ze skupiny: kovalentní vazba, -N(COCH₃)~, -NH-CS-NH-C₆H₄-O-, -NH-CSNH-(CH₂)_a-C₆H₄-O-, -NH-CS-NH-(CH₂)_a-O-C6H₄-O-, -NH-CS-NH-(CH₂)_a-C₆H₄-O-,

-NH-C₆H4-O-, -nh-c₆h₄-coaje 1 až 12, b je 1 až 200, p je 0 až 20, index n má takovou hodnotu, která zajišťuje koncentraci sacharidů v rozsahu lxlO ⁴ až 0,3 g na gram polymerní matrice.