SE503844C2 - Förfarande för rening av streptokinaser - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 503 844 2 The Lancet 13, August 1988, sid 349-360). Behandlingen är emellertid inte helt problemfri. Dels föreligger en liten blödningsrisk, vilket är naturligt vid behandling med olika trombolysmedel, dels kan lindriga feberreaktioner uppträda och i läg frekvens smärre allergiska reaktioner, vilka båda oftast är av övergående karaktär. Eftersom streptokinas utvinnes från en bakterie, kan det i sig ge upphov till feber och allergiska reaktioner. Eventuella kontaminerande komponenter i preparatet kan, åtminstone teoretiskt, också orsaka detta.

Reningsprocessen för streptokinas är av väsentlig bety- delse. Det gäller här dels att renheten skall bli så hög som möjligt, så att därigenom risken för allergiska biverkningar minskas, dels att ett högt utbyte av kliniskt verksamt prepa- rat skall erhàlllas. Vidare âr en snabb och enkel reningspro- cess önskvärd, så att produktionskostnaderna skall kunna ned- bringas.

De processer som för närvarande användes för rening av streptokinas innefattar sådana konventionella förfaranden som ytaktiva ämnen, saltutfällningar, adsorptionskromatografi, jonbyteskromatografi och gelfiltrering. (Se t ex Biochemica et Biophysica Acta, 1979, 19-29, Einarsson et al samt US 3 098 015). I dessa processer är dock reningen tidskrävande och kostsam, bland annat därför att många separationssteg er- fordras och utbytena år relativt låga. Dessutom användes till en stor del relativt ospecifika matriser med dåliga flödesegen- skaper (t ex kaolin) vid de olika kromatografiska reningsste- gen. Huvuddelen av de använda reningsförfarandena utarbetades för omkring 30 är sedan, och uppfyller icke längre de höga krav som ställes i dag.

I samband med undersökningar av egenskaperna hos strepto- kinas har det överraskande visat sig, att streptokinas bindes till hydrofoba ligander, som kopplats till olika gelmatriser.

Eluering kan därefter genomföras med en lösning vars jonstyrka, pH-värde, hydrofilitet och/eller temperatur skiljer sig från motsvarande parametrar hos den lösning som använts vid bind- ningen av streptokinaset till gelen.

“G I närvaro av salt i hög koncentration bindes mer än 90 av streptokinaset till dessa ligander, medan huvuddelen av förorenande proteiner icke bindes, och lätt kan tvättas bort. 10 15 20 25 30 35 503 844 3 Streptokinaset kan sedan elueras från matrisen genom sänkning av saltkoncentrationen i det eluerande mediet.

Föreliggande uppfinning hänför sig sålunda till ett för- farande för rening av ett streptokinas, samt derivat och frag- ment därav, och kännetecknas av att streptokinaset i lösning bringas att bindas till en gel, bestående av en matris av agaros som innehåller fenylgrupper som hydrofoba ligander, var- efter det till dessa ligander bundna streptokinaset elueras från gelen.

Förfarandet enligt uppfinningen kan även användas för rening av derivat av streptokinas, liksom även för rening av fragment av streptokinas, där streptokinasmolekylen till en del har nedbrutits. I föreliggande beskrivning och patentkrav avser uttrycket "streptokinas“ även att innefatta sådana deri- vat och fragment.

Det är tidigare känt, att hydrofoba gel-matriser har förmåga att binda makromolekyler, och detta har utnyttjats till från- skiljande av exempelvis virus (se J. Virol Methods 1981, 3:213-38, Einarsson et al samt US 4 138 287) eller till rening av proteiner i laboratorieskala. Sådana processer är svåra att styra, och speciellt gäller detta, om man försöker att genom- föra dem i större, industriell skala. Det händer då mycket ofta, att makromolekyler denatureras och förstöres, eller att de blir svåra att utvinna i ren form med bibehållen hög aktivi- tet och bibehållet högt utbyte. Genom föreliggande uppfinning har vi dock överraskande funnit att en hydrofob gel är ytterst lämplig för rening av streptokinaser.

Som matrismaterial föredrages speciellt sådana agarosge- ler som är kända för att användas till gelfiltrering, såsom Sepharose® från AB Pharmacia.

De till den hydrofila matrisen bundna hydrofoba ligan- derna utgöres av fenylgrupper. Vid grupper med 4 eller färre kolatomer blir de hydrofoba egenskaperna icke tillräckligt utpräglade för att en god bindning av enzymet till gelen skall erhållas. Vid ett ökande antal kolatomer blir liganderna allt- mera hydrofoba, och enzymet bindes allt starkare till dem. En alltför stark bindning kan medföra svårigheter vid elueringen, så att speciella åtgärder erfordras, och utbytet minskar. När liganderna blir alltför hydrofoba, uppkommer även de svårighe- 10 15 20 25 30 35 503 844 4 terna, att gelen blir "fet", och icke längre vätes väl av vattenfasen. Vidare minskar även gelens densitet så, att den till slut flockas och flyter i vatten, och svårigheter upp- kommer att framställa en normal kolonn. Detta sätter alltså en övre, praktisk gräns för de hydrofoba gruppernas storlek, men denna gräns är icke skarp, utan en gradvis övergång förelig- ger.

Halten av de hydrofoba grupperna på matrisen kan variera inom vida gränser. Det är här de totala hydrofoba egenskaperna hos matrisen med liganderna som är av betydelse. Härvid inver- kar även storleken hos de till matrisen bundna grupperna, så att att der (1976)).

De cykliska kolvätegrupper är bundna till matrismateria- ett större antal ligander med få kolatomer erfordras för ge samma hydrofoba egenskaper som ett mindre antal ligan- med större antal kolatomer (se Experimentia 32, 456 let utgöres av fenyl, och även kolvâtesubstituerade cykliska grupper är användbara, såsom tolyl och xylyl.

Matrismaterialen med de därtill bundna, hydrofoba ligan- derna kan framställas medelst metoder, som i sig är kända från litteraturen. (Carbohydrate Res. 58, 249-51, 1977, Larm et al. samt Nature (1967), 214, 1302-04, Axén et al).

Elueringen av streptokinaset från de hydrofoba ligander- na på matrisen kan genomföras efter olika principer, så som angivits i det föregående. Sålunda kan streptokinaset tillfö- ras gelen i form av en lösning med en hög koncentration av salt, och elueringen sker sedan med en lösning med lägre salt- halt, och därigenom lägre jonstyrka. Den övre gränsen för salt- halten i den tillförda lösningen utgöres av mättnadshalten, men en mera praktisk övre gräns är den, över vilken streptokinaset utfaller ur lösningen. Denna gräns kan lätt fastställas av fackmannen genom ett enkelt rutinförsök. Den undre gränsen för salthalten är icke kritisk, och sättes i praktiken vid värdet noll, alltså rent vatten. Vanligen använder man dock vid elu- eringen en buffertlösning med lämplig jonstyrka. Elueringen kan även utföras med stegvis ändrade salthalter eller med gradient.

De använda salterna utgöres främst av klorider, sulfater eller fosfater av alkalimetall, såsom natrium eller kalium, eller av ammonium. Denna uppräkning är dock icke uttömmande, 10 15 20 25 30 35 503 844 5 och i princip kan vilket salt som helst användas, som icke har någon ofördelaktig inverkan på materialen eller arbetsproces- sen.

En vidare princip för elueringen är att ändra eluerings- lösningens pH gentemot den lösning som använts vid bindningen av streptokinaset till matrisen. I sådana fall âr det vanligen fråga om att elueringen skall genomföras vid ett högre pH-värde än det som använts vid bindningen av streptokinaset. Den in- gående lösningen av streptokinaset har alltså ett pH-värde, vars undre gräns bestâmmes av det pH, vid vilket streptokinaset denatureras eller på annat sätt inaktiveras irreversibelt. Den övre pH-gränsen vid elueringen bestâmmes av det pH-värde, vid vilket streptokinaset eller gelen påverkas ofördelaktigt.

Företrädesvis genomföres elueringen vid alkaliskt pH. pH-grän- serna är dock icke kritiska, utan kan fastställas av fackmannen genom enkla rutinförsök.

För erhållande av önskade pH-värden hos de använda lös- ningarna använder man lämpligen olika buffertlösningar, som lätt kan beredas av fackmannen på basis av uppgifter i litte- raturen, när väl det önskade pH-värdet har fastslagits.

Ytterligare en princip för elueringen är att använda en elueringslösning med olika hydrofila egenskaper gentemot den lösning som använts vid bindningen av streptokinaset till matrisen. Härvid gäller det vanligen att elueringslösningen skall vara mer hydrofil än den ingående lösningen av strepto- kinaset. Detta kan uppnås genom att elueringslösningen utgöres av en vattenlösning av ett lösningsmedel. Sådana lösningsmedel utgöres främst av lågalkanoler, såsom metanol, etanol, propa- nol, isopropanol och butanol, men även andra lösningsmedel är möjliga, såsom etylenglykol, glycerol och aceton, liksom även blandningar av lösningsmedel. Det mest föredragna lösningsmed- let utgöres av etanol.

Halten av lösningsmedel i elueringslösningen kan väljas inom vida gränser. Den övre gränsen bestâmmes av att strepto- kinaset och/eller gelen icke får påverkas ofördelaktigt. Exem- pelvis kan höga halter av etanol i lösningen medföra att strep- tokinaset fâlles ut eller kan denatureras. Den lägre haltgrän- sen i elueringslösningen bestâmmes av att en tillräcklig skillnad i hydrofilitet skall uppnås gentemot ingångslösningen 10 15 20 25 30 35 503 844 6 av streptokinaset. Även ingångslösningen av streptokinaset kan innehålla organiskt lösningsmedel, varvid dock en tillräcklig skillnad i hydrofilitet gentemot elueringslösningen måste före- ligga för att en tillfredsställande separation skall uppnås.

Slutligen kan elueringen även åstadkommas genom att elue- ringslösningen har en annan temperatur än ingångslösningen av streptokinaset. Bindningsstyrkan ändras med temperaturen, och bindningen mellan streptokinas och hydrofob ligand blir starka- re_vid högre temperatur. Det gäller här alltså, att eluerings- lösningen skall ha en lägre temperatur än ingángslösningen.

Inom det praktiskt användbara temperaturområdet vid reningen är dock effekten av en temperaturândring ganska låg, och enbart en temperaturändring hos elueringslösningen är vanligen icke till- räcklig för att en tillfredsställande separation skall erhål- las. Den kan dock utgöra en bidragande faktor vid en eluering enligt någon av de i det föregående nämnda principerna.

De olika elueringssätt som beskrivits i det föregående kan även kombineras. Exempelvis kan en elueringslösning med låg jonstyrka även vara buffrad till ett högt pH-värde, och/- eller vara försatt med ett organiskt lösningsmedel. På detta sätt kan en förstärkt separationseffekt uppnås. Vid kombine- ringen är det av betydelse att inga ofördelaktiga reaktioner uppkommer, såsom utfällningar, eller andra påverkningar på streptokinaset eller gelen.

Själva separationsprocessen genomföres på i och för sig känt sätt. Gelen av matrisen med fenylliganderna är företrädes- vis anordnad i en kolonn av vanlig typ. Enzymet bindes till gelen genom att en lösning av det får passera genom kolonnen, varvid huvuddelen av föroreningarna icke bindes. Därefter sköl- jes lämpligen kolonnen med en lösning som är buffrad till lämpligt pH-värde och jonstyrka för att ingen eluering skall ske, utan endast föroreningarna ytterligare skall sköljas ut.

Slutligen genomföres elueringen enligt någon av de i det före- gående angivna principerna, en enda eller flera i kombination.

Elueringen kan genomföras stegvis eller medelst gradient, på känt sätt.

Om så önskas, kan det renade streptokinaset underkastas ytterligare reningssteg av konventionell typ, såsom gelfiltre- ring eller jonbyteskromatografi. Härigenom kan det alltid 10 15 20 25 30 35 503 844 7 säkerställas, att ett högvärdigt streptokinas med mycket hög renhet erhålles för kliniskt bruk.

Ofta erhålles dock redan genom den hydrofoba kromato- grafin enligt uppfinningen ett streptokinas med en tillräcklig renhet, så att inga ytterligare reningssteg erfordras.

I jämförelse med den tidigare reningstekniken ger för- farandet enligt uppfinningen ett väsentligt högre utbyte och en renare produkt.

För streptokinas har det visat sig, att förfarandet en- ligt uppfinningen ger ett utbyte av ca 95 %, jämfört med det utbyte av ca 45 %, som erhållits med tidigare använda förfa- randen.

En dubbelt så hög renhetsgrad har även erhållits i jäm- förelse med tidigare känd teknik. Uppfinningen medför även ett mindre antal separationssteg varvid processen blir mindre kost- sam, och tager även kortare tid, detta genom att redan den hydrofoba kromatograferingen ger en så hög renhetsgrad, att inga eller färre ytterligare reningssteg erfordras.

En ytterligare fördel hos förfarandet enligt uppfinningen âr, att arbetsmiljön förbättras. Det tidigare mest använda mat- rismaterialet kaolin har ofta orsakat allergiska reaktioner när det vid arbete i industriell skala skall skiljas från enzympro- dukten. Det kan då vara damm av kaolin med vidhängande enzym- rester som orsakat dessa reaktioner hos känsliga användare. Med separationssättet enligt föreliggande uppfinning elimineras helt denna olägenhet.

Uppfinningen åskädliggöres närmare av följande exempel.

Exempel ß-hemolytiska streptokocker jästes i S liters jâstankar med nâringsmedium vid pH 7,1. Efter 7 timmars jäsning vid +35'C sänktes temperaturen till +10'C och pH höjdes till 7,7. Där- efter avlägsnades celler och cellrester genom centrifugering vid 2100 g. Lösningen filtrerades och en koncentrerad lösning av ammoniumsulfat tillsattes tills 18 % mättnadsgrad erhölls.

Ca 30 liter lösning fick passera genom en kolonn innehållande 0,6 liter fenyl-Sepharose® fast flow (Pharmacia), som jämvik- tats med 0,02 M fosfatbuffert pH 7,4 innehållande ammoniumsul- fat till 18 % mâttnadsgrad. All streptokinasaktivitet bands, medan huvuddelen av föroreningarna gick rakt igenom. Efter 503 844 8 tvätt av kolonnen eluerades streptokinaset med 0,02 M fosfat- buffert pH 7,4. Utbytet var 85 % av till kolonnen applicerad aktivitet. Den specifika aktiviteten ökade från 3 internatio- nella enheter per mikrogram kväve till 201. Efter ytterligare två reningssteg erhölls ett till mer än 90 f rent streptokinas. __----_-_-

Claims (5)

10 15 20 7 503 844 Patentkrav

1. Förfarande för rening i industriell skala av streptokinaser, samt derivat och fragment därav, kännetecknat därav, att en lösning av ett streptokinas i en saltlösning med en salthalt under mättnadshalten bringas att bindas till en gel av fenyl-agaros, varefter streptokinas som bundits till gelen elueras därifrån.

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat därav, att saltet i saltlösningen utgöres av ett eller flera sulfater, klorider och/eller fosfater av alkalimetall eller ammonium.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, kännetecknat därav, att elueringen av streptokinaset utföres genom tillförande av en saltlösning med lägre jonstyrka än den hos den lösning som använts vid bindningen till gelen.

4. Förfarande enligt krav l eller 2, kännetecknat därav, att elueringen av streptokinaset utföres genom tillförande av en lösning, vars pH-värde skiljer sig från det hos den lösning som använts vid bindningen till gelen.

5. Förfarande enligt krav 1 eller 2, kännetecknat därav, att elueringen av streptokinaset utföres genom tillförande av en lösning som är mera hydrofil än den som använts vid bindningen till gelen.