DE60210278T2

DE60210278T2 - ENZYMATISCHES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 4-O-ß-D-GALACTOPYRANOSYL-D-XYLOSE, MIT DIESEM VERFAHREN GEWONNENE 4-O-ß-D-GALACTOPYRANOSYL-D-XYLOSE, DIESE ENTHALTENDE ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERWENDUNG DAVON BEIM QUANTIFIIZIEREN INTESTINALER LACTASE

Info

Publication number: DE60210278T2
Application number: DE60210278T
Authority: DE
Inventors: Javier Francisco Juan de la Cierva 3 CANADA VICINAY; G. Inst. Quimica Org. Gral-CSIC CORRALES MORALES; A. I.Quimica Org.Gral-CSIC FDEZ-MAYORALAS ALVAREZ; Manuel I.de Investigaciones Quimucas MARTIN LOMAS; Juan Jose Univ. Autonoma de Madrid ARAGON REYES
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Universidad Autonoma De Madrid Madrid Es; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2022-06-15
Also published as: US20040241811A1; MXPA03011869A; CA2451065C; AU2002314215B2; JP4115933B2; EP1408118A1; ES2182703A1; EP1408118B1; CA2451065A1; WO2002103038A1; ES2260444T3; US7537909B2; ES2182703B1; RU2316593C2; RU2004101406A; JP2004537298A; PT1408118E; ATE321876T1; DE60210278D1

Description

Die vorliegende Erfindung umfasst das Gebiet des Verfahrens zum Erhalt von Verbindungen, insbesondere Disacchariden, die in blutlosen Verfahren zur Bewertung von intestinaler Lactaseaktivität verwendbar sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Mangel an oder die geringe intestinale Lactaseaktivität, die zu unzureichender Fähigkeit oder bis zur Unfähigkeit zur Verdauung von Lactase führt, ist als angeborener Stoffwechselfehler selten, aber ist ein häufiges Syndrom bei menschlichen Erwachsenen. Jedoch gibt es bei den meisten Säugern eine merkliche Verringerung der Lactaseaktivität von dem Moment der Entwöhnung an. Bei Menschen, deren Vorfahren für eine lange Zeit von einem wesentlichen Verbrauch von Milch oder Milchprodukten abhängig gewesen sind, ist diese Verringerung weniger häufig. Andererseits ist bei nicht entwöhnten Säuglingen mangelhafte oder geringe intestinale Lactaseaktivität ziemlich selten.
Die Bestimmung von intestinaler Lactaseaktivität ist in Pädiatrie und Gastroenterologie wichtig, und sie kann direkt aus einer Probe der Schleimhautmembran oder indirekt aus dem Zuckerspiegel im Blut oder aus ausgeatmetem Wasserstoff, nachdem der Person eine Dosis von Lactase verabreicht wurde, durchgeführt werden.
Die direkte Bestimmung hat den Nachteil, ein komplexes und kostspieliges Verfahren zu sein, zurückzuführen auf die Tatsache, dass sie spezielle Instrumente und sehr spezialisiertes Personal erfordert, um die Probe zu entnehmen, die danach der Analyse unterzogen werden soll, abgesehen von der Tatsache, dass sie unangenehm und etwas gefährlich für die Person ist.
Andere Verfahren zur Bestimmung intestinaler Lactase basieren auf der Tatsache, dass Disaccharide, basierend auf ihrer Affinität zu Lactase, imstande sind, als Lactasesubstrat zu wirken, und sie durch die Wirkung des Enzyms in bestimmte Monosacharide umgewandelt werden, die durch das Intestinum leicht absorbiert und im Urin ausgeschieden werden.
Die spanische Patentschrift ES-P-9001650 beschreibt die Herstellung von 4-O-β-Galactopyranosyl-D-xylose-Disaccharid mit der Formel (I)
für die Bewertung von intestinaler Lactaseaktivität. Das Disaccharid wird oral verabreicht, wirkt als Substrat intestinaler Lactase, und deshalb zersetzt es sich im Intestinaltrakt zu Xylose und Galactose, wobei die Xylose absorbiert und im Urin ausgeschieden wird, in dem die Xylose direkt mittels eines einfachen kolorimetrischen Verfahrens bewertet werden kann.
Die Mengen von Xylose, die im Urin ausgeschieden werden, werden mit den Spiegeln von intestinaler Lactase korreliert.
Die spanische Patentschrift ES-P-9001650 beschreibt auch ein Verfahren zur grundsätzlichen Herstellung von 4-O-β-Galactopyranosyl-D-xylose, das die Synthese von Benzyl-β-D-xylopyranosid umfasst und das einer Sequenz von Arbeitsgängen folgt, die die Reaktionen von selektivem Schutz, Glycosylierung und Entfernung von Schutzgruppen beinhaltet. Die Anzahl von Schritten der Reaktion ebenso wie die Verwendung kostspieliger Reagenzien wie Silbertriflat in der Glycosylierungsreaktion und die Verwendung von Chromatographiesäulen bei der Reinigung von Zwischenverbindungen und dem Endprodukt, erzeugen Kosten und bereiten Schwierigkeiten, dieses Verfahren in industriellem Maßstab durchzuführen.
Die spanischen Patentschriften ES-P-9502185 und ES-P-9701156 beschreiben enzymatische Verfahren für die Herstellung von Gemischen von Galactopyranosyl-xylose-Disacchariden, die das Disaccharid (I) und seine Regioisomere 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten, die jeweils die folgenden Formeln haben:
Die in den spanischen Patentschriften ES-P-9502185 und ES-P-9701156 beschriebenen Verfahren machen es möglich, in einem einzigen Reaktionsschritt und nach chromatographischer Reinigung Gemische von 2-, 3- und 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu erhalten, die als Substrate und deshalb für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität von intestinaler Lactase verwendbar sind. Die Verfahren, obwohl machbar aus zugänglichen Substraten und Enzymen, bereiten vom Standpunkt der industriellen Synthese Schwierigkeiten für die Kennzeichnung der geeignetsten Anteile, die Reproduzierbarkeit der Herstellung in den Anteilen und die Bestimmung möglicher Verunreinigungen.
Andererseits beschreiben Gorin et al. in „The Synthesis of β-Galacto- and β-Gluco-Pyranosyl Disaccharides by Sporobolomyces Singularis", Can. J. Chem. 42 (1964), 2307–2319, die Synthese einer Mehrzahl von Disacchariden, unter ihnen 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, mittels eines Verfahrens unter Verwendung von Zellen. Diese Publikation beschreibt keinerlei Verwendung der verschiedenen synthetisierten Disaccharide. Jedoch schlagen Aragon et al. in „Evaluation of rat intestinal lactase in vivo with 4-galactosylxylose" die Verwendung des vorstehend genannten Disaccharids für die Bewertung intestinaler Lactaseaktivität vor.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Die erste Aufgabe der Erfindung besteht darin, die vorstehend angeführten Unannehmlichkeiten des Standes der Technik zu überwinden.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das eine enzymatische Reaktion zwischen D-Xylose und einem β-D-Galactopyranosid-Substrat und eine nachfolgende Phase von Isolierung und Reinigung beinhaltet, die es möglich macht, den Anteil von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose in dem finalen Gemisch der enzymatischen Reaktion bezüglich der 2- und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu erhöhen, aus deren finalen Gemisch 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose durch einfache Arbeitsgänge isoliert werden kann.
Die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, die mittels des vorstehend angeführten Verfahrens erhalten werden kann, ebenso wie die Zusammensetzungen, die die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose umfassen, machen die nachfolgenden Aufgaben der Erfindung aus.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose bei der Herstellung von Zusammensetzungen und Lösungen zu verwenden, die bei der in-vivo-Bewertung von intestinaler Lactaseaktivität verwendbar sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorstehend angeführten Aufgaben werden gemäß der vorliegenden Erfindung mittels eines enzymatischen Verfahrens zum Erhalt von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose erreicht, umfassend:
einen ersten Schritt des Herstellens eines ersten Reaktionsgemisches aus
2 bis 20 Gew.-% D-Xylose,
0,5 bis 5 Gew.-% eines β-D-Galactopyranosid-Substrats,
75 bis 97,5 Gew.-% eines Reaktionsmediums, das gepuffertes Wasser mit einem pH zwischen 5,0 und 9,0 umfasst;
Zugabe von 10 bis 1.000 Einheiten eines β-D-Galactosidase-Enzyms pro Gramm β-D-Galactopyranosid zu dem ersten Reaktionsgemisch; und Erhalt eines zweiten Reaktionsgemisches;
einen zweiten Schritt, in dem das zweite Reaktionsgemisch einer Umsetzung bei einer Temperatur zwischen einer Temperatur, die höher ist als der Gefrierpunkt des zweiten Reaktionsgemisches, und 45°C 2 bis 48 Stunden lang unterzogen wird, um Disaccharide in dem zweiten Reaktionsgemisch zu bilden;
einen dritten Schritt, in dem die Reaktion, nachdem die Disaccharide in der gewünschten Menge gebildet wurden, mit Hilfe einer Behandlung gestoppt wird, die ausgewählt ist aus Desaktivierung der β-D-Galactosidase durch Tiefkühlen des zweiten Reaktionsgemisches bei einer Temperatur zwischen –20°C und –170°C, Desaktivierung der β-D-Galactosidase durch Erwärmen des zweiten Reaktionsgemisches bei einer Temperatur zwischen 95 und 110°C, und Abtrennen der β-D-Galactosidase von dem zweiten Reaktionsgemisch durch Ultrafiltration; Erhalt eines dritten Reaktionsgemisches;
einen vierten Schritt, in dem ein Aglycon-Fragment des in dem ersten Schritt verwendeten 1-D-Galactopyranosid-Substrats von dem dritten Reaktionsgemisch durch Extraktion oder Filtration abgetrennt wird; Erhalt eines vierten Reaktionsgemisches;
einen fünften Schritt, umfassend die Isolierung von Fraktionen, die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten, ausgewählt aus:
Zugabe von Celite zu dem vierten Reaktionsgemisch, gefolgt von Fest-Flüssig-Extraktion mit einem Lösungsmittel und Eluieren mit einem ersten Eluierungsmittel in einer Säule;
und direkte Zugabe von Aktivkohle zu dem vierten Reaktionsgemisch, gefolgt von Filtration und Eluieren mit einem zweiten Eluierungsmittel;
und einen sechsten Schritt, in dem die Fraktionen, die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten, in einem Kristallisationsgemisch kristallisiert werden, das ausgewählt ist aus Gemischen von Aceton/Methanol in einem Verhältnis zwischen 5/1 und 20/1 oder Gemischen von Aceton/Wasser in einem Verhältnis zwischen 5/1 und 20/1.
Gemäß der Erfindung beträgt der Anteil von D-Xylose in dem zweiten Reaktionsgemisch vorzugsweise 7,5 Gew.-%, beträgt der Anteil von β-D-Galactopyranosid in dem zweiten Reaktionsgemisch 1,5 Gew.-% und werden 100 Einheiten β-D-Galactosidase pro Gramm β-D-Galactopyranosid zugegeben.
Gegebenenfalls kann das Reaktionsmedium auch mindestens ein Colösungsmittel-Medium, ausgewählt aus Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dioxan und Gemischen davon, umfassen, vorzugsweise in einem Anteil von 20,5 in bezug auf das Reaktionsmedium. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Reaktionsmedium auf einen pH von 7 gepuffert.
Die Reaktion wird geeigneterweise zum Zweck der Erhöhung ihrer Reproduzierbarkeit bei einer konstanten Temperatur durchgeführt. In einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Reaktionstemperatur höher als der Gefrierpunkt des zweiten Reaktionsgemisches und ist niedriger als 40°C. In einer anderen Ausführungsform wird die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt, was gute Ausbeuten ohne die Notwendigkeit der Kühlung des zweiten Reaktionsgemisches gestattet. Die Reaktion kann auch bei –5°C oder bei 37°C durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise niedriger als 0°C, aber höher als der Gefrierpunkt des zweiten Reaktionsgemisches.
Gemäß der Erfindung wird das β-D-Galactopyranosid-Substrat vorzugsweise aus o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und Lactose ausgewählt. Das β-Galactosidase-Enzym kann E. coli-β-Galactosidase oder Kluyveramyces lactis-β-Galactosidase (wie zum Beispiel MAXILACT^®) sein. Wenn Gal-ONP als Substrat verwendet wird, wird o-Nitrophenol in der Reaktion gebildet, und selbiges wird durch Extraktion mit Ethylacetat in dem Fall, dass die Reaktion durch Erwärmen gestoppt wird, beseitigt, oder sonst wird es durch einfache Filtration in dem Fall, dass die Reaktion durch Kühlen gestoppt wird, beseitigt.
Wenn im dritten Schritt des Verfahrens die Reaktion durch Tiefkühlen des zweiten Reaktionsgemisches gestoppt wird, wird vorzugsweise eine Temperatur von –78°C angewandt. Andererseits wird, wenn im dritten Schritt die Reaktion durch Erwärmen des zweiten Reaktionsgemisches gestoppt wird, vorzugsweise eine Temperatur von 100°C angewandt.
Im fünften Schritt kann die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose mit Hilfe mehrerer alternativer Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.
Gemäß einem ersten alternativen Verfahren wird Wasser aus dem vierten Reaktionsgemisch beseitigt, wobei ein Reaktionsrückstand erhalten wird, der Disaccharide enthält, wird der Reaktionsrückstand einer Acetylierungsbehandlung, um ein peracetyliertes 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose-Derivat zu erhalten, und der Abtrennung des peracetylierten Derivats in einer chromatographischen Säule mit Silicagel unterzogen. Die Acetylierung des Reaktionsrückstandes wird vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid in Pyridin durchgeführt, wohingegen die Deacetylierung des peracetylierten Derivates katalytisch mit Natriummethoxid in Methanol durchgeführt wird.
Gemäß einem zweiten alternativen Verfahren wird das vierte Reaktionsgemisch einer Elution in einer Säule mit einem ersten Eluierungsmittel unterzogen, das aus Gemischen von Wasser mit Methanol, Ethanol oder Isopropanol ausgewählt sein kann, vorzugsweise einem Gemisch von Wasser/Isopropanol mit einem Anteil an Isopropanol von 1 bis 10% (Vol./Vol.), vorzugsweise 2% (Vol./Vol.).
Die Elution wird in einer Filtrationssäule, ausgewählt aus Filtrationssäulen mit vernetzten Dextranpolymer-Füllstoffen, wie zum Beispiel eine Säule mit SEPHADEX-Füllstoff, Filtrationssäulen mit Acrylamidpolymer-Füllstoffen, wie zum Beispiel eine Säule mit BIOGEL-Füllstoff, und Filtrationssäulen aus Aktivkohle oder aus Aktivkohle-Celite, durchgeführt, wobei Fraktionen erhalten werden, die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten.
Vorzugsweise wird das vierte Reaktionsgemisch konzentriert, bevor es einer Elution in der Säule unterzogen wird. Gemäß einem dritten alternativen Verfahren wird Celite zu dem vierten Reaktionsgemisch gegeben, wird das so erhaltene Gemisch bis zur Trockne konzentriert und wird der Rückstand einer Fest-Flüssig-Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel in einem Soxhlet-Apparat, gefolgt von Eluieren in einer Säule, unterzogen. Das für die Fest-Flüssig-Extraktion bevorzugte Lösungsmittel ist Ethylacetat. Die Säule wird aus Filtrationssäulen mit vernetzten Dextranpolymer-Füllstoffen, wie zum Beispiel eine Säule mit SEPHADEX-Füllstoff, Filtrationssäulen mit Acrylamidpolymer-Füllstoffen, wie zum Beispiel eine Säule mit BIOGEL-Füllstoff, und Filtrationssäulen aus Aktivkohle oder aus Aktivkohle-Celite ausgewählt. Vorzugsweise besteht die Säule aus Aktivkohle-Celite, wobei der Kohlenstoff durch Zugabe von Salzsäure desaktiviert wird.
Dieses dritte alternative Verfahren bietet den Vorteil, den größten Teil der Xylose- vor allem wenn sie in großem Überschuss in der Reaktion verwendet wird – vor der Elution in der Säule zu beseitigen, wodurch die Füllstoffe, ebenso wie die Menge des ersten Eluierungsmittels, das für die Elution benötigt wird, viel geringer sind. Ein anderer Vorteil dieses dritten alternativen Verfahrens besteht darin, dass die Fest-Flüssig-Extraktion in Ethylacetat vollständig selektiv ist, wobei gegeben ist, dass in der flüssigen Phase kein Vorhandensein von Disacchariden beobachtet wird, sondern vielmehr nur das von Xylose und Galactose.
Gemäß einem vierten alternativen Verfahren wird die Elution im fünften Schritt durchgeführt, indem Aktivkohle zu dem vierten Reaktionsgemisch gegeben wird, anstatt dass eine Füllstoffsäule verwendet wird, sobald das Aglycon-Fragment von dem Substrat im vierten Schritt abgetrennt worden ist, wobei so erreicht wird, dass die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose auf der Aktivkohle adsorbiert wird und die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose von der Aktivkohle mit einem zweiten Eluierungsmittel eluiert wird. Das Eluieren wird vorzugsweise mittels aufeinanderfolgender Waschungen mit Wasser und mit verdünntem Isopropanol durchgeführt, wobei der Volumenanteil an Isopropanol in aufeinanderfolgenden Schritten zunimmt. Der Volumenanteil an Isopropanol beträgt zwischen 1% und 3% in einem ersten Schritt, zwischen 3% und 5% in einem zweiten Schritt und zwischen 5% und 7% in einem dritten Schritt. Die für das Waschen bevorzugte Konzentration von Isopropanol ist eine Sequenz mit 2% Isopropanol, gefolgt von Eluieren mit 4% Isopropanol und gefolgt von Eluieren mit 6% Isopropanol. Reine 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wird aus dem Rückstand durch Konzentrierung erhalten, indem sie in Aceton-Wasser kristallisiert wird.
Vorzugsweise wird gemäß diesem vierten alternativen Verfahren o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid als Substrat für die Reaktion verwendet.
Gemäß diesem vierten alternativen Verfahren werden mehrfache Vorteile erhalten, wie die Tatsache, dass es weder notwendig ist, das zweite Reaktionsgemisch auf 100°C zu erwärmen, um die Reaktion zu stoppen, noch es notwendig ist, das Aglycon-Fragment im vierten Schritt mittels Extraktion von dem Substrat zu trennen. Ähnlich wird die Notwendigkeit vermieden, das vierte Reaktionsgemisch zu konzentrieren, und deshalb wird keine Karamelisierung davon erzeugt. Die Menge von Aktivkohle, die für den Füllstoff einer Säule benötigt würde, wird verringert, die Gesamtmenge von Eluierungsmitteln wird ebenfalls verringert und die Verwendung von Celite wird vermieden.
Gemäß der Erfindung werden gemäß dem sechsten Schritt die Fraktionen, die die erhaltene 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten, in einem Kristallisationsgemisch, ausgewählt aus Gemischen von Aceton/Methanol in einem Verhältnis zwischen 5/1 und 20/1 und Gemischen von Aceton/Wasser in einem Verhältnis zwischen 5/1 und 20/1, vorzugsweise in einem Verhältnis 10/1, kristallisiert.
Die Erfindung betrifft auch 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, erhalten durch das vorstehend beschriebene Verfahren, und Zusammensetzungen und Kochsalz- oder wässerige Lösungen, die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, erhalten mit Hilfe des Verfahrens, umfassen, ebenso wie die Verwendung einer 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose bei der Herstellung von Zusammensetzungen und Lösungen für die in-vivo-Bewertung von intestinaler Lactase bei Menschen.
In derartigen Zusammensetzungen und Lösungen wird die β-D-Galactopyranosyl-D-xylose mit pharmazeutisch verträglichen Mengen von mindestens einem Zusatzstoff, ausgewählt aus pharmazeutisch verträglichen Stabilisatoren, Schutzmitteln, Geschmacksstoffen, Lactose, Geliermitteln, Fluidisierungsmitteln und Konservierungsstoffen, die an sich herkömmlich sind, vereinigt.
Die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose oder Zusammensetzungen oder Lösungen, die sie enthalten, werden oral verabreicht und führen zu dem Vorkommen von Xylose im Urin, und diese Xylose, die spektrophotometrisch analysiert wird, wird in einer spezifischen, routinemäßigen, blutlosen und einfachen Weise für die diagnostische Bewertung von Mängeln der Lactaseaktivität verwendet.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird jetzt auf der Grundlage einiger Beispiele beschrieben, die mit größerer Ausführlichkeit einige der vorstehend angeführten Eigenschaften veranschaulichen.
Beispiel 1:
Um den Einfluss der Reaktionstemperatur zu bestimmen, wurde der folgende Test durchgeführt:
Proben von Reaktionsgemischen, bestehend aus
125 mg (500 mM) D-Xylose
25 mg (50 mM) o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
1,75 ml Reaktionsmedium, bestehend
aus einer wässerigen Lösung, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol);
wurden hergestellt und Einheiten von E. coli-β-Galactosidase-Enzym wurden bezüglich der angewandten Reaktionstemperaturen gemäß der folgenden Tabelle zu diesen Proben gegeben:

Reaktionstemperatur Zugegebene Einheiten von Enzym

(°C) (E)

45 1,6

37 1,6

25 1,6

5 10

–5 20
Die Zunahmen in der Menge von Enzym waren notwendig, um die Verlangsamung der Reaktion, erzeugt durch den Abfall der Reaktionstemperatur, zu kompensieren. Es sollte darauf hingewiesen werden werden, dass es möglich ist, bei Temperaturen unter dem Gefrierpunkt von Wasser zu arbeiten, dank des kryoskopischen Abfalls, der in dem Reaktionsmedium dank der hohen Konzentration von Zucker in den Proben erzeugt wird.
Das Verhältnis zwischen 4-, 2- und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wurde für jede einzelne von den Proben und für jeden Schritt des Verfahrens durch Gaschromatographie mit einem Chromatographen bestimmt, der mit einem Flammenionisationsdetektor und einer 15 m langen SE-54-Kapillarsäule mit einem Innendurchmesser von 0,15 mm und einer Dicke von 0,3 μm ausgestattet war. Ein Stickstoffstrom von 1 ml/min wurde verwendet. Das verwendete Temperaturprogramm war

Anfangstemperatur: 2 min

Anfangszeit: 160°C

Temperaturerhöhung: 5°C/min

Endtemperatur: 250°C

Die Proben wurden nach der Trimethylsilylierung mittels der folgenden Vorschrift analysiert:
Ein Aliquot (10 μl) wurde bei –170°C tiefgekühlt und lyophilisiert, bis ein trockner Rückstand erhalten wurde, wonach Pyridin (25 μl), das als innere Referenz Benzyl-β-xylopyranosid (10 mM) enthielt, und N-Trimethylsilylimidazol (25 μl) zu dem trocknen Rückstand gegeben wurden, und das Erwärmen bei 60°C wurde 30 Minuten lang fortgesetzt. Die Rückhaltezeiten der Peaks, die den verschiedenen Disacchariden zugeordnet werden konnten, waren die folgenden:

Benzyl-β-D-xylopyranosid:	12,04 min
2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose:	18,46 und 19,50 min
3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose:	18,30 min
4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose:	20,35 und 20,50 min

Die folgende Tabelle zeigt die Anteile, genommen bei der maximalen Bildung von Disacchariden, von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose (= Verbindung I), bezüglich der Summe ihrer Regioisomere 2- und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, die erhalten wurden:
Tabelle I
Aus der vorstehenden Tabelle wird der Schluss gezogen, dass es, wenn die Temperatur abfiel, eine Zunahme in dem Anteil von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose gab.
Beispiel 2:
Um den Einfluss des pH auf die Reaktion zu bestimmen, wurden die folgenden Proben hergestellt:
Gal-ONP (50 mM): 25 mg
D-Xylose (500 mM): 125 mg
E. coli-Galactosidase 1,6 U
Gepufferte wässerige Lösung
(Kaliumphosphat 50 mM, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol) bei pH 8,5 1,6 ml
pH 7 1,6 ml
pH 5 1,6 ml
und sie wurden bei 37°C umgesetzt.
Der Fortschritt der Reaktion wurde in der gleichen Weise verfolgt, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die folgende Tabelle zeigt die Anteile von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose (= Verbindung I) bezüglich der Summe ihrer Regioisomere 2- und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, die erhalten wurden:
Tabelle 2
Aus der vorstehenden Tabelle wird der Schluss gezogen, dass in einem basischen Medium (pH = 8,5) der Anteil von Verbindung I niedriger war als in einem neutralen Medium (pH = 7), wobei der höchste Anteil von Verbindung I in einem sauren Medium (pH = 5) nachgewiesen wurde.
Beispiel 3:
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 6 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 25 g D-Xylose in 330 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, 2 mg (640 E) von E. coli-β-Galactosidase-Enzym wurden zugegeben und die so erhaltene Lösung wurde bei 30°C in einem Orbitalrührer einer Inkubation unterzogen, bis das Gal-ONP praktisch verbraucht war (ungefähr 4 Stunden). Die Verfolgung der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Isopropanol/NH₃ (30%)/H₂O = 7,5/0,5/2,5 als Eluierungsmittel durchgeführt, wobei als Referenz die folgenden Rf-Werte genommen wurden:

Rf (Gal-ONP): 0,58

Rf (D-Xylose): 0,47

Rf (4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose): 0,17

Rf (2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose

+ 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose): 0,26
Die Reaktion wurde durch Erwärmen in einem Wasserbad bei 100°C für 10 Minuten gestoppt und danach wurde das gebildete o-Nitrophenol mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die wässerige Lösung wurde zur Trockne konzentriert und der Rückstand wurde in einer herkömmlichen Weise acetyliert (Essigsäureanhydrid/Pyridin = 1:1, bei Raumtemperatur, über Nacht und mit magnetischem Rühren). Danach wurde das Reaktionsgemisch konzentriert und die Rückstände von Pyridin und Essigsäureanhydrid wurden durch aufeinanderfolgendes Zugeben und Verdampfen von Toluol beseitigt. Die ausgefällten Salze wurde abfiltriert, das Filtrat wurde zur Trockne konzentriert und der Rückstand wurde in einer Silicagelsäule chromatographiert, wobei ein Gradient von Hexan/Ethylacetat in einem Verhältnis von 4 : 1 – 1 : 1 als Eluierungsmittel verwendet wurde. Zuerst wurde acetylierte D-Xylose aus der Säule eluiert und danach das Gemisch von acetylierten Disacchariden. Sobald die Fraktionen, die das Gemisch von Disacchariden enthielten, konzentriert waren, wurde der Rückstand in MeOH gelöst, wurde eine Lösung von 1 M MeONa/MeOH zugegeben und wurde das so erhaltene Gemisch gerührt, bis die Desacetylierung vollständig war (Verfolgung durch TLC mit Isopropanol/NH₃/H₂O). Das Gemisch wurde mit AMBERLITE IR-120 (H⁺) neutralisiert und zur Trockne konzentriert. Das Gemisch von freien Disacchariden wurde zweimal nacheinander mit MeOH/Aceton kristallisiert, wobei 1,07 g reine 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose mit einer Ausbeute von 17%, bezogen auf das anfängliche Gal-ONP, erhalten wurden. (Schmelzpunkt: 171–176°; ¹HNMR (D₂O): 5,17 und 4,58 (2D, 1h, J 3,8 und 7,8 Hz, H-1α und H-1β), 4,55 und 4,45 (2d, 1H, J 7,8 Hz, H-1'), 4,05 (dd, 1H, J 5,3 und 11,6 Hz, H-5e), 3,38 (dd, 1H, J 10,6 und 11,6 Hz), 3,25 (dd, 1H, J 7,8 und 9,4 Hz, H-2').
Beispiel 4:
Eine Säule aus Aktivkohle/Celite wurde durch trocknes Mischen von 200 g Aktivkohle (DARCO G-60) und 200 g Celite hergestellt, und Wasser wurde zugegeben, bis eine homogene Paste gebildet wurde. Die Paste wurde mit 150 ml HCl (35%) behandelt, um den Kohlenstoff zu desaktivieren, ebenso wie um den Rückstand von Eisen und alkalischen Aschen auszuwaschen, und danach wurde diese mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. Sobald gewaschen, wurde die Paste in eine Chromatographiesäule von 5 cm (∅) × 50 cm gepackt und verdichtet.
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 5 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 25 g D-Xylose in 330 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, wurden 2 mg (640 E) von E. coli-β-Galactosidase-Enzym zugegeben und wurde die so erhaltene Lösung bei 37°C in einem Orbitalrührer einer Inkubation unterzogen, bis das Gal-ONP praktisch verbraucht war (ungefähr 2 Stunden). Der in Beispiel 3 dargelegten Methodik folgend wurde die Reaktion durch Erwärmen bei 100°C für 10 Minuten gestoppt, und das gebildete ortho-Nitrophenol wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die wässerige Lösung wurde bis zu einem ungefähren Volumen von 50 ml konzentriert, durch Glaswolle filtriert und durch die Aktivkohle/Celite-Säule gegeben. Zuallererst wurde die überschüssige D-Xylose mit Wasser eluiert und danach wurde unter Verwendung eines fraktionierten Gradienten von EtOH/H₂O (2%–10% EtOH) das Gemisch von Disacchariden gesammelt. Die mit 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose-Regioisomer angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und auf ein verringertes Volumen konzentriert, wonach Aceton zugegeben wurde, bis eine Trübung erschien, und das so erhaltene Gemisch wurde kalt stehen gelassen. Die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wurde in einer reinen Form kristallisiert, wobei 970 mg erhalten wurden, nämlich eine Ausbeute von 19%, bezogen auf da anfängliche Gal-ONP, deren Spektraldaten mit denen übereinstimmten, die für das Produkt angegeben wurden, das gemäß Beispiel 3 erhalten wurde.
Beispiel 5:
Eine Aktivkohle/Celite-Säule wurde durch trocknes Mischen von 200 g Aktivkohle (DARCO G-60) und 200 g Celite hergestellt, und Wasser wurde zugegeben, bis eine homogene Paste gebildet wurde. Die Paste wurde mit 150 ml HCl (35%) behandelt, um den Kohlenstoff zu desaktivieren und um die Rückstände von Eisen und alkalischen Aschen auszuwaschen, und danach wurde diese mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. Sobald gewaschen, wurde die Paste in eine Chromatographiesäule von 5 cm (∅) × 50 cm gepackt und verdichtet.
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 5 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 25 g D-Xylose in 330 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, wurden 2 mg (640 E) von E. coli-β-Galactosidase-Enzym zugegeben und wurde die so erhaltene Lösung bei 37°C in einem Orbitalrührer einer Inkubation unterzogen, bis das Gal-ONP praktisch verbraucht war (ungefähr 2 Stunden). Der in Beispiel 3 dargelegten Methodik folgend wurde die Reaktion durch Erwärmen bei 100°C für 10 Minuten gestoppt, und das gebildete ortho-Nitrophenol wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die wässerige Lösung wurde bis zu einem ungefähren Volumen von 50 ml konzentriert, durch Glaswolle filtriert und durch die Aktivkohle/Celite-Säule gegeben.
Um die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu kristallisieren, wurde zuallererst die überschüssige D-Xylose mit Wasser eluiert und wurde danach unter Verwendung eines fraktionierten Gradienten von EtOH/H₂O (2%–10% EtOH) das Gemisch von Disacchariden gesammelt. Die in dem 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose-Regioisomer angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und auf ein verringertes Volumen konzentriert und in der kleinstmöglichen Menge Wasser gelöst, wonach Aceton Tropfen für Tropfen zugegeben wurde, bis eine Trübung erschien, und das so erhaltene Gemisch wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur belassen. Nach zwei Stunden wurde mit einer dünnen Schicht des Überstands (transparent) eine Kontrolle gemacht, dass es noch eine Menge von nicht kristallisierter 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose gab. Aceton wurde wiederum hinzugefügt, bis es eine Trübung gab, und selbiges wurde für weitere zwei Stunden stehen gelassen. Schließlich wurde mehr Aceton zugegeben und die Probe wurde über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt und es wurde beobachtet, dass der erzeugte Überstand nur eine minimale Menge von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthielt. Die Kristalle von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wurden abfiltriert und mit Aceton gewaschen.
Die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wurde in einer reinen Form erhalten, wobei 1557 mg erhalten wurden, mit anderen Worten, eine Ausbeute von 30%, bezogen auf das anfängliche Gal-ONP, deren Spektraldaten mit denen übereinstimmen, die bezüglich des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Produkts angegeben wurden.
Beispiel 6:
Eine Aktivkohle/Celite-Säule wurde durch trocknes Mischen von 200 g Aktivkohle (DARCO G-60) und 200 g Celite hergestellt, und Wasser wurde zugegeben, bis eine homogene Paste gebildet wurde. Die Paste wurde mit 150 ml HCl (35%) behandelt, um den Kohlenstoff zu desaktivieren und um die Rückstände von Eisen und alkalischen Aschen auszuwaschen, und danach wurde sie mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. Sobald gewaschen, wurde die Paste in eine Chromatographiesäule von 5 cm ∅ × 50 cm gepackt und verdichtet.
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 5 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 25 g D-Xylose in 330 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 6,8 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, 70 Einheiten von Kluyveramyces lactis (MAXILACT^®) β-Galactosidase-Enzym wurden zugegeben und die so erhaltene Lösung wurde bei 37°C in einem Orbitalrührer einer Inkubation unterzogen, bis das Gal-ONP praktisch verbraucht war (ungefähr 2 Stunden). Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie mit Isopropanol/NH₃ (30%)/H₂O (7,5/0,5/2,5) verfolgt, was zu den folgenden Rf-Werten führte:
Rf (Gal-ONP): 0,58
Rf (D-Xylose): 0,47
Rf (4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose): 0,17
Rf (2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose + (3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose): 0,26
Der in Beispiel 4 dargelegten Methodik folgend wurde die Reaktion durch Erwärmen bei 100°C für 10 Minuten gestoppt, und das gebildete ortho-Nitrophenol wurde mit Ethylacetat extrahiert und wurde filtriert, um die Enzymreste zu beseitigen. Die wässerige Lösung wurde unter einem Vakuum bis zu einem ungefähren Volumen von 45 ml konzentriert und durch die Aktivkohle/Celite-Säule gegeben. Zuallererst wurde die überschüssige D-Xylose mit Wasser eluiert und danach wurde unter Verwendung eines fraktionierten Gradienten von EtOH/H₂O (2%–10% EtOH) das Gemisch von Disacchariden gesammelt. Die in dem 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose-Regioisomer angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und auf ein verringertes Volumen konzentriert, wonach Aceton zugegeben wurde, bis eine Trübung erschien, und das so erhaltene Gemisch wurde kalt stehen gelassen. Die kristallisierte 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wurde durch eine Filterplatte filtriert, wobei 817 mg erhalten wurden, nämlich eine Ausbeute von 16%, bezogen auf das anfängliche Gal-ONP.
Beispiel 7:
Eine Aktivkohle/Celite-Säule wurde durch trocknes Mischen von 200 g Aktivkohle (DARCO G-60) und 200 g Celite hergestellt, und Wasser wurde zugegeben, bis eine homogene Paste gebildet wurde. Die Paste wurde mit 150 ml HCl (35%) behandelt, um den Kohlenstoff zu desaktivieren und die Rückstände von Eisen und alkalischen Aschen auszuwaschen, und danach wurde sie mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. Sobald gewaschen, wurde die Paste in eine Chromatographiesäule von 5 cm ∅ × 50 cm gepackt und verdichtet.
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 5 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 25 g D-Xylose in 330 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, wurden 80 Einheiten von E. coli β-Galactosidase-Enzym zugegeben und wurde die so erhaltene Lösung bei 37°C in einem Orbitalrührer für 24 Stunden einer Inkubation unterzogen. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie mit Isopropanol/NH₃ (30%)/H₂O (7,5/0,5/2,5) verfolgt, was zu den folgenden Rf-Werten führte:
Rf (Gal-ONP): 0,58
Rf (D-Xylose): 0,47
Rf (4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose): 0,17
Rf (2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose + (3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose): 0,26
Der in Beispiel 3 dargelegten Methodik folgend wurde die Reaktion durch Erwärmen bei 100°C für 10 Minuten gestoppt, und das gebildete ortho-Nitrophenol wurde mit Ethylacetat extrahiert und wurde filtriert, um den Enzymrückstand zu beseitigen. Die wässerige Lösung wurde unter einem Vakuum bis zu einem ungefähren Volumen von 70 ml konzentriert und die konzentrierte Lösung wurde durch eine Aktivkohle/Celite-Säule eluiert. Zuallererst wurde sie mit Isopropanol/Wasser (2%) eluiert und 1,3 Liter wurden gesammelt. Danach wurden 4%-Fraktionen bis zu 2,6 Litern gesammelt, wobei ein Gesamtvolumen von 3,9 Liter verwendet wurde.
Die in dem 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose-Regioisomer angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und auf ein verringertes Volumen konzentriert, wonach Aceton zugegeben wurde, bis eine Trübung erschien, und das so erhaltene Gemisch wurde kalt stehen gelassen. Die kristallisierte 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose wurde durch eine Filterplatte filtriert, wobei 1213 mg erhalten wurden, nämlich eine Ausbeute von 24%, bezogen auf das anfängliche Gal-ONP.
Beispiel 8:
Eine Aktivkohle/Celite-Säule wurde durch trockenes Mischen von 24 g Aktivkohle (DARCO G-60) und 24 g Celite hergestellt, und Wasser wurde zugegeben, bis eine homogene Paste gebildet wurde. Die Paste wurde mit 18 ml HCl (35%) behandelt, um den Kohlenstoff zu desaktivieren und die Rückstände von Eisen und alkalischen Aschen auszuwaschen, und danach wurde sie mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. Sobald gewaschen, wurde die Paste in eine Chromatographiesäule gepackt und verdichtet.
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 5 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 25 g D-Xylose in 330 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, wurden 80 Einheiten von E. coli-β-Galactosidase-Enzym zugegeben, und wurde die so erhaltene Lösung bei 37°C in einem Orbitalrührer einer Inkubation unterzogen, bis das Gal-ONP praktisch verbraucht war (24 Stunden). Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie mit Isopropanol/NH₃ (30%)/H₂O (7,5/0,5/2,5) in einer Weise verfolgt, die der in Beispiel 7 angegebenen ähnlich war. Der in Beispiel 3 dargelegten Methodik folgend, wurde die Reaktion durch Erwärmen bei 100°C für 10 Minuten gestoppt, wurde sie abkühlen gelassen und wurde das gebildete ortho-Nitrophenol mit Ethylacetat extrahiert. Celite (40 g) wurden zu der wässerigen Lösung zugegeben und das Gemisch wurde zur Trockne konzentriert. Der feste Rückstand wurde einer Fest-Flüssig-Extraktion unterzogen, wobei ein Soxhlet-Apparat verwendet wurde, der mit einer Cellulose-Patrone ausgestattet war, und Ethylacetat (500 ml) als Lösungsmittel verwendet wurde. Nach 23 Stunden wurde der resultierende Feststoff mit Wasser (3 × 40 ml) gewaschen und die wässerige Lösung wurde durch eine Aktivkohle-Celite-Säule eluiert. Zuallererst wurde sie mit Isopropanol/Wasser (2%) und danach mit Isopropanol/Wasser (4%) eluiert, wobei ein Gesamtvolumen an Eluierungsmittel von 400 ml verwendet wurde. Die in dem 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose-Regioisomer angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde aus Aceton-Wasser in einer Weise kristallisiert, die der in Beispiel 7 beschriebenen ähnlich ist, wobei 0,44 g reines kristallines Disaccharid erhalten wurden.
Beispiel 9:
Um 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose zu synthetisieren, wurden 4,12 g o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-ONP) und 20,6 g D-Xylose in 272 ml Wasser, gepuffert auf einen pH von 7 (0,05 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol), gelöst, wurden 66 Einheiten von E. coli-β-Galactosidase-Enzym zugegeben und wurde die so erhaltene Lösung bei 37°C in einem Orbitalrührer einer Inkubation unterzogen, bis das Gal-ONP praktisch verbraucht war (21 Stunden). Die Reaktion wurde durch Kühlen auf 0°C gestoppt und das o-Nitrophenol wurde als Feststoff abfiltriert. 60 g Aktivkohle wurden zu dem Filtrat gegeben und das resultierende Gemisch wurde für 30 min gerührt. Mittels TLC des Überstands wurde die Abwesenheit von Disaccharid in der Lösung beobachtet, da selbiges auf der Aktivkohle adsorbiert wurde. Das Gemisch wurde filtriert und der Aktivkohle-Feststoff wurde mit Wasser (400 ml), 2% Isopropanol (100 ml), 4% Isopropanol (200 ml) und 6% Isopropanol (200 ml) gewaschen. Die Fraktionen, die Disaccharid, 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, enthielten, wurden konzentriert, und der Rückstand (2,38 g) wurde aus Aceton-Wasser kristallisiert, wobei 1,55 g eines Feststoffes erhalten wurden, der wiederum aus dem gleichen Gemisch von Lösungsmitteln in einer Weise ähnlich der in Beispiel 7 verwendeten kristallisiert wurde. 1,32 g reines Disaccharid (32%) wurden erhalten.

Claims

Enzymatisches Verfahren zum Erhalt von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, umfassend: einen ersten Schritt des Herstellens eines ersten Reaktionsgemisches aus 2 bis 20 Gew.-% D-Xylose, 0,5 bis 5 Gew.-% eines 13-D-Galactopyranosid-Substrats, 75 bis 97,5 Gew.-% eines Reaktionsmediums, das gepuffertes Wasser mit einem pH zwischen 5,0 und 9,0 umfasst; Zugabe von 10 bis 1.000 Einheiten eines β-D-Galactosidase-Enzyms pro Gramm β-D-Galactopyranosid zu dem ersten Reaktionsgemisch; und Erhalt eines zweiten Reaktionsgemisches; einen zweiten Schritt, in dem das zweite Reaktionsgemisch einer Umsetzung bei einer Temperatur zwischen einer Temperatur, die höher ist als der Gefrierpunkt des zweiten Reaktionsgemisches, und 45°C 2 bis 48 Stunden lang unterzogen wird, um Disaccharide in dem zweiten Reaktionsgemisch zu bilden; einen dritten Schritt, in dem die Reaktion, nachdem die Disaccharide in der gewünschten Menge gebildet wurden, mit Hilfe einer Behandlung gestoppt wird, die ausgewählt ist aus Desaktivierung der β-D-Galactosidase durch Tiefkühlen des zweiten Reaktionsgemisches bei einer Temperatur zwischen –20°C und –170°C, Desaktivierung der β-D-Galactosidase durch Erwärmen des zweiten Reaktionsgemisches bei einer Temperatur zwischen 95 und 110°C, und Abtrennen der β-D-Galactosidase von dem zweiten Reaktionsgemisch durch Ultrafiltration; Erhalt eines dritten Reaktionsgemisches; einen vierten Schritt, in dem ein Aglycon-Fragment des in dem ersten Schritt verwendeten β-D-Galactopyranosid-Substrats von dem dritten Reaktionsgemisch durch Extraktion oder Filtration abgetrennt wird; Erhalt eines vierten Reaktionsgemisches; einen fünften Schritt, umfassend die Isolierung von Fraktionen, die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Isolationsschritt ausgewählt ist aus: i) Zugabe von Celite zu dem vierten Reaktionsgemisch, gefolgt von Fest-Flüssig-Extraktion mit einem Lösungsmittel und Eluieren mit einem ersten Eluierungsmittel in einer Säule oder ii) Zugabe von Aktivkohle zu dem vierten Reaktionsgemisch, gefolgt von Filtration und Eluieren mit einem zweiten Eluierungsmittel; einen sechsten Schritt, in dem die Fraktionen, die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose enthalten, in einem Kristallisationsgemisch kristallisiert werden, das ausgewählt ist aus: i) Gemischen von Aceton/Methanol in einem Verhältnis zwischen 5/1 bis 20/1 oder ii) Gemischen von Aceton/Wasser in einem Verhältnis zwischen 5/1 bis 20/1.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das vierte Reaktionsgemisch konzentriert wird, bevor es einer Elution in der Säule unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Aceton/Methanol ein Verhältnis von 10/1 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Aceton/Wasser ein Verhältnis von 10/1 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da s das erste Eluierungsmittel ein Gemisch von Wasser/Isopropanol ist, das 1 bis 10% (Vol./Vol.) Isopropanol enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Wasser/Isopropanol 2% (Vol./Vol.) Isopropanol enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der fünfte Schritt in der Zugabe von Celite zu dem vierten Reaktionsgemisch und Konzentrieren bis zur Trockne, gefolgt von Fest-Flüssig-Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel in einem Soxhlet-Apparat mit einer Patrone aus einem Material, das mit dem organischen Lösungsmittel kompatibel ist, und Eluieren mit einem ersten Eluierungsmittel in einer Säule, ausgewählt aus Filtrationssäulen mit vernetzten Dextranpolymer-Füllstoffen, Filtrationssäulen mit Acrylamidpolymer-Füllstoffen, Filtrationssäulen aus Aktivkohle oder Aktivkohle-Celite-Säulen, besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Ethylacetat ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel in einer Menge zwischen 10 ml und 25 ml pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Celite in einer Menge zwischen 1 g und 2 g pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule aus Aktivkohle-Celite besteht, wobei der Kohlenstoff durch Zugabe von 35% Salzsäure desaktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Celite in einer Menge zwischen 0,5 g und 2 g Celite pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivkohle in einer Menge zwischen 0,5 g und 2 g Aktivkohle pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Eluierungsmittel in einer Menge zwischen 5 ml und 25 ml pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Salzsäure in einer Menge zwischen 0,5 ml und 1,5 ml pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im fünften Schritt das vierte Reaktionsgemisch einer direkten Zugabe mindestens eines zweiten Eluierungsmittels auf die Aktivkohle unterzogen wird, wobei die 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose adsorbiert wird und das zweite Eluierungsmittel Wasser, gefolgt von verdünntem Isopropanol ist, wobei der Volumenanteil an Isopropanol in aufeinanderfolgenden Schritten zunimmt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an Isopropanol zwischen 1% und 3% in einem ersten Schritt, zwischen 3% und 5% in einem zweiten Schritt und zwischen 5% und 7% in einem dritten Schritt beträgt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivkohle in einer Menge zwischen 2 g und 4 g Aktivkohle pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Eluierungsmittel in einer Gesamtmenge zwischen 30 ml und 50 ml des zweiten Eluierungsmittels pro Gramm anfänglicher Xylose verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion durch Abkühlen des zweiten Reaktionsgemisches auf 0°C gestoppt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 16 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass das vierte Reaktionsgemisch durch Abtrennen des Aglycon-Fragments von dem β-D-Galactopyranosid-Substrat mittels Filtration erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an D-Xylose in dem zweiten Reaktionsgemisch 7,5 Gew.-% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an β-D-Galactopyranosid in dem zweiten Reaktionsgemisch 1,5 Gew.-% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 20 Einheiten β-D-Galactosidase pro Gramm R-D-Galactopyranosid zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium auch mindestens ein Colösungsmittel-Medium, ausgewählt aus Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dioxan und Gemischen davon, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium 20 Gew.-% des Colösungsmittel-Mediums umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei konstanter Temperatur durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktio nstemperatur –5°C bis 40°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur höher als der Gefrierpunkt des zweiten Gemischs und niedriger als 0°C ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur –5°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur Raumtemperatur ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium auf einen pH von 7 gepuffert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion im dritten Schritt durch Tiefkühlen des zweiten Reaktionsgemisches bei einer Temperatur von –78°C gestoppt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion im dritten Schritt durch Erwärmen des zweiten Reaktionsgemisches bis zu einer Temperatur von 100°C gestoppt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion im dritten Schritt durch Abtrennen der β-D-Galactosidase durch Ultrafiltration gestoppt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das β-D-Galactopyranosid-Substrat aus o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid und Lactose ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das 3-D-Galactosidase-Enzym E. coli-β-D-Galactosidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das β-D-Galactosidase-Enzym Kluyveramyces lactis-β-D-Galactosidase ist.