JP4115933B2

JP4115933B2 - ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースの酵素的製造方法、該方法によって得られる４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロース、該キシロースを含有する組成物および腸ラクターゼの評価における該キシロースの使用

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Publication number: JP4115933B2
Application number: JP2003505359A
Authority: JP
Inventors: フランシスコ・ハビエル・カニャダ・ビシナイ; ギリェルモ・コラレス・モラレス; アルフォンソ・フェルナンデス−マヨララス・アルバレス; マヌエル・マルティン・ロマス; フアン・ホセ・アラゴン・レイェス
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2022-06-14
Also published as: EP1408118A1; US20040241811A1; CA2451065A1; CA2451065C; ES2182703B1; PT1408118E; DE60210278T2; ATE321876T1; JP2004537298A; ES2182703A1; RU2004101406A; MXPA03011869A; ES2260444T3; DE60210278D1; EP1408118B1; US7537909B2; WO2002103038A1; RU2316593C2; AU2002314215B2

Description

本発明は、腸ラクターゼ活性の無血評価法において有用な化合物、特に二糖の入手法の分野に属する。

ラクターゼの不十分な消化能または消化不能をもたらす低い腸ラクターゼ活性または該活性の欠如は先天的代謝障害としてはまれであり、ヒトの成人における一般的な症候群である。しかしながら、大部分の哺乳類においては、離乳期からラクターゼ活性の顕著な低下がみられる。祖先が長い間にわたって乳または乳製品の消費に実質上依存してきたヒトの場合には、この活性低下は頻繁にはみられない。一方、離乳しない乳飲み子の場合、腸ラクターゼ活性の低下または欠如はむしろ珍しいことである。

腸ラクターゼ活性の測定は、小児科学および胃腸病学においては重要であり、該測定は、粘膜の試料から直接的におこなわれるか、またはラクターゼを被験者に投与した後の血中の糖濃度もしくは吐き出される水素から間接的におこなわれる。

直接的な測定は次のような欠点がある。即ち、その後の分析に付されるべき試料を採取するためには特殊な器具や訓練された専門家を必要とするだけでなく、被験者にとっては不快であると共に幾分危険を伴うので、直接的測定法は複雑でコスト高な方法である。

腸のラクターゼを測定する別の方法は、次の事実に基づくものである。即ち、二糖類がそれらのラクターゼに対する親和性に基づいてラクターゼ基質として作用し、該二糖類は酵素の作用によって特定の単糖類に変換され、該単糖類は腸によって容易に吸収され、尿中へ排出される。

スペイン国特許ES-P-9001680号明細書には、腸ラクターゼ活性を評価するための化合物であって、次式（Ｉ）で表される4-O-β-ガラクトピラノシル-D-キシロース二糖の調製法が記載されている：

該二糖は経口投与された後、腸ラクターゼの基質として作用するので、腸管内で分解されてキシロースとガラクトースを生成する。キシロースは吸収されて尿中へ排出されるので、キシロースは簡単な比色定量法によって直接的に評価することができる。尿中に排出されるキシロースの量は腸ラクターゼの濃度と相互に関連する。

スペイン国特許ES-P-9001680号明細書には、4-O-β-ガラクトピラノシル-D-キシロースの基本的な調製法も記載されている。この調製法は、ベンジルβ-D-キシロピラノシドを合成した後、これを一連の反応操作（選択的保護反応、グリコシル化反応および脱保護反応を含む）に付すことを含む方法である。多くの反応工程数、グリコシル化反応における銀トリフレートのような高価な試薬の使用および中間体と最終生成物の精製のためのクロマトグラフィーカラムの使用はこの製造法をコスト高なものとするので、該製造法を工業的規模で実施することは困難である。

スペイン国特許ES-P-9502185およびES-P-9701156号明細書には、二糖（Ｉ）を含むガラクトピラノシル−キシロース二糖並びに下記の式（II）および（III）によってそれぞれ表わされる該二糖の位置異性体である2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースおよび3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有する混合物の酵素的調製法が記載されている：

スペイン国特許ES-P-9502185号およびES-P-9701156号明細書に記載されている方法は、単一の反応工程とその後のクロマトグラフィー精製によって、基質として有用であって、腸ラクターゼの酵素活性の測定に有用な2-、3-および4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースから成る混合物を得ることが可能である。この方法は、入手しやすい基質と酵素に基づいて実行可能であるが、工業的合成の観点からは、最も適切な割合の特性づけ、該割合における調製の再現性および可能な不純物の測定の点で難点がある。

一方、ゴリンらによる次の文献には、細胞を使用する方法によって複数の二糖類、特に2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースと3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの合成法が記載されている：「スポロボロマイセス・シングラリス（Sporobolomyces Singularis）によるβ-ガラクト-およびβ-グルコ-ピラノシルの合成」、Can. J. Chem.、第42巻、第2307頁〜第2319頁（1964年）。しかしながら、この文献には、合成された異なる二糖の用途についての記載はない。

本発明の第１の課題は、従来技術の上記の不都合な点を克服することである。
本発明の別の課題は、D-キシロースとβ-D-ガラクトピラノシド基質との酵素反応とその後の単離精製段階を含む改良法であって、酵素反応の最終混合物中の4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの割合を2-および3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースに関して増加させると共に、最終混合物からの4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの単離を簡単な操作で可能にする該改良法を提供することである。

上記方法によって得られる4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースおよび該4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有する組成物は本発明の別の課題を構成する。
また、本発明のさらに別の課題は、腸ラクターゼ活性の生体内評価において有用な組成物および溶液の調製における4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの使用である。

本発明によれば、上記の課題は、下記の第１工程〜第６工程を含む4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの酵素的入手法によって達成された。
（１）第１工程：D-キシロース2〜20重量％、β-D-ガラクトピラノシド基質0.5〜5重量％およびpHを5.0〜9.0に緩衝化された水を含む反応媒体75〜97.5重量％を含有する第１反応混合物を調製し、β-D-ガラクトピラノシド1gあたり10〜1000ユニットのβ-D-ガラクトシダーゼ酵素を第１反応混合物に添加して第２反応混合物を得る。
（２）第２工程：第２反応混合物を、第２反応混合物の凝固点よりも高い温度〜45℃の温度における反応に2〜48時間付すことによって第２反応混合物中に二糖を生成させる。
（３）第３工程：所望量の二糖が生成した後、第２反応混合物を20℃〜-170℃の温度で凝固させることによるβ-D-ガラクトシダーゼの失活、第２反応混合物を95℃〜110℃の温度に加熱することによるβ-D-ガラクトシダーゼの失活および限外濾過による第２反応混合物からのβ-D-ガラクトシダーゼの分離から選択される処理によって反応を停止させる。
（４）第４工程：第１工程で使用したβ-D-ガラクトピラノシド基質のアグリコンフラグメントを第３反応混合物から抽出または濾過により分離させることによって第４反応混合物を得る。
（５）第５工程：4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有するフラクションを、（i）セライトを第４反応混合物に添加した後、該混合物を溶剤を用いる固体−液体抽出処理に付し、次いでカラム中での第１溶離液を用い溶出処理に付す操作および（ii）活性炭を第４反応混合物中へ直接添加した後、該混合物を濾過処理に付し、次いで第２溶離液を用いる溶出処理に付す操作から選択される処理操作によって分離させる。
（６）第６工程：4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有するフラクションを、アセトン／メタノール混合物（混合比：5/1〜20/1）およびアセトン／水混合物（混合比：5/1〜20/1）から選択される晶出混合物中で晶出させる。

本発明によれば、第２反応混合物中のD-キシロースの含有量は好ましくは7.5重量％であり、第２反応混合物中のβ-D-ガラクトピラノシドの含有量は1.5重量％であり、また、β-D-ガラクトピラノシド1gあたり100ユニットのβ-D-ガラクトシダーゼが添加される。

所望により、反応媒体はジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびこれらの混合物から選択される補助溶剤媒体を少なくとも含有していてもよく、その好ましい含有量は反応媒体に対して20％である。本発明の１つの態様においては、反応媒体はpH7に緩衝化される。

反応は再現性を増加させるために、一定の温度でおこなうのが簡便である。本発明の１つの態様においては、反応温度は、第２反応混合物の凝固点よりも高く、40℃よりも低い温度である。別の態様においては、反応は室温でおこない、これによって第２反応混合物の冷却を必要とすることなく、良好な収率を得ることができる。反応は-5℃または37℃でおこなってもよい。反応温度は0℃よりも低くし、第２反応混合物の凝固点よりも高くするのが好ましい。

本発明によれば、β-D-ガラクトピラノシド基質はo-ニトロフェニルβ-D-ガクラトピラノシド（Gal-ONP）およびラクトースから選択するのが好ましい。β-ガラクトシダーゼ酵素は大腸菌β-ガラクトシダーゼまたはクリーベラマイセス・ラクチス（Kluyveramyces lactis）β-ガラクトシダーゼ［例えば、マキシラクト（MAXILACT）（登録商標）］であってもよい。Gal-ONPを基質として使用する場合、o-ニトロフェノールが反応中に生成し、該化合物は、反応を加熱によって停止させる場合には酢酸エチルを用いる抽出によって除去され、また、反応を冷却によって停止させる場合には簡単な濾過処理によって除去される。

第３工程において反応を第２反応混合物の凝固によって停止させる場合には、温度は-78℃にするのが好ましい。一方、第３工程において反応を第２反応混合物の加熱によって停止させる場合には、温度は100℃にするのが好ましい。

第５工程においては、4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースはいくつかの別の方法によって反応混合物から単離してもよい。

第１の別の方法によれば、第４反応混合物から水を除去することによって、二糖含有反応残渣が得られ、該反応残渣をアセチル化処理に付すことによって過アセチル化4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース誘導体が得られ、該過アセチル化誘導体はシリカゲルクロマトグラフィーカラム中で分離される。反応残渣のアセチル化はピリジン中において無水酢酸を用いておこなうのが好ましく、一方、過アセチル化誘導体の脱アセチル化はメタノール中においてナトリウムメトキシドを用いて触媒的におこなわれる。

第２の別の方法によれば、第４反応混合物は第１溶離液を用いるカラム中での溶出処理に付される。この場合、第１溶離液は水とメタノール、エタノールもしくはイソプロパノールとの混合物から選択してもよく、好ましくは、イソプロパノールを1〜10％（v/v）、好ましくは2％（v/v）含有する水／イソプロパノール混合物である。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有するフラクションを得るための溶出処理は、次の濾過カラム中でおこなわれる：架橋デキストランポリマーフィラーを有する濾過カラム［例えば、セファデックス（SEPHADEX）フィラーを有するカラム］、アクリルアミドポリマーフィラーを有する濾過カラム［例えば、バイオゲル（BIOGEL）フィラーを有するカラムおよび活性炭製もしくは活性炭−セライト製の濾過カラム］。

好ましくは、第４反応混合物は、カラム中での溶出処理に付す前に濃縮させる。第３の別の方法によれば、セライトを第４反応混合物に添加し、得られる混合物を濃縮乾燥させ、得られる残渣はソクスレー抽出器中における有機溶剤を用いる固体−液体抽出処理に付される。固体−液体抽出用の好ましい溶剤は酢酸エチルである。カラムは次のカラムから選択される：架橋デキストランポリマーフィラーを有する濾過カラム（例えば、セファデックスフィラーを有するカラム）、アクリルアミドポリマーフィラーを有する濾過カラム（例えば、バイオゲルフィラーを有するカラム）および活性炭製もしくは活性炭−セライト濾過カラム。好ましいカラムは活性炭−セライト製カラムであり、活性炭は塩酸の添加によって失活させる。

この第３の別の方法は、カラム中での溶出処理をおこなう前に大部分のキシロースが除去されるという利点をもたらし（特に、反応中に多量のキシロースを使用する場合）、これによって溶出処理に必要なフィラーと第１溶離液の量を大きく減らすことができる。この第３の別の方法の他の利点は、酢酸エチル中での固体−液体抽出が完全に選択的におこなわれることであり、液相中には二糖は存在せず、わずかのキシロースとガラクトースが存在するに過ぎない。

第４の別の方法によれば、第５工程中の溶出処理は、フィラーカラムを使用せずに、活性炭を第４反応混合物に添加することによっておこなわれる。第４工程においてアグリコンフラグメントが基質から分離されると、4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースが活性炭に吸着され、4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースは第２溶離液を用いて活性炭から溶出される。この溶出処理は、水および希釈イソプロパノールを用いて連続的に洗浄することによっておこなうのが好ましい。希釈イソプロパノールを用いる場合には、イソプロパノールの体積を逐次的に増加させてゆく。イソプロパノールの体積量は第１段階においては1〜3％であり、第２段階においては3〜5％であり、第３段階においては5〜7％である。洗浄用のイソプロパノールの好ましい逐次的濃度は最初は2％であり、次いで4％のイソプロパノールを用いる溶出処理をおこなった後、6％のイソプロパノールを用いる溶出処理をおこなう。得られる残渣をアセトン−水中での濃縮晶出化によって純粋な4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースが得られる。

好ましくは、この第４の別の方法によれば、反応用基質としては、o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドが使用される。

この第４の別の方法によれば、多くの利点が得られる。例えば、反応を停止させるために第２反応混合物を100℃まで加熱する必要がなく、また、第４工程においてアグリコンフラグメントを抽出処理によって基質から分離させる必要もない。同様に、第４反応混合物を濃縮させる必要もないので、該混合物のカラメル化物も生成しない。カラムのフィラーとして必要な活性炭の量も低減され、また、溶離液の全量も低減され、さらにセライトの使用も回避される。

本発明の第６工程によれば、アセトン／メタノール混合物（混合比：5/1〜20/1）およびアセトン／水混合物（混合比：5/1〜20/1、好ましくは10/1）から選択される晶出混合物中で得られる4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースが晶出する。

本発明は、上記の方法によって得られる4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース、該方法によって得られる4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有する組成物、塩溶液もしくは水溶液、並びにヒトの腸ラクトースの生体内評価用の組成物および溶液の調製における4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの使用にも関する。

このような組成物と溶液において、β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースは製薬学的に許容される量の少なくとも１種の添加剤と併用される。このような添加剤は常套の製薬学的に許容される次のものから選択される：安定剤、保護剤、香味剤、ラクトース、ゲル化剤、流動化剤および防腐剤。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースまたはこれを含有する組成物もしくは溶液は経口投与され、キシロースは尿中に排出され、分光光度法によって分析されるキシロースは、ラクターゼ活性の欠損の診断的評価のための特定の簡単な無血常套法において利用される。

本発明を、上記の特徴のいくつかをより詳細に例示的に記載する以下の実施例に基づいて説明する。
（実施例１）
反応温度の影響を測定するために、以下の試験をおこなった。D-キシロース125mg（500mM）、o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド25mg（50mM）および反応媒体［pHが7に緩衝化された水溶液（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mMメルカプトエタノール）］1.75mlから成る反応混合物の試料を調製し、これらの試料に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素を下記の所定のユニットで添加し、下記の反応温度に付した：
反応温度（℃）酵素の添加ユニット（ｕ）
45 1.6
37 1.6
25 1.6
5 10
-5 20

反応温度の低下による反応低下を補償するためには酵素の添加量の増加が必要であった。試料中の高濃度の糖に起因して発生する凝固点降下に基づいて、水の凝固点よりも低い温度で反応をおこなうことも可能であることに留意すべきである。

各々の試料および各々の工程における4-、2-および3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの割合は炎イオン化検出とSE-54毛細管カラム（長さ：15m、内径：0.15mm、太さ：0.3μm）を備えたクロマトグラフ装置を使用して測定した。窒素ガスの流速は1ml／分とした。また、温度プログラムは次の通りである：
初期温度：160℃
初期時間：2分間
昇温速度：5℃／分
最終温度：250℃

試料は以下の手順に従ってトリメチルシリル化処理に付した後で分析した。アリコート（10μl）を-170℃で凝固させ、乾燥残渣が得られるまで凍結乾燥処理に付し、次いで内部基準としてベンジルβ-D-キシロピラノシド（10mM）を含有するピリジン（25μl）およびN-トリメチルシルイミダゾール（25μl）を乾燥残渣へ添加し、得られた混合物を60℃で30分間加熱した。異なる二糖に帰属されるピークの保持時間は次の通りである：
ベンジルβ-D-キシロピラノシド：12.04分間
2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース：18.46分間および19.50分間
3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース：18.30分間
4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース：20.35分間および20.50分間

以下の表１は二糖の最大収率のときに得られた4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース（化合物Ｉ）の、位置異性体2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース（化合物II）および3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース（化合物III）の全量に対する比を示す。

上記の表１から明らかなように、温度低下に伴って、4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの割合が増加する。

（実施例２）
反応に対するpHの影響を測定するために、下記の配合処方に従って試料を調製し、37℃で反応させた。
（i）Gal-ONP（50mM）：25mg
（ii）D-キシロース（500mM）：125mg
（iii）大腸菌ガラクトシダーゼ：1.6u
（iv）pHが8.5、7および5に緩衝化された水溶液（リン酸カリウム50mM、MgCl₂ 1mM、メルカプトエタノール 5mM）：各々1.6ml
反応は実施例１に記載の方法に従って進行させた。以下の表２は、得られた位置異性体2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース（化合物II）および3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース（化合物III）の全量に対する4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース（化合物I）の比を示す。

上記の表２から明らかなように、塩基性媒体（pH＝8.5）中での化合物Iの割合は、中性媒体（pH＝7）中の場合よりも低く、また、酸性媒体（pH＝5）中での化合物Iの割合は最も低い。

（実施例３）
4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するために、pHを7に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）にo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）6gおよびD-キシロース25gを溶解させ、得られた溶液に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素2mg（640u）を添加し、得られた溶液をオービタルスターラー（orbital stirrer）内において、Gal-ONPが実質上消費されるまで（約4時間）、30℃におけるインキュベーション処理に付した。反応の追跡は、溶離液としてイソプロパノール／NH₃（30％）／H₂O混合物（混合比：7.5／0.5／2.5）を用いる薄層クロマトグラフィー（tlc）によっておこなった。この場合、基準としては下記のRf値を用いた。
Rf（Gal-ONP）：0.58
Rf（D-キシロース）：0.47
Rf（4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース）：0.17
Rf（2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース+3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D
-キシロース）：0.26

反応は、反応混合物を100℃の湯浴中で10分間加熱することによって停止させ、次いで生成したo-ニトロフェノールをCH₂Cl₂を用いて抽出した。水溶液を濃縮乾燥させ、残渣を常套法に従ってアセチル化処理に付した。即ち、該処理は無水酢酸／ピリジン混合物（混合比：1/1）を用いて、磁気攪拌条件下において室温で一夜おこなった。次いで反応混合物を濃縮させ、ピリジンと無水酢酸の残渣はトルエンの逐次的な添加と蒸発処理によって除去した。沈殿した塩は濾去し、濾液を濃縮乾燥させ、残渣を、溶離液として4：1〜1：1のヘキサン／酢酸エチルの勾配（gradient）を用いるシリカゲルカラム中でのクロマトグラフィー処理に付した。最初のアセチル化D-キシロースを該カラムから溶離させた後、アセチル化二糖の混合物を溶離させた。二糖の混合物を含有するフラクションを濃縮した後、残渣をMeOHに溶解させ、この溶液に1M MeONa／MeOH溶液を添加し、得られた混合物を、脱アセチル化が完結するまで攪拌した（反応の追跡はイソプロパノール／NH₃／H₂O混合物を用いるtlcによっておこなった）。

遊離の二糖混合物をMeOH／アセトンを用いる晶出処理に連続的に２回付すことによって純粋な4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを17％の収率（初期のGal-ONPに基づく値）で得た。生成物の物性値は次下の通りである。
融点：171〜176℃
¹H-NMR(D₂O)：δ5.17および4.58（2d、1H、J3.8および7.8Hz、H-1αおよびH-1β）、4.55および4.45（2d、1H、J7.8Hz、H-1'）、4.05（dd、1H、J5.3および11.6Hz、H-5e）、3.38（dd、1H、J10.6および11.6Hz）、3.25（dd、1H、J7.8および9.4Hz、H-2'）

（実施例４）
活性炭（DARCO G-60）200gおよびセライト200gを乾式混合し、該混合物に対して、均質なペーストが形成されるまで水を添加することによって活性炭／セライトカラムを調製した。このペーストをHCl（35％）150mlで処理することによって活性炭を失活させると共に、鉄とアルカリ性灰分の残渣を洗い流し、次いで水洗した（水洗は洗液が中性になるまでおこなった）。洗浄後、ペーストをクロマトグラフィーカラム（直径：5cm、長さ：50cm）に充填して圧縮した。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するためには、pHを7に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）330mlにo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）5gおよびD-キシロース25gを溶解させ、この溶液に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素を添加し、得られた溶液をオービタルスターラー内において、Gal-ONPが実際上消費されるまで（約２時間）、37℃でのインキュベーション処理に付した。実施例３に記載の手順に従い、反応混合物を100℃で10分間の加熱処理に付すことによって反応を停止させ、生成したo-ニトロフェノールを酢酸エチルを用いて抽出した。水溶液を約50mlになるまで濃縮し、濃縮物をガラスウールを通す濾過処理に付した後、活性炭／セライトカラムを通過させた。

最初に、過剰のD-キシロースを溶出させ、次いでEtOH/H₂O（EtOH：2〜10％）のグラジエントを用いて二糖混合物を捕集した。4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース位置異性体が濃縮されたフラクションを一緒にし、このフラクションを濃縮処理に付した後、濃縮フラクション中へ、濁りが発現するまでアセトンを添加し、得られた混合物を冷却させた。純粋な形態の4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを晶出させた。収量は970mgであり、初期のGal-ONPに基づく収率は19％である。生成物のスペクトルデータは実施例３で得られた生成物のデータと一致した。

（実施例５）
活性炭（DARCO G-60）200gおよびセライト200gを乾式混合し、該混合物に対して、均質なペーストが形成されるまで水を添加することによって活性炭／セライトカラムを調製した。このペーストをHCl（35％）150mlで処理することによって活性炭を失活させると共に、鉄とアルカリ性灰分の残渣を洗い流し、次いで水洗した（水洗は洗液が中性になるまでおこなった）。洗浄後、ペーストをクロマトグラフィーカラム（直径：5cm、長さ：50cm）に充填して圧縮した。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するためには、pHを7に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）にo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）5gおよびD-キシロース25gを溶解させ、この溶液に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素2mg（640u）を添加し、得られた溶液をオービタルスターラー内において、Gal-ONPが実際上消費されるまで（約２時間）、37℃でのインキュベーション処理に付した。実施例３に記載の手順に従い、反応混合物を100℃で10分間の加熱処理に付すことによって反応を停止させ、生成したo-ニトロフェノールを酢酸エチルで抽出した。水溶液を50mlまで濃縮し、濃縮物をガラスウールを通す濾過処理に付した後、活性炭／セライトカラムを通過させた。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを晶出させるために、最初に過剰のD-キシロースを水で溶出させ、次いでEtOH／H₂O（EtOH：2〜10％）のグラジエントを用いて二糖混合物を捕集した。4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース位置異性体が濃縮されたフラクションを一緒にし、このフラクションを濃縮処理に付した後、濃縮物を出来るだけ少量の水に溶解させ、次いで得られた溶液中へ、濁りが発現するまでアセトンを滴下し、得られた混合物を室温で２時間放置した。２時間後、透明な上澄みを薄層によって調べたところ、未晶出の4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースが残存することが認められた。再び濁りが発現するまでアセトンを添加し、得られた混合物をさらに２時間放置した。最後に、さらにアセトンを添加して得られた混合物を冷蔵庫内で一夜保存したところ、生成した上澄み中にはわずかに少量の4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースが含まれているに過ぎなかった。4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの結晶を濾取した後、アセトンを用いて洗浄した。

上記の操作によって純粋な形態の4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを1557mg（初期のGal-ONPに基づく収率は30％）得た。この生成物のスペクトルデータは、実施例３で得られた生成物のデータに一致した。

（実施例６）
活性炭（DARCO G-60）200gおよびセライト200gを乾式混合し、該混合物に対して、均質なペーストが形成されるまで水を添加することによって活性炭／セライトカラムを調製した。このペーストをHCl（35％）150mlで処理することによって活性炭を失活させると共に、鉄とアルカリ性灰分の残渣を洗い流し、次いで水洗した（水洗は洗液が中性になるまでおこなった）。洗浄後、ペーストをクロマトグラフィーカラム（直径：5cm、長さ：50cm）内へ充填して圧縮した。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するために、pHを6.8に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）330mlにo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）5gおよびD-キシロース25gを溶解させ、この溶液にクリーベラマイセス・ラクチス（Kluyveramyces lactis）［マキシラクト］β-ガラクトシダーゼ酵素70ユニットを添加し、得られた溶液をオービタルスターラー内において、Gal-ONPが実際上消費されるまで（約２時間）、37℃でのインキュベーション処理に付した。反応をイソプロパノール／NH₃（30％）／H₂O混合物（混合比：7.5／0.5／2.5）を用いる薄層クロマトグラフィーを用いて追跡したところ、以下のRf値が得られた。
Rf（Gal-ONP）：0.58
Rf（D-キシロース）：0.47
Rf（4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース）：0.17
Rf（2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース+3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D
-キシロース）：0.26

実施例４に記載の手順に従い、反応混合物を100℃で10分間加熱することによって反応を停止させ、生成したo-ニトロフェノールを酢酸エチルで抽出し、濾過処理に付すことによって酵素残渣を除去した。水溶液を真空下で約45mlになるまで濃縮し、濃縮物を活性炭／セライトカラムを通過させた。最初に、過剰のD-キシロースを水で溶出させ、次いでEtOH／H₂O(EtOH：2〜10％）のグラジエントを用いて二糖混合物を捕集した。4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース位置異性体が濃縮されたフラクションを一緒にし、このフラクションを濃縮処理に付した後、アセトンを、該濃縮物中に濁りが発現するまで添加し、得られた混合物を冷却させた。晶出した4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを濾過プレートを用いることによって濾取した。収量は817mg（初期のGal-ONPに基づく収率：16％）であった。

（実施例７）
活性炭（DARCO G-60）200gおよびセライト200gを乾式混合し、該混合物に対して、均質なペーストが形成されるまで水を添加することによって活性炭／セライトカラムを調製した。このペーストをHCl（35％）150mlで処理することによって活性炭を失活させると共に、鉄とアルカリ性灰分の残渣を洗い流し、次いで水洗した（水洗は洗液が中性になるまでおこなった）。洗浄後、ペーストをクロマトグラフィーカラム（直径：5cm、長さ：50cm）内へ充填して圧縮した。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するために、pHを7に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）330mlにo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）5gおよびD-キシロース25gを溶解させ、この溶液に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素80ユニットを添加し、得られた溶液をオービタルスターラー内において、37℃でのインキュベーション処理に24時間付した。反応をイソプロパノール／NH₃（30％）／H₂O混合物（混合比：7.5／0.5／2.5）を用いる薄層クロマトグラフィーを用いて追跡したところ、以下のRf値が得られた。
Rf（Gal-ONP）：0.58
Rf（D-キシロース）：0.47
Rf（4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース）：0.17
Rf（2-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース+3-O-β-D-ガラクトピラノシル-D
-キシロース）：0.26

実施例３に記載の手順に従い、反応混合物を100℃で10分間加熱することによって反応を停止させ、生成したo-ニトロフェノールを酢酸エチルで抽出し、濾過処理に付すことによって酵素残渣を除去した。水溶液を真空下で約70mlになるまで濃縮し、濃縮物を活性炭／セライトカラムを通過させた。最初に、イソプロパノール／水（2％）を用いる溶出をおこなって1.3リットルのフラクションを捕集した。次いでイソプロパノール／水（4％）を用いる溶出によって2.6リットルまでのフラクションを捕集した（全フラクション：3.9リットル）。4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース位置異性体が濃縮されたフラクションを一緒にし、このフラクションを濃縮処理に付した後、アセトンを、該濃縮物中に濁りが発現するまで添加し、得られた混合物を冷却させた。晶出した4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを濾過プレートを用いることによって濾取した。収量は1213mg（初期のGal-ONPに基づく収率：24％）であった。

（実施例８）
活性炭（DARCO G-60）24gおよびセライト24gを乾式混合し、該混合物に対して、均質なペーストが形成されるまで水を添加することによって活性炭／セライトカラムを調製した。このペーストをHCl（35％）18mlで処理することによって活性炭を失活させると共に、鉄とアルカリ性灰分の残渣を洗い流し、次いで水洗した（水洗は洗液が中性になるまでおこなった）。洗浄後、ペーストをクロマトグラフィーカラム内へ充填して圧縮した。

4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するために、pHを7に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）330mlにo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）5gおよびD-キシロース25gを溶解させ、この溶液に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素80ユニットを添加し、得られた溶液をオービタルスターラー内において、Gal-ONPが実際上消費されるまで（24時間）、37℃でのインキュベーション処理に付した。反応をイソプロパノール／NH₃（30％）／H₂O混合物（混合比：7.5／0.5／2.5）を用いる薄層クロマトグラフィーを用いて追跡したところ、実施例７の場合と同様の結果が得られた。

実施例３に記載の手順に従い、反応混合物を100℃で10分間加熱することによって反応を停止させ、冷却後、生成したo-ニトロフェノールを酢酸エチルで抽出した。水溶液中にセライト（40g）を添加し、この混合物を濃縮乾燥させた。固体状残渣を、セルロースカートリッジを備えたソクスレー抽出器を用いる固体−液体抽出処理に付した（溶剤としては酢酸エチルを500ml使用した。23時間後、得られた固体を水洗し（3×40ml）、水溶液を活性炭／セライトカラムを通して溶出させた。最初に、該水溶液をイソプロパノール／水（2％）混合液を用いて溶出させ、次いでイソプロパノール／水（4％）混合液を用いて溶出させた（使用した全溶離液の全量は400mlである）。4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロース位置異性体が濃縮されたフラクションを一緒にし、このフラクションを濃縮乾燥させた。残渣を実施例７に記載の場合と同様にしてアセトン−水混合液からの晶出処理に付すことによって純粋な結晶性二糖を0.44g得た。

（実施例９）
4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを合成するために、pHを7に緩衝化した水（0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM メルカプトエタノール）272mlにo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Gal-ONP）4.12gおよびD-キシロース20.6gを溶解させ、この溶液に大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素を添加し、得られた溶液をオービタルスターラー内において、Gal-ONPが実際上消費されるまで（21時間）、37℃でのインキュベーション処理に付した。反応混合物を0℃まで冷却させることによって反応を停止させ、o-ニトロフェノールを固体として濾別した。濾液に活性炭60gを添加し、得られた混合物を30分間攪拌させた。上澄みをtlcで調べたところ、溶液中には二糖が存在しないことが観測されたが、これは二糖が活性炭に吸着されたからである。混合物を濾過処理に付し、活性炭を水（400ml）、2％イソプロパノール（100ml）、4％イソプロパノール（200ml）および6％イソプロパノール（200ml）を用いて洗浄した。二糖4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有するフラクションを濃縮させ、残渣をアセトン／水混合液からの晶出処理に付すことによって得られた固体（1.55g）を実施例７に記載の場合と同様にして同じ混合溶剤から再結晶させることによって純粋な二糖を1.32g（収率：32％）得た。

Claims

下記の第１工程〜第５工程を含む4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースの酵素的入手法において、
（i）第５工程を、ａ）第４工程の反応混合物へセライトを添加した後、溶剤を用いる固体−液体抽出をおこない、次いでカラム中で第１溶離液を用いて溶離をおこなう工程およびｂ）第４工程の反応混合物へ活性炭を直接添加した後、濾過処理をおこない、次いで第２溶離液を用いる溶離をおこなう工程から選択すること、並びに、
（ii）第６工程において、4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有するフラクションを、アセトン／メタノール混合物（混合比：5/1〜20/1）およびアセトン／水混合物（混合比：5/1〜20/1）から選択される晶出混合物中で晶出させること
を特徴とする該酵素的入手法：
第１工程：D-キシロース2〜20重量％、β-D-ガラクトピラノシド基質0.5〜5重量％およびpHが5.0〜9.0に緩衝化された水を含有する反応媒体75〜97.5重量％から成る第１反応混合物を調製し、次いでβ-D-ガラクトピラノシド1gあたり10〜1000ユニットのβ-D-ガラクトシダーゼを第１反応混合物へ添加して第２反応混合物を得る。
第２工程：第２反応混合物を該第２反応混合物の凝固点と45℃との間の温度での反応に2〜48時間付すことによって第２反応混合物中に二糖を生成させる。
第３工程：所望量の二糖の生成後、第２反応混合物を20℃〜-170℃の温度で凝固させることによってβ-D-ガラクトシダーゼの失活および第２反応混合物を95℃〜110℃の温度で加熱することによるβ-D-ガラクトシダーゼの失活から選択される処理によって二糖の生成反応を停止させ、次いで第２反応混合物からβ-D-ガラクトシダーゼを限外濾過によって分離させることによって第３反応混合物を得る。
第４工程：第１工程において使用したβ-D-ガラクトピラノシド基質のアグリコンフラグメントを抽出処理または濾過処理によって第３反応混合物から分離させることによって第４反応混合物を得る。
第５工程：4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースを含有するフラクションを単離させる。
第４反応混合物がカラム中での溶出に付される前に濃縮される請求項１記載の方法。
アセトン／メタノール混合物の混合比が10/1である請求項１記載の方法。
アセトン／水混合物の混合比が10/1である請求項１記載の方法。
第１溶離液が、イソプロパノールを1〜10％(v/v)含有する水／イソプロパノール混合物である請求項１記載の方法。
水／イソプロパノール混合物がイソプロパノールを2％(v/v)含有する請求項１記載の方法。
第５工程が次の過程を含む請求項１記載の方法：（i）第４反応混合物中へセライトを添加した後、該混合物を濃縮乾燥させ、これをソクスレ−抽出器中での有機溶剤を用いる固体−液体抽出処理に付し（該抽出器は該有機溶剤に対して適合性のある材料から製造されたカートリッジを具有する）、次いで（ii）架橋デキストランポリマーフィラーを有する濾過カラム、アクリルアミドポリマーフィラーを有する濾過カラム、活性炭製濾過カラムおよび活性炭−セライトカラムから選択されるカラム中において第１溶離液を用いる抽出処理をおこなう。
溶剤が酢酸エチルである請求項７記載の方法。
溶剤の使用量が当初のキシロース1gあたり10ml〜25mlである請求項７記載の方法。
セライトの使用量が当初のキシロース1gあたり1g〜2gである請求項７記載の方法。
カラムが活性炭−セライト製カラムであり、該活性炭が35％の塩酸の添加によって不活性化された請求項７記載の方法。
セライトの使用量が当初のキシロース1gあたり0.5g〜2gである請求項１１記載の方法。
活性炭の使用量が当初のキシロース1gあたり0.5g〜2gである請求項１１記載の方法。
第１溶離液の使用量が当初のキシロース1gあたり5ml〜25mlである請求項７記載の方法。
塩酸の使用量が当初のキシロース1gあたり0.5ml〜1.5mlである請求項１１記載の方法。
第５工程において、第４反応混合物を、4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-キシロースが吸着された活性炭上において少なくとも第２溶離液の直接的添加処理に付し、該第２溶離液がイソプロパノールの体積を逐次的段階で増加させてイソプロパノールで希釈させてゆく水である請求項１記載の方法。
第１段階、第２段階および第３段階におけるイソプロパノールの量が、それぞれ1〜3容量％、3〜5容量％および5〜７容量％である請求項１６記載の方法。
活性炭の使用量が当初のキシロース1gあたり2g〜4gである請求項１６記載の方法。
第２溶離液の全使用量が当初のキシロース1gあたり30ml〜50mlである請求項１６記載の方法。
第２反応混合物を0℃で冷却させることによって反応を停止させる請求項１または１６記載の方法。
第４反応混合物を、β-D-ガラクトピラノシド基質からアグリコンフラグメントを濾過により分離させることによって得る請求項１、１６または２０記載の方法。
第２反応混合物中のD-キシロースの量が7.5重量％である請求項１記載の方法。
第２反応混合物のβ-D-ガラクトピラノシドの量が1.5重量％である請求項１記載の方法。
β-D-ガラクトピラノシド1gあたりβ-D-ガラクトシダーゼを20ユニット添加する請求項１記載の方法。
反応媒体が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種の補助溶剤も含有する請求項１記載の方法。
反応媒体が補助溶剤を20重量％含有する請求項２５記載の方法。
反応を一定の温度でおこなう請求項１記載の方法。
反応温度が、-5℃〜40℃である請求項１または２７記載の方法。
反応温度が、第２反応混合物の凝固温度よりも高く、0℃よりも低い請求項１または２７記載の方法。
反応温度が-5℃である請求項１、２８または２９記載の方法。
反応温度が室温である請求項１または２８記載の方法。
反応媒体がpH7に緩衝化される請求項１、２６または２７記載の方法。
第３工程において、第２反応混合物を-78℃で凝固させることによって反応を停止させる請求項１記載の方法。
第３工程において、第２反応混合物を100℃まで加熱することによって反応を停止させる請求項１記載の方法。
第３工程において、β-D-ガラクトシダーゼを限外濾過により分離させることによって反応を停止させる請求項１記載の方法。
β-D-ガラクトピラノシド基質がo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドおよびラクトースから選択される請求項１記載の方法。
β-D-ガラクトシダーゼ酵素が大腸菌β-D-ガラクトシダーゼである請求項１記載の方法。
β-D-ガラクトシダーゼ酵素がクリーベラマイセス・ラクチス（ Kluyver amyces lactis ）β-D-ガラクトシダーゼである請求項１記載の方法。