JPH04502863A

JPH04502863A - 芳香成分および芳香物質のグリコシド型前駆体からの該芳香成分および芳香物質の製造方法および該方法を用いて得られる芳香成分および芳香物質

Info

Publication number: JPH04502863A
Application number: JP2512376A
Authority: JP
Inventors: ギュナータ　ジーヤ; ビテュール　シルヴェーヌ; ボーム　レイモン; ブリウ　ジャン　マルク; タピエロ　クロード; ベイヨノーヴ　クロード; コルドニエール　ロベール
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Gist Brocades NV
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Gist Brocades NV
Priority date: 1989-09-07
Filing date: 1990-09-07
Publication date: 1992-05-28
Also published as: US5985618A; DK0416713T3; ES2027946T1; DE69010120T3; ATE107477T1; DE69010120T2; DE416713T1; PT95246A; EP0416713B2; ES2027946T5; ZA907143B; DK0416713T4; AU639024B2; EP0416713A1; GR3031076T3; ES2027946T3; DE69010120D1; EP0416713B1; WO1991003174A1; AU6338990A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】芳香成分および芳香物質のグリコシド型前駆体からの該芳香成分および芳香物質の製造方法および該方法を用いて得られる芳香成分および芳香物質本発明は芳香成分および芳香物質のグリコシド型前駆体からの該芳香成分および芳香物質の製造方法ならびに該方法で得られる芳香成分および芳香物質に関する。

（技術分野）マスカットのようなワイン類似物の場合にはその芳香化合物が遊離型および結合型の２つの状態で存在する。遊離画分は芳香性で揮発性の物質、主にテルベノール類を含んでいる。−力結合画分はテルベノール類の前駆体、特にα−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−Ｄ−グルコピラノシド類（略号Ｒｈａ−Ｇ　１　ｃ）、α− Ｌ−アラビノフラノシルーβ−Ｄ−グルコピラノシド類（略号Ａ　ｒａ−Ｇ　１　ｃ）およびβ−Ｄ−アピオフラノシルーβ−Ｄ−グルコピラノシド類（略号Ａｐｉ−Ｇｊ！ｃ）から生成する非芳香性ジグリコシド類を含んでいる。これらの場合、式％式％で表わされるようにグルコビラノースがテルペン残基（略号Ｔｅｒｐ）および三糖類の間の結合を提供している。

前駆体型の芳香画分は通常遊離芳香画分よりも大きく　（一般に３〜１０倍）、かつリットル当り数ミリグラムのオーダーで溶解し得る。

さらに特にスレッシュホールドの嗅覚およびテルペンアルコール類の芳香性を考慮するとぶどうの木には非常に重要でまた使用果汁中に存在するテルペングリコシド類は広範囲な有効性を持つ市販の酵素調製物を用いて加水分解し得る。果汁のｐＨにおける熱的加水分解で放出されるものより忠実にその果実の天然の芳香を反映するテルペノール類の酵素的放出が可能となる。しかし、芳香性の工業的使用を目的としたこの放出の制御はその加水分解を担うグリコシダーゼの決定およびその作用メカニズムの解明が前提となる。

（関連技術）ストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）等（パーリアメント（Ｐａｒｌｉａｍｅｎｔ）等、Ｂｉｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｒｏｍａｓ、　１９８６、アメリカ化学会、ワシントン　Ｄ、　Ｃ，ｐｐ　２２２−２３９）はぶどうおよびワインの香りにおけるモノテルペン類の重要性およびこれらの化合物が特にワイン製造に重要とされている変種の特性に寄与する程度について議論している。

ピサ一二スキー（Ｐｉｓａｒｎｉｔｓｋｉｉ）、　Ａ７Ｆ、　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔ１２８６５０ｃ、　１９７１．　コロンバス、オハイオ）は、産物中に存在する芳香物質の酵素的合成を担うバルブ酵素の活性を増加し、かつ最終産物に目的の芳香を付与するため、バルブ中の物質を産物に含めることによりワインに香りを付与する方法を発表した。

ドラワー）　（Ｄｒａｗｅｒｔ）　Ｆ、等（Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、、　１９７８゜２６１！、３号、ｐｐ　７６５−７６６）は好気的に培養したイーストクルイベロミセス　ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｌａｃｔｉｓ）から産生される香気性構成物質中のモノテルペン類シトロネロール、リナロールおよびゼラニオールの存在を発表した。

（本発明の概要）本発明は連続型の酵素的加水分解メカニズムに基づいている。

したがってグリコシド類前駆体から芳香成分および芳香物質を得る本発明の方法には以下のような特徴がある。

第１に該前駆体の少なくとも】っを含むグリコシド物質の酵素的加水分解が該前駆体の構造に応じて選択される少なくとも１つの酵素により行なわれそのグリコシド結合の切断により対応するモノグリコシドが放出される、第２に、その産物の酵素的加水分解は第１の酵素（類）と同じか、または異なる少なくとも１つの酵素で行ない、アグリコン−炭水化物結合の切断により芳香成分および芳香物質を放出するよう設計されている。

（図面の簡単な説明）第１図：　α−ラムノジダーゼおよびβ−グルコシダーゼ活性のクロマトグラフィー曲線。

第２図：　α−アラビノシダーゼ、α−ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ活性のクロマトグラフィー曲線・第３図：　ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂイオン交換クロマトグラフイーによるα−アラビノシダーゼ、α−ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ活性のクロマトグラフィー曲線。

第４図：　コンカナバリン八−ウルトロゲルアフィニティークロマトグラフィーによるα−アラビノシダーゼ活性のクロマトグラフィー曲線。

第５図：ｐＨおよび温度変化に対するα−アラビノシダーゼ活性のクロマトグラフィー曲線。

第６図：　合成Ａｒａ−Ｇｌｃ　−ｐＮＰおよびＲｈａ−Ｇｌｃ　−ｐＮＰ基質の酵素的加水分解のＴＬＣによるモニター。

第７図：　グリコシド抽出物の酵素的加水分解のＴＬＣによるモニター。

第８図：　アラビノシダーゼ±β−グルコシダーゼによるグリコシド抽出物の酵素的加水分解のＧＣによるモニター。

第９図：　α−ラ春ノシダーゼ＋β−グルコシダーゼによるグリコシド抽出物の連続的加水分解のＧＣによるモニター。

第１０図；　テルペングリコシド類のＨＰＬＣクロマトグラム。

第１１図：　マスカット・デ・フロンティグナンクレープスのぶどう液由来のグリコシド抽出物（Ａ）、そのヘミセルラーゼによる酵素処理物（Ｂ）、およびそのグラーザイム２００による酵素処理物（Ｃ）のＧＣクロマトグラム。

第１２図：　天然の甘味ワインぶどう液由来のグリコジル化芳香画分の酵素処理物（Ａ）、非酵素処理物（Ｂ）および辛口ワインぶどう液のグリコジル化芳香画分の酵素処理物（Ｃ）、非酵素処理物（Ｄ）のＧＣクロマトグラム。

（発明の詳細な説明） “基質″とは芳香成分または芳香物質のグリコジル型前駆体を含む基質を意味する。

例えば、このグリコジル前駆体とは芳香性ぶどう変種、特にマスカットの栽培副産物と同様にワイン、ぶどう汁またはその関連物質を含む全ての飲料物などぶどう汁、ワインおよびそれらの誘導物のようなぶどう由来の植物性物質である。ぶどうのテルペングリコシド類の加水分解し芳香性で揮発性物質であるテルベノールを放出するのに必要な酵素システムの４つの要素が本発明で明らかにされた。

すなわち第１段階におけるα−アラビノシダーゼ、α−ラムノシダーゼおよびβ −アビオシダーゼおよび第２段階のβ−グルコシダーゼである。本発明につながる研究でチルベンジグリコシド類の加水分解は単一のグリコシダーゼの作用では進行せず、以下に示す２段階の連続的メカニズムに従かい対で作用することで進むことが結論づけられた。

第１段階：　（１−＝−６）グリコシド結合の切断により対応するテルペンモノグリ、コシドを放出するα−アラビノシダーゼ、α−ラムノシダーゼおよびβ− アビオシダーゼの作用。

第２段階：　テルペンアクリコン−炭水化物結合の切断によりテルベノールを放出するβ−グルコシダーゼの作用。

最終的なテルベノールの、放出を左右する最後の重要な酵素、すなわちβ−グルコシダーゼは提唱された方法に関しその応用で完全な効率を示すようにグルコースによ棒阻害が小さく、酸性ｐＨで活性を有し、かつグリコジル基質に含まれるアグリコンに関して高いアフィニティーを有することが好ましい。

本発明に従がい、活性を測定し得る基質（Ａｒａ−Ｇｌｃ−ｐＮＰ）、Ｒｈａ− Ｇｌｃ−ｐＮＰ、Ａｐｉ−Ｇ１１ｃ−ｐＮＰＳＡｒａ−ｐＮＰ。

Ｒｈａ−ｐＮＰ％Ａｐｉ−ｐＮＰ％　Ｇｌｃ−ｐＮＰ）やこれらに対応する酵素の生産に重要な条件も限定された。

本発明の方法はこれに限られる訳ではないが特にマスカットなど芳香性ぶどう変種の栽培の副産物と同様、ぶどう汁、ワインおよびその誘導体からその主要植物原料から選ばれるぶどうの芳香成分の利用により例示される。

しかし、本発明はこの用途に限定されない。実際にここで示すメカニズムは必ずしもプルペン類ではない芳香成分を誘導し、かつぶどう以外の果実、果実誘導体（たとえば飲料物）および果実副産物、芳香性植物および花植物、およびこれらの植物の誘導体および副産物、茶やタバコなどの植物、およびインビトロの細胞培養物由来の植物など以下の条件を満たす全ての植物に応用できる一般的メカニズムである。

条件（ａ）　これらの植物産物がぶどうに存在するもの以外のテルペノールおよびグリコシドを含むグリコシド性芳香物質前駆体を十分な量含む、わ）特異的グリコシダーゼがグリコシド前駆体の構造に対応している、および（Ｃ）　天然の培媒が使用する酵素のインヒビターを含まない。本発明の方法に使用し得るぶどう以外のグリコシドを含む果実には、またグリコシド基質としてはグリコシド抽出物が使用でき、またその加水分解は、その前駆体を含む天然媒体中で行ない得る。

したがって、以下に示すように本発明の方法を行う上で多くの可能性が与えられる。

（イ）天然媒体で働かせることで結合芳香物質の放出によりその産物自体の芳香性を増加させ得る、（ロ）所定のグリコシド抽出物（たとえばパパイヤ）を処理し、他の産物、たとえば飲料物（グレープジュース）に得られた芳香物質を導入し得る、（八）１つ（またはそれ以上の）グリコシド抽出物（たとえばパパイヤ抽出物、マーク抽出物）を液体基質（たとえばグレープジュース、天然飲料物）に導入し、本発明の方法を応用することによりそのままの状態で芳香物質を放出し得る。

また、その芳香物質が食物、飲料物または香料の中で望ましい時間に放出されるよう工夫し得る。　。

“酵素”という語は対応する酵素的活性が得られるものと定義する。本発明の方法で使用される酵素はバクテリア、菌類、イースト、植物、動物、または合成のどの起源のものでもよい。宿主微生物を用いた遺伝子操作で生産した酵素も本発明の範囲に入る。

したがって、本方法で使用し得る酵素を生産するためによく知られた技術を用い微生物を修正し得る。

本発明の方法で特に芳香成分または芳香物質としてゼラニオール、リナロール、ハイドロキシリナロール、リナロールのオキシド、ネロール、シトロネロール、 α−テルピネオール、ノリソフレノイド化合物（ハイドロキシ−３−ダマスコン、３−オクト−α−イオノールなど）、テルペンポリオールおよびフェニルエチルおよびベンジルアルコールのようなアルコールなどのテルペノールを入手し得る。

また本発明に従がい、遊離の芳香物質とは異なるその前駆体に結合した芳香物質の性質に依存し、または使用する酵素の特異性に依存して新しい芳香物質の生産をもくろむことが可能である。

このメカニズムを知ることにより新しい特徴や技術的有効性を有する酵素の生産が可能となる。

基質がモノグリコシドのみを含む場合のように本発明の方法に関する特定の態様では第１段階を通らず直接酵素的加水分解が行なわれる。

先に述べた本発明の定義では、本方法は２つの加水分解段階を含むことが述べられている。しかし、本発明は別の酵素を連続的に投与する２段階の適用に限られるものではない。

（実験）Ａ、基質ノシド（シグマ、ＵＳＡ）およびｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−ラムノピラノシド（エクストラシンセス、フランス）は市販されている。ゼラニルβ−Ｄ−アビオフラノシルーβ−Ｄ−グルコピラノシドはハイボシスアクミナタ株という薬用着物の抽出物である。

他のグリコシド類は合成しな。これらの合成には対応する過アセチル化糖類から出発する３段階の方法を採用した。

第１段階には過アセチル化した対応する糖類の末端炭水化物基のアノマー炭素原子上に塩素または臭素などのハロゲンまたはトリクロロアセトイミデートなどのイミデートを導入することによるこの炭素原子の活性化が含まれる。無水条件下クロロポルムまたは塩化メチレンのような不活性溶媒中二塩化亜鉛およびジクロロメチルメチルエーテルによる過アセチル化ルチンへの作用によりヘキサアセチル−α−クロロルチノシドが得られる。無水条件下、クロロホルムまたは塩化メチレンなどの不活性溶媒中、ペンタアセト−Ｄ−グルコビラノースおよびヘブタアセトルチノースへのガス状臭化水素の作用により、各々テトラアセチル−α− ブロモ−Ｄ−グルコピラノシドおよびヘキサアセチル−α−プロモルチノシドが合成される。Ｏ−（ヘキサアセチルα−およびβ−ルチノシル）トリクロロアセトイミデートの混合物は塩化メチレン、クロロホルムまたはジエチルエーテルなどの溶媒中無水条件下でたとえば炭酸カリウムまたは水素化ナトリウムなどの塩基存在下トリクロロアセトニトリルへのへキサアセチル−１−ルチノース（アセトニトリル、テトラハイドロフランまたはエチルエーテルなどの溶媒中へブタアセトルチノースへのベンジルアミンまたはアンモニアの作用により得られる）の作用により得られる。

ｏ−〔ヘキサアセチル−６−０−（α−Ｌ−アラビノフラノシル）−α−および β−Ｄ−グルコピラノシル〕　トリクロロアセトイミデートも同様に得られる。

￥＆２段階には導入された放出基のパラニトロフェノール、モノテルペノールまたはアルコールによる触媒的親核置換が含まれる。

シリカゲルクロマトグラフィーによる精製後退アセチル化β−ｐ−ニトロフェニル、β−テルペニル、またはβ−アルキルグリコシドが得られる。過アセチル化 −α−ブロモーＤ−グルコピラノシドまたは過アセチル化−α−プロモルチノシドに対するゼラニオール、ネロール、α−テルピネオールまたはリナロールなどのモノテルペノールまたはベンジルアルコールまたは２−フェニルエタノールなどのアルコール類の作用はトリエライトまたは０．４ｎｍ（４人）モレキュラーシーブの存在下、エーテル、塩化メチレン、またはクロロホルムなどの溶媒中炭酸銀の存在下で、または０．４ｎｍ（４人）モレキュラーシーブの存在下アセトニトリル中シ？リジン中炭酸銀およびトリエライトの存在下で行う。Ｏ−（過ロアセトイミデートに対するリナロール、ゼラニオールまたはα−テルピネオールなどのモノテルペンの作用は塩化メチル／またはクロロホルム中０．４　ｎｍ　（４人）モレキュラーシーブおよびボロントリフルオリドエテレートまたはバラ −トルエンスルホン酸の存在下で行う。

目的の過アセチルβ−グルコシドのシリカゲルクロマトグラフィーはエーテル／石油エーテル、クロロホルム／エーテル、塩化メチレン／エーテル、または酢酸エチル／石油エーテルの混合物による溶出を行う。最終段階には生成したグリコシドの糖部分からのアセチル基の脱保護が含まれる。脱アセチル化はナトリウムメチレートなどの塩基性触媒の存在下におけるメタノール中でのトランスエステノフィケーションによって行う。

これらの合成の出発物質である過アセチル化糖類のうち１．２゜３．４−テトラ −Ｏ−アセチル−６−０−（２，３，５−）り一〇−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコビラノースだけは市販されていない。その製造は１．　２．　３．　５−テトラ−Ｏ−アセチル−α、β−Ｌ−アラビノフラノースおよび１．　２．　３．　４−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコビラノースで出発する上述の合成で行なう。しかしこれは塩化スズなどのルイス酸の存在下トリメチルシリルシ４ニドを用いた１、２．　３゜５−テトラ−Ｏ−アセチル −α、β−Ｌ−アラビノフラノースの３．５−ジー０−アセチル−１，２−０− ［（１−アノマーおよび１−エンド−シアノ〕エチリデン〕−β−Ｌ−アラビノフラノースへの活性化、およびトリチル化による１、２．　３．　４−テトラ− Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコビラノースの１．　２．　３．　４−テトラ−Ｏ −アセチル−６−０−）リチルーβ−Ｄ−グルコビラノースへの活性化により行うことが望ましい。これら２つのシントン間のグリコジル化は触媒としてのトリフェニルカルボニウムバークロレートの存在工廠しい無水条件下で行う。この合成法は同様のシアノエチリデン誘導体とｐ−ニトロフェニル２，３゜４−トリー〇−アセチル−６−０−）リチルーβ−Ｄ−グルコピラノシドとのカップリングによるｐ−ニトロフェニル２．　３．　４−）Ｕ　−０−７七ｆルー６−０−　（２，３，５−トリー〇−７セチルーα−Ｌ−アラ（ノフラノシル）−β−Ｄ− グルコピラノシドの合成に適用し得る。しかし、このグリコジル化は期待されるジホロシドの他に１−４糖間結合を有するジホロシドを生成する。

これらの分離は酢酸エチル／石油エーテル混合物により溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで行いうる。

（例１）デカアセチルルチン塩化カルシウム管をつけたコンデンサーを備えた５０〇−丸底フラスコ中マグネチックスターラーによる攪拌を行ないながら１５０ｄの無水ピリジンに２５ｇのルチンを添加していく。この混合物を冷水浴中で冷やしながら約１０分間に渡って１００ｍｆの酢酸無水物を加え、さらに１．２４時間攪拌する。この反応物を１，５１の氷冷水に注ぎ込み白色結晶のアセチル化誘導体を得る。この結晶を濾過し、水と少量のエチルエーテルによって洗浄した後、シリカゲル入りのデシケータ−中域圧下で乾燥させる。３８．３　ｇが得られる（収率９９％）。シリカゲルＴＬＣ−エーテルＲｆ＝０．２２、ｍ、ｐ、　１２８〜１３５℃。

（例２）２、　３．　４−）リー〇−アセチル−６−０−（２，３，４−）ソー０−アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルクロライド約６ｇの１ｎｃ１＊をるつぼ中ブンゼンバーナーで融解する。アルミホイル下で冷却させ、荒く砕いたこのＺｎＣｆｔ４ｇをコンデンサーを備えた２５０ｄ丸底フラスコに素早く入れ、塩化カルシウム管を取り付ける。

次に７ダネチツクスターラーによる攪拌を行いながら以下のものを添加していく。

（１）８０ｍｉ！の無水クロロホルム（２）　２０ｇのデカアセチルルチン（３）最後に５分間に渡り約２Ｍの１．　１−ジクロロメチルメチルエーテルを入れる。

（４）その°後この混合物を７５〜７７℃に２時間維持する。

このクロロホルム溶液をデカンテーションし、２ｏｄのクロロホルムを用いてペースト状残金をフラスコから洗い出す。これを先のクロロホルム溶液と合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて３５〜４５℃で減圧下エバポレートする。

５００ｄのエチルエーテルで油状黄色残金を取り出し、これを氷冷水、飽和Ｎａ＊ＣＯｓ溶液、ついで再び氷冷水で洗浄した。有機層゛をＮａ１ＳＯｎで乾燥し、濾過後約３５℃のロータリーエバポレータを用い減圧下でこの溶液を濃縮する。部分的に結晶表しているこの残金をエチルエーテルで再結晶し、ついで無水アルコールを用いてさらに２回再結晶を行う。この白色結晶をシリカゲル入りのデシケータ−中域圧下で乾燥する。６．３ｇが得られる（収率３５％）、シリカゲＪｌ／ＴＬＣ−工−ｆルＲｆ　＝０．５２、ｍ、　ｐ。

１４８〜１５０℃。

（例３）ｐ−ニトロフェニル２．　３．　４−１−リー〇−アセチル−６−ｏ−（２，３，４−トリー〇−アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド塩化カルシウム管およびマグネチックスターラーを備えた三角フラスコ中５０ｍｊ！の無水ピリジンに３ｇのトリエライトおよび１．５ｇのｐ−ニトロフェノールを入れる。この混合物を１時間攪拌した後新しく調製・乾燥した５ｇのアセトクロロ−α−ルチノシドおよび３ｇ炭酸銀を加える。暗所、室温で２４時間攪拌する。

この反応物を濾過後丈の沈殿を少量のピリジンで洗い濾液を約４０〜４５℃でロータリーエバポレーターを用い減圧下で濃縮する。この残金を２５ｄのベンゼンに溶かし、同様に濃縮する操作を２回行って残存するピリジンを除去する。この残金を１００−のベンゼンに溶かし、氷冷水、ＩＮ水酸化ナトリウム、再度氷冷水で洗浄後ＮａｚＳ０４で乾燥する。濾過後濾液を３５〜４０℃でロータリーエバポレーターを用い減圧下で濃縮する。赤いペースト状の残金をシリカゲルクロマトグラフィーで精製する（６７μｌ〜１９９μｍのメツシュポアサイズのフルイを通過する粒子（７０〜２３０メツシユ））。エチルエーテルによりＲｆ々０．５で溶出する。純粋なフラクションをロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた白色結晶を９５度のアルコールで再結晶する。１．４ｇが０．５、　ｍ、ｐ、１８５〜１８７℃。　−（例４）２．３．４−）リーＯ−アセチル−６−０−（２，３，４−）ジ−０−アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド２０ｍｆのクロロホルム中の１．３ｇのヘプタアセトルチノースおよび０．４− 無水酢酸を５０献丸底フラスコに入れ一４℃、窒素雰囲気下に置く。この溶液に酢酸中ガス状臭化水素酸の３３％溶液を滴下する。−４℃で２時間攪拌を続けた後その反応溶液を５０−の氷冷水に注ぐ。落ちついたら有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後３５℃減圧下でロータリーエバポレーターによる濃縮を行う。黄色の油状物質が得られ、これはそのまま精製せずに次のステップに用いる。しかし、これは少量のエチルニーテルルに溶かし、冷却することにより結晶化させることができる。窒素雰囲気下で濾過し、少量のエチルエーテルおよび石油エーテルで洗浄し、冷却下デシケータ−で乾燥させることにより白色結晶３１０ｍｇ（収率２３％）が得られる。ｍ、　Ｉ）、１２０〜１２５°Ｃ０（例５）ゼラニル２．　３．　４−）ソー０−アセチル−６−０−（２，３゜４−トリー〇−アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−β−Ｄ−グルコビラノシド５０イの丸底フラスコに以下に示すものを入れ室温、窒素雰囲気下２４時間攪拌するニー６６５ｍｇのブロモ−２，３，４−トリー〇−アセチル−６−Ｏ−（２，３，４−トリー〇−アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（ブロム化反応の阻生酸物）−１−のゼラニオール −１０艷アセトニトリル中０．５ｇのシアン化水銀。

この混合物を３５℃、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮し、その残金を５０−のエチルエーテルに分散する。沈殿する固体を濾過しエチルエーテルで洗浄する。濾液を３５°Ｃ減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。油状残金はエチルエーテルを溶出液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー（孔径６７μｍ〜１９９μｍ　（７０〜２３０メツシユ）のフルイを通過する粒子径）にかける。ヘキサアセチルルチノースを含む画分を減圧下で濃縮する。５００ｍｇの無色油状物質が得られる（収率８３％）。シリカゲルＴＩ、Ｃ−ジエチルエーテル　Ｒｆ＝０．３１゜（例７）０−　（２，３，４−）リーＯ−アセチル−６−０−（２，３，４−トリー〇− アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−α−および−β−Ｄ−グルコピラノシル〕　トリクロロアセトイミデート４−トリー〇−アセチル−６−０−（２，３，４−トリー〇−アを混合する。さらにマグネチックスターラーで攪拌しなから１，６ｇの無水炭酸カワウへを加える。この反応液を濾過し沈殿を１０−の塩化メチレンで洗浄する。濾過を３５°Ｃ１減圧下の一ロータリーエバポレーターで濃縮し、その残金をｌ：１工チルエーテル／塩化メチレン混合液を溶出液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー（孔径６７μｍ−１９９μｍ　（７０−２３０メツシユ）のフルイを通過する粒径）で分画する。イミデートを含む画分を合わせ、３５°Ｃ１減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。２．３ｇの無色油状物質が得られる（収率７１％）。シリカ（±）−リナリル２．　３．　４−トリー〇−アセチル−６−０−（２，３，４−）ジ−０−アセチルーα−Ｌ −ラムノピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド１００ｄの丸底フラスコ中、３ｍｌの塩化メチレンに５５（ｌ　ｍＨの（±）リナロール、６５０ｍｇのＯ−（２，３，４−）ジ−０−アセチル−６−０−（２，３，４−）ジ−０−アセチルーα−Ｌ−ラムノピラノシル）−α−および−β −Ｄ−グルコピラノシル〕トリクロロアセトイミデートおよびＩｇの０．４　ｎｍ　（４人）モレキュラーシーブを分散し、室温で窒素雰囲気下３０分間攪拌する。

さらに塩化メチレン中５０％のポロントリフルオリドエテレート溶液２２μｌを加え４０分間攪拌した後回びこの溶液２２μｌを炭酸ナトリウム−を加えてから、この液を０．５Ｍの重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、ついで水で洗浄する。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、３５°Ｃ１減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。油状残金を４：１石油エーテル／ジエチルエーテル四合物で溶出するシリカグルカラＡりＯマドグラフィー（孔径６７μｍ〜１９９μｍ　（７０−２３０メツシユ）のフルイを通過する粒径のもの）で過剰のりナロールを除去し、ついで１：４シ工チルエ後者を含むフラクションを合わせ、３５℃、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。１９０ｍｇの無色油状物質が得られる（収率２９％）。シリカゲルＴＬＣ−ジエチルエーテル／石油エーテル（４：　１）　Ｒｆ＝０．３４゜（例９）ゼラニル６−○−（α−Ｌ−ラムノピラノシル）−β−Ｄ−グル窒素ガス気流下の５０ｒｄ三角フラスコ中、２−の無水メタノールに０．２ｇのゼラニル２．　３．　４−）クー０−アセチル−６−０−（２，３，４−トリー〇−アセチルー α−Ｌ−ラムノピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシドを溶解する。３０秒間に渡って０．３艷のナトリウムメトキシドを添加し、６８−７０°Ｃの油浴中窒素雰囲気下で２０分間攪拌する。その後この三角フラスコを氷水浴中で冷却し約０．２ｄの湿潤り、、、、５０ＷＸ４　（Ｈ”　）（７４／１４７μｍ（１００／２００メツシユ）のフルイを通過する粒径）を加え、この溶液のｐＨ値を７の領域に調整する。樹脂を濾過し、濾液を２５°Ｃ１減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。残った油状物質を３：１酢酸工チル／メタノール混合物で溶出するシリカゲル６−０の〔孔径６７μｍ〜１９９μＩ１１　（７０〜２３０メツシユ）のフルイを通過する粒径〕カラムクロマトグラフィーで精製した。ゼラニルβ−ルチノシドを含むフラクションを合わせ、２５℃減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。

結晶化できない無色ペースト状物質１１０ｍｇが得られる。この産物はシリカゲルＴ　Ｌ　Ｃ、：酢酸エチル／メタノール（３：１）で単一バンドを示した、Ｒｆ＝０．３５゜（例１０）２．３．４−）リーＯ−アセチル−６−〇−（２，３，５−トリー０−アセチル −α−Ｌ−アラビノフラノシル）−α−および一β−Ｄ−グルコビラノース２５ａｔｌ！の７＝３テトラハ１．イドリフラン／メタノール混合液を含み、氷塊で０℃に維持した１００−一の丸底フラスコに１５分間ガス状アンモニアを通気した。それから−４０ｈｇの１．　２．　３．　４−ｆト５−０−７セチルー６−０−　（２，３，５−）！Ｊ　−０−７セチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシドを添加した。

攪拌しながらこのフラスコを室温にもどす。反応はＴＬＣ（シリカゲル　塩化メチレン／エーテル　６：４）で追跡した。原料が無くなったら（約１５分後）反応を停止させその溶液を４０℃減圧下で濃縮乾燥する。この残金を６＝４塩化メチレン／工−テル混合物で溶出するシリカカラムで精製する。１位が脱アセチル化した２５０ｍｇの産物が得られる（収率６７％）。シリカゲルＴＬＣ：　塩化メチレン／エーテル（６：４）　Ｒｆ＝０．３６゜（例１１）０−　［２，３，４−）ＩＪ　−０−７−ｔ＝＋ルー６−０−　（２，３，５− トリー〇−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−α−および−β−Ｄ−グル２ピラノシル〕　トリクロロアセトイミデート窒素雰囲気の反応器に２５０ｍｇの２．　３．　４−）クー０−アセチル−６−０−（２，３，５−）ジ−０− アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−α−および一β−Ｄ−グルコビラノース、λ５ｒｄの無水塩化メチレン、０．１６１ｄ！のトリクロロアセトニトリルおよび１６０ｍｇの無水炭酸カリウムを入れる。この反応物を攪拌しながら室温に４８時間放置し、反応が完結していることをＴＬＣ（シリカゲル、塩化メチレン／エーテル　６：４）でチェックする。

１ＯｒｌｄｌのｃＨｔｃｚｔを用いて反応物を取り出し焼結フィルターで濾過する。その有機層を等容量の飽和ＮａＨＣＯｓ水溶液および氷冷水で洗浄する。それか、ら無水硫酸ナトリウムで乾燥し、３５℃、減圧下で濃縮して乾燥する。２６４ｍｇの黄色油状物質が得られる（収率８８％）。シリカゲルＴＬｅ：塩化メチレン／ジエチルエーテル（６：４）　Ｒｆ＝０．５゜（例１２）ゼラニル２．　３．　４−）クー０−アセチル−６−０−（２，３゜５−トリー〇−アセチルーα−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド窒素雰囲気下の５０ｒｘｔ’反応容器に２５０＋ｇの０−（２，３，４−トリー〇−アセチル−６−０−（２，３，５−）ジ−０−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−α−および一β−Ｄ−グルコピラノシル〕　トリクロロアセトイミデート、２５０μ！のゼラニオールおよび１．５１ｄ！の無水塩化メチレンを入れる。この反応物を窒素雰囲気下で攪拌しながら５０％のボロントリフルオリドエテレートー塩化メチレン溶液２０μｌを滴下する。３時間後反応が完結していることをＴＬＣ（シリカゲル、塩化メチレン／エーテル、７：３）でチェックし、その溶液に５０ｍｇの重炭酸ナトリウムを加える。１０１ｎｉの塩化メチレンを加えた後この反応溶液を等容量の水冷０．５Ｍ重炭酸ナトリウム溶液、ついで氷冷水で洗浄する。この有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、３５℃、減圧下で乾燥させる。速やかにこの油状残金をシリカカラムにかけ、まず１：ｌエーテル／石油エーテルで過剰のゼラニオールを除去し、ついで８：２塩化メチレン／工−テル混合物で生成物を溶出することにより精製する。１５０ｍｇの無色油状物質が得られる（収率５８％）。シリカゲルＴＬＣ：塩化メチレン／エーテル（８：　２）　、Ｒｆ＝０．４９゜（例１３）ｐ−ニトロフェニル２．　３．　４−）ジ−０−アセチル−６−０−トリチル− β−Ｄ−グルコピラノシド１００−の丸底フラスコ中の１〇−無水ビリジンに１．４２　ｇのｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよび１．５ｇの無水トリチルクロライドを入れる。このフラスコを４０℃、暗所で攪拌する。反応はＴＬＣでチェックし必要ならばさらにトリチルクロライドを加える。２４時間後、このフラスコを室温にもどし６ｔｄの無水酢酸を加える。この反応物を４８時間攪拌する。反応はＴＬＣ（シリカゲル、エーテル／石油エーテル、７：３）でチェックする。この反応物を５００１ｄの氷冷水に入れ、さらに２時間攪拌する。この混合物をセライトで濾過しこのセライトを塩化メチレンですすぐ。この有機層を順次氷冷水、１０％塩酸、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、および氷冷水で洗浄する。これを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、３５℃、減圧下で濃縮する。残金を７＝３工−テル／石油エーテル混合物で溶出するシリカゲル力ラムクロマトグラフィーで分画する。

ヘテロシトを含むフラクションを合わせ、３５℃減圧下で濃縮する。２．６ｇの油状物質が得られる（収率８３％）。この生成物はＴＬＣ（シリカゲル−エーテル／石油エーテル（７：　３）で単一バンドを与える。Ｒｆ＝０．３３゜（例１４）１、　２．　３．　５−テトラ−０−アセチル−α、β−Ｌ−アラビノフラノース無水Ｌ−アラビノース（１０ｇ）および無水メタノール（２０〇−）の混合物を１．０６Ｍのメタノール性塩酸〔０℃でアセチルクロライド（４，７ｍｊｉりと無水メタノール（６３ｒｎｌ）を混ぜて調製する〕で処理し、この混合物を０〜５℃で一晩攪拌する。４０−のピリジンを加えてこの混合物を中和してからこれを濃縮する。この残金をピリジンを用いて数回洗い出し、ピリジンを蒸留で除去してから再び８０−のピリジンに溶解する。水冷条件で無水酢酸（３０ｎｌ）を加え、この溶液を２日間室温で放置する。この反応液を酢酸エチルまたは塩化メチレンで抽出するとシロップ状物質が得られるのでこれを酢酸（１００ｍｇ）および無水酢酸（２５ｎｌ）の混合物にとかし、さらに０℃で濃硫酸５−を添加する。この混合物を室温に２時間放置する。この溶液を氷塊（１５０ｇ＞に注ぎ、２時間攪拌してからクロロホルムで抽出する。この抽出物を水、さらに重炭酸す）　ＩＪウム水溶液で洗浄する。有機層の濃縮で得られる残金をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ（溶出液：ベンゼン／エーテル勾配）、シロップ状の１．　２．　３．　５−テトラ−Ｏ−アセチル−α、β−Ｌ−アラビノフラノースを得る（１８ｇ、８５％）、Ｒｆ＝０．４６（溶出液：ベンゼン）。

（例１５）３．５−ジー０−’アセチルー１．　２−０−　（１−ｘクツ−および１−エンド−シアノ）エチリデニルーβ−Ｌ−アラビノフラノ−無水塩化スズ（３６０ｍｇ）およびトリメチルシリルシアニド（３ｍｊりを１．　２．　３．　５−テトラ−０−アセチル−α、β−Ｌ−アラビノフラノース（３ｇ）のア七ト二トリル溶液（１０Ｗｄりに加える。この混合物を室温で一晩攪拌し、エーテルで稀釈後型炭酸す）　ＩＪウム溶液（３Ｘ７５−）および水で洗浄する。有機層を濃縮し、その残金をカラムクロマトグラフィーで分画しく溶出液：ベンゼン／エーテル勾配）、１−エンドシアノ体（９９４１１１ｇ。

３７％）および１−ｘ７ドシ７Ｊ体（７００ｍｇ、２６％）を得た。

エーテル／ペンタンによる結晶化で１−エクソシ′アノアイソマーが得られる（３５％）、ｍ、ｐ、６６〜６９℃、〔α〕Ｉ、−６゜（ＣＩ）、Ｒｆ＝０．５６（溶出液、ベンゼン／エーテル、３：２）。

トルエンによる結晶化では１−エンド−シアノアイソマーが得られる（２３％）、ｍ、ｐ、１０７〜１１０℃、［α）ｏ＋ｓｔ。

（ＣＩ）　、Ｒｆ＝０．３７゜（例１６）１、　２．　３．　４−テトラ−０−アセチル−６−０−（２，３，５−トリー〇−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコビラノースおよびｐ−ニトロフェニル２，３．４−）リーＯ−アセチル−６−０−（２，３，５ −）ソー０−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド音叉形の管で連結した２つの丸底フラスコを用意し、一方にはトリチル化グルコシド（０，５５ｍｍｏｌ）および３，５−ジーＯ−アセチル−１，２−０− ［（１−エフソーおよび１−エンドシアノ）エチリデン〕−β−Ｌ−アラビノフラノース（０，５ｍｍｏｌ　）のニトロメタン溶液（２ｄ）を導入し、他方にはトリフェニルカルボニウムバークロレート（０，０５ｍｍｏｌ　）のニトロメタン溶液＜０．２ｄ）を入れる。両方の溶液を凍結乾燥してから各フラスコに蒸留したベンゼンを入れ内容物を再び凍結乾燥する。この操作を２回繰り返し、このフラスコおよび内容物を数時間にわたって乾燥する。そのままの状態で各フラスコの中に塩化メチレンを蒸留する（２ｍｌ）。２つの溶液を合わせ室温暗所で一晩放置する〔反応物の凍結乾燥および乾燥はＣａＨａを用いたベンゼンおよび塩化メチレンの蒸留同様、０．５３３　Ｐ　ａ（４Ｘ　１０−３ｍｍｈ）の圧力で行う〕。明るい黄色の反応液を１−のピリジン／水（３：１）で処理して脱色し、これをクロロホルム（５０ｒｎｌ）で希釈してから水で洗浄後（３Ｘ３０ｒｎｌＮＩ縮する。残金をベンゼン／エーテルまたは酢酸エチル／石油エーテル勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１，２，３．４−テトラ−０−アセチル−６−０−トリチル−β−Ｄ−グルコビラノースからは１゜２．３．４−テトラ−Ｏ−アセチル−６−Ｄ−（２，３，５−）ジ−０−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノ−シル）β−Ｄ−グルコビラノース、ｍ、　＋１．　１０６．５〜１０８．５℃（エーテル／ペンタン）、シリカゲルＴＬＣ：ベンゼン／エーテル＜３：２）、Ｒｆ＝０．３５を得、ｐ−ニトロフェニル、２．３．４−）リー〇−アセチルー６−〇−トリチル−β−Ｄ−グルコピラノシドからは、ｐ−ニトロフェニル２．　３．　４−トリー〇−アセチル−６−０−（２，３，５−）クー０−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド、シリカゲルＴＬＣ：酢酸エチル／石油エーテル（１：　１）　、Ｒｆ＝０．２４、およびｐ−ニトロフェニル２．　３．　６−）リーＯ−アセチル− ４−０−（２，３゜５−トリー〇−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）− β−Ｄ−グルコピラノシド：シリカゲルＴＬＣ：酢酸エチル／石油エーテル（１：　１）、Ｒｆ＝０．２８を得る。

（例］７）セラニル−６一〇−（α−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド窒素雰囲気下、攪拌しながら５１ｎｌの無水メタノールに２００ｍｇのゼラニル２．　３．　４−トリー〇−アセチル−６−０−（２゜３．５−）ソー０−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシドを溶解する。

さらに０．１−のナトリウムメトキシドのメタノール溶液（ナトリウム２０ｍｇとメタノール１０−から調製する）を加える。室温で４時間攪拌してからこの溶液にり、、、、５０Ｗｘ４　（Ｈ”　）樹脂を入れて中和する。この混合物を濾過し、溶液をロータリー主バボレーターで濃縮する。油状残査を８：２クロロホルム／メタノール混合物で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけシロップ状のセラニル６一〇−（α−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド１０５ｍｇを得る。収率８１％、シリカゲルＴＬＣ−クロロホルム／メタノール（８：２）、Ｒｆ＝０．１７゜（例１８）ｐ−ニトロフェニル６−０−（α−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド上述の操作に従かいｐ−二トロフェニル２．　３．　４−）リーＯ−アセチル− ６−０−（２，３，５−）ソー０−アセチルーα−Ｌ−アラビノフラノシル）− β−Ｄ−グルコピラノシドを脱アセチル化することによりｐ−ニトロフェニル６ −０−（α−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシドを得る。シリカゲルＴＬＣ：酢酸エチル／イソプロパツール／水（６５：３０：１０）、Ｒｆ＝０．６９゜（例１９）１００−丸底フラスコ中２ｇ　（６，２８ｍｍｏｌ　）の１．　２．　３゜５− テトラ−Ｏ−アセチル（３′）−β−Ｄ−アビオースおよび４ｇ　（２８，８ｍｍｏｌ　）のパラニトロフェノールをトルエンとの共沸で乾燥する。さらに４０ｍｇ（０，２ｍｍｏｌ　）のパラトルエンスルホン酸を加え、この混合物を減圧下（１０−’ｍｍＨｇ）　９５℃で５０分間加熱する。冷却後、反応物を２００ −〇〇Ｈ＊ＣＩ！ｔに溶解し数回飽和Ｋ　＊　ＣＯｓ溶液で洗浄する。

油状残査を乾燥後濃縮してから、エチルエーテル／石油エーテル（５０１５０）で溶出するシリカゲル６０カラム（２３０〜２４０メツシユ）クロマトグラフィーで精製する。

１．４ｇの２．　３．　５−トリー〇−アセチル（３’　）　−〇−バラニトロフェニルー１−β−Ｄ−アビオース　ｍ、ｐ、１５５〜１５６℃（収率５６％）および０．２ｇの２．　３．　５−トリー０−アセチル（３’　）−０−パラニトロフェニル−１−ａ−Ｄ−アビオース（収率８％）が得られる。１．０　ｇの２．　３．　５−）リーＯ−アセチル（３”）−０−パラニトロフェニル−１− β−Ｄ−アビオースを無水メタノール中ナトリウムメトキシドで脱アセチル化した。

精製後０．６５　ｇのパラニトロフェニル−１−β−Ｄ−アビオース（収率９５％）が得られる。

アピオフラノシルグリコシドテルベノールおよびアルコールアビオフラノシルグルコシドを得るために使用する一般的方法はラムノシルグルコシドおよびアラビノシルグルコシド合成について述べた方法と同じである。この合成法は３，５−ジー０−アセチル（３’　） −（エンドまたはエフソーシアノエチリデン）−１，２−β−Ｄ−アピオフラノースおよび１．２．３．４−テトラ−０−）リチルー６−β−り一グルコビラノースのカップリングによる１、２．　３．　４−テトラ−○−アセチルー〇−（２，３，５−）ジー０−アセチル（３′）−β−Ｄ−アビオフラノシル）−６− β−Ｄ−グルコビラノースの合成に応用し得る。

ジホロシドへブタアセテートはグルコースのアノマー位カラ離れ、トリクロロアセトイミデート誘導体に変換されてベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、ゼラニオール、ネロール、（Ｒ）（Ｓ）−アーテルピネオール、（Ｒ）− α−テルピネロール、（Ｒ）　（Ｓ）−β−シトロネロール、（Ｓ）−シトロネロール、（Ｒ）（Ｓ）−リナロール、（Ｓ）−リナロールとの各縮合の原料となる。

（例）５０ｍｇ　（０，７ｍ１Ｉｌｏｌ　）のトリクロロアセトイミデート−１−（２，３，４−）リーＯ−アセチル−０−（２，３，５−）リーＯ−アセチル（３′ ）−β−Ｄ−アピオフラノシル）−６−０−（αβ）−Ｄ−グルコビラノース）および３８ａＬｉ！＜８．６　ｍｍｏｌ　）の（Ｒ）（Ｓ）−リナロールを２− の無水ＣＨ２Ｃｊｉ！、に溶かし融出する。精製およびナトリウムメトキシド処理後約５０％の収率でリナリルジホロシドが回収される。

Ｂ、酵素活性の測定および酵素の精製１、酵素活性の測定グリコシダーゼ活性は１００ｍＭ酢酸バッファ（ｐ）１４．２）中４ｍＭの基質（Ｇｌｃ−ｐＮＰ、Ａｒａ−ｐＮＰ、Ａｐｉ−ｐＮＰ、Ｒｈａ−ｐＮＰ）溶液０．１ｍｌ！を０．１−の酵素溶液と４０℃で２０分間インキニベーションすることにより測定する。ｐＮＰの放出はこの反応溶液に１Ｍ炭酸す）　ＩＪウム０．６ｄを加え４００ｎｍでの光学密度を測定することにより見積る。活性１ｎｋａｔは毎秒１　ｎｍｏｌのｐＮＰの放出に相当する。

２つのグリコシダーゼ、α−アラビノシダーゼおよびα−ラムノシダーゼを多くの酵素を含む市販の調製物から単離精製した。

スウィートアーモンドβ−グルコシダーゼ（コツクライト；英国、ロフト番号２８７２−Ｏｆ）は、アラビノシダーゼ、β−アビオシダーゼおよびα−ラムノシダーゼ型の汚染活性（ｐＨ４，２，４０℃で２４時間インキュベーション）を示さなかったのでこのまま用いた。

市販の酵素調製物（クラーザイム２００、ギストープロケーズ、フランス）に存在するβ−アビオシダーゼは精製せずに用いた。

２、酵素の精製２−１　α−Ｌ−ラムノピラノシダーゼの精製α−ラムノシダーゼはそれらの活性に富んでいるナリンジカーゼ（シグマ）から精製した。低いが（α−ラムノシダーゼ活性あ０．１％）が長時間インキュベーションではグルコースを放出し得るβ−グルコシダーゼ活性をクロマトフオーカシング法で除去した。

実験手順ＰＢＥ　９４ゲルを用いたナリンジカーゼのクロマトフオーカシングによるα− ラムノシダーゼの精製４ＩＲ１の２５峠イミダゾールバツフア（ｐ）１７．４＞に溶かした５０ｍｇのヂリンジカーゼを一晩同バッファに対して（２５ｍｉ’）透析する（５℃）。この透析物を同バッファで平衡化したイオン交換樹脂（ポリバッファエクスチェンジャーＰＢＥ９４、ファルマシア、スウェーデン）のカラム（１，ＯＸ４０ｃｍ）に注入した。このゲルに結合したたんばく質を４４ｒｎｌ／ｈの流速でアンホリン［ｐＨ３，７に調整したポリバッファ７４　（ファルマシア）］の移動で作られたｐＨ７，４〜３，７のｐＨ勾配で溶出する。勾配の完結後、１００ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ３，７）中のＩＭＮａＣｊ２溶液の通過で保持されているたんばく質が脱離する。２．８ｍｌ！のフラクションを採取し、α−ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ活性、ｐＨおよび２８ｎａ＋の光学密度を測定する。

ゼのクロマトグラフの写出曲線を第１図に示す。その脚注を以下に示す。

■□■　α−ラムノシダーゼ活性口□口　β−グルコシダーゼ活性 ○□０　２８０ｎｍの吸収＋−−−−−−＋　ｐＨ勾配 α−ラムノシダーゼ活性がこのｐＨ勾配で溶出する。一方β−グ“ルコシダーゼ活性はｐ）１３．７　（ｐｉ＜３．７＞まで保持されておりＩＭＮａＣ１溶液の通過で溶出する。この方法はナリンジカーゼはｐ＋６．２、ｐ１５．７およびＰＩ＜３．７の等電点の少なくとも３つの（ラムノシダーゼ）アイソエンザイムを含んでいることを示している。

４０℃２４時間以上のインキュベーション後でさえ残存するβ−グルコシダーゼ活性を示さない２番目のアイソザイム（３１７ｎｋａｔ／ｍ）を天然および合成グリコシドの酵素的加水分析テストを選んだ。

α−ラムノシダーゼの全回収率は約６２％である。

２−２　α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの精製市販の酵素調製物の中でヘミセルラーゼＲＥＧ−２（ギストブロケーズ、フランス）はα−アラビノシダーゼ活性に富んでいることが分った。しかし、実質的にβ−グルコシダーゼおよびα− ラムノシダーゼ活性も示す。たとえば、２５０ｍｇのへミセルラーゼは２．３２７Ｋｋａｔのα−アラビノシダーゼ活性、２．５６６　ｎ　ｋａｔのβ−グルコシダーゼ活性および２３６ｎｋａｔのα−ラムノシダーゼ活性を含んでいる。α −アラビノシダーゼの単離精製にはいくつかめクロマトグラフィーを順次使用して行う。ウルトロゲルＡＣＡ４４を用いたヘミセルラーゼの分子ふるい（分画）酵素溶液（１００ｍＭクエン酸−リン酸バッファ、ｐＨ７，２，３−中２５０ｍｇのへミセルラーゼ）を同バッファ（５００ｍｊりに対し一晩（＋５℃）透析する。この透析物を使用前に同バッファで平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４　（ＩＢＦ、フランス）のカラム（１，６ｘ　１００ｃｍ）に注入し、９ｍｆ／ｈの流速で上記バッファにより溶出する。１．２−づつのフラクションを採取し、α −アラビノシダーゼ、β−グリコシダーゼ、α−ラムノシダーゼ活性および２８Ｏｎ＋ｎの光学密度を測定する。

（結果）クロマトグラフィーの溶出曲線を第２図に示す。その脚注を以下のとおりである。

・□・　α−アラビノシダーゼ活性口□口　β−グルコシダーゼ活性 ■□■　α−ラムノシダーゼ活性 ○□０　２８０ｎｍにおける吸光度ウルトロゲルＡｃＡ４４による分子ふるいは２つの主要なα−アラビノシダーゼ活性とβ−グルコシダーゼ活性を分離し得る。

α−ラムノシダーゼ活性はα−アラビノシダーゼ活性と共溶出する。元の酵素溶液中に存在するたんばく質の大部分はα−アラビノシダーゼ活性と一緒に溶出する。またα−アラビノシダーゼ活性（１，７５０ｎ　ｋａｔ）に相当するフラクション（５２ｍ７りは、α−アラビノシダーゼ活性に対して１．３％（β−グルコシダーゼ）および２．１％（α−ラムノシダーゼ）と等価な痕跡量のβ−グルコシダーゼ（２３，４ｎｋａｔ）およびα−ラムノシダーゼ活性を含んでいる。

分子ふるいのα−アラビノシダーゼフラクションのＤＥＡＥ−セファロースＣＬ −６Ｂによるイオン交換クロマトグラフィー（分画） α−アラビノシダーゼフラクション（５２ＩＩＬ１りを２５ｍＭイ（ダシールーＨＣｊ２バッファ（ｐ）１７．５）　５００ｍｊ！に対し一晩（＋５℃）透析した。この透析物を同バッファで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア）のカラム（１，６Ｘ４０ｃｍ）にチャージし、最初に１０８ｄ／ｈの流速で同バッファを用い洗浄する。カラムに保持されるたんばく質は４０ｍ１！／ｈの流速で同バッファ（イミダゾール−ＨＣｊ！　）中の塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−０，４Ｍ）で溶出する。４艷づつのフラクションを採取し、α−アラビノシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ラムノシダーゼの各活性および２８０ｒａ＋における光学密度を測定した。

（結果）クロマトグラフィーの溶出曲線を第３図に示す。脚注は以下のとおりである。

・□・　α−アラビノシダーゼ活性口□口　β−グルコシダーゼ活性 ■□■　α−ラムノシダーゼ活性０−０　２８０　ｎｍにおける吸光度 −一一一一一　イオン強度勾配（ＮａｌＪ）これらの条件下で３つの活性はよく分離する。０．３　Ｍ　ＮａＣ１で溶出しく６９＋Ｊ）　、ａ−アラビノシダーゼ活性（３６５ｎ　ｋａｔ）に対応するピークにはα−アラビノシダーゼ活性に対して０．１％（β−グルコシダーゼ）および０．０８％（α−ラムノシダーゼ）に相当する低いβ−グルコシダーゼ１０．４３　ｎ　ｋａｔ）およびα−ラムノシダーゼ（０，３２ｎ　ｋａｔ）の各活性が含まれる。

この段階の終りでα−アラビノシダーゼフラクションは最初の酵素溶液に比べ非常にたんばく質含量が少ないことに注意せよ。

このステップはα−アラビノシダーゼ活性を約１４倍に精製し得る。しかし、低含量のβ−グルコシダーゼおよびα−ラムノシダーゼ活性は天然および合成グリコシド　の加水分解を妨害し得るので精製にはさらに（アフィニティー）クロマトグラフィーを応用した。

ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂによるクロマトグラフィー由来のα−アラビノシダーゼフラクションのコンカナバリンＡ−ウルトロゲルによるアフィニティークロマトグラフィー（分画） α−アラビノシダーゼフラクション（６９ｍｊｉりをセファデックスＧ−２００ゲル（ファルマシア）でカバーした透析サック内で１２ｍ１になるまで濃縮する。まずＯ，１Ｍ　ＮａＣｊ！および０．１ｍＭ　ＭｎＣｊ２２を含む５０ｍＭ）リス−ＨＣ１バッファ（ｐＨ７，２）に対し一晩（＋５℃）透析し、３０ｄ／ｈの流速で同バッファを用い平衡化したコンカナバリンＡ−ＵＧゲル（ＩＢＦ、フランス）　（１，ＯＸｌｏｃｍ）に注入する。このカラムを同バッファ中メチル α−Ｄ−マンノピラノシド（サーバ、ＦＲＧ）のＯ−０，１５Ｍ直線濃度勾配、ついで０．１５Ｍのアイソクラティックで溶出する。１．５−づつのフラクションを採取し、光学密度、α−アラビノシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性およびα−ラムノシダーゼ活性を測定する。α−アラビノシダーゼ活性を示すフラクションを合わせ、１００ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４，２）に対し一晩（＋４° Ｃ）透析を行ないメチルα−Ｄ−マンノピラノシドを除去した。

（結果）クロマトグラフィー溶出曲線を第４図に示す。脚注は以下のとおりである。

・□・　α−アラビノシダーゼ活性 ○□０　２８０ｎｍにおける吸光度 −□−メチルα−Ｄ−マンノピラノシド勾配この段階でドライセファデックスＧ −２００ゲルに対する透析によるフラクションの濃縮で確認されるように大部分のたんばく質および全ての残存するβ−グルコシダーゼおよびα−ラムノシダーゼ活性を除去し得る。主要なα−アラビノシダーゼビーク（１７１ｎｌ、　７５　ｎ　ｋａｔ）は注入時の活性（３６５ｎｋａｔ）の２０．５％を示している。

活性の一部（６Ｚ５ｎｋａｔ）はメチルα−Ｄ−マンノピラノシドによる溶出でテーリングにより失なわれ、これは初期活性の１７．１％に相当する。この酵素はゲル番；強く結合し、またメチルα−Ｄ−マンノピラノシドは初期活性の３７．６％しか溶出し得なかった（同様の結果は他の酵素につし１ても観測されている）。最終ステップの結果としてα−アラビノシダーゼは約２７倍に精製された。

加水分解テストに用いる酵素溶液には２９．９　ｎ　ｋａｔ／−の活性が含まれる。

ヘミセルラーゼからのα−アラビノシダーゼの精製の間、各ステップに対応する結果の数字を第１表にまとめた。

精製α−アラビノシダーゼの性質（至適ｐＨ）酵素溶液を基質の存在下ｐ）１３．０〜７．０の範囲のユニバーサルバコベーションｐＨで行う。ＰＨに関する残存活性を第５ａ図に示す（曲　線　・□・）。

α−アラビノシダーゼ活性は約ｐＨ３，７〜４．０で最高値を示す。

（ｐＨに関する活性の安定性）酵素溶液をｐＨ３，０〜６．５の範囲のユニバーサルバッファ中６０℃で５０分間インキュベートする。それからこのサンプルを１４の１００ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４，２）に対し５時間透析する（＋５α−アラビノシダーゼ活性はｐＨ３，８４４，９の間で比較的安定である。ＰＨ３，５以下またはｐＨ５，５以上ではこの安定性が速やかに減少する。

（至適温度）５℃〜８０℃の種々の温度で反応液をインキュベーションした後にそのα−アラビノシダーゼ活性を測定する。インキュベーション温度に関する相対的活性を第５ｂ図に示す（曲　線　・□・）。

この活性は６０℃で最高値を示す。

（熱安定性）酵素溶液を１００ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４，２）中３０分間種々の温度に維持する。残存活性を測定し、その結果を第５ｂ図に示す（曲　線　○□○）。

α−アラビノシダーゼ活性は６０℃まで安定である。これ以上では安定性は急激に減少する。７０℃３０分間の処理後それはほとんど失活する。

Ｃ０酵素的加水分解種々のグリコシド基質に関する４つの酵素、α−Ｌ−アラビフラノシダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，２，１，５５、α−アラビノシダーゼと呼ばれる）、α−Ｌ−ラムノピラノシダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，２，１，４０、β−ラムノシダーゼと呼ばれる）、β−Ｄ−アピオフラノシダーゼ（β−アビオシダーゼと呼ばれる）、およびβ−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，２，１，２１、β−グルコシダーゼと呼ばれる）の別個の、または連続的作用を研究した。基質は一方ではｐ −ニトロフェニルまたはゼラニルα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−＝−６）− β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｒｈａ　−Ｇｊ２ｃ　−ｐＮＰまたはＲｈａ　−ＧＲｃ−Ｇｅｒと略す）、ゼラニル　β−Ｄ−アビオフラノシル−（１−・・６） −β−Ｄ−グルコピラノシド（Ａｐｉ−ＧｌｃｍＧｅｒと略す）およびｐ−Ｌ− トロフェニルａ−Ｌ−アラビノフラノシル−（１−・・６）−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ａｒａ−ＧＡｃ−ｐＮＰと略す）および他方ではマスカットぶどう液から精製したグリコシド抽出物である。

研究した４つの合成グリコシドはぶどうテルペングリコシドとその炭水化物部分が同じ構造をもつが、それらのうち３つはｐ−二トロフェノール（ｐＮＰ）であるアグリコンが違うことに注意せよ。この酵素的加水分解は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）右よびガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で追跡した。

（薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ））薄層クロマトグラフィーはシリカゲル（５５５３シリカゲル６０、蛍光インジケーターなし、メルク）の薄層（０，２ｍｍ）でおおったアルミニウムホイルで行った。移動層は酢酸エチル／イソプロパツール／水（，６５：　３０　：　１０　ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を用いた。

糖およびグリコシドは使用直前に調製する以下の混合物で発色さこの発色剤はプレートをオーブンで（１０５℃）１５分間乾燥させてから使用する。それらの移動距離とは別に種々の化合物は色で区別できる。グリコシドは赤紫、アラビノシトは水色、アビオシドは緑、ラムノースは緑がかったピンク、アラビノースは青、アビオースは縁およびグルコースはピンクである。

さらにＴＬＣは酵素で加水分解されないグリコシド抽出物の一部を回収し得る。

対応するスポットが存在するクロマトグラフプレートのゾーンをそぎ落し−１そのシリカゲルを回収して５０ｒｎ１のメタノールに懸濁した。おだやかに攪拌しながら一晩放置し、このサスペンションをブフカーロートで濾過し、ゲルを３ｘｌＯ＋ｎＪ！のメタノールで洗浄する。有機溶出液を合わせ、４０℃、減圧下で乾燥させてから５００μβの純水にとかした。このようにして得た水性サンプルを酸加水分解に使用する。

（ガスクロマトグラフィー（ＧＣ））この方法を用い糖およびテルペングリコシドの両方、および遊離テルペノールを分析した。この目的のため２種のクロマトグラフシステムを用いた。

（グリコシドのＧＣ）グリコシドおよび糖は非揮発性の化合物でありＧＣによる分析には適していない。特定の試薬を用いてこれらを揮発性化合物に変換することが必要である。以下の操作に従がいトリメチルシリル誘導体を生成した。

酢酸エチル中５０ｍｇ／Ｉｔの濃度のＧｌｃ　−ｐＮＰ　（内部標準）６０μｌおよびグリ、コシド抽出物４０μｌを適当なフラスコに導入する。この混合物に４０℃で窒素気流を流し乾燥する。さらにシリル化剤（トリシル、ピアス、ロックフォード、’　Ｉ　Ｌ、ＵＳＡ）４０μｌを加える。このフラスコをシールし、４０℃に２０分間維持する。急激に冷却後、シリル化サンプルをＧＣ分析する。使用する装置はシリーズ３０Ｃガスクロマトグラフ、“オンカラム”インジェクター（０，５μ！注入）およびフレームイオナイゼーションディテクター（ガーデル、フランス）からなる。０ｖ−１（ガーデル）非極性シリコン相のフィルム（０，２０μｍ）をキャピラリーカラム（５０Ｘｏ、３２ｎｌＩＩＩ１．　Ｄ、　）の内壁にコートする。

オーブン温度は５℃／分の速度で１２５から３０５℃まで昇温するようプログラムし、３０．５℃で１５分間維持する。最後にディテクターを３００ｔ’にセットし、キャリヤーガスには圧力１２０ｋＰａの水素ガスを用いる。

（テルペノールのＧＣ）ここで研究スるモノテルペンアルコールはクロマトグラフするのに十分なほど揮発性が高い。これらを含むペンタン抽出物にこの溶液５０μｌに対し、ペンタン中２．８９　ｍｇ／＋ｎｊｉ　７１１度の４−ノナノール（合成用、メルク、ダームスタット、ＦＲＧ）溶液ｌμｌの割合で内部標準を加える。この混合物を硫酸ナトリウムで乾燥し、グラスウールで濾過してから１００μｌ程度になるまで濃縮する。このためにはまずペンタンを従来の蒸留器を用いて除去し、ついで残りの容積に適した大きさのダフトン型カラムを用いて除去する。

濃縮抽出物の構成物はＣＰｗａｘ　５２ＣＢ　（クロムバック、ミドルバーブ、オランダ）極性相を含むキャピラリーカラム（２５ｍＸ０．３２＋ｎｍ　Ｉ、Ｄ９）を用いて分離する。コティングしたポリエチレングリコールフィルムは厚いもの（１，２８μｍ）を選び大容量のサンプルの注入（４μｌまで）を可能にした。分析は２５０°Ｃのフレームイオニゼーションディテクターおよび“オン− カラム”インジェクターを装備したフラクトバブシリーズ２９００（カル口　エルバ、ミラノ、イタリア）を用いて行った。キャリヤーガスは圧力６０ｋＰａの水素を用い、オーブン温度は以下のようにプログラムした。５分間７０℃恒温、ついで２℃／分の速度で１９５℃まで昇温、ついで１９５℃で１５分間恒温。

（高速液体クロマトグラフィー）高速液体クロマトグラフィーの利点がいくつかのテルペングリコシドの単離に使用される。この目的で、グリコシド抽出物の構２０μｌの１５回の連続注入で酵素的加水分解および問題の化合物の固定のために行なわれるＧＣ分析用に十分な量の物質が単離された。

クロマトグラフシステムは以下のもので構成される：波長可変ＵＶ／可視光スペクトロフォトメーター（ヴアリアン社、サニーベール、ＣＡ、ＵＳＡ）を装備したヴイスタ５５００クロマトグラフ：２０μ！ループを備えた６方インジエクシヨンバルブ（ヴアルコ）；スフエリ−５（ブラウンリーラブス、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）オクタデシルコーティングシリカ（粒子サイズ５μｍ）を充填したステンレススチールカラム（２２０Ｘ　４ｍｍ　１．Ｄ、）　：同定常相を充填したプレカラム（３７ｘ４ｍｍ　１．　Ｄ、　）。クロマトグラフは水／アセトニトリル水−有機移動相を用い（逆相極性クロマトグラフィー）、１０分間にアセトニトリル濃度３０から４０％（容積）までの勾配による溶出で行った。溶出溶媒は１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しｔコ。検出は２００ｎｍ、０．５ＡＵＦＳで行った。

ｌ−合成基質の酵素的加水分解合成基質の酵素的加水分解に関する全てのテストでは各酵素（α−アラビノシダーゼ、β−アビオシダーゼ、α−ラムノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）に対し同じグリコシダーゼ活性（０，１５ｎｋａｔ）を用いる。

加水分解および分析操作は計画様式で示す（第２表）。主な略号を再度示しておく。

ｐＮＰ　ｐ−二トロフェノールＡｒａ−ｐＮＰ　ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシドＲｈａ−ｐＮＰ　ｐ−二トロフェニルα−Ｌ−ラムノピラノシドＡｐｉ−ｐＮＰ　ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−アピオフラノシドＲｈａ　−Ｇ４ｃ　−ｐＮＰ　ｐ−ニートロフェニルａ−Ｌ−ラムノフラノシル −（１−＞６）−β−Ｄ−グルコピラノシドＲｈａ　−Ｇｌ！ｃ　−Ｇｅｒ　ゼラニルａ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１・− ＝）６）−β−Ｄ−グルコピラノシドＡｒａ　−Ｇ１１ｃ　−ｐＮＰ　ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシル−（ｌ・−）６）−β−Ｄ−グルコピラノシドＡｒａ　−Ｇｉｃ　−Ｎｅｒ　ネリルα−Ｌ−アラビノフラノシル−（ｌ・−り６）−β−Ｄ−グルコピラノシドＡｒａ　−Ｇｊ２ｃ　−Ｇｅｒ、ゼラニル（Ｘ−Ｌ−アラビノフラノシル−（１・−・・６）−β−Ｄ−グルコピラノシドＡｐｉ　−Ｇｌｃ　−Ｇｅｒ　ゼラニルβ−Ｄ−アピオフラノシルー（１−＝− ６）−β−Ｄ−グルコピラノシドＧｊ！ｃ　−ｐＮＰ　ｐ−二トロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドＧｊ！ｃ　−Ｌｉｎ　リナリルβ−Ｄ−グルコピラノシドＧ１１ｃ　−Ｎｅｒ　ネリルβ−Ｄ−グルコピラノシドＧｌｃ　−Ｇｅｔ　ゼラニルβ−Ｄ−グルコピラノシドＴＬＣで得られた結果を第６図に示す。脚注は以下のとおりである。Ａｒａ−Ｇｉｃ　＝ｐＮＰ　（ａ）　、Ｒｈａ−Ｇｌ！ｃ　−ｐＮＰ（ｂ）およびＡｐｉ　−ＧＩ！ｃ　−Ｇｅｒの酵素的加水分解のＴＬＣによるモニター１　ａ、Ａｒａ　−Ｇｊ７ｃ　−ｐＮＰ十β−グルコシダーゼ２ａ、Ａｒａ−Ｇｌ！ｃ　−ｐＮＰ＋ａ−アラビノースーゼ３　ａ、　Ａｒａ　−Ｇｉｃ　−ｐＮＰ＋ａ−アラビノシダーゼ＋β−グルコシダーゼ１　ｂ、Ｒｈａ−Ｇｌｃ　−ｐＮＰ十β−グルコシダーゼ２ｂ、Ｒｈａ−Ｇｌｃ　−ｐＮＰ十ａ−ラムノシダーゼ３ｂ、Ｒｈａ−Ｇｊ？ｃ　−ｐＮＰ十ａ−ラムノシダーゼ＋β−グルゼの作用はこの基質の消失とアラビノースおよびＧｌ！ｃ　−ｐＮＰの出現を起こす。

同様に、Ｒｈａ−Ｇｌｃ　−ｐＮＰまたはＲｈａ−Ｇｌｃ　−Ｇｅｒに関するα −ラムノシダーゼの作用はこれらの基質の消失とラムノースおよびＧＪ７Ｃ−ｐＮＰまたはＧｌ！ｃ−Ｇｅｔの出現を起こす。このことは加水分解の第１ステツプを構成する。

α−アラビノシダーゼまたはα−ラムノシダーゼと予めインキュベートした各反応物に関するβ−グルコシダーゼの連続的作用はＧｌ！ｃ−ＧｅｒおよびＧＩ！ｃ−ｐＮＰの消失とグルコース（第２ステツプ）の出現を引き起こす。

対応するアグリコン（ｐＮＰまたはゼラニオール）に関し、これらは両グリコシダーゼ、すなわちα−ラムノシダーゼまたはα−アラビノシダーゼ、ついでβ− グルコシダーゼの連続的作用の後にのみ放出される。別に、Ａｐｉ　−１ｃ−Ｇｅｒへのβ−アビオシダーゼの作用は基軍の消失とアビオースおよびグルコースの出現をもたらす。これらの結果はこれらのグリコシドの酵素的加水分解が先に述べたように２段階で進行することを示している。

２−グリコシド抽出物の酵素的加水分解（グリコシド抽出物の生成操作）グリコシド抽出物はステーション、エクスベリメタル・デ・ベックラウゲ（ＩＮＲＡグルーサン、フランス）のぶどうの完熟期に採取されたマスカット・デ・フロンティグナン変種ぶどう液の抽出および遊離テルペノールおよび糖の除去で得た。

多くの実験を行なって一定のグリコシドの供給が重要であることが分った。最後に、この操作は予め遠心しサルファイド処理（５０ｐｐｍ）したぶどう液を大量（８０リツトル）に用いて行った。

グリコシドの抽出はぶどう栽培法≠従来から用いられてきた活性炭（ＣＸＶ型活性炭、七カ　Ｓ、　Ａ、、−、Ｓリジービラコープレー、フランス）８０グラムを用いて行った。この混合物を攪拌しながら４時間保ち、ついで−晩装置する。

セルロースフィルター（孔径４０−５０μｍ）による濾過で活性炭を回収した。

活性炭で抽出された糖を除去するため、これを４Ｘ１５０ｍｌの水で洗浄し、ブフカーロートで濾過した。Ｔ　Ｌ　Ｃによるモニターでグリコシドの溶出を起こすことなく各ステージで糖含量が減少していくことを５ｆｉ認できた。グリコシドは５Ｘ２００ｍｊ！のアセトンで洗うことにより回収する。ここでもＴＬＣによりグリコシドの定量的溶出が確認された。アセトンを減圧下のエバポレーションで除き、このサンプルを４０ｄの純水に溶かした。このグリコシド抽出物は以下の手順で調製したアンバーライ）ＸＡＤ−２（ローム・アンド・ハース社、フィラデルフィア、ＣＡ、ＵＳＡ）有機性樹脂による分画でさらに精製した：孔径１７５〜３５０μｍ（８０〜４０メツシユ）のふるいに相当するサイズの粒子のグラインディングおよびふるい分け、ついでソックスレー中各々８時間のメタノール、アセトニトリルおよびジエチルエーテルによる３回の洗浄。ラボラトリ− ・デス、アロメス・工・デス　サブスタンシス　ナチュレレス（γロマス　アンド　ナチュラル　サブスタンス　ラボラトリ−）で開発されたこの分画法はすでに詳細に報告されている。本研究においては以下に示すようにつづけて２回適用したニー　メタノールに懸濁したレジンをテフロンタップとグラスウールを端に備えたガラスカラム（３５Ｘ１ｃｍ）に注ぐ。落ちつかせてレジン層の長さをおよそ２０ｃｍとする。５０ｒｎｌのメタノールを数回通した後５０ｍｊ！のジエチルエーテルを流し、最後に１００ｒｎｌ。

の純水を用いてレジンを平衡化さ妊る。これでカラムの準備ができる。

＝　４０−のグリコシド抽出物を２〜２．５　ｍｌ／ｍｉｎの速度でカラムに流す。その後カラムを１００ｍ１！の水で洗浄し残存する糖を除去し、さらに１００−のペンタンを流してレジンに結合した遊離テルペノールを流出する。流速は先に述べたものと同様である。

−ついで１００−の酢酸エチルを用いてグリコシドを溶出する。

このフラクションの組成はＴＬＣで調べた。これで遊離した糖が存在しないことが確認できる（ここではＸＡＤ−２による２回目の分画の終りに）ａ減圧下このグリコシドフラクションを乾燥させ、ついで１８ｄの水にとかす。このようにしてクロマトグラフおよび酵素的実験で用いるグリコシド抽出物が得られた。

加水分解グリコシド抽出物の酵素的加水分解に関する実験操作を第３；に示す。

表この加水分解をＴＬＣおよびＧＣでモニターする。

ＴＬＣによる加水分、解のモニター結果を第７図に示す：グリコシド抽出物の酵素的加水分解のＴＬＣによるモニター。

１、グリコシド抽出物２、グリコシド抽出物＋β−グリコシダーゼ３６クリコシド抽出物＋α−アラビノースーゼ４、　グリコシド抽出物＋α−ラムノシダーゼ５、　グリコシド抽出物＋α−アラビノシダーゼ＋β−グルコシダーゼ６、　グリコシド抽出物＋α−ラムノシダーゼ＋β−グルコシダ最初のグリコシド抽出物は主要スポラ）（ＴＬＣ：Ｒｆ　Ｏ，７１、魔２）および２つのサブスポット’（ＴＬＣ：Ｒｆ　Ｏ，６７および０．７９、Ｎα１およびＮα３）を示す。

β−グルコシダーゼによる抽出物の加水分解でグルコースと同じＲｆ（０，２６）の小さいスポットが生成し、大きい方のスポット（Ｎα３）が減少する。

α−アラビノシダーゼによる加水分解の場合、主要スポットの実質的減少が観察され、かつテルペンモノグルコシドと同じＲ、ｆ値（０，７６，０，７９）のスポット、アラビノースのＲｆ（０，３１）のスポット、およびラムノースよりも少ないＲｆ（０，５５＞の弱い未知スポットが出現した。このグルコシド抽出物にα−ラムノシダーゼを作用させたとき、Ｒｈａ　−Ｇｌｃ　−Ｇｅｒに対応するスポットＮα１が消失し、テルペンモノグリコシドのＲｆをもつ弱いスポットが出現する。この場合、ラムノース（Ｒｆ　Ｏ，５９）だけが単糖類として放出される。

α−アラビノシダーゼまたはα−ラムノシダーゼとインキュベートした各反応物に対するβ−グルコシダーゼの連続的作用で単糖類のＲｆをもつスポットが実質的に減少し、かつグルコースが生ずる。しかし、グリコシド抽出物の主要スポット（Ｎα２）はグリコシダーゼの連続的作用後にも完全に消失しないので、残存する一部を回収し、以下に述べる条件下で酸加水分解を行った。ｐＨ３，０での加水分解ではなんの変化も起こらなかった（ＴＬＣで確認）。一方、２Ｍ）ＩＪフルオロ酢酸による完全な加水分解でこのスポットは消失し、かつグルコース、ラムノースおよび未知化合物（Ｒｆ　Ｏ，５５）が生成する。

これらのＴＬＣ実験で精製酵素による加水分解の際にグリコシドの炭水化物部分がどのような運命をたどるかが分る。これらの結果からテルペングリコ２．ドの加水分解は連続的加水分解で起こることが分る。この加水分解のメカニズムは、ＧＣ分析でより詳細に示される。

ＧＣによる加水分解のモニター加水分解の各ステージで反応産物（糖、テルペングリコシドおよびテルペノール）をＧＣにより分析する。結果を第８図および第９図に示す。

第８図：　グリコシド抽出物の酵素的加水分解のＧＣによるモニター。

ａ、シリル化グリコシド抽出物、ｂ、グリコシド抽出物＋α−アラビノシダーゼ、Ｃ，グリコシド抽出物＋α−アラビノシダーゼ＋β−グルコシダーゼ１．　Ｓ、内部標準（Ｇｊ！ｃ　−ｐＮＰ）ｌおよび２、　α−およびβ−アラビノース５および６、　α−およびβ−グルコ−スミ、Ｇｌｃ　−Ｌｉｎｂ、Ｇｉｃ　−ＮｅｒＣ１Ｇｌｃ　−ＧｅｔＡ、Ａｒａ　−Ｇｌｃ　−ＮｅｒＢ、Ａｒａ　−Ｇｌｃ　−Ｇｅｒ第９図：　第８図同様、α−ラムノシダーゼ＋β−グルコシダーゼによる連続的加水分解の場合３および４　α−およびβ−ラムノース最初の（シリル化）グリコシド抽出物は単糖類もモノグリコシドも含まない（第８ａ図）。

β−グリコシダーゼの作用はこの抽出物のプロフィールを実質的に変化させず、グルコースの出現はない。また加水分解のＴＬＣモニターでも観られるようにこの酵素によるグリコシド抽出物からのグリコースの放出は、おそらくテルペン前駆体の加水分解からは生じず、他のグリコシドから生じる。

α−アラビノシダーゼまたはα−ラムノシダーゼの作用で、グリコシド抽出物のプロフィールが実質的に変化する（第８ａ図および第９ｂ図）。特に、同定された（ピークＡ＝Ａｒａ−Ｇｌｃ　−Ｎｅｒ：ビークＢ＝　Ｇｌｃ−Ｇｅｒ）２つの主要なピークはα−アラビノシダーゼとのインキュベーション後に完全に消失する一方、アラビノースが出現する。Ｒｈａ−Ｇｌｃ　−Ｇｅｒの保持時間に相当するビークＣはα−ラムノシダーゼの作用後に減少する。同時にラムノースが出現する。グリコシド抽出物を２つのグリコシダーゼのいずれかとインキュベーションすると参照物質との比較で同定し得る３つのモノグリコシド（リナリル、ネリルおよびゼラニルグリコシド）を生ずる。これらのテルペンモノグリコシドの大部分はα−アラビノシダーゼの作用で放出される。残りは（２３％）α−ラムノシダーゼの作用で生ずる（第４表）第４表グリコシド抽出物からα−アラビノシダーゼおよびα−ラムノシダーゼによって放出されるテルペンモノグリコシド３１ゝ（１）この結果は２つの酵素により放出される各化合物の総量のパーセンテージで表わされる。

加水分解の第１段階、すなわち３つのグリコシダーゼの１つによるグリコシド抽出物の加水分解の際に検出されるテルペノール量は無視し得る。

先にα−アラビノシダーゼまたはα−ラムノシダーゼとインキュベートしたグリコシド抽出物へのβ−グリコシダーゼの連続的作用（第２段Ｆ＃）でネリルおよびゼラニルモノグルコシドの消失およびリナニルモノグルコシドの減少およびグルコース（第８Ｃ図および第９Ｃ図）およびテルペノールの大量の生産が起こる。

スウィートアーモンドから抽出され、かつテルペングリコシドの連続的加水分解を研究する目的で選択されるβ−グルコシダーゼはりナリルグルフシドへのアフィニティーが低く、使用される条件下ではりナリルグリコシドの加水分解は不完全となる。

大量に放出されるテルペノールにはゼラニオール、ネロールおよびリナロールがある。これらのテルペノールの約８０％はα−アラビノシダーゼとβ−グルコシダーゼの作用の組合せで生ずる。

また他のテルペノールまたは揮発性化合物は少量ながらこれらの酵素の連続的作用で検出される。これらにはα−テルピネロール、シトロネロール、ハイドロキシリナロール、リナロールオキシド（シスおよびトランスフラン構造およびシスビラン構造を有する）、ベンジルおよびフェニルエチルアルコール、テルペンポリオール、ノリツブレノイド（３−ハイドロキシダマスコン、３−オクソーα− イオノール）、ビニルガイアコールおよびエチルフェノールが含まれるグリコジル抽出物へのα−アラビノシダーゼの作用の後に観察されるクロマトグラフプロフィールの実質的変化は優勢なグリコシドのより深い研究へ誘導する。この目的のため、ＨＰＬＣプロフィールのピークＡおよびＢに対応するフラクションを分取した。この一部をシリル化してからＧＣで分析した。第１０図および第８図の２つのクロマトグラムのピークＡとビークＢの間の一致が確認された。

第１θ図の１１■注：　グリコシド抽出物のＨＰＬＣプロフィールＡ、　Ａｒａ　−ＧＩ！ｃ　−ＮｅｒＢ、　Ａｒａ　−Ｇｌｃ　−Ｇｅｒさらに各フラクションにα−アラビノシダーゼ、ついでβ−グルコシダーゼの連続的作用を行った。各段階の終りに先に述べた操作に従ｆＪ＜、ｃ、インキュベート物をＧＣで分析し、一方では糖およびグリコシド、他方ではテルベノールを調べた。この結果を第５表にまとめた。ビークＡおよびＢは各々ネリルおよびゼラニルα−Ｌ−アラビノフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシドと同定された。

さらにゼラニルグリコシドの同定はグリコシド抽出物と合成化合物との共注入で確認した。

第５表一方グリコシド抽出物へのへミセルラーゼ調製物（α−ラムノシダーゼ、α−アラビノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ活性を含む）の作用後のグリコシド抽出物へのβ−アビオシダーゼの作用について調べた。ヘミセルラーゼ調製物はラムノシル−およびアラビノシル−グリコシドを生成した（第１１ｂ図）。その後残存するアビオシルグルコシドをクラーザイム２００のβ−アビオシダーゼおよびβ−グルコシダーゼの加水分解作用で処理した（第１１ｃ図）。注目すべきことにアビオシルグルコシドが消失し、リナリルオキシドグリコシドが出現した。

このことはアビオシルグリコシドの連続的加水分解を示している。ゼラニルおよびネリルモノグルコシドとは逆にリナリルモノグリコシドは加水分解しなかった。これはりナリルグリコシドに対してクラーザイムのβ−グルコシダーゼのアフィニティーが低いことに寄因する。

総合するとこれらの結果はぶどうテルペンの酵素的加水分解が合成基質で示されたものと同様に連続的メカニズムによることを確認している。

３．天然媒体の酵素的加水分解一方では天然媒体（ぶどう液またはドライワイン）、他方では参照媒体（バッファ）に含まれるグリコシド抽出物の必要とされる３つのグリコシダーゼを含む市販の調製物の作用による酵素的加水分解を研究した。

テルベノールおよびテルペングリコシドを含まないがマスカットの既知量のグリコシド抽出物に富むぶどうのジュースおよびワインを市販の酵素調製物で処理する。コントロールと同様にこの画参照）。これらをグリコシド抽出物の生産に適用した操作に従かいアンバーライトＸＡＤ−２カラムに通し、かつテルペノールをＧＣで検討する。

実験操作計画５０ｗｔ１ぶどう液　＋０．５ｍｊ！ヘミセルラーゼ（１）（ｐＨ３，４、糖　１８０ｇ＃）　＋０．５ｍｉ！ナリンジナーゼカー）コントロール＋２−２％ＮａＮ５　（３）またはドライホワイトワイン　＋０．５−ヘミセルラーゼ（ｐＨ３，１）　＋ｏ、５− ナリンジカーゼ＋１ｄグリコシド抽出物（４）＋２艷　２％ＮａＮ５＋１ｍｊ２グリコシド抽出物５Ｑｍｇ′＜ツファ　コントロール（５０ｍＭクエン酸−リン酸　＋２ｍｌ　２％ＮａＮａｐＨ３，３）＋　０．５１１１１！へミセルラーゼ＋　０．５　ｍｆｆナリンジナーカー照＋１ｍｇグリコシド抽出物＋２ｄ　２％ＮａＮ５（１）　使用するヘミセルラーゼＲＥＧ−２溶液（１５ｍｇ／　ｍ＞　０．５ｄは７０ｎｋａｔのα−アラビノシダーゼ活性、７２ｎｋａｔのβ−グルコシダーゼ活性および９ｎｋａｔのα−ラムノシダーゼ活性を有する。

（２）使用するナリンジカーゼ溶液（５ｏ＋ｇ／ｍｊり　０．５ｒｎｌは７８ｎｋａｔのα−ラムノシダーゼ活性および０．１ｎＫａｔのβ−グルコシダーゼ活性を有している。　。

（３）ＮａＮｓは微生物の増殖を抑えるために用いる。

（４）グリコシド抽出物はマスカットアセキサンドリア種のぶどう液をアンバーライトＸＡＤ−２に通すことにより得る。テストに投入するグリコシド抽出物の量（ｌＩＩＬ１２）はマスカットアレキサンドリア種のぶどう液５０＋ｄに相当する。

実際のぶどう栽培に似せた条件下でテルペノールの放出が観られた。この放出はワインの場合よりもぶどう液の方が少ない（第６表）。参照媒体中で放出される量と比較して、２５℃、８６時間後に放出される芳香成分の割合に関してはぶどう液では１１％でワインでは２８％である。ゼラニオールグリコシドはりナロールおよびネロールに比べてよりよく加水分解を受けることが注目される。

ぶどう液中に大量に存在するグルコースによりβ−グルコシダーゼ活性が阻害されることはワインと比べて効率が低いことを説明している。

テルペングリコシドの優位性を考慮して遊離のテルペン画分を少なくとも倍化し得ることからこの結果はワインの場合により満足なものであった。

第６表市販の酵素調製物によるぶどう液およびワインのグリコシド抽出物の加水分解（１）参照媒体：グリコシド抽出物＋クエン酸−リン酸バッファｐＨ３，３＋へミセルラーゼＲＥＧ−２＋ナリンジナーゼ（酸加水分解）精製グリコシダーゼによる酵素的加水分解に耐性なＴＬＣスポット中の未知構造のテルペングリコシドの存在を検出するため、ＴＬＣから回収したスポットに対応する化合物を酸加水分解した。

１）　回収した媒体を窒素気流中４０℃で乾燥する（２５０μＩ２）。

２５０μｌの２５１１ＩＭクエン酸−リン酸バッファ（ｐＨ３，０）をフラスコに入れ、シールして２０分間１００℃に加熱する。冷却後、その媒体をペンタンで洗浄する（５Ｘ２５０μｌ）。どのブンタン抽出物に内部標準を入れ濃縮後ＧＣで分析する。また水相２５μｌをＴＬＣプレートにスポットする。

２）　上述のように乾燥後回収した媒体を２５０μｌの２ＭＩＪフルオロ酢酸で処理し、１２０℃で７５分間加熱する。冷却後その媒体を上述の方法で分析する。

４、技術的応用天然のスウィートワインおよびぶどう液のドライワインのアルコール発酵の際の菌類由来のグリコシダーゼの作用につＧ）で研究した。２つの酵素調製物へミセルラーゼおよびクラーザイム２００（いずれもギストープロケーズで生産されたもの）を試した。

（実験手順）マスカットフロンテイグチン類の成熟した健全なぶどうを圧搾した。このぶどう液をサルファイド化しく５ｇ／ｈ　Ｉ　Ｓ　Ｏ２）遠心した。

これにヘミセルラーゼ酵素調製物（１リットルぶどう液当り４６７ｎｋａｔのα −アラビノシダーゼ、２９６ｎｋａｔのβ−グルコシダーゼおよび３１ｎｋａｔのα−ラムノシダーゼを含む）およびＬｏｇ／ｈｊ２のワインイー、スト　（サツカロミセス　セレビシエパラチフ・ドウ・ゲイン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｃａｏｐａｒａｔｉｆ　ｄｕ　Ｖｉｎ）、モーリン、フランス）を加えた。

アルコールを添加することにより発酵中期で発酵を止めることによりアルコール濃度１７％（Ｖ／Ｖ）の天然スウィートワインが得られる。

ドライワインは糖が消耗されるまで発酵をつづけて得る。このダーゼは（ＮＨ４）、ＳＯ４による沈殿で単離した後に対応するｐ−ニトロフェニルグリコシドを用いて測定する。

２０〜２２℃で１．５力月貯蔵後各サンプルの遊離および結合芳香化合物をアンバーライ）ＸＡＤ−２カラムを用いて５０ｍＡの部分標本に抽出しＧＣで分析した。

培地中に残存グルコースがない場合（ドライワインの場合）アルコール発酵における芳香成分の放出に外来グリコシダーゼが有効であった。したがってノリツブレノイド誘導体（β−ダマセノン、３−ヒドロキシ−β−ダマスコン）同様テルペノール（たとえばネロール、ゼラニオール、シトロネロール、α−テルピネオール、ヒドロキシリナロール）の含量は酵素処理したぶどう液由来のドライワインに多い（第８表）。この分析結果はティストパネルでも確認される。全てのティスター（１５名）は酵素処理したドライワインを好んだ。またティスターは天然スウィートワインについて酵素処理したか否か判断できなかった。酵素処理したぶどう液由来のワインはより芳香性が高くかつより特徴的であると判断されるはずである。

酵素処理ぶどう液由来のスウィートワインの場合、チルベンジグリコシドの加水分解は不完全でストップしモノグルコシドだけが残る（第１２図）。主要なジグリコシド（アラビノシルグリコシド、ビーク７および９）の顕著な減少および対応するネロールおよびゼラニオールモノグリコシド（ビーク２および３）が目立つ。後者はβ−グリコシダーゼ（アスペルギラスニガ−（Ａｓｐｅｒ−ｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来）活性を阻害する効果を有するグルコース（３０ｇ／ｌの存在のため天然のスクイ−トワイン中では加水分解されない。一方酵素処理ドライワインの場合これらのグルコシドは加水分解される。

しかし、β−グルコシダーゼ（イーストカンディダ　ウィッカーハミ　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｗｉｃｋｅｒ　ｈａｍｉｉ）　ＣＢＳ　２９２８由来）はＰＨ３，６以上の天然スウィートワイン中ネリルーおよびゼラニルモノグルコシドを加水分解し得た。これはＰＨ３，６以下ではキャンディダウィッカーハミ　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｗｉｃｋｅｒ　ｈａｍｉｉ）β−グルコシダーゼの安定性が低いことによる。

ｐＨ３，６で天然スクイ−トワイン中に存在するネリルーおよびゼラニルグリコシドは、各々１９％および４５％が加水分解した。ｐＨ４，０では各グルコシドの３分の２が加水分解した。

アラビノシル−およびラムノシルグルコシドとは反対にアピオシルグルコシドはへミセルラーゼ酵素調製物では加水分解されなかった（ビーク８および１０）。

これはこのｔｌｉ製物中物中ビオシダーゼが存在しないことに帰因する。

一方、α−ラムノシダーゼ、α−アラビノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼの各活性に加えてβ−アビオシダーゼ活性を含む酵素調製物（クラーザイム２００）の作用をマスカットフロンチグナン種のドライワインの発酵に関して研究した。ぶどう液にクラーザイム２００　（ぶどう液１リットル当り）２．７７０ｎｋａｔのβ−グルコシダーゼ、７０：、４　ｎ　ｋ　ａｔのβ−アビオシダーゼ、２７（ｉｎｋａｔのα−アラビノシダーゼおよび３５ｎｋａｔのα−ラムノシダーゼを含む）および１０ｇ／ｈ１ｏηインイースト（サツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｋ　ｌ型）を加えた。

酵素処理ドライワインはへミセルラーゼを用いた場合と比較して、遊離芳香成分の増加で区別された（第９表）。さらにクラープイム２００中のβ−アビオシダーゼ活性の存在はアピオシルグルコシドの加水分解を可能にした（第１０表）。

他のグルコシドやグリコシドとは反対にリナリルグルコシドおよびリナリルオキシドグルコシドは加水分解されなかったことは注目される。このことはこれらの基質に関するクラーザイム２００調製物中のβ−グルコシダーゼの活性が弱いこ止で説明される。

ビニル、ガイアコールおよび３−オクソーα−イオノールなどの他の揮発性成分も酵素処理ワイン中に低濃度で検出された。

ワイン中重要な２−フェニルエタノールの増加はぶどう液の発酵の際にイーストによって合成されることに帰因する。別に外来グリコシダーゼにはぶどう液やワインの酸性ｐＨにおいて安定であるものがあることが分った。

浄書（内容に変更なし）ｙｉｇｕｒａ　１− 吸光度　（２８０コ）　α−−一つ活性　ｃ山ｔ／ａｌｌ浄３（内容に変更なし）ｙｉｇｕｒ＠２吸光度　（ｚｓｏｎｍ）　σ−−−〇活性　（ｎ）ｃａｔ／！１１　）浄８（内容に変更なし）Ｆｉｇｕｒａ　３吸光度　（２８０ｒａｍ）　Ｇ−一一〇活性　（ｎ）ｃａｔ／ｍｌ）浄書（内容に変更なし）ｙｉｇｕｒ＠４吸光度　（２１１０ｎｍ）　０−−−り活性　（ｎｋａｔ／ｍｌ　）　番−一一七ＦｉｇｕｒａフＦｉ−・８ｒ１φ「・９浄書（内容に変更なし）Ｆｉｇｕｒａ　１０浄書（内容に埜更なし）ＦｉｇｕｒｅＬｍマスカット　デ　フロンテグナン種のぶどう液由来のグリコンド抽出物のＧＣクロマトグラム（八）：ヘミセルラーゼによる酵素処理（Ｂ）；クラーザイム２００による酵素処理（Ｃ）。

浄書（内容に変更なし）Ｆｉｇｕｒｅ　１２平成　年　月　日

Claims

【特許請求の範囲】

１．グリコシド構造を有する前駆体から芳香性成分および芳香性物質を得る方法で、（イ）第１段階で少なくとも１つの該前駆体を含むグリコシド基質を該前駆体の構造に従い選択した少なくとも１つの酵素を用いて酵素的に加水分解しグリコシド結合の切断により相当するモノグリコシドを放出させる。この酵素的加水分解の際に少なくとも１つのβ−アピオシダーゼとこれに対応するアピオシドが存在することを条件とする。（ロ）第２段階では第１段階の産物の酵素的加水分解を第１段階とは別で、かつアグリコン−炭水化物結合を切断することにより芳香性成分および芳香物質を放出させる少なくとも１つの酵素を用いて行う、以上（イ）および（ロ）のステップを含む方法。
２．前記β−アピオシダーゼがβ−Ｄ−アピオフラノシダーゼであることを特徴とする請求項１記載の方法。
３．グリコシド基質としてβ−Ｄ−アピオーβ−Ｄ−グリコシドが存在することを特徴とする請求項１記載の方法。
４．基質がモノグリコシドのみを含む場合、酵素的加水分解が第１段階を経ずに直接行なわれることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
５．グリコシド基質を第１段階において芳香性成分および、または芳香物質同様モノグリコシドを放出し得るよう選択された酵素と接触させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
６．グリコシド基質として、フルーツ、芳香性植物または花植物およびそれらの誘導体または副産物由来の植物物質またはインビトロの細胞培養物由来の植物物質を選択することを特徴とする請求項５記載の方法。
７．ぶどう液、ワインおよびその誘導体や芳香性ぶどう、特にマスカットの発酵副産物などのぶどう由来の植物物置を選択することを特徴とする請求項６記載の方法。
８．グリコシド基質としてグリコシド抽出物を用いることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
９．グリコシド基質として、使用前に遊離のテルペノールおよび糖を除去したマスカットなどのぶどう由来のぶどう液の抽出物を用いることを特徴とする請求項８記載の方法。
１０．加水分解を天然の媒体中で行なうことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
１１．天然媒体としてテルペノールおよびテルベングリコシドを含むか、もしくは含まないぶどうのぶどう液およびワインを用い、該媒体がテルペノールおよびテルペングリコシドを含まない場合、請求項８で定義したグリコシド抽出物に富んでいることを特徴とする請求項１０記載の方法。
１２．合成基質を用いることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
１３．付加的合成基質としてｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−ラムノピラノシルー（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシド、ゼラニルα−Ｌ−ラムノピラノシルー（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシドまたはｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラピノフラノシルー（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシドを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
１４．第１段階において、α−アラビノシダーゼおよびα−ラムノシダーゼを含む２つの付加的酵素を用い、かつ第２段階における酸素としてβ−グルコシダーゼを用いることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項記載の方法。
１５．α−アラピノシダ−ゼおよびα−ラムノシダーゼとして各々α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．５５）およびα−Ｌ−ラムノピラノシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４０）を用い、かつβ−グルコシダーゼとして β−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
１６．芳香性成分または芳香性物質として、ゼラニオール、リナロール、ネロール、α−テルピネオール、シトロネロールなどのテルペノール；リナロールオキシド；ヒドロキシリナロールなどのテルベンポリオール；フェニルエチルアルコール、エチルフェノールおよびベンジルアルコールなどのアルコール；３−ヒドロキシダマスコンおよび３−オクソーα−イオノールなどのノリソプレノイド；およびビニルギアコールを得ることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項記載の方法。
１７．パラニトロフェノールなど無臭性アグリコンが生成することを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項記載の方法。
１８．請求項１乃至１７のいずれか１項記載の方法で得られる芳香性物質および芳香性成分。