PT95246B - Processo de obtencao de componentes aromas e aromas a partir dos seus precursores com uma natureza glicosidica. - Google Patents

Description

μι IIn^ll.%.11II Ι^ππίΐΓΓ^

t d· β-D-apiofuranosil* j£-I?-glueopiranó sidos {designados por Api-Glc) nos quais a glucopiranose proporciona a ligação. entre o resíduo de terpeno (designado por Terp) e o dissacarídeo, de aeorde eom as fórmulas*

Rlia( 1—\6)Gle-Terp Ar&( l—>6)Gle-Terp Api( 1— >6)Glc«Terp A fracção de aroma na forma de precursores · muito frequentemente bastante superior à fracção dos aromas livres (tipicamente de um factor de 3 a 10) e pode alcançar concentrações elevadas da ordem de alguns miligramas por litro·

Tendo em consideração ainda o limiar de percep-ção olfactiva particularmente baixo e a qualidade aromática dos álcoois terpénicos, existe entre estas variedades de vinhos um potenoial aromático extraordinariamente importante e não explorado·

Os glicósidos terpénicos presentes no suco podem ser hidrolisados utilizando composições enzimáticas comerciais eom uma vasta variedade de especificações. A libertação por via enzimátiea do torpenois, que reflectem o aroma natural livre do fruto com maior fidelidade do que a que á proporcionada pela hi drólise térmica ao pH do suco, é pois possível) todavia, o controle desta libertação para uma exploração industrial do potenoial aromático pressupõe que as glicosidases responsáveis pelas hidrólises estão bem definidas e que o seu mecanismo de acção está perfeitamente estabelecido*

TÉCNICA ANTERIOR

Strauss et al· (in Parliament et al·, Biomenera-tion of aromas· 1986, American Chemical Society, Washington, D*C·, pp, 222-239) analisam a importância dos monoterpenos no aroma da uva e do vinho 0 em que medida estes compostos contribuem para o carácter da variedade que e particularmente significativo na produção vinícola·

Plsarnitskil, A.F. (Chemical Abstra -t 128650c, • 1971» Columbus, Ohio) revelam um processo para conferir odores . aos vinhos através do enriquecimento do produto com substâncias = 2 = t

na polpa para aumentar n aetividade dos enzimas da polpa que são responsáveis pela síntese ©nzimatiea das substâncias aroma*» tic&s presentes no produto e a conferir o aroma pretendido ao produto acabado.

Drawert, F, et al, (j, Agric. Food Chem., 197^» vol, 26* n» 3* págs, 765-766) revelam a descoberta dos monoter-penos citronelol, linalool e geraniol nos constituintes odorífe ros produzidos pela levedura Kluworomycea lactis em culturas submersas aeróbicas. Variando as condiçSes da cultura foi possj[ vel influenciar a blossímtes# do citronelol na K, lactis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

J A presente invenção baseia-se numa demonstração do mecanismo da hidrólise enzimtica, sendo o referido mecanismo de natureza sequencial·

Deste modo o processo de acordo com a presente iirvençSo para a obtenção de componentes de aroma e aromas a par tir dos seus precursores de natureza glicosídica é caracteriza-do por* - numa primeira fase realiza-se uma hidrólise enziraática de um substrato glicosídico contendo pelo menos um dos referidos precursores* com pelo menos um enzima escolhido de acordo com a estrutura do referido precursor* para libertar os correspon dentes monoglucósidos por clivagem numa ligação de glicóeidof

J - numa segunda fase* realiza-se uma hidrólise enzimatica do pro duto da primeira fase com pelo menos um enzima diferente ou igual ao enzima da primeira fase e destinado a libertar os componentes de aroma e os aromas por clivagem da ligação agli eona-carbohidrato«

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS fig. li perfis cromatográficos das actividades de ç^-ramno sidase e P -glucosidase·

Fig· 2| perfil cromatogrófico de actividades de ^arabinosida-se* 5(-ramnosidase e β-glucosidase. . Fig· 3* perfil cromatográfico de actividades de ©t -arabinosida-* se, 0( -ramnosidase e ^-glucosidase após cromatogra- t

fia de pormuta :>ónica por ÍSAB-Sepharose CL-áB.

Fig· 4* perfil croma tográfico de actividade de q(-arabinosida— •e após cromatografia de afinidade por A-Ultrogel de concanavalina. ri*. 5* 1 Fig. ót < Fig. 7* Fig. 8* Fig. 9* 1 Fig. 10* Fig. 11* 5* perfil cromaiográfico de actividade de c(-arabinosidase como função de pH e da temperatura. 6t controle por TLC da hidrólise eazimática de substrato» sintéticos Ara-Glc-pNP e Rha-Glc-pNP. 7* controle por 7LC de uma hidrólise enzimatica d© um suba trato glicosídico.

Fig* 8* controle por GO da hidrólise enzimátlca de um extracto glicoeídico por ¢( -arabinosidase £ ^-glucosidase. 9* controle por GC da hidrólise sequencial de um extracto glicoeídico por <χ«ramnosidas© + β-glucosidase. 10* cromatograma por IIPLO d© glieÓeidos terpanicos. 11* cromatograma em fase gasosa de extractos glicoeídicos do mosto de uvas Muscat de Frontignan (a)$ tratadas enzimaticamente com Ilsmioelulase (fí)| tratadas enzima-ticamente com Klerzyme 200 (c) .

Fig. 12* cromatograma em fase gasosa de fracçdes de aromas gli eosiladas dos mostos de vinhos naturalmente doces* (a) tratados onzimaticamentej (b) não tratados ©nzimatica-mentei e vinhos secos* (c) tratados enzimaticamonte; (D) não tratados onzimaticamente·

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA 1HVEBCÍO

Por "substrato* entende-se qualquer substância contendo um precursor de natureza glicosídica de um componente de aroma ou de um aroma* A título de exemplo o precursor glicoeídico pode ser um produto vegetal derivado de uvas, tal como suco de uvas, de vinhas e seus derivados, por exemplo todas as bebidas conten do vinho, suoo de uva ou uma substância relacionada, bem como sub-produtos da vinificaoílo de variedades de vinho aromático, especialmente moscatéis, Os quatro componentes do sistema enzi-

mátxco necessários para que a hidrólise doa glicósidos terpeni-eos das uvas libertem terpenois, substancias voláteis e odoríferas, são agora conhecidas de acordo com a invenção j uma (*--arabino sidase, uma a^-ramnosidase e uma ^-apaosidade para a primeira fase, e β-glucosidase para a segunda fase· 0 trabalho que conduziu à presente invenção permitiu, com efeito, concluir -se que a hidrólise de diglicósidos terpenicos não e resultado da acção de uma só glicosidase mas, pelo contrário, de várias, operando aos pares, de acordo com o seguinte mecanismo sequencial em duas fasest

Fase 1: acção de uma ti—arabino sidase, de uma tf-rainnosida.se e de uma ^-apio sidase libertando os correspondentes mono glucosidos terpenicos por clivagem n~. ligação de glico-sido {l»*)ô)·

Fase 2* acção de uma {3-glucosidase propor.ionando a libertação de terpenois por clivagem da ligação terpenica aglicona -carbohidrato·

J

Ara( 1—>6 )Glc-Terp »-arabinosidase Rha( 1—>6 )Glc-Terp tf-ramnosidase Api (1—> 6 ) Glc-Terp f^apio sidase ^ Fase 1

Glc-Terp y Terpanol y-glucosidaso

Fase 2 O ultimo enzima chave, nomeadamente a p-gluccsjL dase, do qual depende á libertação final dos terpenois, exibe de preferencia uma inibição mínima para glucose, actividade a valores de pH ácido e alta afinidade com respeito às agliconas fixadas em substratos glicosídicos, para que c processo proposto possua completa eficácia nas suas aplicaçães* • Be acordo com a invenção foram também definidos . os substratos (Ara-Gle-pNP, Rha-Glc-pKP, Api-Glc-pNP, Ara-pNP, * 5 = ί

*·

J

J

Rha^pNP, Api-plíP, Glc-pKP) que permitem a medição das aciivida des, sendo estas condições essenciais para a produção dos eox‘— respondentes enzimas* 0 prooosso de acordo com a presente invenção e exemplificado peim exploração do potencial aromático de uvaa, sendo o material do plantas primário escolhido de sucos de uvas* vinhos e derivados, hem como de aub—produtos da vinifica-çSo de variedades de vinhos aromáticos, especialmente, mas não exclusivamente, vinhos moscatéis*

Todavia, a presente invenção não está limitada a esta aplicação* Com efeito, o mecanismo dernonotrado e um mecanismo geral quo conduz a componentes de aromas o a arooi; que não são necessariamente terponicos, e o qual S aplicável a todos os produtos do plantas que não sejam uvas: frutos, derivados de frutos (por exemplo bebidas) e subprodutos de frutos} plantas aromáticas e plantas que produzem flores, assim como derivados e sub-produtos destas plantas} outras plantas, tais como chá e tabaco} e mesmo material de plantas que tem origem na cultura in vitro de células; com as seguintes condições: (a) que estes produtos de plantas centonham, em quantidade suficiente, aromas ou precursores de perfumes de natureza glicosídica, incluindo terpenois e outros glicóeidos que não sejam os que se encontrara nas uvas, (b) que as glicosidaues específicas correspondam à estrutura dos precursores glicosídicos} e (e) que o meio natural não contenha inibidores dos enzimas aplicados·

Como frutos contendo glicosidos, paxa além das uvas, que podem ser usados no processo da presente invenção, podem mencionar-se alperces, mangas, papaias © maracujá, entre outros* Como planta que produz flores pode niencioa&r-se, entre outras, a rosa*

Também é possível utilizar um extracto glicosádico como substrato glicosídico, ou como alternativa a hidréli-* se pode ser realizada mim meio natural contendo os precursores* * 6 =

Beste modo dispaa*3e do ma grande numera de possibilidades para a realização do processo de acordo com a presente invenção* - Trabalhando-se num maio natural, como foi descrito acima, o aroma ligado 4 libertado, aumentando deste modo o aroma do proprio produto} - também e possível tratar um determinado extracto glioosídico (por exemplo, de papaia) e introduzir o aroma obtido noutro produto, por exemplo uma bebida (sumo de uva); - também e possível introduzir um (ou mais) extracto» glicosfdi eos (por exemplo extracto de papaia, extracto de bagaços) num substrato líquido (por exemplo sumo de uvas, bebidas naturais) e aplicar o processo de acordo com a invenção, libortauao àeste modo o aroma in si tu. Também é possível prever que o aroma seja libertado mais tarde, no momento ρλ* o tendido, num alimento, numa bebida ou num perfume. 0 termo "enzima” define no presente caso qualquer meio capaz de obter a correspondente activiclade enzimátioa. de enzimas empregues no processo de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer origem* baoteriana, de fungos, de leveduras, de plantas, de animais ou sintéticos. Os enzimas produzidos por manipulaçães genéticas utilizando microorganismos hospedeiros estão também abrangidos de acordo com a presente invenção*

Os microorganismos podem pois ser modificados por técnicas conhecidas dos especialistas na matéria para a pro-j duçfto de mm enzima ou de vários enzimas, que podem ser utilizáveis no processo. 0 processo da invenção torna possível obter, em particular, como componentes de aroma ou como aromas, terpenols tais como geraniol, linalool, hidroxilinaloois, oxides <£e ILaa-leol, nerol, citronelol, of -terpineol, compostos norisoprenei-des (tais corno hidrox;»-3-danas cona, 3-oxo-e<-ionol) policis e a1 coois terpénicos, tais como álcool feniletíllco e álcool fcenzí-lico, ou semelhantes.

Be acordo com a invenção é também passível, cen-| soante o perfil do aroma ligado c-o precursor, que pode ser dile- e 7 *

rente tio aroma livre» oa consoante a especificidade do enziiaa usado» ter em vista a produção ue uni aroma novo. 0 conhecimento do mecanismo resulta na produção de enzimas que tem propriedades características novas Λ Cr.p J>i-lidados tecnológicas novas.

Do acordo com uma variante particular de realiza ção do processo da presente invenção» correspondente ao caso em que o substrato contem apenas monoglucósidos » a hidrólise enzi-mática e realizada directamente sem passagem através da pri; .eira fase»

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J

Na definição da invenção» como foi referido acima» afirmou-se que o processo envolvia uma hidrólise em duas fa ses. Todavia» a invenção nãoestá de modo algum limitada â utiii zação das duas fases com adições sucessivas de enzimas separados* Como variante e* com efeito» perfeitaireute possível» esae-cialmente se se tratar do mesmo enzima ou enzimas que libertam os monoglicosidos e também os componentes de aroma e os araras» levar o substrato glicosídicc ao contacto» numa única fase» com o enzima ou enzimas escolhidos» prosseguindo então a hidrólise enzimatica em pelo monos numa fase reactiva conduzindo aos aromas e/ou componentes de aramas pretendidos* &sta variante de realização do processo da invenção pode provar ser adequada» por exemplo» se for usado pelo menos um microorganismo codificado para a produção do enzima ou enzimas úteis na reacção» para a reacção com o substrato glicosídico* Na descrição que se segue» quando se referrm uma primeira fase a uma segunda fase por conveniência da descrição» isto significa simplesmente que a reacção de hidrólise prossegue em varias fases» mas isto não sig nifica de modo algum que estas fases reactivas necessitem do adições separadas de enzimas#

Os exemplos adiante são apresentados como um meio de ilustrar a presente invenção» e não devem ser tomados como limitando o âmbito da invenção* = 8 a

S2C Ç λΟ JSXIJiSRIj.·j£Í„íXViX» A* =>UBSTHaTOS

Jr;ntre substratos utilizados, pode» ser obtidos comercialment© o p -D-^litcopiranósido de p-nitrofsrJÍI> (Sigma* USA), o -L-arabinofuranósido do p-nitrofenilc ( is-ma, USA) e o o( -L-ramnopiraiiúsldo de p-*niirafenilo ('>;xtrc~ aynthese, França)*, O β-D-apiofuranosil- D- «lucopirarxri-’.ο d· geranilo e um extraeto da espécie ds olanta medicinal Hyr>o-xis acuminata» Os outros ,211 cosidos foram sintetizados; as suas sínteses empregam 3 passos, partindo do correspondente s&carí-deo peracetilado* O 1¾ casso consiste na aetivaeão do carbono afiomj, rice do grupo carbohidrato terminal do correspondente sacarxdeo peracetilado por introdução, neste átomo de carbono, de ux átomo de halogenso, como por exemplo cloro ou bromo, ou de um i.ax-dato, tal como tricloroacetoimidaio·

Deste modo o liexaaeetil- o( -cloro-rutiaósido I ob tido pela acção do dicloreto de zinco e de éter dicloror»atii~ -metílico sobre ruiina peracetilada num dissolvente inerte como por exemplo clorofórmio ou cloreto de aetileno, em cond.içães anl dras. O tetraacetil- o(-bromo«’Vglucopiranósido e o .fte-xacetil- «K-bromorutinósido são preparados pela acção de ácido bromídrico gasoso sobra pentaaceto- -D-glucopiranosa © sobre heptaacstorutinosa, r ospectivamente, num dissolvente inerte, como por exemplo clorofórmio ou cloreto d© metileno, em eondiçSes anidras· A mistura de 0-{hexaacetil-er- e - £ -rutinosxl)-tricloroaeetoimidatos & obtida pela acção de bexaceiil-l-rutiao se (obtida pela acção ã& benzilamina ou amónia sobre aeptaaceto-rutinose num dissolvente aprótico, como por exemplo acotonitrilo, tetrahidrofurano ou éter etílico) sobre tricloroacstonitrilo, na presença de uma base, por exemplo de carbonato de potássio ou de hidreto de sódio, nua dissolvente apróti o co«x por exemplo cloreto de metileno, clorofórmio 012 éter dietxliso, a » 9 «

o(-L—araMnofurorio em condições anidras. 0:: C-sil)-o(- e - p —D—glucopirancsi^-trioloroacetoimidatos são obtidos do mesmo modo. ύ Si oosso consiste na substituição ritcleofílíea catalítica do grup·; dissociarei introduzido, por pnrr.niir^rf r-.«*1, por um inolioterpencl ou por via álcool* Deste modo, depois da , rificaçffo por crcrnsitografia atravss de sílica-gel, é ct-tiiv u:i glioósido de β-ρ-nitrofanilo, d® p-trirprnilo ou ds p~;;lv-.Llo peracetilados*

Deste modo a acç&o dos monoterpenois, geraniol» nerol* oC^terpiscol ou linalool, ou de álcooic, tis como o álcool ben^íllco ou S-feniletanol, sobre psracetil-oç --broaw-D-glucopirarósido eu poracetil- ot -bromorutinesido e roa-Usada na presença de carbonato de prata, num dissolvente arro-tico, como por exemplo éter, cloreto de metileno ou clorolór. <io, na presença de drierite ou de um crivo molecular 0,4 nra (41;; cu na presença de um catalisador solúvel, tal como cianeto . .~-r~ cúrico, em aeetonitrilo, na presença de um crivo molecular ,.·, 4 nra (41) | a acçKo do p-n£trofenol sobre peracetil— 0(~clororutino sido é obtida era piridina, na presença de carbonato de prata e drieritet a acçSo de monoterpenois, tais como linalool, gera-niol ou ô^-terpinool sobre 0-{ peracotil-e β-ruiinosil)-* -tricloroacetoimidatos, ou ϋ·*£~hes:aa,oôtil-6-Q-( o( -L**ara"*?iiiofura* nosil)-,* - β β —D-glucopiranosiljr»triclox'oacetoimidatos ó realizada na presença de um crivo molecular 0,4 na (41) e de •terato de trlfluoreto de boro ou de acido para—tolueno sulf óni-co em cloreto de metileno ou clorofórmio· A cromatografia dos -glicóaidos de peracetilo pretendidos através de sílica-gol é realizada eluindo ccm sii Stu4 ras éter/éter de petróleo, clorofórmio/éter, cloreto de sr-etfle-no/éter ou acetato de etilo/éter de petróleo· Λ passo final consiste na remoção do» grupos de bloqueio acetilo da parte açúcar do glicósido formado} a desace-tilaç&o é realizada por transes 1,erificação era metanol na presença de um catalisador básico, tal como metilato do sódio ·

Batre os saearxdecs peracetilados que são usáúos ss 10 s

J como produtos do partido, para estão sínteses apenas u 1,-,3,1--1 e tra-Q-ace ti.l-6-0-{ 2,3,3“tri-G-acotil- of-L-arabinofurauo sil/-• β -D-glucopiranoso não existe ao comércio. A sua preparação pode ser realizada pe?a síntese descrita a~,Lcta, partindc da 1,2,3»5-tetra-0-ac :* til- , β «L«arab£nofurarioss e do l,243,f.~ -tetra-O-acetil— jJ*»?)»3li?copirartOso* Todavia, ã preferível m li zar a síntese por activt-.gão da A*2,3,5~-etr&-0-aeot£X-of, j$ - ~ -arabinofurancse a 3»5~di—0~aeeti2«?.,2«3»/"{l«eKe** e Γ -ο; : ; - ’í.a no-etilidenp7- β -L-arabinofuranoses utilisanic-se cianeto J ' trimetilsililo na presença de um ácido de Lenis, tal cesto elcre te estanose, e de l#2,3*^~tetra-0-acetil- β-B-glucopiranese ;;or tritilaçSo a 1,2,3,4-tetra-0~acetil-6-G-tritil- p-B-glucox iri no-se. A reacçâo de glicosâlaçã© entre estes 2 compostos é rer^im-da em condições rigorosamente anidras, na presença de percicru-to de trifeniicarbónio como catalisador* jS possível aplicar esta síntese â preparado -e Z, 3,4-tri-O-acetil—6-0« (2,3, 5-tri—O—acetil— q( «-L-arabino* urano*-sil)« β -D-glucopiranosido de p-aitrofeiiiio, por acoplamento -o mesmo derivado de cianoetilideno com 2,3, *»—tri—0«e oeti 1-=*]-' ’ - tri til- β-D-glucopiranosido de p-nitrofenilo* Todavia, esta glico-eilação, além do diholosido esperado, conduz também ao cíiliolósido tendo .ima ligação intersacarxdeo 1-¾: a sua oeparacão é poj» sível por cromatografia sobra sílioa-gel, elui: Χϊο-se cota a i. tiiia lura acetato de ctilo/éter de petróleo*

J

Exemplo .1

Lacaacatil-rutina

Num balão de fundo redondo de 500 ml, equipado com um condensador com um tubo de resguardo de cloreto de cálcio, adicionaram-se 25 S de rutina, mediante agitação magnética, a 150 »1 de piridina anidra· Gnquanto a mistura é arrefecida num banbo de água fria adicionam-se simultaneamente iuG ml de anidrido acético, no decurso de aproximadanioute 10 minutos, e prolonga-so a agitação durante Zh fcu O meio reactivo e então ver tido para 1,5 1 de água com geles o derivado acetil&do precipita na forma de cristais brancos* Lsies cristais são imolados por filtração, são lavados com água o com um pouco de éter etílico e 11 a

cu. —. j ;> :1 > sillea-jdi — seguidamente sSo coco a sílic^—gel· Obtêm—s© 38»3 c3 (ro—âiíSíKitsí 99$)«J^$, ater Rfa 0,22, pf. 128-135° 0.

Exemplo 2

Cloreto de 2,3,4—tri—G—acetil—6—0—(2,3,4—tri—0—^-cet;il—o(—A’*'·'*-’- i— nooiranosil)- fi -L-Tlucor>iranosilo ........ 'Mi^BWMWwieweÍyweBieffrrrTfrTeriTro-iiin r ι Í/jinnam— rsurisr.ij· .uiiaifte: v af.w^jtawaea· r * -~*+*

Aprosim^dament* 6 % do cloreto da zinco ε?!.’· didoa num cadilho, na chama de um bico de BQnsen· r*eixa-se ••.vrfji fecer, protegido por folha de alumínio, & em seguida colae rapidamente 4 g deste cloreto de zinco, que foi triturado r?e-seiramente, num balão da fundo redondo de 250 ml equipado c f um condensador o munido com um tubo do resguardo do oiorrv. .a cálcio·

Adicionam-ee então os seguintes ingredie&i:.?, mantendo-·* permanmtamente uma agitação ecm agitador Sià^os - 80 ml de clorofórmio anidro, eia seguida - 20 de rutina do caace tilada % - finalmente, aproximadameate 20 ml de et ar 1, l«di cloroaotil -- .ie tílico introduzidos no decurso do 5 minutos·; - a mistura e depois aquecida a 75“T7° & durante 2 h· A solução em clorofórmio á decantada e c rasíduo pastoso é removido do balão por lavagem com 20 ml áa clorolor-* mio, · este · combinado coro a solução em clorofórmio, evaporando- se o todo sob vácuo num evaporados* rotativo a 23-43° G, O resíduo amarelo oleoso e tomado em 5C0 tal da eter etílico que é lavado con água arrefecida por gelo, com solução saturada de carbonato de sódio e seguidamente de novo com água arrefecida por gelo» A fase orgânica © seca com salfat' da sódio © filtrada, © a solução © concentrada num evaporador rota tive sob vácuo a cerca do 33° <3. 0 resíduo, que cristalicou a ar ciaimente, é recrista.Lizsdo em êtov otílicc* e cm seguida 6 r?-cristalizado uma segunda vez em otanol anidro. Os cristais brancos assim obtidos são secos sob vácuo em exsicador com sílica.--gel·

Obiêu-se 6,3 δ (rendimento *3$) - TI£, sír.lo-:. -gel - eter Rf m 0,52» pf. 148-150° O. s 12 se i t

Exemplo 3 2,3,4- tri~0-acetiX-â-0-(2 ,3,4- tri-w-acatiú- o( »li)- e-c -jglueopiranósido ã& p-nitrofanilo

Hum baiêto d» Erlenmeyar equipado com ma tubc -io resguardo de cloreto <3© cálcio © com um agitador magnéiiou introduzem-se 3 3 de dnierit© © 1,5 3 de p-nitrofenol em 5c- >;1 d© piridina anidra. A mistura e agitada durante 1 hora e aditic ; ím -se-lhe em seguida 5 g de acetocloxo«c( -rutinósidc c 3 p αν ο ιτ bonato de prata rocem preparada e seco·

Prolongasse a agitação no escuro e à temj-αινεί ambiente durante 24 horas*

J O meio reactivo 0 filtrado, o precipitado 4 %a do com um pouco de piridina & o filtrado é depois conconír, em evaporador rotativo sob vácuo a cerca do 4g - 45° 0. i. ·£-duo por duae vezes coa 25 12I de benzeno o é concentra i*. 1 ...-s-mo modo para so rosovor os vectág&os do piridina·

J O resíduo o do novo tomado era 100 ml it e a solução 4 lavada com água arrefecida por gelo, oom solLiaf!j norms.l da hidróxido lo sólio e de novo com água arrofooidi .:,- 0 gelo, e finalmanto seca-ae pôr maio da sulfato de sódio* loyois da filtração o filtre .do e concentrado em evaporador rotativo sob vácuo a 35 - 40° -Jm O resíduo pastoso avermelhado 4 parixi-eado poi cromatografia sobre sllica-gel £ de granulo me tri a. correspondente à paasagen atravós do um crivo da abertura do ralha 67 J»m a 199 pm (70 a 230 rnosh)^ aluindo-se com etor etílico - - Rf » 0,5. As fraeçdes mais puras são concentradas era ©vapora-dor rotativo e os cristais brancos obtidos são roeristalizado s em etanol a 95° * Gbtem-se assim 1,4 g {rendimento » 25¾) - - TLC, sílica-gel - éter Rf a 0,5* pf. 185-187° €.

Exemplo 4

Brometo de 2,3*4-tri-0-ac©til-ó-0-{2t3*4-tri-0—aoe'Cil-o< -ramnopiranosil)—β—D-gluconiranosilo 1,3 g de heptaacatorutinose e 0,4 ml da aniurido acético em 20 ml de clorofórmio são introduzidos, sob atniosx era . de azoto e a —4° d, num balão de fundo redondo de 30 ml e udi- « 13

cionum-se-lhos gota a gota 3*8 ml cie uma solução a 33$ de ácido bromídrico gasoso em ácido acético* Prolonga-se a agitação a -4° C durante 2 h e o meio reactiv© é então vertido para 50 ml de água arrefecida por gelo· A fase orgânica I separada depois de sedimentar, seca-se cora sulfato de sódio anidro e concentra--se num evaporador rotativo sob vácuo, a 35° b. G gelo amarelo obtido é usado sem iiurificagão no passo seguinte· Todavia, é possível cristaliza—lo tomando-o com um pouco de éter etílico e deixando-o arrefecer· Por filtração sob atmosfera de azoto, lavagem com ura pouco de éter etílico e éter de petróleo e secagem em exaicador a frio, obtêm-se 310 mg de cristais brancos (rendimento 23$), Pf, 120-125° C*

J

Exemplo 5 2,3,4-tri-0-acetll-ó-G-(2,3,4-tri-Q-acetil eç-L-ramnopiranosil)- - B-D-glucooiranósido de geranilo

Num balão de fundo redondo de 50 ml, uma mistura constituída pelas substâncias abaixo indicadas é agitada durante 24 h sob atmosfera de azoto, à temperatura ambientei - óó5 mg de bromo-2,3»4-tri-ú-acetil~6-C-(2,3,4-tri-0-acetil-o(--1-ramnopiranosil)- p-D-glucopiraiiósiâo (produto bruto da reac de bronicição); - 1 nl de geraniol; - '.,,5 g de cianeto accrcurio sa 10 ml cie acetonitrilo*

J li. mistura é depois concentrada num evaporador rotativo sob vácuo, a 35° c, e o resíduo «I tomado era 50 ml de éter etílico. 0 sólido que precipita é removido por filtração e I enxaguado com eter etílico, e o filtrado é concentrado num evarora dor rotativo sob vácuo a 35° C. O resíduo oleoso é croraatografa-do através do sílica-gel £ de granuloraetria correspondente à pas sagern através de um crivo da abertura do malhas 67 pn a 199 /ura (70 a 230 raesli)^ eluindo-se sucessivac.ente com éter etílico/ /éter de petróleo (10í90) para remover o excesso do geraniol e depois com éter etílico/éter de petróleo (75*25) para eluir o rutinosido· As fracçãe» contendo o rutinósido são combinadas e concentradas a 35° 0 sob vácuo num evaporador rotativo· Obtem-se * 140 mg de uma pasta incolor que não foi possível fazer cristali- • sar (rendimento 19$) sendo o produto puro de acordo com TLC - sí

lica-gelj cíer/cfces Lxemplo 6 2,3,4-trl-O-acetil-6-O-(2,3,4-tri-O-acetil-$-L-ramnopirano si 1) - —D-glucoolranoae____

Num balão cio fundo rodondo de 100 ml mantém-se durante 24 à tempere'tura ambiente, sob agitação com agitador magnético e set» atmosfera do ase te, uma mistura de 6CC rc heptaacetorrutincee e 1,2 ei de bensilo.nlna cm 80 ml de êt,>r etílico# 0 meio reaeiivo õ depois concentrado num evaporador rotativo sob vácuo o o resíduo oleoso é croniatcgrafado nuna. coluna de sílica-gel /fde granule me tr ia correspondente a passagem através de um crivo de abertura de malha 67 μηι a 199 p. (7C-ST. mesh)JJ eluindo—se com éter etílico* As fraeçães contendo bo— xaacetxlrrutinose são concentradas num evaporador rotativo sob vácuo* ôbtera-se 5CG mg de um óleo incolor (rendimento ^ 33,..;· ; TLC - sílica-gel - éter dietílico E£ = 0,31»

Kxemolo 7

Tricloroacetoimidato de C-/, 2,3,4-tr±—G-acetil—6-0—(2,5«4-ir±- — β -b-glucopirunasilo/ -O-acetil- ti-L-racmopirancsil}- <χ« 2,6 g de 2,3,4-tr±-C-ncetil-6-0-(2,3,4-tri-C-n.ee- to til- o( -L-ramnopiranos±l)-I}-gIucopiranose, 1,6 ml de triclororce nitrilo e 25 ml de cloreto de nietileno são misturados sob atmosfera de azoto à temperatura ambiente num balão de 100 ml de fundo redondo* Adicionam-se em seguida 1,6 g de carbonato de potás sio anidro mediante agitação com agitador magnético e prolonga--se a agitação durante i8 horas* Á mistura reactiva é depois fil trada e o precipitado é lavado com 10 ml de cloreto de metileno* 0 filtrado é concentrado num evaporador rotativo sob vácuo a 35° C e o resíduo é cromato grafado através de uma coluna de sílica-gel £~de granulometria correspondente à passagem através de um crivo de abertura do malha 6j μη a 199 f«n) (7C-230 n:esh) J eluindo-se com uma mistura líl de éter etílico/cloreto de metile no. As fraeçães contendo o imidato são combinadas o concentradas num evaporador rotativo sob vácuo a 35° 0* Obtêm-se 2,3 g de um oleo incolor (rendimento - 71$) 5 ** sílica-gel - éter diotíli co Rfa0,76. = 15 »

Exemplo β 2,3* 4-tri-0-acetil-ó-0-( 2 , 3 ,4-tri-Q-acetil- c< -L-ramnopiranosil)-- fl -D-glucopiranósido do (*)-linalilo

Hum balão de fundo redondo de 100 ml agita-se •ob atmosfera de azoto, à temperatura ambiente, durante 30 mi» nutos, uma mistura composta por 550 mg de (jj-linalool, 650 mg de tricloroacetoimidato de 0-/~2,3,4-tr±-0-acetil~6-0-(2,3,4--tri-O-acetil- $ -L-ramnopirano sil)~ gç - e ^ -D-glucopirano silo/ e 1 g de crive molecular 0,4 nm (4Ã) em 3 ml de cloreto de me* tileno. Adicionara-se em seguida 22 pl de uma solução a 50# de eterato de trifluoreto de boro em cloreto de metileno, e adicionam* ee também de novo, após 40 minutos de agitação com agitador magnético* Depois de um novo período de agitação durante 40 mi* nutos adicionam*8e 650 mg de bicarbonato de sódio à mistura reactiva que ó então lavada, em volumes iguais, com solução aquo sa 0,5 M de bicarbonato de sódio e depois com água* A fase orga-nioa é seca com sulfato de sódio anidro e concentrada num evapo* rador rotativo sob vácuo a 35° C. 0 resíduo oleoso é cromatogra* fado através de sílica*gel /Γ"granulometria correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 67 pm a 129 pm (70*230 meshXjT eluindo-se primeiro com uma mistura 4*1 de éter de petróleo/éter dietílico para remover o excesso de linalool, e depois com uma mistura 1*4 de éter dietílico/clorofórmio para eluir o heterósido acetilado· As fracçães contendo este ultimo composto são combinadas e são concentradas em evaporador rotati vo sob vácuo a 35° <?· Obtem-se 190 mg de um óleo incolor (rendimento * 29#)| TLC * sílica gel) éter dietílico/éter de petróleo (4tl) Rf m 0,34,

Exemplo 9 ¢-0-( or -L-ramnopirano sil)-#-D-glucopiranosido de geranilo

Hum balão de Erlenmeyer de 50 ml, varrido por uma corrente de azoto, dissolvem-se 0,2 g de 2,3,4-tri-O-acetÍl--ó-0*(2f3,4*tri-O-acetil--L-ramnopiranosil)-£ -D-glucopiranó* sido de geranilo mediante agitação mecânica em 2 ml de metanol . anidro· • Adicionam-se em seguida no decurso de 30 segundos - 16 «

J 0,3 ml de uma solução da metilato de sódio (preparada a partir de 130 mg de sódio e 100 ml de metanol anidro) e prossegue-se a agitação sob atmosfera de azoto em banho de óleo a 68-70° C durante 20 minutos* O balão de Erlenmeyer e depois arrefecido num banho de água/gelo e adicionam-se-lhe aproximadamente 0,2 ml de Dowex 50 W x 4(u) húmido /"de granulometria correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha yk/lltf pm (100/200 mesh)// de modo que o pll da solução seja de aproximada-mente 7* A resina · depois removida por filtração e o filtrado e concentrado num evaporador rotativo sob vácuo a 25o C* 0 resíduo oleoso obtido é purificado por cromatografia através de uma colu na de sílica-gel 60 /""de granulometria correspondente a passagem atraví. d. um crivo de abertura de malha 67 jm a 199 fim (70 a 230 mesh)// eluindo-ee com uma mistura 3*1 de acetato de etilo/ /metanol* As fracçSea contendo o β-rutinósido de geranilo são combinadas · são concentradas num evaporador rotativo sob vácuo a 25o C. Obtém-se 110 mg de uma pasta incolor que não foi possível fazer cristalizar* sendo o produto puro segundo TLC - sílica -gel} acetato de etilo/metanol (3*l) Rf * 0,35*

Exemplo 10 2,3,4-tri-0-acetil-6-0-(2,3,5-tri-O-acetil- X-L-arabinofurano-sil)-ot- e *» B-D-elucopiranosee

Faz-se borbulhar amoníaco gasoso durante 15 minutos num balSo de fundo redondo de 100 ml contendo 25 ml de uma mistura 7*3 de tetrahidrofurano/metanol e que se mantém a 0° C na presença de gelo triturado*

Adicionam-se em seguida kOO mg de 1,2,3,4-tetra--0-acetiÍ~6-0-(2,3,5-tri-0-aeetil-eC -L-arabinof uranosil)-D--glucopiranó sido·

Deixa-se então o balão vir à temperatura ambiente mantendo-se sempre a agitação* A reacção é acompanhada por TLC (sílica-gel} cloreto de metileno/éter, 6tk), Quando já não existe o composto de partida (aproximadamente 15 minutos) a reacção é interrompida · o meio reactivo é concentrado até à secura a pressão reduzida, a ! *0° C. s 17«

O resíduo é depois purificado numa coluna de sili ca-gel eluindo-se com tuna mistura de 61 24 de cloreto de metileno/ /éter· Obtém»se 250 mg do produto desacetilado na posição 1 (ren dimentot 67$)· TLC - sxlica-gel - cloreto de metileno/éter (6th), Rf m 0#3ó.

Exemolo 11

Tridoroaeetoimidato de O-/]”2 » 3 » 4—tri—O-acetil-6-ϋ-(2,3,5-tr±-G~ -acetil- <X -L-ar&òinofuranosil- oç- e - φ -D-glucopiranosilo]/ 250 mg de 2,3, 4—tri»0»acet±l-6-0—(2,3, 5-tri-0-ace til- (X-L-arabinofuranosil)- # - e — £ -D-glucopiranoses, 2,5 ml de cloreto de metileno absoluto, 0,l6 ml de tricloroacetonitrilo e 160 mg de carbonato de potássio anidro sito introduzidos num reaetor mantido sob atmosfera de azoto, 0 meio reactivo é deixado à temperatura ambiente 48 horas, matttendo-se sob agitação por meio de um agitador magné tico. Verificasse periodicamente se a reacçSo está completa por meio de TLC (SÍlica-gelj cloreto de metileno/éter, Sth) 2 O meio reactivo é depois tomado com 10 ml de di-clorometano e é filtrado através de vidro sinterizado. A fase or gânica é lavada sucessivamente cem iguais volumes de solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e com égua arrefe eida por gelo} seca-se em seguida com sulfato de sodio anidro e depois concentra-se até à secura a 35° C a pressão reduzida. Obtêm- se 264 mg de um óleo amarelado (rendimento =s 88$) — TLC - sí lica-gel — cloreto de metileno/éter dietxlico (624) - Rf = 0,52

Exemplo 12 2,3,4-tri-O-acetil-6-0-{2,3,5-tri-0-acetil- ef-arabinofuranosil)- 1 - ft-D-Klucopiraiióaido de geianilo 250 mg de tricloroacetoimidatos de O-/"3,3,4-tri--0-acetil- ^-L-arabinofuranosil)- of- e - ^-D-glucopiranosilo7, 250 bl d» geraniol e 1,5 ml de cloreto de metileno anidro aão In troduzidos num reaetor de 50 ml mantido sob atmosfera de azoto· [ 0 meio reactivo é mantido sob azoto e é agitado 2 com um agitador magnético} adicionam-se gota a gota 20 hl de uma s 18 a "” ' •^-v,.1;;,u<aÍ^MSS^^^ínWwWa<1.^gag.ú ^

scluçâo a 50% de eterato de trifluoreto de boro em cloreto de me tileno1

Depois d© 3 horas de reacção verificais© se esta está completa por TW (sílica-gel, cloreto de metileno/éter» 713) · adicionam-se então 50 mg de bicarbonato de sódio ao meio reactivo· Adicionam-se de seguida 10 ml de cloreto de metileno e o meio reactivo e lavado com volumes iguais de solução 0,3 M de bicarbonato de sódio arrefecida por gelo e depois com água arrefecida por gelo· A fase orgânica é seca com sulfato de «ódio anidro e e concentrada à secura a 35° O a pressão reduzida· 0 resíduo oleoso e purificado rapidamente numa coluna de sílica, eluin do-se primeiro o excesso de geraniol com uma mistura Itl de etep' /éter de petróleo, e seguidamente o produto © eluído com uma mis tura 812 de cloreto de metileno/éter· Obtêm-se 150 mg de um óleo incolor (rendimento « 58$}1 TlXSt sílica-gel, cloreto de metileno/éter (812) Rf 1 0,491

Exeaolo 13 2,3» 4-tri-0-acetÍl-6-G-tritil-β-D-glucopiranóeido de p-nitro- f enilo ________________________

Num balão de fundo redondo de 100 ml intrcduzem--ee 1,A2 g de β—Γ—glucopiranósido de p-nitrofenilo e 1,5 ç de cloreto de tritilo anidro em IO ml de piridina anidra, e o balão ó mantido no escuro agitando-se continuamente a 40° C, A reacçSo ó acompanhada por TIO, adicionando—se cloreto de tritilo se necessário· Passadas 24 b o balão é levado à temperatura ambiente e adicionam-se 6 ml de anidrido acético1 0 meio reactivo e deixa do durante 48 h sob agitação contínua, acompanhando-se a reacção por TLC (sílica-gel, éter/eter de petróleo, 713)f toma-se o resí duo em 500 ml de água arrefecida por gelo e agita-se durante 2 h A mistura é então filtrada através do colite e a celite é lavada com diclorometano. A fase orgânica é lavada sucessivamente com água arrefecida por gelo, com ácido clorídrico a 10^, com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e finalmente com água arrefecida por gelo. Seca-se com sulfato de sódio e concentra-se sob vácuo a 35° 0· G resíduo I cromatografado através de ©

1 uma coluna de sílica-gel eluindo-se com uma mistura 713 de éter/

/•ter de petróleo. As fracçães contendo o boterósido são combina dae e concentrada» sob vácuo a 35° 0. Obtera-se assim 2,6 g de um óleo (rendimento = 83$) sendo o produto puro de acordo com TLGt 1 sílica-gel óter/óter d© petróleo (7:3) Kf=Ô,33,

Exemplo 1¾ 1.2.3.5-tetra-O-acetil- ot» p-L-arabinofurano ae t/ma mistura de L-arabinose anidra (lO g) e metanol anidro (200 ml) 6 tratada com ácido clorídrico metanólico 1,06 M /_ preparado por adição de cloreto de acetilo (4,7 ml) e metanol anidro (63 ml) a 0° Qj\ a mistura ó agitada uma noite a 0-5° C* Adiciona-se piridina (4G ml) para neutralizar a mistura que é depois concentrada. O resíduo e tomado várias vozes em pi— ridina que é removida por destilação, e dissolve-se depois em 80 ml de piridina. Adiciona—se anidrido acético (30 ml) frio e a solução á deixada em repouso à temperatura ambiente 2 dias* A ex tracção da mistura reactiva com acetato de etilo ou diclorometa— no dá origem a um produto viscoso que é depois dissolvido numa mistura de ácido acético (100 ml) e anidrido acético (25 ml); adicionam-se 5 ml de ácido sulfurico concentrado a 0o C e a mistura ó depois deixada uma noite à temperatura ambiente. A solução é então imersa em gelo triturado (150 g) e a mistura é agita da durante 2 h e seguidamente extraída com clorofórmio* O extrajç to é lavado com água 0 depois com solução aquosa de bicarbonato de sódio} o resíduo obtido depois da concentração da fase organi ca ó cromatografado através de uma coluna de sílica-gel (eluen-tet benzeno/éter em gradiente) e dá origem a 1*2,3f5-tetra-O-ace til- , -L-arabinofuranose na forma de um xarope (18 g, 8556)

Rf * 0,46 (eluenteí benzeno).

Exemplo 15 3,5-di-0-acetil-l,2-0-£*"l-exo- a i-endo-eiam>/-etilideno7—β -L--arablnof urano se __ _______________

Adiciona-se cloreto estanoso anidro (360 mg) e cianeto de trimetilsililo (3 ml) a uma solução de 1,2,3,5-tetra-—O—acetil— -L-arab±nofuranose (3 g) em acetonitrilo (10 ml), . A mistura e agitada por uma noite a temperatura ambiente, segui-

damente é diluída com éter e lavada com solução aquosa do bicarbonato do sódio (3 x 75 rol) o seguidamente com água. Λ fase orgâ nica é concentrada o o resíduo é cromatografado através de uma coluna (eluontosbenzeno ϊ éter cm gradiente) ©btenclo-sc o produto de 1-exo-ciano (99^ mg} 37f) e o produto de 1-endo-ciano (700 mg 2é$). A cristalização com éter/pentano origina o lsómero de 1--exo-ciano (35^)* pf. 66-69° 0., ΖΓοζ^-όδ <ci), Rf*0,5é (eluen-teibenzeno/éter, 3f&)« Δ cristalização com tolueno dá origem ao lsómero 1-endo-ciano (23$}, pf, 107-110° G, r<7» + 519 (Cl), RfaOf37,

Exemplo 16

J 1#2»3*^-tetra-0-acetil-6-0-(2f 3,3-tri-O-acotil- ci-L-arabinofura-noeil)-β-b-glucopiranose e 2,3,4-trâ-O-acetil-ó-O--0-acetil-o< -L-arabiaoíuranosil)— β —D—glucopiranósido de p-nitro fenilo________ . .___'

Bm 2 balões de fundo redondo, fechados e ligados entre si por um tubo com a forma de um diapasão, introduzem-se, por um lado (num doa balão3} una solução do glacésido tritilado (0,55 mmole) e 3»5-di-ô-acetil-l,2-0-£”(l-oxc- e l-endc-eianc)--etilidenoT- β -L-arabinofuranose (0,5 miaolo) em nitro.metano (2 ml), e por outro lado (no outro balão) uma sclução d© perclorato de trifenilcarbónio (0,05 mmole) em 0,2 isl de nitroruetano* Ambas as soluções são liofilisadas e em seguida introduz-se, em cada balão, 2 ml de bsnzeno destilado, sendo os conteúdos liofilisa-dos de novo} esta operação c repetida uma segunda, vez; os balões © os reagentes são deste modo secos durante várias horas* á destilado diclorometano (2 ml) ±n situ para cada um dos 2 balões.

As 2 soluções são então combinadas e deixam-se reagir uma noite à temperatura ambiente e no escuro £ a liofilisação e também a secagem dos reagentes, bem como a destilação do benzeno e do d±— clorometano atraíres de Oarlg, são realizadas a unia pressão de 0,53.3 Pa (4 x IO*3 mm Hg)J. 0 meio reaciivo amarelo brilhante é tratado com 1 ml de mistura piridina/água (3il) e a solução descorada é depois diluída com clorofórmio (50 ml), é lavada com água (3 x 30 ml) e concentrada. 0 resíduo é puzd.£içado numa colu • na de sílica-gel eluindo-se com benzono/Ster ou acetato de eti-. lo/éter de petróleo em gradientes, obtendo-seí ss 21 s - a partir d· l,2,3*4-teira-0-acetil-6-0-tritil- β-D**g!v*copira- nos», a 1,2,3,4-tetra-0-ac etil-6-C-{ 2,3* 5-tri-Q-acetil- 0{ -L--arabinofuranosil)- β-P-glucopirano se, pf . 100,5-108,5 0 (Iter/pentano)$ TLG* sílica-gel5 fceazeao/éter (3i-}* Rf-G*35· - A partir do 2f3,4-tr±-G-acetil-6«0-tritIl-p-y»glucopiranósido da p-nitrofenilo, o 2,3* k-tri-G-acet±l-6-0-(2,3* 5-tri-0-aee-til- o(-L-arabinofuranosil)«jJ-D-glucopiranosido dé p-nitro-feniloj TLC* sílica-gel* acetato de etilo/éter de petróleo 1*1, ftf = 0,24 e 2,3,6-trÍ-0-acetil«4-0-(2,3,5‘*tri-G-acetil-g-L-arabinofura-nosil)- p-D-glucopiranósido de p-nitrofanilo* TLC, síllca--gell acetato de etilo/éter de petróleo (líl), Kf«0,28,

J

Exemplo 17 6-0-( t* -L-arabinofuranosil)~ p-D-fclucopiranósido do geranilo 200 mg de 2,3,4«tri-G-aee feLl-6-ϋ-(2,3,3-tri-0-ac«» til-o(—L-arabinofuraaosil)—0—D-glucopiranósido de geranilo são dissolvidos sob atmosfera de azoto em 5 ml do metanol anidro, me diante agitação com agitador magnético· Adicionam-se 0,1 ml de uma solução metabólica de matilafco de sódio (preparado a partir de 20 mg de sódio e 10 ml de metanol)· Prolonga-se a agitação durante 4 laoras à temperatura ambiente e a solução 0 depois neutralizada por adição de resina Jowex 50 1 κ 4(ϊΓ)· A mistura ê filtrada e a solução ê concentrada até à secura num evaporador rotativo, O resíduo oleoso ê purificado· por croniatografia numa coluna do sílica-gel, eluindo—se com uma mistura 8*2 de clorofórmio/metano 1 para se obter ara 105- mg d» 6-0-(^-L-arabinofuranosil-£-D-glucopiranóeido de geranilo na forma de um xarope. Rendimento 81$, TLCs sílica-gel, clorofórmio/ /metanol (8*2), Rf » 0,17·

Exemplo 1B 6-0-( <X -L-arabinofuranosil)- -D-glucopiranósido de p-nltrofenilc

Por desacotilação c!e 2,3» 4-tri«0-aeet±l-ó-3- (2,3,¾ -triO-acetil-¢(-L-arabinofuranosil)-0-S-gluoopiranosidc de p-• -nitrofenilo de acordo coa o processo anterior obtêm-se o 6-C- 22 =

-( ¢(-L-arabinofuranosil) - -D-glucopiranosido de p-nitrofenilo· T-LCs sílica-gel, acetato de etilo/isopropanol/água (65*30*10), Rf=*0,ó9.

Exemplo 19 1- g-D-aptos» de p-nitrofenilo 2 g (ó,28 mmol) de X,2,3,5-tetra-0-acetiX{3'β“ -D-aipiose e 4 g (28,3 mmol) de paranitrofenel imm balão redondo de 100 ml são secos por evaporarão simultânea eia tolueno» oeguidamente adicionam-se kQ mg (0, aaaol) de áci do paratolueno-sAlfónico e a mistura © aquecida a 95° d durante j|30 minutos sob vácuo (ΐθ“” minHg) · Bepoxs do arrefecimento o -uieio reactivo o dissolvido era 200 ml de dxclox-omôtano e é lavado por várias vezes com uma solução saturada do carbonato de potássio. 0 resíduo oleoso é seco, concentrado e depois purificado por cromatografia através de uma coluna de sílica-gel ÓO (230-240 mesh) eluindo-se sucessivamente com éter etílico/ /éter de petróleo (50/50). Obtêm-seí - 1,4 g de 2,3»5“tri-0-acetll(3* )—tí—paranitrofenil—1-β —T-r.piose , pf. 155-15-° 0 (rendimentos 56$) » - 0,2 g de 2,3,5-tri—0-acetil(3* )-3-naranitrof enoiX-X-c.-b-Apiass (rendimento: 8$).

J 1,0 g da 2,3,5-»trx-G-acetil(31 )-0-paranitrofenil--1- β-η-apioso foram desacetxiados por aetilato de sódio ora meta nol anidro.

Após a purificação obtêm-se 0,65 g de paranitrof e·* nil-3-β-D-apiose (rendimento í 95$)·

Aipiofuranosilglucósidos 0 método geral utilizado para obter torpsnois c álcoois apiofuranosilglucósidos é o mesmo que o anterior «já descrito para a síntese dos ramuosilglucósidos e ar&b&nosilglucósi— dos. Ê possível aplicar osta 'síntoso a preparação efe • l,2 * 3,4-tetra-C-acotil-9-(2,3,5-tri-0-acotil( 3*)- β .-D-apiofura-. ηοβϋ)-6-β -D-glucopiranose por acoplamento da 3,5-di-0-acetil- 23 *

't μ£3&ϊ3τχηκ: % •j?

(3* )-(endo ou exo-cianoetilideno)«1, 2» β-D**apiofur?nose o da 1,2,3,4-tetra-Q-tritil-6- β -Γ»-jlunopirnn© so · O hepiaacetato de dihelósido e libertado da posição anomerica da gluccse, transformado no seu derivado de fcriclo roacetoiroidato que ó o produto do partida para as respectivas cond<*ns&ç3es comi álcool bonzílico, álcool feniletílioo, geraniol, nerol, (5}(S/--a-terpineol, (li) -a-ierpireol» (i.) (s)- β -eitronelol, ( : )-eitro-nelol, ( R ) ( S )-linalool, (s)-li»alool.

Exemplo» 50 mg (O,7 mmol) de trieloreaeetoimidato de 1--(2,3» 4-tri-0-acot±I-0*(2,3» S-trí-O-acoil!·.»^*' )·* β-TVapiof urano-sil)-6-0-(a β)«D-glucop±raucse) e 38 ml (8,6 romol) de (R. )(3)-11-

nalool são dissolvidos em 2 mi do dicloroniotono cnid.ro e adici.o-na-se uma quantidade catalítica de 0 meio reactivo I neutralizado e e extraído por métodos clássicos* Depois da purificação e acção do metilaio de sódio o diholosido de lin&lilo ó recuperado com um rendimento do cerca de

B. ADIÇÃO DA3 ACglVIDADEa ^ZB^TICAS B smSFXCAC&Q i-u, 1 - MEDIÇÃO DAS AGTIVIMDSS mZXZÃSmAS

As actividades de glicoaidade são determinadas por incubação de 0,1 ml do ma substrato 4 rnS-i (Glc—pMX?, Ara—poi, Api-pNP, Rha-pNP) num tampão de acetato 100 nú-i (pH 4,2) com 0,1 ml da solução do enzima a 4θ° C durante 20 minutos* A libertação d· pNP e estimada por adição de 0,6 ml de uma solução 1 H de cor bonato de sódio ao meio de incubação © depois a medição cia donsi dado óptica a 4uu mu. 1 nkat de activiáade corresponde à liberta ção de 1 nmol de piNfP por segundo*

Duas glicosidades, oc -arabinosidad© e o<-ramno3i-dade, foram isoladas e purificadas a partir de composioõos eomer ciais contendo misturas complexas de enzimas* A β «*gluco3Ídade de amêndoas doces (£ooh~Light, Grã-3r et anlia, lote n®« 2872-01) nSo s-presentando qualquer acti-vidade cont&aiinante do tipo cio e(-arabinceidade, Ç-apiosidas© ss 24 = • ^-ramnosidase (24 horas d& incubação a 40° 0, nll 4*2) foi usa da tal qual nos ensaios, h. β-apiosidase prosouto numa composição enzimati ea comercial (Klerzime 200» Gast-Brocades* França) foi utilizada sem qualquer purificação·

2 — PURIFICAÇÃO JJOa EMUlãS 2-1, PURIFICAÇÃO DE Viik ot-l-MÍlHOPlEAJíOSXIMSS j , í c A o(-ramnosidase foi purificada a partir de na-ringinase (Sigma) rica nesta actividade, As actividades de β--glucosidase* embora baixas (otlyi da actividade de of -ranaio sida-se) mas capaz de libertar glucose durante per.CodoB .de incubação longos, foi reraovida pela técnica de focagem cromatográfica

PROTOCOLO PUicIF IOAÇaO bis. o(*“£*i-iiviíySjLiLiíiSd FGxí FUCiiGEãvi &áCO-IííaOSíííLÍ''xCA ííkí NARXKOXNAjE Ó03RB GI3L Pilà 94 ^0 iag d© ncringinasa* tomados* em 4 ml de oa taíu-pSo de irnidazol 25 nfi-í (pE 7,¾) aSo dialisados contra c ;r»í*io tam pão (25 ml) durante uma noite (5° G), O dializado é iajocfcado nu ma coluna (l,0 x 40 cm) do um persiutador de iães (permutador poli tampão PBE 94, Pharmacia, Suécia) equilibrado com o mesmo tampão, As proteínas ligadas a este gel são eluCtías por um gradiente d·? pH desde 7*4 a 3*7» criado durante a migração de Arapholi-nes j^p o li tampão 74 (Pharmacia) ajustado previasento a pS JtZ? com um débito de 44 ml/hora.

Depois de o gradiente estar completo a passagem de cloreto de sódio 1 U em tampão acetato 100 mE (pH 3,7) produz a dessorção das proteínas retidas»

Icecolhem-se fraeçães do 2*8 ml sobre as quais se medem as actividades de <<-ramnosidase e β -glucosidaso, o pE e s. densidade óptica a 280 nm. 0 perfil crooatografieo esta representado na fig, 1, da qual a legenda o a seguintes ·—· actividade de fl-ramno sidase II·—0 actividade de £-glucosidase 0 absorvância a 280 nm +-+ gradiente de pH.

As actividades de <>(-ramno sidase são elufdas ao gradiente de pH, enquanto que toda a actividade de j) -glucoeida se é retida ate pH 3,7 (pi < 3*7) e e eluída pela passagem de uma solução de cloreto de sódio 1 M*

Esta técnica mostra que a Naringlnase contem pelo menos 3 ieoenzimas (ramnosidase) com pontos isoeléctricos pi 6,2, pi 5,7 e pi ^3,7. 0 segundo ponto isoelóctrico (317 nkat/ml) que não apresenta actividade residual de ^-glucosida-se mesmo depois de mais do que 2h horas de incubação a 40° C, e eecolhido para os ensaios da hidrólise enziraática de glicosi-daeee naturais e sintéticas· 0 rendimento de recuperação global de aetivida-des de ^-ramnosidase é aproximadamente de 62^·

2—2, PURIFICAÇÃO DE UMA et -L-ARABINOFURANOSIPASS

Entre as compoaiç8es enzimaticas estudadas a He-micelulas* REG-2 (Gist-Brocades, França) provou ser rica numa actividade de o(-arabinosidase« No entanto apresenta também ac-tividades substanciais do tipo de β-glucosidase e ¢(—ramnosida se· Por exemplo, 250 mg de Hemicelulase continham 2327 nkat de actividade de -arabino sidase, 2566 nkat de actividade de -glucosidase e 236 nkat de actividade de ^-ramnosidase. São aplicadas diversas técnicas cromatograficas sucessivamente a fim de isolar e purificar a <χ -arabino sidase. CRIYAGEM MOLECULAR DE HEMICELULASE SOBRE CT/HttlgRL AcA Uk

Fraccionamento A solução do enzima (250 mg de Hemicelulase em 3 ml de tampão citrato-fosfato 100 iriM, pH 7,2) é dialisada contra o mesmo tampão (500 ml) durante uma noite (4*5° C)· 0 diali-sado é depois colocado numa coluna (l,6 x 100 cm) de Ultrogel 26 «

j I ;Jj η j A«A 4¾ (XBF, França) equilibrada previaaente com o mesmo tampão A coluna é em seguida eluída com o mesmo tampão com tua débito de 9 ml/h, Hecolhem-se fracçães de 1,2 ml e medem-se em seguida as actividades de o(-arab±no sidade* p-glucosidase e o(-raranosida-ee, bem como a densidade ética a 280 nm.

Resultados 0 perfil cromatográfico está representado na fig* 2, cuja legenda e a seguintes actividade de <x-arabino sidade actividade de 0—glucosidase actividade de et-ramnosidase absorvância a 280 nm* A crivageia molecular sobre Cltrogel AcA 44 possibilita a separação cias 2 actividades principais de q( -arabinosi daae e p -glucosidase* â.s actividade» de <χ -ramnosidase são elui daa em simultâneo com as actividades de q(-arabinosidase* A maio ria daa proteínas presentes na solução enzimática inicial é elui da com a actividade de o( -arabinosidase. A fracção (52 ml) correspondente âs actividades de cu -arabinosidase (1750 rikat) também contem actividades residuais, isto c, β-glucosidase {23,4 nhat) e χ-ramnosidase (37*4 nkat) equivalentes a 1,3$ ( β-glucosidase) e a 2,1$ ( ^-ramno eida.se) relativas à actividade de ^-arabinosidase* C ro mato grafia oor nenauta iénica sobre 33IiA5-deuharose CL-óli da fraccSo oc-arabinosidase derivada da clivagem molecular

FRaCCXON.-UIjjNTO A fracção rica em ç(-arabinosidase (52 ml) foi dialisada contra 500 ml do tampão clorâdrato de imidazol 25 rt»i (pH 7»5) durante uma noite (+5° C) · O dialisatío é depois colocado numa coluna (l,ô « 4C cm) de !Dj3A£-3epharose OL-éii (Pharmacia) equilibrada previamente com o mosmo tampão· 0 gel é prlmeiramen-te lavado com este tampão a um débito de 108 ml/hora. As proteínas retidas na coluna são então eluxtías por um gradiente linear de cloreto de sodio (desde 0 a 0,4 ií) no mesmo tampão (cloridra-to de imidazol) com um debito de 40 ml/hora. Recolhem-se frac- * 27 «

g* §Γ;Ϊ) L·.

II J K .j

J ç8es de k ml nas quais se medeia as actividades de 0(-arabinosidase, 0—glucosidase e eç-raimosidase, e a densidade óytica a 280 nm. Resultados 0 perfil croraatográfico está representado na fig. 3, cuja legenda é a seguintes actividade de oj-arabinosidase actividade de ψ«glucosidase actividade de ^-raiano sida se absorvância a 280na gradiente icnico (líaOl)· Nestas condiçães as três actividades estão bem separadas. O pico eluído (69 ml) utilizando cloreto de sódio 0,3 N β correspondente às actividades de of-arabinosidase (365 nkat) contém agora apenas reduzidas actividades de Çt—glucosida· se (0,^3 nkat) e de C(-ramnoaidase (0,32 nkat), equivalentes a 0,1$ ( β -glucosidase) e a 0,08$ ( ç( -ramnosida.se) relativamente à actividade de ¢(-arabinosidase. Note-se que ao se completar esta fase, a fracção de C( -arabinosidase contém muito menos proteína do que a solução enziiuática inicial. lista fase permite que a actividade de $f—arabino* eidase seja purificada aproximadamonte 14 vezes. Todavia, uma vez que a presença de baixas actividades de ^-glucosidase e de cf -ramnosidase podem interferir na hidrólise das glicosidases naturais e sintéticas, a purificação foi refinada pela aplicação de uma técnica cromatógráfica posterior (de afinidade). CROiivxoGR ’jtâ m mm® mmèmsiããm. a-vltrossl da FRACÇlO m 0( -AIMSENOSIimSS BA FASD ORCI-IATOGRÍFIOA SG- BRB psab-sepeasoss CL-óB FRACCI0NAMT3NT0 A fracção de of-arabino sida se (ó9 ml) é concentrada numa bolsa de diálise coberta com gel Sephadex $-200 (Pharmacia) até 12 ml. Ú dialisada primeiro contra um tampão

s 28

tris-HCl 50 ntfí (pH 7*2) contendo cloreto de sódio 0,1 e cloreto de manganês 0,1 ma durante uma noite (4-5° C) e em seguida in-jecta-se sobre um gel concanavalina A-UG (IBP, França) (l,0 x x 10 cm) equilibrado previamente com o tampão anterior, a um debito de 30 ml/hora· A coluna e eluída com manopiranósido da metilo (Serva, PRfír) no mesmo tampão, primeiro com um gradiente linear (0_>0,15 M) e depois em oondiçSes isocríticas (0,15 d) e depois em condições isocríticas (0,15 A)· Recolhem-se frac çães de 1,5 ml sobre as quais se determinam a densidade óptica e as actividades de «-arabinosidase, p-glucosidase e «-ramno sidaae. As fracçães combinadas que apresentam actividades de o(--arabinosidase são dialisadas contra tampão de acetato 1G0 ml.. (pH kt2) durante uma noite 0) para remover o oç-b-iaanopira- nósido de metilo*

Resultados 0 perfil cronatográfico está representado na fig* k cuja legenda é a seguinte:

actividade cie #-arabinosidase absorvânoia a 280 nm gradiente de of-B-maíiopiranósido de metilo.

Bsta fase tornou possível remover a maioria das proteínas e todas as actividades residuais de p»glucosidase e oç-ramnosidase, verificadas após concentração das ôacçães por diálise contra o gel Sephadex 0-200 seco* 0 maior pico de «-«arabinosidase (17 ml; 75 nkat) representa 20,5$ da actividade Inicial injectada (365 nkat)* Parte da actividade (62,5 nkat) perde-se pela eluição com oc-B-manopiranósido de .etilo & corresponde a 17,1$ da actividade inicial» O enzima estava forte-mente ligado ao gel © o «-S-aanôpiranósido de metilo só permitiu que se eluxssera 37#$* da actividade inicial {são observados resultados semelhantes para outros enzimas)*

Como resultado desta fase final a actividade de -arabinosidase foi purificada aproximadamente 27 vezes. A solução enzimatica utilizada no® testes de hidrólise contem 29» 9 . nkat/ml de actividade* » 29 s»

Os resultados numéricos correspondentes às diferentes fases durante a purificação da ©(-arabinosidase a partir da Hemicelulase são apresentados no quadro 1. a 30 =

J

J C\i i Φ Λ 3 fi3 H d» u •H P Φ » d> *tí k +> kaí I •H Λ 0 e τΙ fl 3 k «3 1 β *0 o ta o» φ o Tf <tf Tf k3 2 Ό «I3 Φ I 3 3 O k Tf 0 <H P •Hl o k O 3 3 »3 fe P: Os

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pH óptimo A solução do enzima e incubada na presença de seu substrato (Ara-nNP) eia tampão universal (tipo Britton e Ro** biíson) a valores variáveis de pH desde 3*0 ate 7,0. As medidas de actividades são realisadas a vários valores de píl d© incubação nas condiçães descritas no início desta secção A* A activi-dade residual eia função do pH está representada na fig. 5a (cu£ va f ""—f ),

J A actividade de ef-arabino sidase e máxima a um va lor de pH em torno de 3,7 — 4,0*

ΣΑΜΠΙΡΑΪΒ DA ÃGTTÍDSADS A solução do íiizirra e incubada durante 50 minutos a 60o C num tampão universal cujo valor de p-i varia desde 3,0 a 6,5· As amostras são depois dialisadas contra 1 litro de tampão de acetato ICO mi (pS 4,2) durante 5 horas (+5° O)* A no tividade residual medida está representada aa fig* 5a (curve. 0 — o). A actividade de o^*>araMnosidase é relativamen— te estável entre valores de pH compreendidos entre 3,8 o 4,9· Gsta estabilidade diminui rapidamente para valores de pK inferiores a 3*5 e superiores a 5*5·

J ·ιιατϋΐι?ι. A actividade da o(—arabinosidase e determinada depois da incubação do meio reactivo a diferentes temperaturas O ^ o que vadiam entre 5 C ate 8G G. A actividade relativa em íurt-Ção da temperatura de incubação está representada na fig. gb (curva * —* e), ã actividade 6 máxima a 6o° õ0 BtíTAETIJDADfí TnKnICÂ Δ solução do enzima é mantida a diferentes temperaturas (desde 5° C atê 80° O) era tampão do acetato 100 mM (pH 4,2) durante 30 minutos* a actividade residual é medida en-• tão e os resultados estão representados na fig. 5b (curva o*—o) a 33 *

Λ activida.de cie ^-arabinosidaso é estável até 6o° C e acima desta temperatura α estabilidade diminui abrupta-mente. 7>stá quase totaiiaenie inactivada após α·.α tratamento a 70° 0 durante 3C minutos* c. tíxmôLLim m^miíÍTmà \

ή acção separada ou sequencial dos quatro enzimas» uma ¢(-3>arabinofttranoaidase (fí. €U 3.2.1*55» designada -arabinosida.se) » uma L—ramnopiranoeidase (B*C.3,2*1*40, designada gç-ramno sidas©)» uma β-D-apiofuranosidase (designada p-apiosidase) o usa p-D«glucopiranosidase (B.0.3*2.1.21, designada p-gluoosiclase) foi estudada em diferentes substratos glicosídicos, Vistas últimos s3o* por um lado» pç-i-ranaiopirano ó)« β-Β-g-lucopiranósidos de p-nitrofenilo ou de gerani lo (designados nha-Glc—pBP ou ilba—Qic-C*er)» β -n-apiofuranosil— -(l—> ó)- β-D-glucopiranóeicIo de geranilo (designado Api-Grlc--Ger) e ^ -L-arabinofuranoaâl-C 1—^ ó)-p-ii-glucopiranósido de p-nitrofenilo (designado Ara-Gle-pNPj e por outro lado um eat-tracto glicosídico purificado» obtido de um mosto muscatel.

Note-se que os quatro glicósidos sintéticos estudados possuem as mesmas estruturas, no que diz respeito à sua parte carbohidraio, que os glicósidos terpénicos da uva» mas diferem na sua parto aglicona que* para três deles» ê o p-nitrofe-nol (pNP).

J hidrólise ©nsiaatica o aco- por cromato- grafia de camada delgada (Τΐϋ) & por cromtôórafia eo fase gaso sa { GO).

ÍÍC...J.J

CílOB^TOGRAFTA 5Μ:ιΜ {*2Lú) A cromatoprafia de adsorção de camada delgada foi realizada em peças de folha de alumínio cobertas com uma camada delgada (0,2 aa) de sílica-gel (5553 sílica-gel 60 sem indicador fluorescente, i.srcJi)· Foi utilizada uma mistura acetato de etilo/isopropanol/água (Ó3s3b*10 v/v/v) como dissolvente de migração*

Os açúcaroe e cs glicósidos são visualizados por * meio da seguinte mistura, preparada imecliataKonte antes da uti- • lizaçãoi Λ 1/ 2**

0f2r^C de naftoresoreinol ea etaaol/ácido siilfúrico concentrado (19:1 v/v). A ap licação cies te agente de visualização 4 seguida pela secagem das placas e::i estufa (105° 0} durante 15 minutos· 'parte a sua distancia ão migração os caries compostos distin-guem-se tombem pela sua cor* Os glic©sidos são púrpura-verme-lbos, os arabinesidos são azulados, os apiosidos são verdes, a ramnoee 4 verde rosada, a arabinose ó azul, a apioae 4 verde e a glucose o rcaea.

Ales* disso a ALO permitiu recuperar a porção do extracto glicõsádico não liidrolisado pelos enzimas, A zona da placa cromatográiioa onde se localizava a mancha correspondente foi removida, a sáliea-gel foi raspada & posta em suspensão em 50 ml de metanol, Bspoia do se deixar uma noite sob agitação mo derada a suspensão 4 filtrada através de um funil de Sttchner e o gel 4 lavado coa 3 X 10 .ml de metanol. Os eluidos orgânicos são combinados, são levados à secura sob vácuo a 40° O e depois tomados em 500 ftl de água ultrapura, A amostra aquosa obtida deste modo está então pronta para a hidrólise acida, CR0i..ifGUAíiJXi SA ΡΑΑλ3 OASGLA (SG)

Asta técnica foi utilizada a fim do se analisar tanto os açúcares como os glicésidos terpénicos e tambsra os ter penois livres, Goia esta finalidade empregarani-se 2 sistemas cro matográficos· GC doe glicosidos

n. wa.twwnwrT-xwre.CT

Os glicosidos o os açúcares suo compostos não vo, iáteis,. e deste modo, não são adequados para serosa analisados tal qual por G‘X, 'â essencial convertS-los sn oorpostos voláteis por meio de ua* reagente apropriado. Deste- modo foram obtidos os derivados de triínotilsilàlo de acordo eon o seguinte protocolo* /40 |il de um extracto glico sádico e 60 pl de una solução de Glc-—ρΝΊ? (padrão interno) a uma concentração de 5'X mg/l em acetato de etilo, são introduzidos num balão apropriado, A mistura 4 le vada à secura a 40° 0 com uma corrente de azoto. Introduzem-se então 40 ul do reagente de sililação (fri-sii, Pierce, Aockford, IL. , USA)} o balão 4 fechado e mantido a 40° G durante 20 min. Depois de um ctrrofecisxsat© rápido a amostra sililada esta então » 35 «

pronta para análise por GO* 0 aparelho utilizado consiste num cromatografo de gás série 3QC# coei um injector ,,on»columnw (volume infectado 0,5 jjO.) e um dotector de ionização áe chama (Cíirdel, França}! Foi aplicada uma delgada película (0yâ0 fun) de uma fase do sili-cone apoiar OV-l (Girdel) sobre a parede interna da coluna capi·* lar (50 x 0,32 mn de diâmetro interno)* L temperatura da estufa está programada desde 125 a 305° C à razão ds 5° O/minuto e em seguida é mantida a 30.5° 0 durante 1*> minutos* Finalmente sx tom peratura do detector é ajustada a 300° 0 e utiliza-se Melrogé-neo como gás veicular, à pressão de 120 IrPcu

J dC dos teroenols

Os álcoois monoierpenicos aqui estudados são suficientemente voláteis para serem cr©matografados tal qual* .0 extracto em pentano que os contém adiciona-se o padrão interno 4-nonanol (para sinto30, ilerck, Sarmstadt, Alemanha) na proporção de 1 jil de uma solução a concentração do £,89 rag/iai em pentano por 50 fil do meio. A mistura σ então soca «em sulfato do sodio, © filtrada através d© lã de vidro © depois I concentrada até um volume da ordora de 190 J*· Para este fim o pentano s pri4 meiramsnte removido utilizando uma destilação convencional e em seguida uma coluna tipo Sufton cie tamanho apropriado ao volume re-janescente a concentrar*

J

Gs constituintes do extracto concentrado são se parados utilizando unia coluna capila: r (25 m :< 0,3*2 πω» d© diâmetro interno) contendo uma fase polar de OP Jax 3® C.B (Ohrompach, iíiddeldurg, Holanda/· A pelxeula. cie polietilenoglicol aplicada às paredes da coluna tinha uma espessura prevista relativamente grande (l,28 jxm) a fia de permitir a injocção â& volumes do amos tra grandes, até *1*· A análise é realizada utilizando um cro-matografo Fractovap sério 2900 (Cario 3rba, ílilão, Itália) equipado com um detector de ionização de chama mantido a 2^0° 0 e um injsetor <<on-colunm,i · Utilizou-se hidrogénio com gáz veicular a uma pressão de 60 hPa, e a temperatura da estufa foi programada do seguinte modos isotérmica a 0 durante 5 minutos, * seguida por uma subida a 193° 0 à razão cie 2° C/ioinuto e usa pa-. tamar a 195° C durante 15 minutoe.

Cromatoarafia líuuida de alta resolução

Os benefícios da cromatografia líquida d© alta resolução foram explorados para o isolamento de alguns glicosi-dos terpénicos* iara este fim recolheram-se iracçSe» à medida que emergiam do sistema cromatográfieo (maie especialment© por eluição dos picos A e 13) durante e. separação dos constituintes do extracto glicosídico· (Figura 10 ea baixo). 15 injeoeoes sucessivas de 20 cada uma permitiraa recolher material saficieá te para serem realizadas a hidrólise ©nzimátioa a as audlrses por GC a fim de identificar os compostos em questão·

J 0 sistema cromatográfieo consistia nos seguintes componentes? um cromatografo Vista 55^0 equipado com ura es-pectrofotoraetro de comprimento de onda variável W/visível (Va-rian Assoe» Sunnyvale* 0.4» US4)5 uma válvula de injecção do 6 vias (Valco) equipada com um "loop" de 20 |d{ uma coluna de aço Inoxidável (220 x k mm de diâmetro interno) cheia com âpheri-5 (fírovniee labs· Santa Clara» 04» VSt) sílica de granulometria reduzida (5 jan) revestida com cctndeeilo; 'bera como uma coluna prévia (37 x h ma do diâmetro interno) cheia com a mesma faso estacionária· ereraat o grafia o realizada utilisand icctoui trilo (cromatografia de P2>

J .0 ume, iase novel aquosa-orgânica de luridad o de fase reversa) e uma cluição graduada de acordo com ura aumento no teor de ncetositrila desde 30 a (en> volume) no decurso de 10 minutos· 0 dissolvente do eluição e fconíbe-são a um débito de 1 ml/raitiuto* L detecção é realizada α 20C nn e a 0,5 de unidades de absorvancia em topo de escala· 1 - hidrólise enzimática sobro substratos sintéticos

Bra todos os testes relativos à hidrólise enzima— tica dos substratos sintéticos é utilizada, a mesma actividade de glicosidade (c,15 nkat) para cada um dos enzimas ( o( -arc.bi— nosidas©, -apiosidase, οζ. -raranosidas©» -glucosidase). A hidrólise e os protocolos de análise estão indicados na forma de plano (quadro 2)·

As principais abreviaturas utilizadas serão aqui relembradas* « 37 «

pNP Áifa-pSi* kha-pfíP

Api-pNP Rha-GrlC“p^T·

Hha-Glc-Crer

Ara-dlc-p^i1

J

p^niirofenoX ^ «L-axQ.bino^or ano sida do p-nitrofenXXo o( -L-raaraopirano sido de p-nitrofenilo β -D-apiof tirano sido âe p-ni trofenllo ¢( «L-ra;íinopirano s:ll— {1-^ 6)-^ -Bwgiucopiranosid© de p-nitrofOniXo oC -L«-rarmopiranoail«^ 1-^ 6)-p -D» gXucopiranosMo de geAoíiilo ^ «•L-arabiaof uraaosil—i,!—^6)— ~D~giueopirano sido de p-nitrc fenilo

Ara-Glc-Ker

^«•D-gluco- -L^arabinofurasosil-(X 0v

Biranosido de norllo vra-Gle~G«r ^ -L-arràbinof u^ano sil- (1—^6 } - ^-D-glucopirano sido de geranilo

J

Api-Gle-Gea? β -r-apiofuranesiX-Cl—^o)-glu copirano sido de geranilo Gle-pNP £-B-glucopiranosido de p-nitrofeni!o Gle-Lin g -25-gluoopiranosido de Xiaalilo Glc-Ner ^-L-glucopiranosido do nerilo Gle-Gei* p-B-glueopiraaosido de gsraailo /

J

J «ο Ό «3υ Ή μ c •Η Ν C Φ Φ * Ή Η '0 h Ό a cd ¥ U Φ » 0 0 O 0 *rl Η P 0 \φ 0 P 0 £ +» •ri 0 « u 0 (fi 0 φ •μ fl <e u 0 P CS Λ ώ £ Η a A< (0 1 Cv o U Ό « a O"

\

J quadro 2 Continuando)

Os resultados obtidos por TLC estão representados na fig· 6 cuja legenda é a seguintes

Controle por TLC cia Iiidrólise enzimatica de ja^lc-oiú'· Ca). Rha-Clc-piNl" {'b) e At>j*-&le*-Ser lã# Âra-G-lc-pNr *r jj-gluco sidase 2a. Ara-Grlc-plTd ·:· ét-oxabino sidase 3a* \ra-Grlc-pAP -5- ^-arabinosidase ií Jht a—G· 1 c—p . '> P v Rfaâ—ulC—pâL' i* Rha—Grlc-piSP ·:· g-glueosidase lb. 2b. 3b. £*»glueo sidase οζ aitlaso 0( —ramnosidase * β —giueo sidase A acção da £—glucosidase sobre os diferentes substratos sintéticos não origina qualquer Modificação* L acção da oC-arabinosidase sobre Ara-O-lc-pNP causa o desaparecimento deste substrato o o aparecimento· de ara** bino se e Glc-pNP*

Analogamente a acção de pç-ramuosidase sobre Rha-CXc-pAP ou P2ba-Glc-Ger origina o desaparecimento destes substratos e o aparecimento cie raomose e Gric-pliP ou Alc«'3or*

Isto constitui a 1& fas© da hidrólise. A acção consecutiva de £—gluoosidase sobre cada um destes mesbs previaiuente incubado eom ©(«arafcincsidase ou com ^ —ramno sidase conduz a© desaparecimento cio Glc»<*er © GXc»tjNP e ao aparecimento d© glucose (23 fase).

No que se refere às correspondentes agliconas (pNP ou gersniol) cão libertadas apenas depois da acção sequencial de ambas as glicosidade® t ef -reamosidase ou bf -ayabinosidase, e depois p-giucosidas©·

Luto outro aspecto a acção da β -epiosidaso (presente no Alerzyme 260/ sobre Api-^io-Ska? condua ao desaparecimento do substrato & ao apareeiLií&ato de agios© e dé glucose*

Aste resultado mostra que a iiidrólis© enasiaiática a Ul ss

dos glicósidos estudados decorro bera cera as 3 fases descritas acima· 2 - Hidrólise enzirrática de taa extracto glfeosídiçq Protocolo -para, a rtroducão do o.utracto plioosíaicp G extracto glieosíciieo foi obtido por extracção de um -nosto de uvas de variedade Kuscat de GrontAgnan, colhidas na maturidade, nas vinlias da ώ-fecvsioa AxperAtvaHitale de Pech iiou-ge (XWilA Gruissan, França) seguido pela remoção doa terpenois livres e aguçares.

Con vista à realização cio um grande numero de ox periencias foi osaanaial racerror-so a tià supriLioiito de glicósi do que fosso ©onsistoats* Goe osta finalidade c processa foi realizado sobro tr*i graúdo volurae (80 %) do mosto proviameate c en.trifugaua o tratado cosi sulfito (50 pr«a) o a estracção .do ma teria! glicosídieo foi realizada utilizando 80 q de carvão acti vado usado tradicionalraeate era enologia (carvão tipo 0X7} Oeca S.I., Velizy-/illaeoublay, uranga)· A mistura foi mantida sob agitação durante ·'* li e depois deisou-se repousar uma noite. G carvão foi «ntfío removido por filtração através do filtros de celulose (porosidade hG**$Q |ira)# A fia de remover a maioria dos açucares extraídos também pelo carvão ost© último foi lavado cora k x 150 sal de água e filtrado através de um funil do BfieSmer. ϋ controlo por TLC permitiu verificar que o teor de açúcar diminui era cada fase sem ocorrer a oluição dos glicósidos. Istos últimos foram en tão recuperados por lavagem cora 5 X *09 rai de acetona. Tcmbem neste caso o controle por TLQ permitiu controlos,- o elaioão quantitativa do material glieosádico» A acetona foi removido por eira poração sob vácuo o a amostra foi tomada era ’ί·0 i.cl ele água ultra- pura. Healizou-se então uma purificação sais exaustiva do extrac( to glicosádico por fraccioaasaoato numa coluna cie resina orgânica· Amtoerlite AAD-2 (..cisa *A 3aaa Go», Filadélfia, CA, vJ„.) preparada. de acordo coai o se-guinto prctoceloí o.oonâa e cri vago:·, < cuias de granulonetria eorrospondoato a ura criva tio sb malha 175-35i /bra (entro oG e oesíu) seguido por troe ãj?' urtí-i tara ele αν :\qene num extractor Goxnlet cora uiotanolj acetonitrilo s eter diefcíli-s í(2s * *

cof por esta ordem» durante S horas psra oada solvente*, d pro-cesso de fraccionaineuio» desenvolvido ao Laboratoire des Aromes et des Substances Naturelles foi descrito pormenoriz ada mente, Neste estudo aplicou-se por duas veses consecutivamente» e consistia nas seguintes fases*

J - uma resina, posta oa suspensão em metanol» e vertida para uma coluna de vidro (33 :< 1 cm) que -termina numa torneira de te-flon e num tampão· cie lã de vidro. Sepois de assentar a .camada de resina mede aproxiiBadaasate 20 cm* .?assam-se então diversas porgões de sjI cada do metanol através da coluna» segui do pela lavagem com £0 ml de eter dietílico e finalmente equi líbrio da resina utilizando ICO ml de água ultrapura* A coluna está então pronta 'para utilização. - os UO ml do O!?L^2?C10 to glicosádico são passados através-da coluna a uri débito compreendido entre Λ» O ^ sl/minuto· Λ colu I na S depois lavada com 100 ml de pentano a fim de eluir os tarpenois livres. ligados pela resina» sendo o clobito aproxima- damente o mesmo quo o antorior* - os glicosidos stto então recuperados por- eluigão utilizando—se 10u ml cia acetato de etilo, A composição desta fracçSo e estu dada por TJlO que permite verificar a ausência cie aguçares livres (neste caso no fim Ca segundo fraccionamento sobre Aau- — i ) .

J A fraegão do glieósido foi levada s, secura sob vácuo e on: seguida tomada em 13 sl d© ágr.a* i/oi obtido deste mo do o extractc gjlicosáslico utilizado aas experiências croa-.-tográ1 ficas e enzimáticas.

tílDRéiMàS zimátiea do

‘5^ .C ;rc to colos omperimontais para a 5© gliece-íclloe são apresentados iíiãrolise en.-s-o quacro 3. -ί·3

Quadro 3 — Plano de protocolo para a hidrólise enzimática de extructo glicosídico

Φ m d Tát H

["·. nsta nidroliso o controlada por ví.-v e por táu* conxkoljí βλ iim:iíLi£D pcs ao

Os resultados estão indicados »a fig« fí coNTiiox;í) poi-. *H£» i-iiBufeas bo ssss*k3'&~* giígccÍbiooi, 1. extracto glicosádica 2. extracto glicosádico * p-gluoosidaso 3, extracto glicosádico ·:* oc-arabinosidase k, extracto glicosádico * 4-rasaicsidase 5. extracto glicosádio© ·> o<=-araMnosidase * p-giucosidasc 6« extracto glicosádico v ¢(- rasnesidaec ❖ 0-â'luoc·siáaso C extracto glicosádico'inicial mostra una grando mancha (Hf 0f7lf si® 2 sobre 75L$) o duas Ermchas nenores {.af 0,67 e 0,79» nS 1 e 3 sobre TLG)· L hidrólise deste extracto con £»gXucosiiase origina uma mancha teime tendo o fâasmo valor έί£ í£>9á6j que a glucose, e rodus a maior (n® 3), 2ío caso da Iriárolise com et-ambinosids.sc·, observa-se uma redução substanciai na mancha maior (»2 2} e noia-se o aparecimento tíe manchas com valores Ef (C,T6# 79) idênticos ao dos monoglucósâdos terpcniccs e cos o valor df í,c,3i* da ara— bino se, e de uio. mancha desconfcseida tor.ue con ua valor lif (0,55) inferior ao da rasisoso· v>uando o extracto glicosádico e submetido à aeção da tf-ramnosidase a mancha η® 1 corrooponde ao valor Uf do Rba--Glc-Ger desaparece e aparece uí;ía mancha toaiue cos o valor Ri do monoglucósido terpcnico. Ifeete caso apsnas se verifica a liberta ç8o de ranmose (l:f 0,39) como monoesaoarídeo libertada. j:. acoão consecutiva de ψ «gliiGc sidas© sobre cada um dos íeios incubados, qper cosi ef-arafeincsida.se et? con o(-rrn-nosidase, redua safestancialeonte as Eonctes eoia valores PS de nogluoosidos, © origisia sl^oose· C-odavia, caa vos cno B nanoha maioi- S) do ex- BS *1-3 53

tracto glxcosxelico aSo closaparoee GeKplotai:;o:at© depois da acçSo sequencial das glicosidados, a parte restante foi removida © s»5 metida então a Mclróliso ácida., nas condições descritas adiante· Λ sua hidrólise a ρϊΐ 3,0 nao originou qualquer codificação (verificado por TIO)· Γ-or outro lado a líidroXisa completa com acido trifluoroacotico 2 I-i causou o desaparecimento desta mancaa e libertou glucose, raanose e uia conposto desconhecido· (Rf 0,fi5)« Λ-istee testes por TLCJ fornecera!·; informações acerca do destino da parte carbohiératc dos piicósiilos durante a sua hidrólise com enaimac pui^ifiçados· Depreoads-se destes resultados que a hidrólise cie glxcósiclos terpenleos eavolve uma lii&róli se sequencial* i> mecanismo desta hidrólise foi demonstrado n:ais precisamente par análise por 60* COíiTROLB T>Â POE 60 "desta fas© da hidrólise os produtos da rcacçSo' (açúcares, gliccsiclos tcrpónicos o terpenois) suo analisados por GC. .Os resultados estão indicados nas fies· ó e 9s

Fia·» tíi Controle por GG da Mdrólise enzi<ucttioa do' extraoto gli- cosádico. a, idxtracfeo glio© sxcíí. 2o sxlxlado b* dxtracto glicosílice ·!· (g-araMnosid9.se c. ívxtracro giieosxdieo ·ι· arabinosidaso *:* £-gluoosidase 1.$· Padrão interno (Gic-ρΠΡ) 1 e 2. m- e ^-c.rabincse 5 e ó, q( - e ^-glucose a. Glc-iin b. Clc-.Nôr c* aic-aer A, Ara-Glc-Ner B, ivra-Glc-der FI6.-.9.¾ Idêntica a fig. 8, ao caso da Mtâróliso sequencial por -ramnosidas© + β -glucosidase. 3 e 4* °f ô 0-ramnDso· ú ostras to glioo sádico (siliiacio) inicie.! não con tem nem monossaearudoos aaa isonoglue©sidos torpóiaicos (fig· ou/.

L accão da glucosido.se não modofica substan-cialmonte o perfil deste extracto» aparte o aparecimento de glucose. .:/sta ultima também observada por TLO durante o controle da hidrólise do extracto glioasídicís por este ©naire-i» provavelmente -não tem pois origem na hidrólise dos precursores terpeni-cos, mas de outros giioósidos. A aceão cie ^«arabinosidase ou de ^ -ranaao sidas· origina modificações substanciais no eue se refere ao perfil do extracto glicosrdico (figs. Sb e 9b). i3>a particular os dois picos maior o a que foram identificados- (pico A «o Ara-dlc-Aarj pico i> - Alc-Aer) desaparecem eompletamonto depois da incubação do meio com ^-arabinosiclase* enquanto que apareço sraMnose. C pico ot correspondente ao tempo de retenção de Aha-Alc-der» á±í:;i-nui depois da aoção da ^-raicnosi<2nse| simultaneamente obcorva— -se o aparecimento do ramnose. Λ incubação do extracto giioos£áico coe cada um destes dois glicosidos origina» adicionalment ef três aonogluoó-sidcs abundantes (glucósidos de iinalilo, áo nerilo o cio gerani-lo) identificados por comparação cos substancias de referência* c maior parte (77‘p) destes monoglucósidos terpenicos ó libertada pala acção da «araoiiiosiclase, e o restante (23$) produzido pela acção de -raimosidase (quadro 4). * s \;U\!>R0 4 - i-,.onoglucósidos terpenicos libertados (l) j>or ec-ara-binosidase e ^-rasaiosidase de um extracto glicosí-dico

3 47 £S Γ *ΙΜ ·» VLX' Τ1 “

i ^..Ri^rríftíiíasfeSi^iu, << í-ism. ser 0^-arabino siâase t-ranmosidas® $ de mono— glueósidos

Glc-Lxn 10 9 19 Glc-Xer £8 5 33 Glc-Ger 39 9 m f< de monoglu» cósidos 77 23 1€;Q (l) Cs resultado© são expressos cor*© percontagen da quaatiác.dc total de cada composto libertado polos dois t snaxi.ia©* iie quantidades cie terpenois detectudos durante os ta txrifciOira fase da liidifólise, neEieactamente a hidrólise- do 02:— tracto glxcosíclico com cada urna das tares glieosidades isoladaman te, forar.i apenas negligxveis. L ac$ao consecutiva da 0—glueosiáase sobro os extractos glicosídieo0 previamento incubados quer com ^ -arabing sidas© ou com ®(-rasnnosidase (segunda fase) originam o desaparecimento dos monoglucósidos do neril© e geranilo o uma redução do mortoglucósido de linalilo, e a produção de glucose (figs, 8c e 9c) e terpenois em grande quantidade» Ê sabido que a glucosidas© utilisada, que -3 ex traída de amêndoas doces o seleceionada com α finalidade de se estudar a hidrólise sequencial de glicóeidos terpénicos» teia uma baixa afinidade no que se refere ao glucósido de linaiilo* resultando numa hidrólise incompleta deste ultimo nas condições empregues·

Gs mais abundantes cios terpenois libertados sõo geraniol, nerol e linalool, por esta ordem* Aproxiniadamente 8o£ destes terpenois sSo derivados da aegSo conjugada de Q( -urabino-sidase e β -glucoeidase. = í-rB = *

Z?orar.: do tostados tanboc outros torponois o u cora-postos voláteis» aas om pequenas quantidades» doireis da acção sequencial dos ensinias, tais eoE» ^-torpinsol, eitronelol, hi-droxilinaloois» óxidos do linaiool (©om as configurares ©is e transiurano e a configuraçKo ©is-pirano) álcoois bonzílico c fe-nil-etxlico, poliois torpénieos, «©risoprcaoides (S-hxdroaida-mascona, 3-0x0-·of-ionol,* váailgttaiaooX o ©tilfonal* «s modificagaos substanciais* cios r>orfÍ3 ©roinsto-gráfico 3 observa-ôas dopeis da aogSo da ^-arabinor-ifac 3 .sobro o extracto glicca&iloo eondusiran a uma .aci» profun da dos glicoiiides preponderantes. Sem osta finalidade reoollio-ra:n-se frac^ões corr-ospsndontQO aos picos 0« c B do porfi2 dc IIMO · baia pardo allqnots foi sililada o dopeis analisada por 10* correspondência entro os picos L o D aos dois cromatojrauías nas fi^s. ix,· e »?- ficou assim octeJs-slocida*

Legenda da fig. 10s

Perfil por ilTIO do GStraoto olieosádico Λ» ám-Glc-lTer B, ' ra-llc-Cror, ;_l©a disso eacía £&oog&> snbnstide à aeçSe scTUono.l-t.l cio arabiBO sida se o aepoms gitaoosxd .-.so* fx.n de cada fase» o do acordo coo o processo e.c-ccrxto» o mexo Anca— Dado foi analisado por QO a fio do o onsaiar no que se rofore a açucares e glucósidos, por s lado, ® *©»pen©is por outro lado. Os resultados s3c apr-asontados -~'J «λοτ,ο aclGatafA- carant-se os pisos d o 3, rospoetlva^ato, ocmo ^eado βς-1-ai-atoi-nofuranosil— |J —^lucc-piraaosidos && ΛΟ-^χΙι o jí_v.-.jíj.o* x, xdenti dade do giicósido de -oranilo foi verificaca adáoionaliroate por co-injecçao do extracto glieocídie© COía 0 oin^csto sintático. . uadro 5 - Idoatifica-^So do© pisos *· 0 ^colhlaos» per IS-Lú ’:·9 -j

Pico Λ

J

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Goanosies que apareço::* ano a a ao@~o de ¢( ~·γ sidase ώΙΟ-Ιί'ΟΪ' o(*»ara'bi2icsi« das© © denois β-gXttc© sidas© glUCOSG aecOl

OoaroEtos idoiitif icactô s crabitios© glucose iilc—GrOr gemalo! q ··-*·“ racxino ;.'u·• λ .....' · β *._ caniranaci-bo be Γ-G Pilo ^-J^ar&bino ftt- rKÍÍO.*>Íl— (¾ — iU coyiranosico t!e ^oranilo ,arp outro asnoot© ©et«doi’«^e e .-ãrXt.O** αοψχο íie, ^ sidase sobre ua estreei© glicosádico (fig* 11b) dopois da aceão da preparação do 1 'leniôe-iulasó {contonáo aotividc.dos de ^-*ra.4do-sida.so, e(«arabiaesidas© o ^«glaoosidase] sobr·:. esto ©Ktract©·

J Λ. composição do beraioelulaso olibinob os gluoc-eidos ô,o r-cnuiobi-* lo o arabinosilo (fig. IIB). iSm seguida os api©silglucoeidos r©H manescentes forni;: suerretidcs à acgão MdroÁitiôs. de β «-e^iosida· se e p-glucoside.se de Klorsya© 200 (fig. 110). ..*> digco úts nota o desaparecimento de apiosiigiitsósidos o © annrooiíiie&tc ôs /*lu-cosidos do- óxido de liaalilo* o que demonstra a M,bról:Lse se^ucn ciai dos apiosilglueósidos* Os raoneglueó sidos cio l-iaalilo n$o £0 rani hidrolxsaclos*' ao contrario dos Eosioglueosidos t":e .c tre-uil© e de nerilo. Isto o a^ibuível à fsatá afinidade da β -..^lueosidasi do Klerzyme 200 face aos glucósidoe de linalilo. netos resultados eon£ir;::n:i! colootivs^ea.tQ aue e hidrólise orrinnbien de glioósido» terpénieos da uva envolvo a-; i.tecanis 10 sequencial idêntico ao demonstrado sobre 0? substrato; sintéticos. 3 - nimto

j

J

Estudou-se a hidrólise ensiaátiee, de ran o&traeto glxcosxdxco incorporado por um lado nun moio natural (aiosto ou vinho seco) e por outro lado ηα-η εϊθχο do re^orenela itampão) po* la acçfo cie composições comerciais contende as três glieosicla-ses referidas. G protocolo de hidrólise e o seguinte5 um suco e um vinho de uwa variedade de vinho que não eoatsm ter penois e glicósidos terponicos, mas enriquecido previamente com urna quantidade conhecida do oxtracto glicosidico de uva moscatel, são tratados com corjposicões enaináticas comerciais. 3s meios* bem coíbo os controlos, são incubados a 25o 0 durante 85 horas (ver o plano de protocolo ospcrinental abaixo). iEo depois passados através do uoa coluna do .imfearlite a;V:'«2 de acordo com o protocolo aplicado para a produção do extraeto glicos£ ctico, e os terpenois são determinados por CÍG. jJL JiU bõ hiQ±'jGGL9 Í7S&L 30 inl de mosto (pi 3Λ1 açuearos 1C-3 g/l) ou 3*1) vinho branco seco ·*· 0.5 E3l Hoaiiceliila.se ;l) > 0.5 ol aaringinnse(l| Oontrolc * 2 B2l S£ raZ?3(3) o 0,3 ml Henilcolulaso ❖ 0.3 ml aarin^inase v 1 12I extraeto glicoaíciico fJi) v 2 ml 2>; laU,. o 1 ml extraeto glioca£dico Controle 50 ml de tampão (50 Sm' citrato-fosfato) pn 3-3 2 ínl 2tú ifeui. •í* 0.3 ai HemioeXulase v 0.3 ial llarin^iiiaae Referencia :* 1 *al oxtr-act© Glioosícíico v 2 ml 2>j Haifg i (l) 0,5 ml da solução (a uma concentração de 15 mg/nil) d& Ke;ai- =s 51 ® I (2)

Sí$*'

(3) W

J célulase REGr-2 utilizada possuia 70 nkat de aetividade da * -arabinosidase, 72 rikat de aetividade de β -glicosidase e 9 nkat de aetividade de ^-ramnosidase · 0,5 ml da solução (a uma concentração de 5 ing/ml) de narin-ginase usada possuia 78 rikat de aetividade de ^-ramnosida-se e 0,1 rikat de aetividade de β-glucosidase·

Utiliza-se NaN^ a fim de evitar o crescimento microbiano · 0 extracto glicoaídieo utilizado é obtido fazendo passar um mosto de uvas da variedade Museat d*Alexandria através de Amberlite XAD-2. A quantidade do extracto glicosldico (l ml) adicionado nos ensaios corresponde ao que é determinado em 50 ml de mosto de uvas da variedade Museat d*Alexandria ·

Em condições que se assemelham às que se verificam na pratica enológica observa-se uma libertação de terpenols* Esta libertação é menor no caso do mosto do que no do vinho (quadro 6}· Em termos de percentagens de aromas libertados após 86 horas a 25° C comparado com a quantidade libertada no meio de referencia isto significa 11$ para o mosto e 28$ para o vinho. Note-se que os glicósidos de geraniol são hidrolisados mais satisfatoriamente do que os de linalool e de nerol.

Mostrou-se que a inibição da aetividade de β-glu eosidase pela glucose presente em grandes quantidades no mosto pode explicar a menor eficiência relativamente ao vinho.

Os resultados são mais satisfatórios no caso do vinho, uma vez que então é possível, tendo em conta a preponderância dos glicósidos terpénicos, pelo menos duplicar a fraeção de terpenos livres. SE 52 —

JÒL QUADRO 6 « Hidrólise de um extracto glicosídico incorporado nua mosto © num vinho por eomposiçães enzimâticas comer» ciais Compostos libertados relativamente ao (x) m meio de referência Linalool Nerolr Geraniol álcool benzílico Total de terpenois MOSTO 9 6 15 U 3*3» VINHO 14 18 k9 50 28 (1) Referencia* extracto glicosídico + tampão citrato-fosfato, pH 3*3 + Hemicelulase REG-2 + Naringinase·

HIDRÓLISE ÁCIDA A fim de detectar a possível presença de glicósidos terpenicos de estrutura desconhecida na mancha (TLC) reais» tente à hidrólise enzimática pelas glicosidades purificadas* aplicaram-se hidrólises ácidas aos compostos correspondentes a esta mancha recuperada por TLC» l) 0 meio recuperado {250 μΐ) ó levado à secura a k0° 0 com uma corrente de amoto· Introduzera-se no balão 250 ;ul de um tampão citrato-fosfato 25 xtM (pH 3*0} e depois fecha-se o balão e deixa-se a 100° C durante 20 minutos· Depois de se arrefecer este meio é lavado com pentano (5 x 250 jul) · Adi» clona-se o padrão interno ao extracto de pentano que ó de» pois concentrado e analisado por GC· Aplicam-se então sobre uma placa TLC 25 Ail da fase aquosa· (2) o melo recuperado (250 hxX) depois de ser seco como se des» creve acima e tratado com 250 /ul de ácido trifluoroacético * 53 *

2 Ά β deixasse depois a 120° S durante T5 minutos# Depois do arrefecimento o meio e submetido à mesma análise descrita acima·

4. APLICAÇÃO TACNOLtoCA A acção de glicosidases exógenas de origem fúngica foi estudada durante a vinificação de vinho» doces naturais e de vinhos secos do mosto da uva (variedade Huscatel)· Foram en saladas duas composlçSes enzimaticas, Hemicelulase e Klerzyme 200 (ambas produzidas por Gist-Brocades)·

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Espremeram-se uvas maduras e sãs da variedade Mueeat de Frontignan. O mosto foi sulfitado (5 g/hl de so2) · eentrifugado. Estas operação» foram seguidas pela adição da composição enzimática Hemicelulase (contendo (por litro de mosto) jk»7 nkat de ^-arabinoaidase , 2$& nkat de β-glucosidase e 31 i nkat de g-ramnosidase) 0 10 g/hl de uma levedura do vinho (Saccharoayce» cerevisiae. tipo Kl* Institui Ooopóratif du Vin, Maurin, França)·

Os vinhos naturalmente doces são obtidos terminando-se a fermentação a melo deste processo peia adição de álcool atá à concentração final de aproximadamente 17# (v/v) de álcool·

Para os vinhos secos a vinificação é prolongada ate à exaustão dos açucares. A actividade das glicosidases foi acompanhada durante o curso da fermentação. As glicosidases foram isoladas por precipitação com sulfato de amónio e em seguida medidas utilizan do-se os correspondentes glicósidos de p-nitrofenilo·

Depois da armazenagem durante 1,5 meses a 20 -« 22° C extrairam-se as fracçães de componentes de aromas livres e ligados de cada amostra numa coluna de Amberlite XAD-2 em partes alíquotas de 50 ml que se analisaram por SC*

As glicosidases exógenas foram eficazes na liber-. tação de componentes de aroma na vinificação quando não havia [ glucose residual no meio (como e o caso dos vinhos secos)· Des- α 34 *

νϊ’’: t· modo o teor de terpenois (por exemplo, nerol, geraniol, ci-tronelol, ^-torpineol, hidroxi-linaloois) bera como de derivado» d» norisoprenoides ( p -damascenona, 3-hidroxi- β-tíamascona) aumentaram no vinho seco originário do mosto tratado onzimatica-mente (quadro 8}· Este resultado analítico foi confirmado por um painel organolóptico· Todos os provadores (15 ao todo) preferiram o vinho seco tratado enzimaticamente· Os provadores não mostraram preferência no caso dos vinhos naturalmente doces, quer fossem ou não tratados enzimaticamente. Os vinhos originários do mosto tratado enzimaticamente foram considerados raais aromáticos (floral) e mais típicos.

No caso de vinhos doces originários de mostos tratados enzimaticamente a hidrólise de diglicósidos terpenioos não foi completa e foi interrompida quando apenas restavam mono-glucosidos (fig* 12). digna de nota a redução perceptível dos diglicósidos maioritários (arabinosilglucósidos, picos 7 e 9) e um correspondente aumento dos monoglucósiãos de nerol e de gera-niol (picos 2 e 3)· Estes últimos nSo são hidrolisados nos vinhos naturalmente doces devido à presença da glucose (30 g/l) que tem o efeito de inibir a β—glucosidase (originaria de As-pergillus niger). Por outro lado, estes glucósidos foram hidrolisados no caso dos vinhos secos tratados enzimaticamente.

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No entanto uma β-glucosidase (originária da levedura Candida Wickerhamii CBS 2928) foi capaz de hidrolisar ne-ril - e geranil-monoglucósidos nos vinhos naturalmente doces a um pH de 3,6 e superior. Isto e devido à fraca estabilidade da P -glucosidase da Candida Widcerhamii a um valor de pH inferior a 3,6. £ A pH 3*8 tanto os neril- como os geranilmonoglu-cósidos presentes nos vinhos naturalmente doces foram hidrolisados de 19$ a 45$ * respectivamente. A pH 4,0 2/3 de cada glucó-sido foram hidrolisados*

Ao contrário dos arabinosilglucósidos e raranosil-glucósidos, os apiosilglucósidos não são hidrolisados (fig. 12, picos 8 e IO) pela composição enzimática Hemicelulase. Isto e atribuível à ausência de actividade de β-apiosidase nesta composição. Num outro aspecto estudou-ae a acção da composição enzi = 55 = 1 u

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mática (Klerzyme 200) contendo actividade de β-apiosidase adicionalmente às actividades de oç-ramiiosidase, #-arabinosidase • β -glucoaidaa·, durante a fermentação de vinho» secos a partir do mosto do Muscat do Frontignan. Adicionaram-se ao mosto Klerzyme 200 (contendo (por litro de mosto) 2770 nkat de β-glu cosidase· 704 nkat de φ—apiosidase* 27ó nkat de «-arabinosida •e e 35 nkat de cx-raircao sidase) e 10 g/hl de uma levedura de vinho (Saccharomvees cerevisiae, tipo Ivl)* O vinho seco tratado enzimaticamente distinguiu--se pelo aumento da fracçao de componente de aroma livre (quadro 9) quando comparado com o caso em que foi usada a composição Hemicelulase· Além disso a presença de actividade de p-apic sidase no Klerzyme 200 permitiu a hidrólise de apiosilglucósidos (quadro IO). Ê de notar que o glucósido de linalilo e os glucósidos de Óxido de linalilo» ao contrário de outros glucó-sidos ou glicósidos* não foram hidro1isados. Isto pode ser explicado pela fraca actividade da jg-glucosidase na composição Klerzyme 200 sobre estes substratos· Outros componentes voláteis, tais como o vinilo, guaiacol e 3-0x0- ef -ioncl, foram detectad.es em baixas concentra ç5es no vinho tratado enzimaticaraente· O importante aumento de 2-feniletanol no vinho 0 consequência da sua síntese pela levedura durante o decurso da fermentação do mosto. Num outro aspecto as glicosidasea exógenas escolhidas provaram ser estáveis aos valores de pil ácido do mosto e do vinho. 5ó

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Processo para a obtenção de componentes tfe aromas e aromas a partir dos soas precursores coe uma natureza ghcosídi ca, caracterizade pors - num primeiro passo, ser efectuada, uma hidrólise enzimática dum substrato glieosldico contendo pelo menos ura dos referidos percursores com pelo menos ura enzima oscolfcido de acordo com a estrutura do referido percursor, para libertar os monoglicosidos correspondentes por clivagem de uma ligação glicosádica, com a ! condição de polo menos tena p —apio sion.se e o seu correspondente apio sido estarem presentes na hidrólise ersi unticaj o - num segundo passo, realizar-se uma hidrólise enzimática do pro duto do primeiro passo cora pelo menos ura ou outro enzima diferen te ou idêntico ao do primeiro passo e escolhido para libertar os componentes de aroma e aromas por clivagem da ligação aglicona--carbohidrato.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por a referida p-apiosidase ser uma β-h-apiofurauosida-*e,

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Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizada por estar presente um j£-Ei-aoio- β -B-glucosido como subs trato glicosídico· a» ít í mt

Processo de acordo com qualquer das reivindicação» 1 a 3, carseterizada por, no caso de o substrato conter somente monoglicosidos, a hidrólise enzimática ser realizada direetaman-te sem a realização do primeiro passo· - 5* - * Processo de acordo cora qualquer das reivindica- e . çães 1 a 4» caracterizado por o substrato glicosádico ser feito

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Claims (1)

1. contactar num único passo cotn os enzimas escolhidos ou com os en zlrnas susceptíveis de libertarem os Eonoglicosidos assim como arome e/ou componentes do aromas# « 6$ - Processo de acordo com a reivindicação 5, carac-terizada por se escolher como substrato glicosádico um material vegetal derivado dum fruto# duma planta aromática ou de uma plan ta com flores# assim como dos seus derivados ou sub-produtos, ou alternativamente ura material de plantas originário de cultura de células Hin vitrou. - 7* - J Processo de acordo c©ir. a reivindicação 6, caracte rizado por se escolher «n material vegetal derivado de uvas# tais como sumo de uva, vinhos e seus dorivados, assim como sub--produtos de vihificação de variedades de videira aromáticas, especialmente moscatéis· - 8s - Processo de acordo cora qualquer das reivindicações i a 7* caractsriaado por o extract© gliCGsádico ser usado como substrato glicosádico. • 9« - J Processo de acordo com a reivindicação 8, caractj» rizado por se utilizar como extracto glieosádico, extracto dura mosto originado de «ma variedade de videira tal como a moscatel, de onde os terpenois livres e açúcares foram priraeiramente removidos. - 19* - Processo de acordo coa qualquer das reivindicações 1 a 7» caracterizado por a hidrólise ser realizada num meio natural. - 11® - Processo de acordo coa a reivindicação 10, caracterizado por serem utilizados coiso raeio natural os sumos e vinhos duma variedade de videira contendo ou não terpenol e glico- S Ó3 «

   •idos da terpono sendo o referido meio enriquecido, no caso d© não conter ierpenol a glieesidos de terpono, com :121 extraeto gli | coeídico como definido na reivindicação 8, Processo do acordo cora qualquer das reivindicações 1 a 7* caracterizado por ser usado um substrato sintético. - 13* - Procosso do acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser usado como substrato sintético adicional ef-L* -ramnopiranosilo-(l—3 6}- £-D-gluoopiranosido de p-nitrofenilo, ou um Qf -L-arabinofuranoailo»(l--y 6)- j^-D-glucopirano sido de p--nitrofenilo. • 14* - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 caracterizado por serem usados como enzima, no primeiro passo, dois enzimas adicionais consistindo numa —ar&bi— nosldase e numa ^-raranosidase, e no segundo passo, uma β -glu— cosidas». - 15a * Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por uma ^-L-arabinofuranosidase (13.0,3.2.1.55) e uma ^ -L-raomopiratto sidase (B.C.3*221*40} serem usadas respeetiva-mente, como eç-arabino sidase e ^-raninosidase, e por ser usada β-D-glucopiranosidase (3,0.3*2.1.21) como β-glucosidase. - I6t“ - Processo do acordo com qualquer das reivindicação s 1 a 15 caracterizado por se obter como componentes de aromas ou aromass terpenéis tais ce-;;;o geraniol, linalol, nerol, --terpineol, citronelol e análogos; oxidos da linalol; terpenopo-liois tais como hidraxilinalol; álcoois tais como álcool fenil--etílico, etilfenol e álcool benzílico e análogos; norisoprenoi-des tais como 3-bidroxidamaacona e 3**>xo- °(-ionol; vinilgaiacol. 64 s= - 17* - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16 caracterizado por se obterem agliconas nâo odoríferas tais como paranitrofenol· As requerentes reivindicam a prioridade do pedi do de Patente Europeia apresentado em 7 de Setembro de 1989, sob o N» 89202271.6, J Lisboa, 7 de Setembro de 1990

   = 65 =

   R "PROCESSO PARA L OBTENÇÃO lá m AR0E2&S E >JR€!íiU> A PARTIR DOS SEUS PERCURSORES COM WIL NATURE2A GLICQSIDICA» I-i. invenção ref ere—se a u® processo para a obtenção de componente» de aromas e aromas a partir do» seus precursores com uma natureza glicosádica* que compreende· - num primeiro passo» ser efoctuada, uma hidrólise eczimatica dum substrato glicosídieo contendo pelo menos um dos referidos percursores com pelo menos tm enzima escolhido de acordo com a estrutura do referido percursor* para libertar as monoglicosidos correspondentes por clivagem de uma ligação glicosádica» com a condição de pelo monos uma β-apiosidase & o seu correspondonts apiosido estarem presentes na hidrólise enzimática; e - num segundo passo* realizar-se uma hidrólise enzimatica do pro duto do primeiro passo com pelo menos um outro enzima diferente ou idêncica ao do primeiro passo o escolhido para libertar os componentes de aroma e aromas por clivagem da ligação aglicona--carbohidrato. J

   Volume (ml) A cti vi da de (nka l·/m l)