PT89942B - Processo para a obtencao de componentes de aromas e aromas a partir dos seus precursores de uma natureza glicosidica - Google Patents

Description

Descrição

A presente invenção refere-se a um processo para obtenção de componentes de aroma ou aromas a partir dos seus precursores de natureza glicosídica, assim como aos componentes de aroma e aromas obtidos por este processo.

Em algumas variedades de videiras, tais como moscatel, os compostos de aroma existem em duas formas, livres e ligados. A fracção livre consiste de

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•SSSSSBaaaarr-^.

substâncias odoríferas voláteis, principalmente terpenois. A fracção ligada contém precursores de terpenois, especialmente di-glicosídeos não odoríferos, formados a partir de =/ -L-ramnopiranosil β-D-glucopiranosidos (designado por Rha-Glc) e de o< -L-arabinofuranosil /2>-D-glucopiranosi deos (designado por Ara-Glc), nos quais a glucopiranose proporciona a ligação entre o radical terpeno (designado por Terp) e o dissacarídeo, de acordo com as fórmulas:

Rha(l-->6)Glc-Terp Ara(l—>6)Glc-Terp

À fracção aroma na forma de precursores é muitas vezes muito maior do que a fracção afoma livre (tipicamente num factor de 3 a 10), e pode atingir concentrações elevadas, da ordem de alguns miligramas por litro. Considerando, em adição, o particularmente baixo nível de percepção olfactiva e a qualidade aromátice. dos álcoois de terpeno, existe, nestas variedades de videj ras, um potencial muito importante de aroma não explorado.

Os glicosídeos de terpeno, isolados do sumo, podem hidrolisar-se utilizando preparações cc merciais de enzimas com uma grande variedade de especifica çÕes. É assim possível a libertação enzimática de terpe nóis, a qual reflecte mais fielmente o aroma natural livre do fruto do que o revelado por hidrólise térmica ao pH; do sumo; contudo, o controlo desta libertação, para uma exploração industrial, do potencial aroma pressupõe que se definam as glicosidades responsáveis pela hidrólise e que se estabeleçam os seus mecanismos de acção.

A presente invenção baseia-se numa demonstração do mecanismo de hidrólise enzimática, sendo tal mecanismo do tipo sequencial.

Assim, o processo de acordo com a

presente invenção para obtenção de componentes de aroma e aromas a partir dos seus precursores de natureza glicosídica caracteriza-se por:

- numa primeira fase, uma hidrólise enzimática de um substrato glicosídico contendo pelo menos um dos referidos precursores, se executar com pelo menos uma enzima escolhida de acordo com a estrutura do referido precursor, pa ra libertar o monoglucosido correspondente por clivagem numa ligação glicosídica;

numa segunda fase, executar-se uma hidrólise enzimático do produto da primeira fase, com pelo menos uma enzima diferente ou idêntica à(s) da primeira fase e escolhida para libertar os compoúentes de aroma e aromas por clivagem da ligação aglicona - hidrato de carbono.

Substrato significa qualquer substância que contém um precursor de natureza glicosídica de um componente de aroma ou aromas.

A título de exemplo, o precursor glicosídico pode ser um material vegetal derivado de uvas, tal como sumo de uva, vinhos e seus derivados, por exemplo todas as bebidas que contêm vinho, sumo de uva ou uma substância relacionada, assim como sub-produtos da verifi cação das variedades de vinhas aromáticas, especialmente moscatel. Os três componentes do sistema de enzima necessários para a hidrólise dos glicosídeos de terpeno de uvas para libertar os terpenóis, substâncias voláteis odo ríferas, são agora conhecidos, de acordo com esta invenção: uma °6-arabinolidase e uma cX-ramnosidase para a primeira fase, e β-glicosidase para a segunda fase. Com efeito, o trabalho que conduziu à presente invenção possi bilitou concluir que a hidrólise'de diglicosídeos de terpeno não resulta da acção de uma única glicosidase mas sim de várias, que operam aos pares de acordo com o seguinte mecanismo sequencial de duas fases:

Fase 1; Acção de uma ©(-arabinodidase e uma o< -ramnosi3 dase, que libertam os monoglucosídeos de terpeno correspondentes por clivagem de ligação glicosídea (1—>6).

Fase 2; Acção de uma f$-glucosidase que proporciona a libertação dos terpenóis por clivagem da ligação aglicona de terpeno-hidrato de carbono.

Ara(l—>6)Glc-Terp -arabinosidase

Rha (1— >6)Glc-Terp «X-raranosidase

Fase 1 damente a β-glicosidase,

Glc-Terp —> Terpenol

P-glicoéidase

Fase 2 última enzima do esquema, nomea a qual depende a libertação final dos terpenóis, tem que apresentar uma inibição mínima por glicose, da actividade a valores de pH ácido e elevada afinidade relativamente às agliconas utilizadas nos su bstratos glicosídicos, para'que o processo proposto tenha completa eficácia nas suas aplicações.

De acordo com esta invenção, têm também que se definir os substratos (Ara-Glc-pNH, Rha-Glc -pNP, Ara-pNP, Rha-BfP, Glc-pNp) cujas actividades são sus ceptíveis de se medirem, sendo estas condições essenciais para a produção das enzimas correspondentes, processo de acordo com a presen te invenção é exemplificado pela exploração do potencial aroma das uvas, sendo o material principal de planta esco lhido de sumo de uvas, vinhos e derivados, assim como sub -produtos da virificação de variedades de vinhas aromáticas, especialmente, mas não exclusivamente, moscatel.

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Contudo, a presente invenção não se limita a esta aplicação. Com efeito, o mecanismo demonstrado é um mecanismo geral para componentes de aroma e aromas os quais não são necessariamente terpenicos, e que é aplicável a todos os produtos de plantas diferentes de uvas: frutos, derivados de frutos (por exemplo bebidas) e sub-produtos de frutos; plantas aromáticas e plantas que dão flor) assim como derivados e sub-produtos destas plantas; outras plantas tais como chá e tabaco; e mesmo material de plantas proveniente de culturas de células in vitro; com as condições seguintes:

(a) que estes produtos de plantas, contenham, em quantidades suficientes, precursores de aroma ou perfume de natureza glicosídica, incluindo terpenois e glicosídeos diferentes dos encontrados nas uvas) (b) que as glicosidases específicas correspondam à estrutura dos precursores glicosídicos; e (c) que o meio natural não contenha inibidores das enzimas aplicadas.

Como frutos que contêm glicosídeos, diferentes de uvas, que se podem utilizar no processo da presente invenção, podem referir-se, inter alia, damascos, mangas, papaias e fruta de flor-da-paixão. Como uma plan ta que dá flor, pode referir-se, inter alia, a rosa.

É também possível utilizar um extracto glicosídico como um substrato glicosídico, ou a hidrólise pode, alternativamente, executar-se num meio na tural contendo os precursores.

Assim, são oferecidas várias possibilidades para executar o processo de acordo com a presen te invenção:

trabalhando num meio natural, como atrás descrito, liberta-se a ligação do aroma, aumentando assim o aroma do próprio produto;

- é também possível tratar um dado extracto glicosídico (por exemplo de papaia) e introduzir o aroma obtido noutro produto, por exemplo uma bebida (sumo de uva);

- é também possível introduzir um (ou vários extractos glicosídicos (por exemplo extracto de papaia, extracto de bagaço) num substracto líquido (por exemplo sumo de uvas, bebidas naturais) e aplicar o processo de acordo com esta invenção, para libertar, assim, o aroma in si tu, É também possível conseguir que o aroma se liberte mais tarde, no momento desejado, num alimento, numa bebida ou num per fume.

termo enzima significa aqui qualquer meio susceptivel de obter a correspondente actividade enzimática. As enzimas utilizadas no processo de acordo com a presente invenção podem ter qualquer origem; bacteriana, de fungos, de leveduras, de plantas, de animais ou sintéticos. As enzimas produzidas por manipulações genéticas utilizando microorganismos hospedeiros são também abrangidas por esta invenção.

Os microorganismos podem, assim, modificar-se pelas técnicas conhecidas dos especialistas da técnica de produção de uma enzima ou várias enzimas, as quais se podem utilizar no processo.

processo desta invenção torna possível obter, em particular como componentes de aroma ou aromas, terpenóis tais como geraniol, linalol, nerol e análogos, polióis e álcoois de terpeno tais como álcool de fenilo, de etilo e de benzilo, ou análogos.

De acordo com esta invenção, é também possível, dependendo do perfil da ligação do aroma aos precursores, o qual pode ser diferente do aroma livre, ou dependendo da especificidade da enzima utilizada, obter a produção de um aroma novo.

O conhecimento do mecanismo origina a produção de enzimas com propriedades características e capacidades tecnológicas novas.

De acordo com uma forma de realize, ção particular do processo da presente invenção, correspor dente ao caso em que o substrato contém apenas monoglicosídeos, a hidrólise enzimática executa-se directamente sem passar pela primeira fase.

Na definição desta invenção, como descrito anteriormente, estabelecem-se que o processo envolve uma hidrólise de duas fases. Contudo, esta invenção não é, de qualquer modo, limitada à utilização de duas fases com adições sucessivas de enzimas separadas. Como efeito, é perfeitamente possível, como uma variante, espe cialmente se é a mesma enzima ou enzimas que liberta(m) o monoglicosídeo e também os componentes de aroma e aromaa, colocar o substrato glicosídico em contacto com a enzima ou enzimas escolhidas, numa fase única, originando, então, a hidrólise enzimática pelo menos uma fase de reacção que proporciona os aromas e/ou componentes de aroma desejados. Esta forma de realização do processo desta invenção pode mostrar-se adequada, por exemplo, se pelo menos um microorganismo codificado para produzir a enzima ou enzimas adequadas para a reacção, se utilizar para a reacção com o substrato glicosídico. Na descrição que se segue, quando se referem uma primeira fase e uma segunda fase, por interesse e conveniência da descrição, isto apenas significa que a reacção de hidrólise se processa em várias fases, mas não significa, de modo algum, que estas fases de reacção necessitem de adições separadas de enzimas.

A presente invenção é ilustrada pelos resultados experimentais apresentados adiante;

A. Substratos utilizados

Entre os substratos utilizados, o β-D-glucopiranosídeo de p-nitrofenilo (Sigma, USA), oCX-L-arabinofuranosídeo de p-nitrofenilo (Sigma, USA) e o

-L-ramnopiranosideo de p-nitrofenilo (Extra-síntese, França) existem comercialmente disponíveis. Os outros glicosíduos foram sintetizados: a sua síntese utiliza tfes fases, e agitação com o sacarídeo peracetilado correspondente.

A primeira fase consiste na activa ção do átomo de carbono anomérico do grupo terminal carbo -hidrato do sacarídeo peracetilado correspondente, por in trodução, neste carbono, de um halogéneo tal como cloro ou bromo, ou um imidato tal como tri-cloro-acetimidato.

Assim, o hexa-acetil-*^ -cloro-ruti nosídeo obtém-se pela acção de dicloreto de zinco e éter metílico de diclorometilo em rutina num solvente inerte tal como clorofórmio ou cloreto de metileno, sob condições anidras.

O tetra-acetil- -bromo-D-glucopiranosideo e o hexa-acetil--bromo-rutinosídeo preparam-se por acção de ácido bromídrico gasoso em penta-aceto-D-glucopiranose e em hepta-acetato-rutinose, respectivamente, num solvente inerte tal como clorofórmio ou cloreto de metileno, sob condições anidras.

A mistura de tri-cloro-acetimidatos de 0-(hexa-acetil e<- e - (^-rutinosilo) obíém-se por acção de hexa-acetil-l-rutinose (obtido por acção de benzilamina ou amónia em hepta-aceto-rutinose num solvente aprótico tal como acetonitrilo, tetra-hidrofurano ou éter etílico) em tri-cloro-acetonitrilo, na presença de uma base, por exemplo carbonato de potássio ou hidreto de sódio, num solvente aprótico tal como cloreto de metileno, clorofórmio ou éter di-etílico e sob condições anidras.

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Os tri-cloro-acetimidatos de 0-^ Hexa-acetil-6-0-(o<-L-arabinofuranosil)-o(- e - (^-D-glucopiranosilo_/ obtém-se da mesma maneira.

A segunda fase consiste na substituição nucleófila catalítica do grupo removível introduzi do, por para-nitrofenol, por um monoterpenol ou por um álcool. Assim, depois de purificação por cromatografia em sílica gel, obtém-se um glicosídeo de β-ρ-nitrofenilo, de |^-terpenilo ou β-alquilo peracetilado.

Assiçi, a acção de monoterpenois tai como geraniol, nerol, -terpineol ou linalol, ou de álcoois tais como álcool benzílico ou 2-fenil-etanol, em pera cetil-<=«(-bromo-D-glucopiranosideo ou peracetil-°í -bromo-rutinosido executa-se na presença de carbonato de prata, num solvente aprótico tal como, por exemplo, éter, cloreto de metileno ou clorofórmio, na presença de drierite ou de um crivo molecular de 0,4 nm (4A); ou na presença de um catalizador solúvel tal como cianeto de mercúrio, em acetonitrilo, na presença de um crivo molecular de 0,4 nm (4/k); a acção de p-nitrofenol em peracetil-©C-cloro-rutinosideo obfém-se em piridina, na presença de carbonato de prata e drierite; a acção de monoterpenois tais como linaol, geraniol ou o^-terpinol em tri-cloro-acetimidatos de O-(peracetil-©*>- e β-rutinosilo) ou tri-cloro-acetimidatos de 0-/ hexa-acetil-6-0-(-L-arabi nofuranosil)- <*- e P~D-glucopiranosilo_/ executa-se na presença de um crivo molecular de 0,4 nm (4Ã) e tri-fluoreto-eterato de boro ou ácido para-tolueno-sulfónico em cloreto de metileno ou clorofórmio.

A cromatografia em sílica gel dos β-glucosideos de peracetico desejados executa-se por eluição com éter/éter de petróleo, clorofórmio/éter, cloreto de metileno/éter ou acetato de etilo/misturas de éter de petróleo.

A fase final consiste na remoção dos grupos acetilo de protecção da porção de açúcar dos glicosideos formados; a desacetilação executa-se por trans-esterificação em metanol na presença de um cataliza dor básico tal como metilato de sódio.

Entre os sacarídeos peracetilados que são materiais de partida para estas sínteses, apenas o 1,2,3,4-tetra-O-acetil-6-O-/~2,3, 5-tri-O-acetil- -L-arabinofuranosil)- P-D-glucopiranose não existe disponível comercialmente. A sua preparação pode realizar-se por intermédio da síntese atrás descrita, partindo de 1,2, 3,5-tetra-0-acetil-°< , P-L-arabinofuranose e 1,2,3,4-tetra-O-acetil- /^-D-glucopiranose. É, contudo, preferen ciai executá-la por activação da 1,2,3,5-tetra-0-acetil-°1, P-L-arabinofuranose para proporcionar 3,5-di-0-acetil-1,2,-Q-/^—(1-exo- e 1-endo-ciano)etilideno_/-f^-L-arabinofuranoses utilizando cianeto de tri-metil-sililo na presença de um ácido de Lewis tal como cloreto estanho so, e da 1,2,3,4-tetra-0-acetil- β-D-glucopiranose para proporcionar 1,2,3,4-tetra-0-acetil-6-0-tritil- P-D-glucopiranose por tritilação, A reacção de glicosilação entre estes dois aintões realiza-se sob condições rigorosamente anidras, na presença de peraclorato de tri-fenil-carbono como um catalizador.

É possível aplicar esta síntese à preparação de 2,3,4-tri-O-acetil-6-O-(2,3,5-tri-O-acetil-t*-L-arabinofuranosil)- P^-D-glucopiranosídeo de p-nitrofenilo, por ligação do mesmo derivado ciano-etilideno com

2,3,4-tri-0-acetil-6-0-tritil- (P-D-glucopiranosideo de p-nitrofenilo. contudo, esta glicosilação origina, além de di-holosidos não esperados, di-holosidos com uma ligação inter-sacarídeo 1--- 4· a sua separação é possível por cromatografia em gel de sílica, eluída com um acetato de etilo/mistura de éter de petróleo.

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Rutine de deca-acetilo

Num frasco de fundo redondo de 500 ml equipado com um condensador com um tubo de segurança de cloreto de cálcio, adicionaram-se 25 g de rutine com agitação magnética a 150 ml de pirldina anidra. Enquanto se arrefeceu a mistura num banho de água fria, adicionaram-se 100 ml de anidrido acético durante aproximadamente 10 minutos, e continuou-se a agitação durante 24 horas. Verteu-se então o meio de reacção em 1,5 1 de água gelada: o derivado acetílado precipitou em cristais brancos. Filtraram-se estes cristais, lavaram-se com água e com um pouco de éter etílico e então secaram-se sob vácuo num excicador sobre sílica gel. Obtiveram-se 38,3 g (rendimento: 99%) -TLC, (cromatografia de camada final Éjel de sílica - éter 0,22, p.f. 128-135°C.

Cloreto de 2,3,4-Tri-O-acetil-6-O-(2,3,4-tri-0-acetil--L-ramnopiranosil) - =< -D-glucopiranosilo

Fundiram-se aproximadamente 6 g de ZnCl₂ num cadinho sobre um bico de Bunsen. Permitiu-se que arrefecessem sob folha de alumínio e colocaram-se, rapidamente 4 g deste SnC^, que se tinham moído grosseira mente, num frasco de fundo redondo de 250 ml equipado com um condensador e com um tubo de segurança de cloreto de cálcio·

Adicionou-se então, com agitação magnética, o seguinte:

- 80 ml de clorofórmio anidro, depois

- 20 g de rutine deca-acetilado;

- finalmente, introduziram-se aproximadamente 20 ml de éter metílico de 1,1-dicloro-metilo durante 5 minutos;

- levou-se então a mistura a 75-77°C durante 2 horas.

Decantou-se a solução de clorofór

- 11 τ f

mio e lavou-se o resíduo pastoso do frasco com 20 ml de clorofórmio, e combinou-se este com a solução de clorofór mio que se evaporou sob vácuo num evaporador rotativo a 35-45°c.

Absorveu-se o resíduo oleoso amarelo em 500 ml de éter etílico o qual se lavou com água gelada_z com solução saturada de Na₂C0₃ e depois, de novo, com água gelada. Secou-se a fase orgânica sobre Na₂SO^ e filtrou-se, e concentrou-se a solução num evaporador rotativo sob vácuo a cerca de 35°c. Recristalizou-se o resíduo, que estava parcialmente cristalizado, em éter etílico, e depois, uma segunda vez em etanol anidro. Secaram-se os cristais brancos obtidos sob vácuo num excicador sobre gel de sílica.

Obtiveram-se 6,3 g (rendimento -53%) -TLC, gel de sílica -éter R = 0,52, p.f. 148-15O°C.

2,3,4-tri-O-acetil-6-O-(2,3,4-tri-O-acetíl-^-L-ramnopiranosil)- -glucopiranosideo de p-nitrofenilo

Num Erlenmeyer equipado com um tubo com cloreto de cálcio e um agitador magnético, introduziram-se 3 g de drierite e 1,5 g de p-nitrofenol em 50 ml de piridina anidra. Agitou-se a mistura durante 1 hora, e adicionaram-se, depois, 5 g de aceto-cloro-^-rutino sido e 3 g de carbonato de prata, preparados de fresco e secos.

Continuou-se a agitação no escuro e à temperatura ambiente durante 24 horas.

Filtrou-se o meio de reacção, lavou-se o precipitado com um pouco de piridina e concentrou -se o filtrado num evaporador rotativo sob vácuo a cerca de 4o-45°c. Absorveu-se o resíduo duas vezes com 25 ml

de benzeno e concentrou-se da mesma maneira para remover os vestígios de piridina.

Absorveu-se de novo o resíduo em 100 ml de benzeno e lavou-se a solução com água gelada, sç lução N de hidróxido de sódio e depois, de novo, com água gelada, e finalmente secou-se sobre ^2^0^.

Depois da filtração, concentrou-se o filtrado num evaporador rotativo sob vácuo a 35-40°C. Puri±icou-se o resíduo avermelhado, pastoso por cromatogrç. fia em gel de sílica de uma partícula de tamanho correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha de 67‘yum a 199 pn (malha 70 a 23O)__/, eluída com éter etílico- - 0,5» Concentraram-se as fracções mais puras num evaporador rotativo e recristalizaram-se os crie tais brancos obtidos, em etanol a 95°. Obtiveram-se assim 1,4 g (rendimento = 25%) -TLC, gel de sílica -éter Rf= 0,5, p.f. 185-187°C.

Brometo de 2,3,4-tri-0-acetil-6-0-(2,3_>4-tri-Q-acetil-o<-L-ramnopiranosil)-c<-D-glucopiranosilo

Colocaram-se 1,3 g de hepta-acetorutinose e 0,4 ml de anidrido acético em 20 ml de clorofói mio, sob azoto a -4°C num frasco de fundo redondo de 50 ml, e adicionaram-se, gota a gota, 3,8 ml de uma solução a 33% de ácido bromídrico gasoso em ácido acético. Contà nuou-se a agitação a -4°c durante 2 horas, e então verteu -se o meio de reacção em 50 ml de água gelada. Separou-se a fase orgânica, depois da clarificação, secou-se sobre sulfato de sódio anidro e concentrou-se num evaporadoí rotativo sob vácuo a 35°c. utilizou-se o óleo amarelo obtido sem purificação na fase subsequente. É possível, contudo, cristalizá-lo, absorvendo-o com um pouco de éter etílico e deixando-o arrefecer. Por filtração sob azoto, lavagem com um pouco de éter etílico e éter de petróleo e secagem num excicador no frio, obtiveram-se 310 mg de crie

- 13 tais brancos (rendimento -23%), p.f. 12O-125°c.

2,3,4-tri-0-acetilo-6-0-(2,3,4-tri-O-acet il- -L-ramnopirç, nosil)- P-D-glucopiranosideo de geranilo

Num frasco de fundo redondo de 50 ml agitou-se, durante 24 horas, sob azoto à temperatura ambiente o seguinte;

5 mg de bromo-2,3,4-tri-O-acetil-6-O-(2,3,4-tri-O-acetil- o<-L-ramnopiranosil)-^-D-glucopiranosídeo (pro duto bruto da reacção de bróminação);

- 1 ml de geraniol;

0,5 g de cianeto de mercúrio em lo ml de acetonitrilo.

Concentrou-se, então, a mistura num evaporador rotativo sob vácuo a 35°c, e absorveu-se o resíduo em 50 ml de éter etílico. Filtrou-se o sólido precipitado e lavou-se com éter etílico, e concentrou-se o filtrado num evaporador rotativo sob vácuo a 35°c. Fez -se a cromatografia do resíduo oleoso em sílica gel /^—de um tamanho de partícula correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 67 jum á 199 jum / malha 70 a 230)_/, eluído sucessivamente com éter etílico/éter de petróleo (10:90) para remover o excesso de geraniol e depois com éter etílico/éter de petróleo (75;25) para eluir o rutinosídeo. Combinaram-se as fracções que continham o rutinosídeo e concentraram-se a 35°c sob vácuo num evaporador rotativo. Obtiveram-se 140 mg de uma pasta sem côr, a qual não foi possível cristalizar, (rendimento = = 19%), sendo o produto purificado em TLC-sílica gel; éter/ /éter de petróleo (3:1) R^= 0,33.

2,3,4-Tri-Q-acetil-6-O-(2,3,4-tri-0-acetil-<X-L-ramnopiranosil)-p-glucopiranose

Num frasco de fundo redondo de 100 ml, colocou-se uma mistura de 600 mg de hepta-aceto-rutino

se e 1,2 ml de benzilamina em 80 ml de éter etílico e dei xou-se ficar com agitação magnética e sob azoto durante 24 horas à temperatura ambiente. Concentrou-se, então, o meio de reacção num evaporador rotativo sob vácuo, e fez-se a cromatografia do resíduo oleoso numa coluna de gel de sílica / de uma tamanho de partícula correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 67 /im a 199 /am (malha 70-230), eluído com éter etílico. Concentraram-se as fracções que continham hexa-acetil-rutinose num evaporador rotativo sob vácuo. Obtiveram-se 500 mg de óleo sem côr (rendimento = 83%); TLC -gel de silica -éter di-etílico R^= 0,31.

Tri-cloro-acetimidatos de 0-/~~2,3,4-tri-0-acetil-6-0-(2,

3,4-tri-0-acetil-°(-L-ramnopiranosil)-o<- e - fi-D-gluco piranosilo 7

Misturaram-se 2,6 g de 2,3,4-tri-0-acetil-6-0-(2,3,4-tri-0-acetil-°<-L-ramnopiranosil)-0-glucopiranose, 1,6 ml de tri-cloro-acetonitrilo e 25 ml de cloreto de metileno, sob azoto e à temperatura ambiente, num frasco de fundo redondo de 100 ml, Adicionaram-se, então, 1,6 g de carbonato de potássio anidro com ag_i tação magnética, e continuou-se a agitação durante 18 horas. Filtrou-se, depois, o meio de reacção e lavou-se o precipitado com 10 ml de cloreto de metileno. Concentrou -se o filtrado num evaporador rotativo sob vácuo a 35°c e fez-se a cromatografia do resíduo numa coluna de sílica /de um tamanho de partícula correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 67 yum a 199 pra (malha 7O-23O)__/, eluído com uma mistura 1;1 éter etílico,' /cloreto de metileno. Combinaram-se as fracções que con tinham o imidato e concentraram-se num evaporador rotativo sob vácuo a 35°c. Obtiveram-se 2,3 g de um óleo sem cor (rendimento = 71%); TLC-gel de sílica -éter di-etílico R = 0,76.

2,3,4-Tri-Q-acetil-6-Q-(2,3,4-tri-O-acetil-<K-L-ramnopira nosil)- ft-p-glucopiranosideo de (-)-linalilo

Num frasco de fundo redondo de 100 *1* ml, agitou-se uma mistura de 550 mg de (-)-linalol, 650 mg de tri-cloro-acetimidato de 0-/( 2,3,4-tri-0-acetil-6-0-(2,3,4-tri-0-acetil- ος-L-ratnnopiranosil) - °<- e - P~D-glucopiranosilo_/, e 1 g de crivo molecular de 0,4 nm (4a) em 3 ml de cloreto de metileno, sob azoto à temperatura ambiente, durante 30 minutos. Adicionaram-se, então, 22 pl de uma solução a 50% de trifluoreto eterato de boro era cloreto de metileno, e adicionaram-se também depois de 40 minutos de agitação magnética. Depois de uma agitação adicional durante 40 minutos, adicionaram-se 650 mg de bicarbonato de sódio ao meio de reacção, o qual se lavou então, volume a volume, com solução aquosa 0,5 M de bicarbonato de sódio e depois com água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro e concentrou-se num evaporador rotativo sob vácuo a 35°c. Fez-se a cromatografia do resíduo oleoso em gel de sílica £ de um tamanho de partícula correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 67 pm á 199 pm / malha 70-23O)__/, eluído primeiro com uma mistura 4:1 de éter de petróleo/éter di-et£lico para remover o excesso de linaloL e depois com uma mistura 1;4 éter di-etílico/clorofórmio para eluir o heterosido acetilado. Combinaram-se as fra cções que continham o último e concentraram-se num evaporador rotativo sob vácuo a 35°C. Obtiveram-se 190 mg de um óleo sem cor (rendimento = 29%); TLC-gel de sílica; éter di-etílico/éter de petróleo (4:1) R^=O,34.

6-0-(c<-L-ramnopiranosil)- fr-D-glueopiranosideo de gerani lo

Num Erlenmeyer de 50 ml lavado com um fluxo de azoto, dissolveram-se 0,2 g de 2,3,4-tri-O-acetil-6-0- (2,3,4-tri-O-acetil- -L-ramnopiranosil) -

-D-glucopiranosideo de geranilo, 2 ml de metanol anidro.

com agitação mecânica, em

Adicionaram-se, então, 0,3 ml de uma solução de metilato de sódio (preparada a partir de 230 mg de sódio e 100 ml de metanol anidro) durante 30 segundos, e continuou-se a agitação sob azoto num banho de óleo a 68-70°C durante 20 minutos. Arrefeceu-se o Erlenmeyer num banho de água/gelo e adicionaram-se aproximadamente 0,2 ml de Dowex húmido 50W x 4(H ) / de um tamanho de partícula correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 74/147 pm (malha 100/200)__7 de modo a que o pH da solução fique na gama de 7. Filtrou-se então a resina e concentrou-se o filtrado num evaporador rotativo sob vácuo a 25°c. Purificou-se o resíduo oleoso obti do por cromatografia numa coluna de gel de sílica 60 âe um tamanho de partícula correspondente à passagem através de um crivo de abertura de malha 67 jum â 199 pm (malha 70 a 23O)__/, eluído com uma mistura 3:1 acetato de etilo/metanol. Combinaram-se as fracçÔes que continham o (^-ruti nosideo de geranilo e concentraram-se num evaporador rotativo sob vácuo a 25°c. Obtiveram-se 110 mg de uma pasta sem côr, que não foi possível cristalizar sendo o produto purificado em TLC-gel de sílica; acetato de etilo/metanol (3:1) R_f= 0,35.

2,3,4-Tri-O-acetil-6-O-(2,3,5-tri-0-acetil- -L-arabinofuranosil)-o(- e - fi-D-glucopiranoses

Borbulhou-se amónia gasosa durante 15 minutos num frasco de fundo redondo de 100 ml contendo 25 ml de uma mistura 7:3 de tetra-hidrofurano/metanol e manteve-se a 0°c em gelo moído.

Adicionaram-se, então, 400 mg de

1,2,3,4-tetra-O-acetil-6-O-(2,3,5-tri-0-acetil- -L-arabinof uranosil)- β-D-glucopiranosideo.

Permitiu-se, então, que o frasco voltasse à temperatura ambiente enquanto se continuou a agitação.

A reacção foi seguida por TLC (síli ca gel; cloreto de metileno/éter, 6:4). Quando não havie mais material de partida (depois de aproximadamente 15 mi nutos), parou-se a reacção e concentrou-se o meio até secar sob pressão reduzida a 40°C.

Purificou-se, então, o resíduo nume coluna de sílica, eluída com uma mistura 6;4 de cloreto de metileno/éter. Obtiveram-se assim 250 mg de produto desa cetilado na posição 1 /rendimento: 67%). TLC -gel de sílica - cloreto de metileno/éter (6:4); R^= 0,36.

Tri-cloro-acetimidato de 0-/ 2,3,4-Tri-O-acetll-6-O-(2,3,

5-tri-O-acetil-οζ-L-arabinofuranosil-οζ e - P-D-glucopiranosilo /

Introduziram-se 250 mg de 2,3,4-tri -0-acetil-6-0-(2,3,5-tri-0-acetil-o^-L-arabinofuranosil)- <X- e - P-D-glucopiranoses, 2,5 ml de cloreto de metile no absoluto, 0,16 ml de tri-cloro-acetonitrilo e 160 mg de carbonato de potássio anidro, num reactor mantido sob azoto.

Deixou-se o meio durante 48 horas à temperatura ambiente, com agitação magnética. Verificou-se a reacção terminou por TLC(gel de silica; cloreto de metileno/éter, 6:4).

Absorveu-se então o meio com 10 ml de CH^C^ e filtrou-se num tufo. Lavou-se a fase orgânica sucessivamente, volume a volume, com solução aquosa sa turada de NaHCO^ e com água gelada; secou-se, então, sobre sulfato de sódio anidro e depois concentrou-se até à secu- 18 -

ra a 35°C sob pressão reduzida. Obtiveram-se, assim,

264 mg de um óleo amarelado (rendimento = 88%) - TLC - si lica gel - cloreto de metileno/éter di-etílico (6:4) - R_f= 0,5.

2.3.4- tri-Q-acetil-6-O-(2,3,5-tri-0-acetil- -arabinof ura nosil)- fi-p-glucopiranosideo de geranilo

Introduziram-se 250 mg de tri-cloro-acetimidatos de 0-/“2,3,4-tri-0-acetil-6-0-(2,3,5-tri-0-acetil-o<-L-arabinofuranosil) - <%- e - fi-D-glucopiranosilo_/, 250 pl de geraniol e 1,5 ml de cloreto de metileno anidro, num reactor de 50 ml mantido sob azoto.

Manteve-se o meio sob azoto e com agitação magnética; adicionaram-se, gota a gota, 20 pl de uma solução a 50% de trifluoreto eterato de boro em clore to de metileno.

Depois de decorridas 3 horas de reacção, verificou-se se a reacção se completou por TLC (gel de sílica, cloreto de metileno/éter, 7:3), e então adicionaram-se 50 mg de bicarbonato de sódio ao meio. Adicionaram-se 10 ml de cloreto de metileno e lavou-se o meio de reacção, volume a volume, com solução gelada 0,5M de bicarbonato de sódio e depois com água gelada. Secou -se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro e levou -se à secura a 35°c sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo oleoso rapidamente numa coluna de sílica, eluin do primeiro o excesso de geraniol com uma mistura 1:1 de éter/éter de petróleo, e depois o produto com uma mistura 8:2 cloreto de metileno/éter. Obtiveram-se assim 150 mg de um óleo sem cor (rendimento = 58%). TLC: gel de sílica cloreto de metileno/éter (8:2), R^= 0,49.

2.3.4- tri-0-acetil-6-0-tritil- fi-D-glucopiranosideo de p-nitrofenilo

Num frasco de fundo redondo de 100 ml, introduziram-se 1,42 g de P-D-glucopiranosideo de p-nitrofenilo e 1,5 g de cloreto de tritilo anidro em 10 ml de piridina anidra, e deixou-se o frasco no escuro com agitação a 40°C. A reacção foi seguida por TLC, com adi ção de cloreto de tritilo se necessário. Depois de 24 horas, levou-se o frasco à temperatura ambiente e adiciona ram-se 6 ml de anidrido acético. Deixou-se o meio de reacção durante 43 horas com agitação sendo a reacção seguida por T.LC (gel de sílica, éter/éter de petróleo, 7:3); absorveu-sè em 500 ml de água gelada e agitou-se durante 2 horas. Filtrou-se então a mistura através de celite e lavou-se a celite com dl-cloro-metano. Lavou-se a fase orgânica, sucessivamente com água gelada, ácido clorídrico a 10%, solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e depois água gelada. Secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se sob vácuo a 35°c. Fez-se a cromatografia do resíduo numa coluna de sílica, eluído com uma mistura 7:3 de éter/éter de petróleo. Combinaram-se as fracções que continham o heterosido e concentraram-se sob vácuo a 35°c. Obtiveram-se 2,6 g de um óleo (rendimento = 83%), sendo o produto purificado em TLC: gel de sílica, éter/éter de petróleo (7:3); R_^= 0,33.

1,2,3,5-Tetra-0-acetil- - p-L-arabinofuranose

Tratou-se uma mistura de L-arabinose anidra (10 g) e metanol anidro (200 ml) com ácido clorídrico metanólico l,06M preparado por adição de cloreto de acetilo (4,7 ml) e metanol anidro (63 ml) a 0°C__/; agitou-se a mistura durante a noite a 0-5°c. Adicionou-se piridina (40 ml) para neutralizar a mistura, a qual depois se concentrou. Absorveu-se o resíduo várias vezes em piridina, a qual se removeu por destilação, e, então, dissolveu-se em 80 ml de piridina. Adicionou-se anidri. do acético (30 ml) frio, e deixou-se a solução à temperatura ambiente durante 2 dias. A extracção do meio de

reacção com acetato de etilo ou cicloro-metano proporcionou um produto xarope que depois se dissolveu numa mistura de ácido acético (100 ml) e anidrido acético (25 ml); adicionaram-se 5 ml de ácido sulfúrico concentrado a 0°C, e deixou-se a mistura, durante a noite, à temperatura ambiente. Emergiu-se então a solução em gelo moído (150 g) e agitou-se a mistura durante 2 horas e, então, extraiu-se com clorofórmio. Lavou-se o extracto com água e depois com solução aquosa de bicarbonato de sódio; fez-se a cromatografia do resíduo obtido, depois da concentração da fase orgânica, numa coluna de gel de sílica (eluente: gradiente benzeno/éter) e obteve-se 1,2,3,5-tetra-0-acetil-e<, P-L-arabinofuranose na forma de um xarope (18 g, 85%), Rf= 0,46 (eluente: benzeno).

3,5-Di-O-acetil-1,2,0-/ 1-exo- e 1-endo-ciano)etilideno /-

- P-L-arabinofuranose

Adicionaram-se cloreto estanhoso anidro (360 mg) e cianeto de tri-metil-sililo (3 ml) a uma solução de 1,2,3,5-tetra-0-acetil-, P-L-arabinofura nose (3 g) em acetonitrilo (10 ml). Agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente, depois diluíu-se com éter e lavou-se com solução aquosa de bicarbonato de sódio (3x75 ml) e depois com água. Concentrou-se a fase orgânica e fez-se a cromatografia do resíduo numa coluna (eluente: gradiente benzeno/éter) para proporcionar os produtos 1-exo-ciano (994 mg; 37%) e 1-endo-ciano (700 mg; 26%). A cristalização com éter/penteno proporcionou o isómero 1-exo-ciano (35%), p.f. 66-69°C, / (Cl),

Rf= 0,56 (eluente: benzeno/éter, 3:2). A cristalização com tolueno proporciona o isómero 1-endo-ciano (23%), p. f. 107-llo°C, /“^_7_d + 51° (cl), R_f= 0,37.

1,2,3,4-Tetra-O-acetil-6-0-(2,3,5-tri-0-acetil-^-L-arabi nofuranosil)- fi-D-glucopiranose e 2,3,4-tri-O-acetll-6-O—

-(2,3, S-tri-Q-acetil-*⁵* -L-arabinofuranosil) - P-D-glucopira

- 21 nosídeo de p-nitro£enilo

Em dois frascos de fundo redondo fechados e ligados por um tubo com forma semelhante a um diapasão, introduziram-se, num lado (num frasco) uma solu ção de glucosídeo tritilado (0,55 mmoles) e 3,5-di-0-acetil-1,2-0-^ (1-exo- e 1-endo-ciano)etilideno_/- ^-L-ara binofuranose (0,5 mmoles) em nitro-metano (2 ml), e no ou tro lado (no outro frasco) uma solução de perclorato de tri-fenil-carbono (0,05 mmoles) em 0,2 ml de nitro-metano Liofilizaram-se as duas soluções, e introduziram-se então 2 ml de benzeno destilado em cada frasco, sendo os conteú dos liofilizados de novo; repetiu-se a operação uma segun da vez; secaram-se os frascos e os reagentes durante várias horas. Destilou-se di-cloro-metano (2ml) in situ em cada um dos dois frascos. Combinaram-se, então, as duas soluções e deixaram-se a reagir durante a noite à temperatura ambiente e no escuro /) a liofilização e também a secagem dos reagentes, assim como a destilação do benzeno e di-cloro-metano sobre CaH_, executaram-se à pressão de 0, 533 Pa (4 x 10 mmHg)_/. Tratou-se o. meio de reacção amarelo brilhante com 1 ml de piridina/água (3:1), e diluíu-se, então, a solução descolorida com clorofórmio (50 ml), lavou-se com água (3 x 30 ml) e concentrou-se. Purificou-se o resíduo numa coluna de gel de sílica, eluído com gradiente benzeno/éter ou acetato de etilo/éter de petróleo, para produzir;

de 1,2,3,4-tetra-0-acetil-6-0-tritil-p*-D-glucopiranose, 1,2,3,4-tetra-0-acetil-6-0-(2,3,5-tri-0-acetil—®<-L-arabinofuranosil)- P-D-glucopiranose, p.f. 106₇5-l08,5°c (éter/penteno); TLC: gel de sílica; benzeno/ /éter (3:2), R_f= 0,35.

de 2,3,4-tri-0-acetil-6-0-tritil- P -D-glucopiranosideo de p-nitro£enilo, 2,3,4-tri-O-acetil-6-O-(2,3,5-tri-O-acetil- (X-L-arabinofuranosil)- β-D-glucopiranosideo de p-nitrofénilo;

TLC: gel de sílica; acetato de etilo/éter de petróleo Ϊ:1

Rf= 0,24 e 2,3, b-tri-0-acetil-4-0- (2, 3, 5-tri-0-acetil-<=< -L-arabinofuranosil)- β-D-glucopiranosídeo de p-nitrofeni lo; TLC, sílica gel; acetato de etilo/éter de petróleo (1:1), R_f= 0,28.

6-0-(c<-L-arabinofuranosil)- P-D-glucopiranosídeo de gera nilo

Dissolveram-se 200 mg de 2,3,4-tri -0-aceti1-6-0-(2,3,5-tri-0-acetil-e^-L-arabinofuranosil)- /^-D-glucopiranosídeo de geranilo, sob azoto, em 5 ml de metanol anidro com agitação magnética. Adicionaram-se 0,1 ml de uma solução metanólica de metilato de sódio preparada de 20 mg de sódio e 10 ml de metanol^/. Con tinuou-se a agitação durante 4 horas à temperatura ambien te, e neutralizou-se, então, a solução por adicção de resina Dowex Sow x 4 (H ).

Filtrou-se a mistura e concentrou-se a solução até à secura num evaporador rotativo. Purifieou-se o resíduo oleoso por cromatografia numa coluna de gel de sílica, eluído com uma mistura 8:2 clorofórmio/ /metanol para produzir 105 mg de 6-0-(<=^-L-arabinofuranosil)- p*-D-glucopiranosídeo de geranilo na forma de um xarope. Rendimento 81%, TLC: gel de sílica, clorofórmio/ /metanol (8:2), R_f= 0,1/.

fe-0-(«a(-L-arabinofuranosil) - ft-D-glucopiranosídeo de p-ni trofenilo

Por desacetilação de 2,3,4-tri-O-acetil-6-0-(2,3,5-tri-0-acetil-cÇ-L-arabinofuranosil)- β -D-glucopiranosídeo de p-nitrofenilo, de acordo com o pro cedimento anterior, obteve-se 6-0-(-L-arabinofuranosil) - β-D-glucopiranosideo de p-nitrofenilo. TLC: gel de sí lica, acetato de etilo/isopropanol/água (65:30:10), R^ = = 0,69.

Β. Medição das Actividades Bnziméticas e Purificação das Enzimas

1· Medição das actividades enzimáticas

As acfividades glicosidase determj. naram-se por incubação de 0,1 ml de substrato 4mM, (Glc -pNP, Ara-pNP, Rha-pNP) num tampão acetato lOOmM (pH 4,2) com 0,1 ml de solução de enzima a 40°C durante 20 minutos Calculou-se a libertação de pNP por adição de 0,6 ml de carbonato de sódio 1M ao meio de incubação e mediu-se, en tão, a densidade óptica a 400nm. lnkat de actividade corresponde à libertação de 1 nmole de pNP por segundo.

Isolaram-se duas glicosidases, o<-arabinosidase e ®(-ramnosidase, e purificaram-se de pre parações comerciais que continham misturas complexas de enzimas.

Utilizou-se P-glucosidase de amên doas doces (Koch-Light, Grã Bretanha, Batch N2. 2872-01) que não apresentava qualquer actividade contaminante tipo

-arabinosidase e <%,-ramnosidase (24 h de incubação a 40°C, pH 4,2).

2· Purificação das enzimas

2.1. Purificação de uma oç-L-ramnopiranosidase

Purificou-se a -ramnosidase de naringinase (Sigma) rica nestas actividades. As actividades P-glucosidases, embora baixas (0,1% da actividade ©Ç-ramnosidase), mas susceptíveis de libertarem glicose durante longos períodos de incubação, removeram-se pela técnica de cromatografia.

protocolo experimental;

Purificação de oÇ-ramnosidase por cromatofocagem de narin ginase em gel PBE96

Dializaram-se 50 mg de naringinase, absorvicios em 4 ml de tampão imidazol 25 mM (pH 7,4), contra o mesmo tampão (25 ml) durante a noite (5°c). Injectou-se o dializado numa coluna (1/0 x 40 cm) permutado· ra de iões (Polybuffer exchanger PBE 94, Pharmacia, Suécia) equilibrada com o mesmo tampão. Eluiram-se as proteínas ligadas a este gel por um gradiente de pH de 7,4 a 3,7, criado durante a migração de Ampholina Polybuffer 74 (Pharmacia) ajustado anteriormente a pH 3,7)' a um caudal de 44 ml/h.

Depois de se completar o gradiente a passagem de NaCl 1 M em tampão acetato 100 mM (pH 3,7) desabsorve as proteínas retidas.

Recolheram-se fracções de 2,8 ml, nas quais se mediram as actividades βζ-ramnosidase e fr-glucosidase, o pH e a densidade óptica a 280 nm.

O perfil cromatográfico apresenta· -se na Figura 1, para a qual a legenda é como se segue:

||-£ actividade οζ-ramnosidase actividade p*-gi_ucosj_<3_ase Absorvência a 280 nm pH gradiente

As actividades cA-ramnosidase eluiram-se num gradiente de pH, enquanto que o conjunto da actividade P-glucosidase se reteve a pH 3,7 (pi < 3,7) e eluíu-se por passagem de uma solução de' NaCl IM.

Esta técnica mostra que a naringi· nase contém pelo menos 3 (ramnosidase) iso-enzimas de pon· tos isoelectricos pi 6,2, pi 5,7 e pl<3,7. A segunda (317 nkat/ml), que não apresentou nenhuma actividade -glucosidase residual mesmo depois de mais de 24 horas de incubação a 40°q_z f_oi escolhida para os ensaios de hidró25 τ

lise enzimática de glicosídeos naturais e sintéticos.

rendimento de recuperação global das actividades ©ζ-ramnosidase é de aproximadamente 62%.

2.2. Purificação de uma o<-L-arabinofuranosidase

Entre as preparações comerciais de enzima estudadas, a Hemicellubase REG-2 (Gist Brocades, França) mostrou-se rica em actividade e<-arabinosidase. Contudo, apresenta actividades substanciais do tipo ^-glucosidase e -ramno sidas e. Por exemplo, 250 mg de Hemi cellulase contêm 2.327 nkat de actividade ©< -arabinosidase, 2.566 nkat de actividade glucosidase e 236 nkat de actividade ©Ç-ramnosidase. Aplicaram-se várias técnicas cromatográficas sucessivamente para isolar e purificar a ©ς-arabinosidase.

Peneiração Molecular de Hemicellulase em Ultrogel Aca 44

Fracoiongmento

Dialisou-se a solução de enzima (250 mg de Hemicellulase em 3 ml de tampão citrato-fosfΒίο 100 mM, pH 7,2) contra o mesmo tampão (500 ml) durante a noite (+ 5°c). Colocou-se então o dialisado numa colu na (1,6 x ICO cm) de Ultrogel Aca 44 (IBF, França) equilibrada antecipadamente com o mesmo tampão. Eluíu-se entãc a coluna com o tampão anterior a um caudal de 9 ml/h. Recolheram-se fracçÕes de 1,2 ml e mediram-se as actividades oÇ-arabinosidase, (^-glucosidase e «<-ramnosidase, assim como a densidade óptica a 280 nm.

Resultados prefil cromatográfico apresenta -se na Figura 2, para a qual a legenda é como se segue:

Actividade ©Ç-arabinosidase Actividade P-glucosidase Actividade «=«-ramno sidase Absorvência a 280 nm.

A peneiração molecular em Ultrogel ACA 44 proporciona a separação das duas principais actividades ©<-arabinosidase e /^-glucosidase. As activi dades «K-ramnosidase são co-eluídas com as actividades «k-arabinosidase. A maior parte das proteínas presente na solução inicial de enzima é eluída com as actividades <Λ-arabinosidase.

A fracção (52 ml) correspondente às actividades ©ζ-arabinosidase (1.750 nkat) contém também vestígios de actividades, que são P-glucosidase (23,4 nkat) e oí-ramnosidase (37,4 nkat), equivalentes a 1,3% ( ^-glucosidase) e 2,1% (4-ranmosidase) relativamen te à actividade ©Ç-arabinosidase.

Cromatografia de permuta iónica em DBAE-Sefarose CL-6B da fracção ©(-arabinosidase derivada de peneiração molecular Fracc ionamento

Dialisou-se a fracção rica em o(-arabinosidase (52 ml) contra 500 ml de tampão imidazol-HCl 25 mH (pH 7,5) durante a noite (+ 5°c). Colocou-se então o dialisado numa coluna (1,6 x 40 cm) de DEAE-Sepharose CL-õb (Pharmacia) equilibrada antecipadamente com o mesmo tampão. Lavou-se primeiro o gel com este tampão a um caudal de 108 ml/h. Eluiratn-se, então, as proteínas retidas na coluna com um gradiente linear de cloreto de sódio (de 0 a 0,4 15) no mesmo tampão (imidazol-HCl) a um caudal de 40 ml/h» Recolheram-se fracções de 4 ml, nas quais se mediram as actividades ©(-arabinosidase, P-gluco sidase e «<-ramnosidase e a densidade óptica a 280 nm.

τ

Resultados:

perfil cromatográfico apresenta-se na Figura 3, na qual a legenda é como se segue:

Actividade ©Ç-arabinosidase Actividade P-glucosidase Actividade <X-ramnosiâase Absorvância a 280 nm Gradiente de força iónica (NaCl)

Sob estas condições, a.s três actividades são bem separadas. 0 pico eluído (69 ml) utilizando NaCl 0,3 li correspondente às actividades ©ς-arabinosidase (365 nkat) contém agora apenas baixas actividades p*-glucosidase (0,43 nkat) e <=*-ramnosidase (0,32 nkat), equivalentes a 0,1% (P-glucosidase) e 0,08% (©Ç-ramnosida se) relativamente à actividade arabinosidase.

É de notar que, no fim desta fase, a fracção ©<-arabinosidase contém muito menos proteínas do que a solução inicial de enzima.

Esta fase permite que a actividade c<-arabinosidase seja purificada aproximadamente 14 vezes. Contudo, uma vez que a presença de baixas actividades glucosidase e «ζ,-ramnosidase pode interferir na hidrólise de glicosídeos naturais e sintéticos, refinou-se a purificação por aplicação de uma técnica cromatografia adicional (de afinação).

Cromatografia de afinação em A-ultrgel de concanavalin de uma fracção o\-arabinosidase derivada da fase cromatografia em DEAS-Sefarose CL-6B

Concentrou-se a fracção «X-arabino sidase (69 ml) num saco de diálise coberto com gel Sephadex

- 28 τ

G-200 (Pharmacia) até 12 ml. Dialisou-se primeiro contra um tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) que continha NaCl 0,1 Me MnC^ 0,1 mM, durante a noite (+ 5°C), e depois injectou-se num gel de concanavalin A-UG (IBF, França) (1,0 x 10 cm), equilibrado antecipadamente com o tampão anterior, a um caudal de 30 ml/h. Eluíu-se a coluna com oÇ-D-monopiranosídeo de metilo (Serva, RFA) no mesmo tampão, primeiro com um gradiente linear (0--> 0,15 M) e depois isocraticamente (0,15 M). Recolheram-se fracções de 1,5 ml, nas quais se mediram a densidade óptica e as actividades o<-arabinosidase, β-glucosidase e c<-ramnosi_ dase. As fracções combinadas que apresentavam actividades ©(-arabinosidase dialisaram-se de novo, contra tampão acetato 100 M (pH 4,2) durante a noite (+ 4°c), para remo ver o ©C-D-manopiranosídeo de metilo.

Resultados perfil cromatografico apresenta-se na Figura 4, para a qual a legenda é a que se segue;

φ-φ Act ivi d ade o< -arabinosidase

O-O Absorvância a 280 nm

--- Gradiente <X-D-manopiranosídeo de metilo

Esta fase tornou possível remover a maior parte das proteínas e todas as actividades residu ais /^-glucosidase e o<-ramnosidase, verificadas depois de concentração das fracções por diálise contra gel seco de Sephadex G-200. 0 maior pico de «Λ-arabinosidase (17 ml; 75 nkat) representa 20,5% da actividade inicial injectada (365 nkat). Uma parte da actividade (62,5 nkat) é arrastada na eluição com οζ-D-manopiranosídeo de me tilo e corresponde a 17,1% da actividade incial. A enzi ma ligou-se fortemente ao gel, o οζ-D-manopiranosídeo de metilo conseguiu eluir apenas 37,6% da actividade inicial (observaram-se resultados semelhantes para outras enzimas I

Como um resultado desta fase final, a actividade o4 -arabinosidase purificou-se aproximadamente 27 vezes. A solução de enzima utilizada nos ensaios de hidrólise contém 29,9 nkat/ml de actividade.

Os resultados numéricos corresponder tes às diferentes fases da purificação de ©(-arabinosidase a partir de Hemicellulase apresentam-se na Tabela 1.

Tabela 1 Purificação de ^(-arabinosidase

Propriedades da -arabinosidase purificada ph óptimo

Incubou-se a solução de enzima na presença do seu substrato (Ara-pNP) em tampão universal (tipo Britton e Robinson) de pH a variar de 3,0 a 7,0. Me diram-se as actividades a vários valores de pH de incubação sob as condições descritas no início desta secção A.

A actividade residual como uma função do pH apresenta-se na Figura 5§ (curva φ-φ).

A actividade ©(-arabinosidase é má xiraa a um pH de 3,7-4,0 aproximadamente.

Estabilidade da actividade como uma função do pH

Incubou-se a solução de enzima durante 50 min. a 60°C num tampão universal cujo pH varia de 3,0 a 6,5. Dialisaram-se, então, as amostras contra 1 1 de um tampão acetato 100 mM (pH 4,2) durante 5 horas (+ 5^C C). A actividade residual medida apresenta-se na Figura 5â (curva Q-O ) ·

A actividade c<-arabinosidase é re lativamente estável entre pH 3,8 e 4,9. Esta estabilida de diminui rapidamente a valores de pH inferiores a 3,5 e superiores a 5,5.

Temperatura óptima

Determinou-se a actividade °(-arabi nosidase depois de incubação do meio de reacção a diferen tes temperaturas que variam de 5°C a 80°C. A actividade relativa como uma função da temperatura de incubação apre senta-se na Figura 5b (curva φ-φ).

A actividade é máxima a 60°C.

Estabilidade Térmica

Manteve-se a solução de enzima a diferentes temperaturas (de 5°c a 80°C) em tampão acetato 100 mM (pH 4,2) durante 30 minutos;

mediu-se, então, a actividade residual e os resultados apresentam-se na Figura 5 b (curva o-O )·

A actividade o<-arabinosidase é estável até 60°C, e acima dela a estabilidade diminui abruptamente. Fica quase totalmente inactivada depois de um tratamento a 70°C durante 30 minutos.

C. Hidrólise Enzimática

Estudou-se a acção separada ou sequencial de três enzimas, uma oQ-L-arabinofuranosidase (E.C.3.2.1.55, designada c<-arabinosidase), uma N-L-ramno piranosidase (E.C.32.1.4o, designada <&<-ramnosidase) e ume /^-D-glucopiranosidase (E.C.3.2.1.21, designada p*-glucosi dase), em diferentes substratos glicosídicos. Estes são, por um lado <X-L-ramnopiranosil- (1-- 0 6)- f^-D-glucopiranosídeos de p-nitrofenilo ou geranilo (designados Rha-Glc-pNp ou Rha-Glc-Ger) e «<-L-arabinofuranosil-(1— >6)-D-glucopiranosídeo de p-nitrofenilo (designado Ara-Glc-pNP), e por outro lado um extracto glicosídico de um mos to moscatel.

É de notar que os três glicosídeos sintéticos estudados possuem as mesmas estruturas relativa mente à sua porção carbo-hidrato dos glicosídeos terpenos de uvas, mas diferem na sua aglicona que para dois deles, é p-nitrofenol (pNP).

A hidrólise enzimática é seguida por cromatografia de camada fina (TLC) e por cromatografia gasosa (GC).

Cromatografia de Camada Fina (TLC)

A cromatografia de adsorção de ca mada fina executou-se em unidades de lâminas de alumínio cobertas com uma camada fina (0,2 mm) de gel de sílica (5553 gel de sílica 60 sem um indicador de fluorescência, Merck). Utilizou-se uma mistura de acetato de etilo/isopropanol/água (65:30:10 v/v/v) como um solvente de migração.

Visualizaram-se os açucares e os glicosídeos por intermédio de seguinte mistura, preparada imediatamente antes da utilização 0,2 % de naftoresorcinol em etanol/ácido sulfúrico concentrado (19:1 v/v). A apli cação deste agente de visualização é seguida da secagem das placas num forno (105°C) durante 15 minutos. Para além da sua distância de migração, os vários compostos dis tinguem-se também pela sua cor. Os glicosídeos são vermelhos-purpura, os arabinosídeos são azulados, a ramnose rosa esverdada, a arabinose azul e a glicose rosa.

Além disso, a TLC permite a recuperação da porção do extracto glicosídico não hidrolisada pelas enzimas. Raspou-se a zona da placa cromatografica onde se localizava a mancha correspondente, recuperou-se a sílica gel e suspendeu-se em 50 ml de metanol. Depois de se deixar ficar durante a noite com agitação suave, filtrou-se a suspensão num funil BOchner e lavou-se o gel com 3 x 10 ml de metanol. Combináram-se os eluídos orgâ nicos levaram-se à secura sob vácuo a 40°C e então absorveram-se em 500 Λ¹ de água ultra-pura. A amostra aquo sa assim obtida está pronta para hidrólise ácida.

Cromatografia de Gás (CG)

Utilizou-se esta técnica para anal;, sar os açucares e os glicosídeos terpenos e também os ter·

penóis livres. Com este objectivo, utilizaram-se dois sistemas cromatográficos diferentes.

C.G dos glicosídeos

Os glicosídeos e os açucares são compostos não-voláteis e portanto não adequados, como tal, para uma análise por C.G. É essencial convertê-los em compostos voláteis por intermédio de um reagente seleccionado. Formaram-se, assim, derivados de trimetil-sililo, de acordo com o protocolo seguinte:

Introduziram-se 40 pi de extracto glicosídico e 60 yul de uma solução de Glc-pNP (padrão interno) a uma concentração de 50 mg/1 em acetato de etilo num frasco adequado. Levou-se então a mistura à secura a 40°C com um fluxo de azoto. Introduziram-se êntão 40 Λ¹ de reagente de sililação (Tri-sil, Pierce, Rockford, IL», USA); vedou-se o frasco e manteve-se a 40°C durante 20 minutos. Depois de arrefecimento rápido, a amostra sililada estava pronta para análise por CG.

O aparelho utilizado consiste de um cromatografo de gás série 30C, um injector em- coluna (volume injectado 0,5 ^ul) e um detector de ionização de chama (Girdel, França). Enxertou-se uma película fina (0,20 pm) de uma fase silicone apoiar OV-1 (Girdel) na pa rede interna da coluna capilar (50 x 0,32 mm D.I.). Programou-se a temperatura do forno de 125 a 3O5°C a uma velo cidade de 5°c/minuto, e manteve-se a 3O5°C durante 15 minu tos. Finalmente fixou-se o detector de temperatura a 300 °C e utilizou-se hidrogénio como gás veículo a uma pressão de 120KPa.

C.G dos terpenóis

Os álcoois monoterpenos aqui estu- 35 -

dados são suficientemente voláteis para serem cromatografados tal como eles são. Ao extracto pentano que os con tém, adicionou-se o padrão interno, 4-nonanol (para sínte se, Merck, Darmstadt, RFA) na proporção de lyul de uma solução a uma concentração de 2,89 mg/ml em pentano por 50 ^ul de meio. Secou-se, então, a mistura sobre sulfato de sódio, filtrou-se através de lã de vidro e concentrou-se a um volume na gama de 100 yil. Para estes obje ctivos, removeu-se primeiro o pentano utilizando um desti lador convencional, e depois uma coluna tipo Dufton de um tamanho adequado ao volume remanescente a concentrar.

Separaram-se os constituintes do extracto concentrado utilizando uma coluna capilar (25 m x 0,32 mm de D.I.) contendo uma fase, polar de cera CP 52 CB (Chrompack, Middelburg, Holanda). A película de polietileno glicol enxertada seleccionada era espessa (1, 28 yum) para permitir a injecção de grandes volumes de amostra, eté 4 ^ul. a análise executou-se utilizando um cromatografo Fractovap série 2900 (carbo Erba, Milão, Itá lia), equipado com um detector de ionização de chama mantido a 25O°C e com um injector em-coluna. Utilizou-se hidrogénio como gás veículo a uma pressão de 60 KPa, e programou-se a temperatura do forno como se segue: isotér mico a /0°C durante 5 minutos, seguido de um aumento até 195°c a uma velocidade de 2°c/minuto e um patamar a 195°

C durante 15 minutos.

Cromatografia Liquida de Elevado Rendimento (HPLC)

As vantagens da cromatografia Liquida de Elevado Rendimento foram exploradas para isolar alguns glicosideos terpenos. Com este objectivo, re colheram-se as fracções que emergiam do sistema cromatográfico (mais especialmente na eluição dos picos A e B) durante a separação dos constituintes do extracto glicosí. dico. (Figura 10 adiante). Quinze injecções sucessivas

de 20 /ui cada permitiram isolar material suficiente para a hidrólise enzimática e executou-se a análise por CG para identificar os compostos em questão.

sistema cromatográfico é constituído pelos seguintes componentes; um cromatografo Vista 5500 equipado com um espectrofotometro de comprimento de onda varíavel VV/vísivel (Varian Assuc., Sunnyvale, CA, USA); uma válvula de injecção de 6 posições (Valco) equipada com 20 yu.1 de retorno; uma coluna de aço inoxidável (220 x 4 mm D.I.) cheia com sílica enxertada de octadecilo spheri-5 (Brownler Labs, Santa Clara, CA, USA) de tama nho de partícula pequeno (5 /um); assim como uma pré-coluna (3/ x 4 mm D.I) cheia com a mesma fase estacionária.

Executou-se a cromatografia utilizando uma fase móvel orgânica água/acetonitrilo aquoso (cromatografia de polaridade de fase inversa) e uma eluição graduada de acordo com um aumento no conteúdo de acetonitrilo de 30 a 40% (em volume) durante 10 minutos. Bombeou-se o solvente de eluição a um caudal de 1 ml/min. A detecção efectuou-se a 200 nm e 0,5 unidades de absorvância da escala completa.

1- Hidrólise Enzimática em Substractos Sintéticos

Em todos os ensaios relacionados com a hidrólise enzimática dos substractos sintéticos, utilizou-se a mesma actividade glicosidase (0,15 nkat) para cada uma das enzimas ( ©<.-arabinosidase, «X-ramnosiâase, ^-glucosidase).

A hidrólise e os protocolos de análises apresentam-se na forma de plano (Tabela 2).

Recordam-se aqui as principais abre viaturas utilizadas;

ρΝΡ	p-nitrofenol
Ara-pNP	οζ-L-arabinofuranosideo de p-nitrofenilo
Rha-pNp	^-L-ramnopiranosideo de p-nitrofenilo
Rha-Glc-pNP	«Á-L-ramnopiranosil-(1—)> 6)- P-D-glucopira nosideo de p-nitrofenilo
Rha-Glc-Ger	o(-L-ratnnopiranosil-(1 — > 6)- ^-D-glucopira nosideo de geranilo
Ara-Glc-pNP	«<-L-arabinofuranosil-(1—)> 6)- ^-D-glucopi ranosideo de p-nitrofenilo
Ara-Glc-Ner	«K-L-arabinofuranosil-(1—7 6)- f^-D-glucopi ranosideo de nerilo
Ara-Glc-Ger	o<-L-arabinofuranosil-(1—/ 6)- ^-D-glucopi ranosideo de geranilo
Glc-pNP	P-D-glucopiranosideo de p-nitro£enilo
Glc-Lin	P-D-glucopiranosideo de linalilo
Glc-Ner	P-D-glucopiranosideo de nerilo
Glc-Ger	P-D-glucopiranosideo de geranilo

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Os resultados obtidos em TLC apresentam-se na Figura 6, para a qual a legenda é como se segue:

Controlo por TLC da hidrólise enzimática de Ara-Glc-pNP (a) e Rha-Glc-pNP (b)

lã.	Ara-Glc-pNP	+	^-glucosidase
2â.	Ara-Glc-pNP		°<-arabinosidase
38.	Ara-Glc-pNP	+	e<-arabinosidase + (^-glucosidase
1§.	Rha-Glc-pNP	+	p-glucosidase
2ã.	Rha-Glc-pNP	+	o<-ramnosidase
38.	Rha-Glc-pNP	+	®<-ramnosidase + p-glucosidase

A acção da /^-glucosidase nos diferentes substratos sintéticos não dá origem a qualquer modâ f i c a ç ao.

A acção da «^-arabinosidase em Ara-Glc-pNP origina o desaparecimento deste substrato e o aparecimento de arabinose e Glc-pNP.

Do mesmo modo, a acção de ©(-ramnosidase em Rha-Glc-pNP ou Rha-Glc-Ger dá origem ao desapare cimento destes substractos e ao aparecimento de ramnose e Glc-pNP ou Glc-Ger.

Isto constitui a primeira fase da hidrólise.

A acção consecutiva de j^-glucosida se em cada um destes meios previamente incubados com ©<-arabinosidase ou °<-ramnosidase leva ao desaparecimento de Glc-Ger e Glc-pNP e ao aparecimento de glicose (segunde fase).

Relativamente às agliconas corres40 -

pondentes (pNP ou geraniol), elas libertam-se apenas depois da acção sequencial de duas glicosidases: ©(-ramnosi dase ou e<-arabinosidase, e depois ^-glucosidase.

Estes resultados mostram que a hidrólise enzimática dos glicosídeos estudada se processa bem com as duas fases atrás descritas.

2- Hidrólise Enzimática de um Extracto Glicosídico Protocolo para a Produção do Extracto Glicosídico

Obteve-se o extracto glicosídico por extracção de um mosto de uvas da variedade Moscatel de Frontignan recolhido na maturação das vinhas da Estação Experimental de Pech Rouge (INRA Gruissan, França), seguida da remoção dos terpenois e açúcares livres.

Com vista a executar um grande número de experiências, foi essencial recorrer a um abastcimento de glicosídeo que fosse consistente. Para isso o procedimento realizou-se num grande volume (80 litros) de mosto prevlamente centrifugado e tratado com sulfito (50 ppm), e executou-se a extracção do material glicosídico utilizando 80 gramas de carvão activado tradicionalmente utilizado em anologia (carvão tipo CXV; ceca S.A., Velizy-Villacoublay, França). Manteve-se a mistura agitada durante 4 horas e depois deixou-se em repouso durante a noite. Recuperou-se, então, o carvão por filtração através de filtros de celulose (porosidade 40-50 jum).

Para remover a maior parte dos açúcares também extraídos pelo carvão, lavou-se este com 4 x 150 ml de água e filtrou-se num funil BUcher. 0 controle por TLC permitiu verificar que o conteúdo em açu car diminuiu em cada fase sem eluição dos glicosídeos. Estes recuperaram-se por lavagem com 5 x 200 ml de acetona. Aqui também o controle por TLC permitiu verificar a eluição quantitativa do material glicosídico. Removeu-se a acetona por evaporação sob vácuo e absorveu-se a amostra em 40 ml de água ultra-pura. Executou-se uma purd ficação mais exaustiva do extracto glicosídico por fracciç namento numa resina orgânica Amberlite XAD- 2 (Rohm & Haa£ Co., Filadélfia, CA, USA) preparada de acordo com o protocolo seguinte: trituração e peneiração das partículas de tamanho correspondente a uma malha de abertura 175-350 /um (malha entre 80 e 40), seguidas de três lavagens num Soxhlet com metanol, acetonitrilo e éter di-etílico, por este ordem, durante 8 horas para cada solvente. 0 processo de fraccionamento, desenvolvido no laboratóire des Arfhes e des Substances Naturelles (Laboratório de Aromas e Substân cias Naturais), foi já descrito em pormenor. Neste estudo, aplicou-se duas vezes consecutivas, e incluiu as seguintes fases:

- Verteu-se uma resina# suspensa em metanol, numa coluna de vidro (35 x 1 cm) terminada por uma torneira Teflor e uma rolha de lã de vidro. Depois da deposição, a camada de resina media aproximadamente 20 cm. Passaram-se entãc através da resina várias porções de 50 ml de metanol, a, que se seguiu a lavagem com 50 ml de éter di-etílico e finalmente o equílibrio da resina utilizando 100 ml de água ultra-pura. A coluna ficou então pronta para utilização.

Passaram-se 40 ml de extracto glicosídico através da coluna a um caudal que variava entre 2 e 2,5 ml/minuto. Lavou-se então a coluna com 100 ml de água para remover açúcares residuais, e com 100 ml de pentano para eluir os terpenois livres ligados pela resina, sendo o caudal o mesmo.

- Recuperaram-se os glicosídeos por eluição utilizando 10C ml de acetato de etilo. Estudou-se a composição desta fraeção por TLC, o qual permitiu verificar a ausência de açúcares livres (nesta altura, no final do segundo fraç cionamento em XAD-2).

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Levou-se a fracção glicosídeo à secura sob vácuo e depois absorveu-se em 18 ml de água. Obteve-se assim o extracto glicosídico utilizado nas expe riências cromatograficas e enzimáticas.

Hidrólise

Os protocolos experimentais para a hidrólise enzimática nos extractos glicosídicos apresentam -se na Tabela 3.

Tabela 3 - Plano do protocolo para hidrólise enzimática do extracto qlicosídico'

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O — — 44 ”e CG

Controlou-se esta hidrólise por TLC Controle da hidrólise por TLC.

Os resultados apresentam-se na Fign ra 7: Controle por TLC da hidrólise enzimática do extrac to glicosídico.

1.	Extracto	glicosídico
2.	Extracto	glicosídico + β-glucosidase
3.	Extracto	glicosidíco + «Ç-arabinosidase
4.	Extracto	glicosídico + °<-ramnosidase
5.	Extracto	glicosídico + «<-arabinosidase + β-glucoside se
6.	Extracto	glicosídico + e(-ramnosidase + β-glucosidase

extracto glicosídico inicial apre senta uma mancha maior (R_f 0,71, N². 2 em TLC) e duas manchas menores (R_£ 0,67 e 0,79) (N² 1 e N² 3 em TLC).

A hidrólise deste extracto com β-glucosidase deu origem a uma mancha esbatida com o mesmo R_£ (0,26) gue a glicose, e reduziu a mancha maior (N² 3).

No caso da hidrólise com c4-arabinc sidase, observou-se uma redução substancial na mancha maior (N² 2), e notou-se o aparecimento de manchas com valores de R_£ (0,76, 0,79) idênticos aos dos monoglucosídeos de terpeno e com o R_£ (0,31) de arabinose, e de uma manche.

esbatida desconhecida com um R_ (0,55) menor do que o da X ramnose.

Quando se submeteu o extracto glico sídico à acção de ©(-ramnosidase, a mancha N² 1, oorrespor. de ao R_£ de Rha-Glc-Ger desapareceu e apareceu uma mancha esbatida com o R_£ dos monoglucosídeos de terpeno. Neste caso verificou-se que apenas a ramnose (R_£ 0,59) libertou monossacarídeo.

A acção consecutiva de ^-glucosida se em cada um dos meios incubados com ©<-arabinosidase ou ©ζ-ramnosidase reduziu substancialmente as manchas com R_ f de monoglucosídeos, e originou a glicose.

Contudo, uma vez que a mancha maior (N2 2) do extracto glicosídico não desapareceu completamen te depois da acção sequencial das glicosidases, recuperou-se a porção remanescente e depois submeteu-se a uma hidró lise ácida, sob as condições atrás descritas, para verificar se continha ou não terpenois. Esta hidrólise a pH 3 não deu origem a modificações (verificadas por TLC) nem libertou terpenois (verificada por CG). Por outro lado, a hidrólise completa com ácido tri-fluoro-acético 2 M levou a que esta mancha desaparecesse e se libertasse glicose, ramnose e um composto desconhecido (R^ 0,55), mas não terpenois (CG).

Demonstrou-se, assim, que a mancha que resiste à acção conjugada das glicosidases não contém glicosídeos de terpeno.

Estes ensaios TLC proporcionaram informação acerca do destino da porção carbo-hidrato dos glicosídeos durante a sua hidrólise com enzimas purificadas. Ressalta destes resultados que a hidrólise de glico sídeos de terpeno envolve uma hidrólise sequencial. 0 mecanismo desta hidrólise foi demonstrado com mais precisão por análise CG. Controle da hidrólise por C.G.

Em cada fase da hidrólise, analisa ram-se os produtos de reacção (açucares, glicosídeos de terpeno e terpenois) por C.G. Os resultados apresentam-se nas Figuras 8 e 9:

Figura 8: Controle por C.G. da hidrólise enzimática do ex tracto glicosídico»

a. Extracto glicosídico sililado

b. Extracto glicosídico + ©(-arabinosidase

c. Extracto glicosídico + «(-arabinosidase f p-glucosida se

I.S. Padrão Interno (Glc-pNP) e 2. e β>-arabinose e 6, ©(- e (^-glicose

a. Glc-Lin

b. Glc-Ner

c. Glc-Ger

A. Ara-Glc-Ner

B. Ara-Glc-Ger

Figura 9: Como Figura 8, no caso da hidrólise sequencial por ©(-ramnosidase + f^-glucosidase, 3 e 4. ©<- e |2>-ram nosidase.

extracto glicosídico inicial (sililado) não contem monossacerídeos nem monoglucosideos de terpeno (Figura 8ã).

A acção de |2>-glucosidase não modifica substancialmente o perfil deste extracto, excepto o aparecimento de glicose. Esta também observada por TLC durante o controle da hidrólise do extracto, glicosídico por esta enzima, provavelmente não teve origem na hidrólise dos precursores de terpeno, mas de outros glico sídeos.

A acção de ©(-arabinosidase ou de ©(-ramnosidase dá origem a modificações substanciais rela tivamente ao perfil do extracto glicosídico (Figuras 8b e 9b). Em particular, os dois picos maiores que se tinham identificado (pico A ⁼ Ara-Glc-Ner; pico B= Glc-Ger) desa parecem completamente depois de incubação do meio com ©(-arabinosidase, enquanto que aparece arabinose. 0 pico C, correspondente ao tempo de retenção de Rha-Glc-Ger, d/

minuiu depois da acção de o(-ramnosidase, o aparecimento de ramnose observou-se simultaneamente.

A incubação do extracto glicosídi. co com cada uma destas duas glicosidases, originou, além disso, três monoglucosideos abundantes (glucosídeos de li nalino, nerilo e geranilol), identificados por comparação com substâncias de referência. A maior parte (77%) des tes monoglucosideos de terpeno libertou-se por acção de ©(-arabinosidase, o remanescente (23%) produziu-se por ac ção de «ς-ramnosidase (Tabela 5)

Tabela 5 - Monoglucosideos de terpeno libertados por '©(-arabinosid.ase e ©ζ-ramnosidase de um extrac to glicosídico

ar abinos idase	c(-ramnos idase	% de deos	monogucosi-
Glc-Lin 10	9		19
Glc-Ner 28	S		33
Glc-Ger 39	9		48
% de mono 77 glucoside os	23		100

(1) Os resultados são expressos como uma percentagem da quantidade total de cada composto libertado pelas duas en zimas.

As quantidades de terpenóis detec tadas durante esta primeira fase da hidrólise, nomeadamen te a hidrólise do extracto glicosídico com cada uma das três glicosidases sozinhas, era desprezável.

A acção consecutiva de P-glucosã. dase nos extractos glicosídicos previamente incubados com °<-arabinosidase ou oÇ-ramnosidase (segunda fase) deu origem ao desaparecimento dos monoglucosídeos de nerilo e geranilo e a uma redução no monoglucosídeo de linanilo, e à produção de glicose (Figuras 8c e 9c) e terpenóis em grandes quantidades.

Admitiu-se que a P-glucosidase utilizada, a qual se extraiu de amêndoas doces e se sellec cionou com o objectivo de estudar a hidrólise sequencial de glicosídeos de terpeno, tinha uma baixa afinidade relativamente ao glucosídeo de linalilo, o que proporcionava uma hidrólise incompleta deste sob as condições utilizadas,

Os terpenóis, libertados mais abundantes são, geraniol, nerol e linalol, por esta ordem. Aproximadamente 80% destes terpenóis são derivados da acção conjugada de °<-arabinosidase e p»-glucosidase.

Detectaram-se também outros terpe nóis ou compostos voláteis, mas em pequenas quantidades, depois da acção sequencial das enzimas, tais como óxidos de οζ-terpinol, citronelol, lilanol (com as configurações cis e trans furano e a configuração cis pirano) e álcoois benzílicos e fenil-etílicos.

As modificações substanciais dos perfis cromatográficos observados depois da acção de <-arabinosidase no extracto glicosídico levou a uma investi gação com mais pormenor dos glicosídeos preponderantes.

Com este objectivo, recolheram-se fracções correspondentes aos picos A e B do perfil HPLC. Sililou-se uma porção aliquota e depois analisou-se por C.G. Estabeleceu-se en tão a correspondência entre os picos A e B dos dois cromatogramas de Figuras 10 e 8s,

Legenda da Figura 10;

Perfil HPLC do extracto glicosídico

A. Ara-Glc-Ner

B. Ara-Glc-Ger

Além disso, submeteu-se cada fracção à acção sequencial de ©(-arabinosidase e depois p-glv cosidase. No fim de cada fase e de acordo com o procedimento descrito, analisou-se o meio incubado por CG para_z por um lado, testar os açúcares e glucosídeos e por outro lado, os terpenóis. Os resultados apresentam-se na Tabela 4. Identificaram-se, assim, os picos a e B, respectivamente, como οζ-L-arabinofuranosil- f^-D-glucopiranosíceos de nerilo e geranilo. Em adição, verificou-se a identidade do glicosídeo de geranilo por co-injecção do extracto glicosídico com o composto sintético.

Tabela 4 - Identificação dos picos A e B recolhidos por HPLC

Compostos que aparecem depois da acção de
	°<-arabino sidase	oO-arabinosidase e depois ^-glucosidase	Compostos identificados
	Arabinose	glicose	^-L-arabinofurano-
Pico	A +	t	sil- p-D-glucopirs
	Glc-Ner	nerol	nosideo de nerilo
	arabinose	glicose	^-L-arabinof urano-
Pico	B +		sil- (^-D-glucopira
	Glc-Ger	geraniol	nosideo de geranilo

- 50 Estes resultados confirmam colec tivamente que a hidrólise enzimática de glicosídeos de terpeno de uvas envolve um mecanismo sequencial idêntico ao demonstrado nos substractos sintéticos.

3- Hidrólise Enzimática em Meio Natural

Estudou-se a hidrólise enzimática de um extracto glicosídico incorporado, por um lado, nun meio natural (mosto ou vinho seco), e, por outro lado, num meio de referência (tampão) por acção de preparações comerciais que contêm as três glicosidases exigidas.

protocolo de análises é como se segue;

Tnataram-se um sumo e um vinho de uma variedade de vinha que não continha terpenóis e glicc sideos de terpeno, mas enriquecida antecipadamente cora uma quantidade conhecida de extracto glicosídico de moscatel, com preparações comerciais de enzimas. Incubou-

ras (ver o plano do protocolo experimental adiante). Pas saram-se então através de uma coluna de Amberlite XAD-2 de acordo com o protocolo aplicado à produção do extracto glicosídico, e ensaiamento dos têrpenois por CG.

Plano do protocolo experimental + 0.5 ml I-Iemicelulase (1) ml mosto + 0.5 ml Naringinase(2)

Controle (pH 3.4; açúcares 180 g/1) + 2 ml 2% NaN₃(3) ou

Vinho branco seco (pH 3.1) + 0.5 ml Hemicelulase t 0.5 ml Naringinase t 1 ml Extracto glicosídico (4) + 2 ml NaN₃, 2% + 1 ml Extracto glicosídico

Controle ml tampão + 2 ml NaNg 2% (Citrato-fosfato 50 mM) + 0.5 ml Hemicelulase p_H 3.3 + 0.5 ml Naringinase Referência + 1 ml Extracto glicosídico + 2 ml NaN₃ 2%

(1) 0,5 ml da solução (a uma concentração de 15 mg/ml) de Hemicelulase REG-2 utilizada possuía 70 nkat de actividade oÇ-arabinosidase, 72 nkat de actividade ^-glucosidase e 9 nkat de actividade c^-ramnosidase.

(2) 0,5 ml da solução (a uma concentração de 5 mg/ml) de Naringinase utilizada possuía 78 nkat de actividade ®(ramnosidase e 0,1 nkat de actividade jS-glucosidase.

(3) Utiliza-se Na N^ para evitar o crescimento microbiano, (4) o extracto glicosídico utilizado obtém-se por passagem de um mosto de uma variedade de uvas Muscat. de Alexandrie através de Amberlite MAD-2. a quantidade de extracto gl;. cosídico (1 ml) adicionada nos ensaios corresponde à encontrada em 50 ml das uvas e variedade Muscat. de Alexandrie.

Sob condições semelhantes às encontradas na prática enológica, observou-se uma libertação de terpenóis. Esta libertação é menor no caso do mosto do que no do vinho (Tabela 6). Em termos da percentagem de aroma libertada depois de 86 horas a 25°c comparada com a quantidade libertada num meio de referência, esta vai até 11% para o mosto e 28% para o vinho. É de notar que os glicosídeos de geraniol são hidrolisados mais satisfatoriamente do que os de linalol e nerol.

Demonstrou-se que a inibição da actividade P~glucosidase pela presença de glicose em grandes quantidades no mosto podia explicar a eficiência mais baixa relativamente ao vinho.

-r

Os resultados são mais satisfatórios no caso do vinho, uma vez que é possível, tendo em consideração a preponderâncie de glicosídeos de terpeno, pelo menos, duplicar a fracção de terpenos livres.

Tabela 6 - Hidrólise de um extracto glicosídico incorpora do num mosto e num vinho por preparações comer ciais de enzimas

	Compostos cia(l) (%)	libertados	relativos	ao meio de	referên-
		Linalol	Nerol	Geraniol	Álcool Benzílico	Terpenoi.3 totais
	Mosto	9	6	15	46	11
	Vinho	14	18	49	50	28

Hidrólise Ácida

Para detectar a possível presença de glicosídeos de terpeno de estrutura desconhecida na mancha (TLC) resistente à hidrólise enzimática pelas glucosidases peurifiçadas, áplicou-se hidrólise ácida aos compostos correspondentes a esta mancha recuperados por TLC.

1) Levou-se o meio recuperado (250 pl) à secura a 40°C com um fluxo de azoto. Introduziram-se ' 250 /il de tampão citrato-fosfato 25 mM (pH 3,0) no frasco, o qual se vedou e se deixou a 100°C duran te 20 minutos. Depois de arrefecido, lavou-se o meio com pentano (5 x 250 pi). Adicionou-se padrão interno ao extracto pentano, que depois se corjcentrou e analisou por C.G.

Colocaram-se, então, 25 p.1 da

- 53 fase aquosa numa placa TLC.

2) 0 meio recuperado (250 /il), depois de se secar como atrás, tratou-se com 250 Jil de ácido tri-fluoro-acético 2M. Depois de se arrefecer, submeteu-se o meio à mesma análise que anteriormente.

Claims (1)

1. Processo para a obtenção de componentes de aromas e aromas a partir dos seus precursores de uma natureza glicosídica, caracterizado porj

   - num primeiro passo, hidrolisar-se enzimaticamente um su bstracto glicosíóico, que contém pelo menos um dos referi dos precursores, com pelo menos uma enzima escolhida de acordo com a estrutura do referido precursor, para libertar os monoglicosidos correspondentes por clivagem de uma ligação glicosídica;

   - num segundo passo, hidrolisar-se enzimaticamente o produto do primeiro passo com pelo menos um enzima diferente ou idêntico ao do primeiro passo e escolhido para libertar os componentes de aroma e aromas por clivagem da liga ção aglicona-hidrato de carbono.

   - 2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no caso em que o substracto contem somente monoglicosídico, hidrolisar-se directamente sem se passar através do primeiro passo.

   - 3§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por fazer-se contactar o substra cto glicosídico, num único passo, com o enzima ou enzimas escolhidos susceptíveis de libertar os monoglicosidos bem como aromas e/ou componentes de aromas.

   - 4 ã Processo de acordo com umas das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por se escolher co mo substracto glicosídico um material vegetal derivado de um fruto, uma planta aromática ou uma planta com flores, bem como a partir dos seus derivados ou subprodutos ou em alternativa um material vegetal originário de culturas de células in vitro.

   - 5§ Processo de acordo com a reivindi cação 4, caracterizado por se escolher o material vegetal derivado de uvas, tais como sumos de uva, vinhos e deriva dos bem como sub-produtos da vinificação de variedades de vinha aromáticas, especialmente uvas muscatel.

   - 6ã processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por se utilizar um extracto glicosídico como um substracto glicosídico.

   7ã Processo de acordo com as reivin dicações 5 e 6, simultaneamente, caracterizado por se uti lizar como extracto glicosídico, um extracto de um mosto originário de uma variedade de vinha tal como muscatel, a partir do qual se removeu anteriormente os terpenois livres e os açucares.

   - 8ã Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por se efectuar a hidrólise num meio natural.

   Processo de acordo com a reivindi cação 8, caracterizado por se utilizarem sumos e vinhos de uma variedade de vinha contendo ou não terpenóis e ter peno glicosidos como um meio natural, sendo o referido meio no caso de não conter terpenóis e terpeno glicosidos enriquecido com um extracto glicosídico como definido na reivindicação 6.

   - lo§ Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por se utilizar um substracto sintético»

   - 11§ Processo de acordo com a reivindi cação lo, caracterizado por se utilizar um substracto sin tético p-nitrofenil oÇ-L-ramnopiranosil-(1- y 6)- ^-D-glu copiranosido, geranil ©ς-L -ramnopiranosil-(1-D-glucopiranosido ou p-nitrofenil οζ-L-arabinofuranil-(1- 6)- ^-D-glucopiranosido.

   - 12§ Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 10 caracterizado por, no primeiro passo, se utilizarem dois enzimas que consistem numa -arabinosidase e numa ©(-ramnosidase e no segundo passo se utilizarem como enzima uma ©4-glucosidase.

   - 13§ processo de acordo com a reivind: cação 12, cargcterizado por se utilizar uma «<-L-arabino furanosidase e uma ©ζ-L-ramnopiranosidase, respectivamen te, como uma arabinosidase e ^-ramnosidase e por uma

   P-D-glicopiranosic.ase como P-glucosidase.

   _ 14ã _

   Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado por se obter como componentes de aromas ou aromas: terpenois como geraniol, linalol, nerol e análogos; terpeno poliois e álcoois tais como álcoois benzílico e fenil-etílico e análogos.

   - 15§ Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado por se obter outras agliconas não adoríferas como paranitrofenol.

   As requerentes declaram que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na França em 8 de Março de 1988, sob o n2. 8802961.

   Lisboa, 8 de Março de 1989

   RESUMO

   PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE COMPONENTES DE AROMAS S ARO

   ............ i ilftil I i—m···.·.····· ....................II II i m li ...... .............. I

   MAS A PARTIR DOS SEUS PRECURSORES DE UMA NATUREZA GLICOSÍDICA

   A invenção refere-se a uru processo para a obtenção de componentes de aromas e aromas a partir dos seus precursores de uma natureza glicosídica, que compreende;

   - num primeiro passo, hidrolizar-se enzimaticamente um su bstracto glicosídico, que contem pelo menos um dos referi dos precursores, com pelo menos um enzima escolhido de acordo com a estrutura do referido precursor, para libertar os monoglicosidos correspondentes por clivagem de uma ligação glicosídica;

   - num segundo passo, hidrolizar-se enzimaticamente o produto do primeiro passo com pelo menos um enzima diferente ou idêntico ao do primeiro passo e escolhido para libertar os componentes de aroma e aromas por clivagem da liga ção aglicona-hidrato de carbono.