DE69010120T2

DE69010120T2 - Verfahren zur Gewinnung von Aromabestandteilen und Aromas aus ihren Vorläufern einer glycosidischen Art und so gewonnene Aromabestandteile und Aromas.

Info

Publication number: DE69010120T2
Application number: DE69010120T
Authority: DE
Inventors: Raymond F-34980 St. Gely Du Fesc Baumes; Claude F-34000 Montpellier Bayonove; Sylvaine F-34070 Montpellier Bitteur; Jean-Marc F-34060 Montpellier Brillouet; Robert F-34000 Montpellier Cordonnier; Ziya Cite Paul F-34070 Montpellier Gunata; Claude F-34090 Montpellier Tapiero
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Gist Brocades NV
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; DSM IP Assets BV
Priority date: 1989-09-07
Filing date: 1990-09-07
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2010-09-08
Also published as: PT95246A; GR3031076T3; AU6338990A; US5985618A; DE416713T1; JPH04502863A; US5573926A; EP0416713A1; ATE107477T1; DK0416713T4; GR920300070T1; ES2027946T5; ZA907143B; WO1991003174A1; EP0416713B2; AU639024B2; PT95246B; ES2027946T3; EP0416713B1; DK0416713T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erhalten von Aromastoffkomponenten oder Aromastoffen aus ihren Vorläufern glycosidischer Natur.

Technischer Hintergrund

In manchen Rebsorten, wie Muskaten, existieren die Aromastoffverbindungen in zwei Formen, frei und gebunden. Die freie Fraktion besteht aus wohlriechenden flüchtigen Substanzen, hauptsächlich Terpenolen. Die gebundene Fraktion enthält Vorläufer von Terpenolen, insbesondere nicht wohlriechende Diglycoside, die aus α-L-Rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosiden (bezeichnet als Rha-Glc), aus α-L-Arabinofuranosyl-β-D-glucopyranosiden (bezeichnet als Ara-Glc) und aus β-D-Apiofuranosyl-β-D-glucopyranosiden (bezeichnet als Api-Glc) gebildet sind, in denen die Glucopyranose das Bindeglied zwischen dem Terpenrest (bezeichnet als Terp) und dem Disaccharid darstellt, gemäss den Formeln:
Rha(1T6)Glc-Terp
Ara(1T6)Glc-Terp
Api(1T6)Glc-Terp.
Die Aromastofffraktion in Form von Vorläufern ist meistens viel grösser als die freie Aromastofffraktion (typischerweise um einen Faktor von 3 bis 10), und sie kann hohe Konzentrationen in der Grössenordnung von einigen Milligramm pro Liter erreichen.
Wenn man zusätzlich die besonders niedrige Schwelle der Geruchswahrnehmung und die aromatische Qualität von Terpenalkoholen in Betracht zieht, gibt es in diesen Rebsorten ein äusserst wichtiges ungenutztes Aromastoffpotential.
Die Terpenglucoside, die in dem Saft vorhanden sind, können unter Verwendung handelsüblicher Enzympräparate mit einer grossen Vielfalt von Spezifikationen hydrolysiert werden. Die enzymatische Freisetzung von Terpenolen, die das freie natürliche Aroma der Frucht getreuer widerspiegelt als dasjenige, das durch thermische Hydrolyse beim pH des Saftes enthüllt wird, ist somit möglich; jedoch setzt die Kontrolle dieser Freisetzung fur eine industrielle Nutzung des Aromastoffpotentials voraus, dass die für die Hydrolyse verantwortlichen Glycosidasen definiert sind und ihr Wirkungsmechanismus aufgeklärt ist.

Hintergrund-Stand der Technik

Strauss et al. (in Parliament et al., Biogeneration of aromas, 1986, American Chemical Society, Washington, D.C., Seiten 222-239) diskutieren die Wichtigkeit von Monoterpenen in Trauben- und Weinaroma und das Ausmass, in dem diese Verbindungen zu dem Sortencharakter beitragen, der bei der Weinherstellung besonders signifikant ist.
Pisarnitskii, A.F. (Chemical Abstracts 128650c, 1971, Columbus, Ohio) offenbart eine Methode, den Weinen Düfte zu verleihen über die Anreicherung des Produktes mit Substanzen in der Maische, um die Aktivität der Maischenenzyme zu erhöhen, die für die enzymatische Synthese der in dem Produkt vorhandenen aromatischen Substanzen verantwortlich sind, und dem fertigen Produkt das gewünschte Aroma zu verleihen.
Drawert, F. et al. (J. Agric. Food Chem., 1978, Bd. 26, Nr. 3, Seiten 765-766) offenbaren das Auffinden der Monoterpene Citronellol, Linalool und Geraniol in den wohlriechenden Bestandteilen, die durch die Hefe Kluyveromyces lactis in einer aeroben submersen Kultur erzeugt werden. Durch Aenderung der Kulturbedingungen war es möglich, die Biosynthese von Citronellol in K. lactis zu beeinflussen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf einem Beweis des Mechanismus der enzymatischen Hydrolyse, welcher Mechanismus dem sequentiellen Typ angehört.
Somit ist das erfindungsgemässe Verfahren zum Erhalten von Aromastoffkomponenten und Aromastoffen aus ihren Vorläufern glycosidischer Natur dadurch gekennzeichnet, dass
- in einer ersten Stufe eine enzymatische Hydrolyse eines glycosidischen Substrats, das mindestens einen der genannten Vorläufer enthält, ausgeführt wird mit mindestens einem Enzym, das gemäss der Struktur des genannten Vorläufers gewählt ist, um die entsprechenden Monoglycoside durch Spaltung einer glycosidischen Bindung freizusetzen, mit der Bedingung, dass mindestens eine β-Apiosidase und ihr entsprechendes Apiosid bei der enzymatischen Hydrolyse zugegen sind;
- in einer zweiten Stufe eine enzymatische Hydrolyse des Produktes der ersten Stufe ausgeführt wird mit mindestens einem Enzym, das verschieden von oder identisch mit demjenigen/denjenigen der ersten Stufe ist und dazu bestimmt ist, die Aromastoffkomponenten und Aromastoffe durch Spaltung der Aglycon-Kohlenhydrat-Bindegliedbindung freizusetzen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Chromatographisches Profil von α-Rhamnosidase- und β-Glucosidaseaktivitäten.
Figur 2: Chromatographisches Profil von α-Arabinosidase-, α-Rhamnosidase- und β-Glucosidaseaktivitäten.
Figur 3: Chromatographisches Profil von α-Arabinosidase-, α-Rhamnosidase- und β-Glucosidaseaktivitäten nach DEAE-Sepharose-CL-6B-Ionenaustauschchromatographie.
Figur 4: Chromatographisches Profil von α-Arabinosidaseaktivität nach Concanavalin-A-Ultrogel- Affinitätschromatographie.
Figur 5: Chromatographisches Profil von α-Arabinosidaseaktivität als Funktion von pH und Temperatur.
Figur 6: TLC-Ueberwachung der enzymatischen Hydrolyse von synthetischen Ara-Glc-pNP- und Rha-Glc- pNP-Substraten.
Figur 7: TLC-Ueberwachung der enzymatischen Hydrolyse eines glycosidischen Extrakts.
Figur 8: Ueberwachung der enzymatischen Hydrolyse eines glycosidischen Extrakts mit α-Arabinosidase ± β-Glucosidase durch GC.
Figur 9: Ueberwachung der sequentiellen Hydrolyse eines glycosidischen Extrakts mit α-Rhamnosidase + β-Glucosidase durch GC.
Figur 10: HPLC-Chromatogramm von Terpenglycosiden.
Figur 11: GC-Chromatogramme von glycosidischen Extrakten aus dem Most von Muscat de Frontignan- Trauben (A); enzymatisch behandelt mit Hemicellulase (B); enzymatisch behandelt mit Klerzyme 200 (C).
Figur 12: GC-Chromatogramme von glycosylierten Aromafraktionen aus den Mosten von natursüssen Weinen: (A) enzymatisch behandelt; (B) nicht enzymatisch behandelt; und trockenen Weinen: (C) enzymatisch behandelt; (D) nicht enzymatisch behandelt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wird vorausgesetzt, dass "Substrat" jede beliebige Substanz bedeutet, die einen Vorläufer glycosidischer Natur einer Aromastoffkomponente oder eines Aromastoffes enthält.
Zum Beispiel kann der glycosidische Vorläufer ein pflanzliches Material sein, das von Trauben stammt, wie Traubensäfte, Weine und deren Derivate, zum Beispiel alle Getränke, die Wein, Traubensaft oder eine verwandte Substanz enthalten, sowie Nebenprodukte der Vergärung von aromatischen Rebsorten, insbesondere Muskaten. Die vier Komponenten des Enzymsystems, die für die Hydrolyse der Terpenglycoside von Trauben unter Freisetzung von Terpenolen, wohlriechenden flüchtigen Substanzen, erforderlich sind, sind nun erfindungsgemäss bekannt: eine α-Arabinosidase, eine α-Rhamnosidase und eine β-Apiosidase für die erste Stufe und β-Glucosidase für die zweite Stufe. Die Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, haben es praktisch ermöglicht, zu folgern, dass die Hydrolyse von Terpendiglycosiden nicht durch Einwirkung einer einzigen Glycosidase vor sich geht, sondern im Gegenteil durch die Einwirkung von mehreren, paarweise zusammenwirkenden gemäss dem folgenden zweistufigen sequentiellen Mechanismus:

Stufe 1:

Einwirkung einer α-Arabinosidase, einer α- Rhamnosidase und einer β-Apiosidase zur Freisetzung der entsprechenden Terpenmonoglucoside durch Spaltung an der (1T6)Glycosidbindung.

Stufe 2:

Einwirkung einer β-Glucosidase, die für die Freisetzung der Terpenole durch Spaltung der Terpene-Aglycon-Kohlenhydrat-Bindegliedbindung sorgt. Ara(1T6)Glc-Terp α-Arabinosidase Rha(1T6)Glc-Terp α-Rhamnosidase Api(1T6)Glc-Terp β-Apiosidase Glc-Terp β-Glucosidase Terpenol Stufe 1 Stufe 2
Das letzte Schlüsselenzym, nämlich die β-Glucosidase, von der die letztendliche Freisetzung der Terpenole abhängt, weist vorzugsweise eine minimale Hemmung durch Glucose, Aktivität bei sauren pH-Werten und hohe Affinität in bezug auf die Aglycone, die in den glycosidischen Substraten vorkommen, auf, um für den vorgeschlagenen Prozess eine vollständige Wirksamkeit bei ihren Anwendungen zu besitzen.
Gemäss der Erfindung wurden auch die Substrate (Ara-Glc-pNP, Rha-Glc-pNP, Api-Glc-pNP, Ara-pNP, Rha-pNP, Api-pNP, Glc-pNP) definiert, was es ermöglicht, die Aktivitäten zu messen, wobei diese Bedingungen wesentlich für die Produktion der entsprechenden Enzyme sind.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung wird exemplifiziert durch die Nutzung des Aromastoffpotentials von Trauben, wobei das primäre Pflanzenmaterial gewählt wird aus Traubensäften, Weinen und Derivaten, sowie Nebenprodukten der Vergärung von aromatischen Rebsorten, insbesondere, aber nicht ausschliesslich Muskaten.
Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Anwendung beschränkt. Tatsächlich ist der bewiesene Mechanismus ein allgemeiner Mechanismus, der zu Aromastoffkomponenten und Aromastoffen führt, die nicht notwendigerweise terpenisch sind, und der auf alle von Trauben verschiedene Pflanzenprodukte anwendbar ist: Früchte, Fruchtderivate (zum Beispiel Getränke) und Fruchtnebenprodukte; aromatische Pflanzen und blühende Pflanzen sowie Derivate und Nebenprodukte dieser Pflanzen; andere Pflanzen, wie Tee und Tabak; und sogar Pflanzenmaterial, das von in vitro-Zellkulturen stammt; unter den folgenden Bedingungen:
(a) dass diese Pflanzenprodukte in genügenden Mengen Aromastoff- oder Duftstoffvorläufer glycosidischer Natur, einschliesslich Terpenolen und Glycosiden, die von den in Trauben gefundenen verschieden sind, enthalten,
(b) dass die spezifischen Glycosidasen der Struktur der glycosidischen Vorläufer entsprechen; und
(c) dass das natürliche Medium keine Inhibitoren der angewandten Enzyme enthalten.
Als Glycoside enthaltende Früchte, die von Trauben verschieden sind und die in dem Verfahren gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden können, können unter anderem Aprikosen, Mangos, Papayas und Passionsfrucht erwähnt werden. Als blühende Pflanzen kann unter anderem die Rose erwähnt werden.
Es ist auch möglich, einen glycosidischen Extrakt als glycosidisches Substrat zu verwenden, oder die Hydrolyse kann alternativ auf einem die Vorläufer enthaltenden natürlichen Medium ausgeführt werden.
Somit wird eine grosse Anzahl von Möglichkeiten zur Ausführung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung angeboten:
- indem man auf einem natürlichen Medium, wie oben beschrieben, arbeitet, wird der gebundene Aromastoff freigesetzt, wodurch das Aroma des Produktes selbst zunimmt;
- es ist auch möglich, einen gegebenen glycosidischen Extrakt (zum Beispiel von Papaya) zu behandeln und den erhaltenen Aromastoff in ein anderes Produkt, zum Beispiel ein Getränk (Traubensaft), einzuführen;
- es ist auch möglich, einen (oder mehr) glycosidische(n) Extrakt(e) (zum Beispiel Papayaextrakt, Tresterextrakt) in ein flüssiges Substrat (zum Beispiel Traubensaft, natürliche Getränke) einzuführen und das erfindungsgemässe Verfahren anzuwenden, wodurch der Aromastoff in situ freigesetzt wird. Es ist auch möglich, zu bewerkstelligen, dass der Aromastoff später, im gewünschten Moment, in einem Nahrungsmittel, einem Getränk oder einem Duftstoff freigesetzt wird.
Der Ausdruck "Enzym" definiert hier jedes beliebige Mittel, das in der Lage ist, die entsprechende enzymatische Aktivität zu erhalten. Die in dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme können einen beliebigen Ursprung haben: aus Bakterien, aus Pilzen, aus Hefe, aus Pflanzen, aus Tieren oder synthetisch. Durch genetische Manipulierungen unter Verwendung von Wirtsmikroorganismen erzeugte Enzyme werden auch von der Erfindung umfasst.
Mikroorganismen können somit durch den Fachleuten bekannte Methoden modifiziert werden zur Erzeugung eines Enzyms oder mehrerer Enzyme, das bzw. die in dem Verfahren verwendbar sein kann bzw. können.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, insbesondere als Aromastoffkomponenten oder Aromastoffe, Terpenole, wie Geraniol, Linalool, Hydroxylinaloole, Oxide von Linalool, Nerol, Citronellol, α-Terpineol, nor-Isoprenoidverbindungen (wie Hydroxy-3-damascon, 3-Oxo-α-ionol), Terpenpolyole und Alkohole, wie Phenylethyl- und Benzylalkohol, oder dergleichen, zu erhalten.
Erfindungsgemäss ist es auch möglich, in Abhängigkeit von dem Profil des an die Vorläufer gebundenen Aromastoffes, das von demjenigen des freien Aromastoffes verschieden sein kann, oder in Abhängigkeit von der Spezifizität des verwendeten Enzyms, die Erzeugung eines neuen Aromstoffes ins Auge zu fassen.
Die Kenntnis des Mechanismus führt zu der Erzeugung von Enzymen mit neuen charakteristischen Eigenschaften und technologischen Tauglichkeiten.
Gemäss einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens entsprechend dem Fall, in dem das Substrat nur Monoglucoside enthält, wird die enzymatische Hydrolyse direkt ohne Durchlaufen der ersten Stufe ausgeführt.
In der Definition der Erfindung, wie sie oben erwähnt wurde, wurde festgestellt, dass das Verfahren eine zweistufige Hydrolyse umfasst. Jedoch ist die Erfindung in keiner Weise auf die Anwendung von zwei Stufen mit aufeinanderfolgenden Zusätzen von separaten Enzymen beschränkt. Als Variante ist es praktisch durchaus möglich, insbesondere wenn es sich um das gleiche Enzym oder die gleichen Enzyme handelt, das bzw. die die Monoglycoside und auch die Aromastoffkomponenten und Aromastoffe freisetzt bzw. freisetzen, das glycosidische Substrat in einer einzigen Stufe mit dem gewählten Enzym oder den gewählten Enzymen in Kontakt zu bringen, wobei die enzymatische Hydrolyse dann in mindestens einer Reaktionsphase vor sich geht, die zu den gewünschten Aromastoffen und/oder Aromastoffkomponenten führt. Diese Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann sich zum Beispiel als geeignet erweisen, wenn mindestens ein Mikroorganismus, der für die Erzeugung des Enzyms oder der Enzyme, das bzw. die in der Reaktion brauchbar ist bzw. sind, codiert ist, für die Reaktion mit dem glycosidischen Substrat verwendet wird. Wenn eine erste Stufe und eine zweite Stufe in der folgenden Beschreibung im Interesse der Bequemlichkeit der Beschreibung erwähnt sind, bedeutet dies einfach, dass die Hydrolysenreaktion in mehreren Phasen vor sich geht, es bedeutet aber in keiner Weise, dass diese Reaktionsphasen getrennte Zusätze von Enzymen erfordern.
Die folgenden Beispiele werden als Mittel zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung gegeben.

Experimenteller Teil

A. Substrate

Unter den verwendeten Substraten sind p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (Sigma, USA), p-Nitrophenyl- α-L-arabinofuranosid (Sigma, USA) und p-Nitrophenyl-α- L-rhamnopyranosid (Extrasynthese, Frankreich) im Handel erhältlich. Geranyl-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranosid ist ein Extrakt der medizinischen Pflanzenspezies Hypoxis acuminata. Die anderen Glycoside wurden synthetisiert: Ihre Synthese verläuft in drei Stufen, ausgehend von dem entsprechenden peracetylierten Saccharid.
Die erste Stufe besteht in der Aktivierung des anomeren Kohlenstoffs der endständigen Kohlenhydratgruppe des entsprechenden peracetylierten Saccharids durch Einführung eines Halogens, wie Chlor oder Brom, oder eines Imidats, wie Trichloracetimidat, an diesem Kohlenstoffatom.
Somit wird Hexaacetyl-α-chlorrutinosid erhalten durch Einwirkung von Zinkdichlorid und Dichlormethylmethyläther auf peracetyliertes Rutin in einem inerten Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, unter wasserfreien Bedingungen.
Tetraacetyl-α-brom-D-glucopyranosid und Hexaacetyl-α-bromrutinosid werden hergestellt durch Einwirkung von gasförmiger Bromwasserstoffsäure auf Pentaaceto-D- glucopyranose bzw. auf Heptaacetorutinose in einem inerten Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, unter wasserfreien Bedingungen.
Das Gemisch von O-(Hexaacetyl-α- und -β-rutinosyl)-trichloracetimidaten wird erhalten durch Einwirkung von Hexaacetyl-1-rutinose (erhalten durch Einwirkung von Benzylamin oder Ammoniak auf Heptaacetorutinose in einem aprotischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, Tetrahydrofuran oder Ethylether) auf Trichloracetonitril in Gegenwart einer Base, zum Beispiel Kaliumcarbonat oder Natriumhydrid, in einem aprotischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Chloroform oder Diethylether, und unter wasserfreien Bedingungen. O- [Hexaacetyl-6-O-(α-L-arabinofuranosyl)-α- und -β-D- glucopyranosyl]-trichloracetimidate werden in der gleichen Weise erhalten.
Die zweite Stufe besteht in der katalytischen nucleophilen Substitution der eingeführten austretenden Gruppe durch para-Nitrophenol, durch ein Monoterpenol oder durch einen Alkohol. Somit wird nach Reinigung durch Chromatographie auf Kieselgel eine peracetyliertes β-p-Nitrophenyl-, β-Terpenyl- oder β-Alkylglycosid erhalten.
Somit wird die Einwirkung von Monoterpenolen, wie Geraniol, Nerol, α-Terpineol oder Linalool, oder von Alkoholen, wie Benzylalkohol oder 2-Phenylethanol, auf Peracetyl-α-brom-D-glucopyranosid oder Peracetyl-α- bromrutinosid in Gegenwart von Silbercarbonat in einem aprotischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Ether, Methylenchlorid oder Chloroform, in Gegenwart von Drierite oder einem 0,4 nm-(4 Å)-Molekularsieb; oder in Gegenwart eines löslichen Katalysators, wie Mercuricyanid, in Acetonitril, in Gegenwart eines 0,4 nm-(4 Å)- Molekularsiebs ausgeführt; die Einwirkung von p-Nitrophenol auf Peracetyl-α-chlorrutinosid wird in Pyridin in Gegenwart von Silbercarbonat und Drierite erhalten; diejenige von Monoterpenolen, wie Linalool, Geraniol oder α-Terpineol, auf O-(Peracetyl-α- und -β-rutinosyl)-trichloracetimidate oder O-(Hexaacetyl-6-O-(α-L- arabinofuranosyl)-α- und -β-D-glucopyranosyl]-trichloroacetimidate wird in Gegenwart eines 0,4 nm-(4 A)-Molekularsiebs und von Bortrifluorid-etherat oder para- Toluolsulfonsäure in Methylenchlorid oder Chloroform ausgeführt.
Die Chromatographie der gewünschten Peracetyl-β- glycoside auf Kieselgel wird ausgeführt durch Eluieren mit Ether/Petrolether-, Chloroform/Ether-, Methylenchlorid/Ether- oder Ethylacetat/Petrolether-Gemischen.
Die letzte Stufe besteht aus der Entfernung der schützenden Acetylgruppen von dem Zuckerteil der gebildeten Glycoside; die Desacetylierung wird durch Umesterung in Methanol in Gegenwart eines basischen Katalysators, wie Natriummethylat, ausgeführt.
Unter den peracetylierten Sacchariden, die die Ausgangsmaterialien für diese Synthesen sind, ist nur 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-a-L- arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranose nicht im Handel erhältlich. Ihre Herstellung kann durch die oben beschriebene Synthese, ausgehend von 1,2,3,5-Tetra-O- acetyl-α,β-L-arabinofuranose und 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranose, erzielt werden. Jedoch ist es zu bevorzugen, die Reaktion durch Aktivierung der 1,2,3,5- Tetra-O-acetyl-α,β-L-arabinofuranose zu 3,5-Di-O-acetyl-1,2-O-[(1-exo- und -1-endo-cyano)-ethyliden]-β-L- arabinofuranosen unter Verwendung von Trimethylsilylcyanid in Gegenwart einer Lewis-Säure, wie Stannochlorid, und der 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranose durch Tritylierung zu 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O- trityl-β-D-glucopyranose auszuführen. Die Glycosylierungsreaktion zwischen diesen beiden Synthonen wird unter rigoros wasserfreien Bedingungen in Gegenwart von Triphenylcarboniumperchlorat als Katalysator ausgeführt.
Es ist möglich, diese Synthese auf die Herstellung von p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5- tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid anzuwenden durch Kupplung des gleichen Cyanoethyliden derivats mit p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O- trityl-β-D-glucopyranosid. Jedoch führt diese Glycosylierung nicht nur zu dem erwarteten Diholosid, sondern daneben zum Diholosid mit einer 1T4-Intersaccharidbindung: Ihre Trennung ist möglich durch Chromatographie auf Kieselgel unter Eluieren mit einem Ethylacetat/petrolether-Gemisch.

Beispiel 1

Decaacetylrutin

In einem 500 ml-Rundkolben, der mit einem Kühler mit einem Calciumchlorid-Sicherheitsrohr ausgerüstet ist, werden 25 g Rutin unter Rühren mit einem Magnetrührer zu 150 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Während das Gemisch in einem kalten Wasserbad gekühlt wird, werden dann im Verlauf von annäherungsweise 10 Minuten 100 ml Essigsäureanhydrid zugegeben, und das Rühren wird 24 Stunden lang fortgesetzt. Das Reaktionsmedium wird dann in 1,5 l eiskaltes Wasser gegossen: Das acetylierte Derivat fällt in weissen Kristallen aus. Diese Kristalle werden abfiltriert, mit Wasser und mit ein wenig Ethylether gewaschen und dann unter Vacuum in einem Exsikkator über Kieselgel getrocknet. 38,3 g werden erhalten (Ausbeute: 99%) - TLC, Kieselgel - Ether Rf = 0,22, Smp. 128-135ºC.

Beispiel 2

2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-α-D-glucopyranosylchlorid

Annäherungsweise 6 g ZnCl&sub2; werden über einem Bunsenbrenner in einem Tiegel geschmolzen. Man lässt es unter Aluminiumfolie abkühlen, und 4 g dieses ZnCl&sub2;, das grob gemahlen worden ist, werden schnell in einen 250 ml-Rundkolben gebracht, der mit einem Kühler ausgerüstet und mit einem Calciumchlorid-Sicherheitsrohr versehen ist.
Die folgenden Materialien werden dann unter Rühren mit einem Magnetrührer zugesetzt:
- 80 ml wasserfreies Chloroform, dann
- 20 g descaacetyliertes Rutin;
- schliesslich werden annäherungsweise 20 ml 1,1- Dichlormethylmethylether im Verlauf von 5 Minuten eingeführt;
- das Gemisch wird dann 2 Stunden lang auf 75 bis 77ºC gebracht.
Die Chloroformlösung wird dekantiert, und der pastenförmige Rückstand wird mit 20 ml Chloroform aus dem Kolben ausgewaschen, und dieses wird mit der Chloroformlösung vereinigt, die unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer bei 35 bis 45ºC eingedampft wird.
Der ölige gelbe Rückstand wird in 500 ml Ethylether aufgenommen, der mit eiskaltem Wasser, mit gesättigter Na&sub2;CO&sub3;-Lösung und dann wieder mit eiskaltem Wasser gewaschen wird. Die organische Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert, und die Lösung wird in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei ca. 35ºC eingeengt. Der Rückstand, der teilweise kristallisiert ist, wird in Ethylether und dann ein zweites Mal in wasserfreiem Ethanol umkristallisiert. Die erhaltenen weissen Kristalle werden unter Vakuum in einem Exsikkator über Kieselgel getrocknet.
6,3 g werden erhalten (Ausbeute - 53%) - TLC, Kieselgel-Ether Rf = 0,52, Smp. 148-150ºC.

Beispiel 3

p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O- acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranosid

In einem Erlenmeyer, der mit einem Calciumchlorid- Sicherheitsrohr und einem Magnetrührer ausgerüstet ist, werden 3 g Drierite und 1,5 g p-Nitrophenol in 50 ml wasserfreies Pyridin eingeführt. Das Gemisch wird so eine Stunde lang gerührt, und 5 g Acetochlor-α-rutinosid und 3 g frisch hergestelltes und getrocknetes Silbercarbonat werden dann zugesetzt.
Das Rühren wird im Dunkeln und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang fortgesetzt.
Das Reaktionsmedium wird filtriert, der Niederschlag wird mit ein wenig Pyridin gewaschen, und das Filtrat wird dann in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei ca. 40 bis 45ºC eingeengt. Der Rückstand wird zweimal mit 25 ml Benzol aufgenommen und in der gleichen Weise eingeengt, um die Spuren von Pyridin zu entfernen.
Der Rückstand wird wieder in 100 ml Benzol aufgenommen, und die Lösung wird mit eiskaltem Wasser, 1normaler Natriumhydroxidlösung und dann wieder mit eiskaltem Wasser gewaschen und schliesslich über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Nach Filtration wird das Filtrat in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35 bis 40ºC eingeengt. Der rötliche, pastenförmige Rückstand wird durch Chromatographie auf Kieselgel [mit einer Teilchengrösse, die dem Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 67 um bis 199 um (70 bis 230 mesh) entspricht] unter Eluieren mit Ethylether gereinigt - Rf 0,5. Die reinsten Fraktionen werden in einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die erhaltenen weissen Kristalle werden in Ethanol mit einer Konzentration von 95º umkristallisiert. Dadurch werden 1,4 g erhalten (Ausbeute = 25%) - TLC, Kieselgel-Ether Rf = 0,5, Smp. 185-187ºC.

Beispiel 4

2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-α-D-glucopyranosylbromid

1,3 g Heptaacetorutinose und 0,4 ml Essigsäureanhydrid in 20 ml Chloroform werden unter Stickstoff bei -4ºC in einen 50 ml-Rundkolben gebracht, und 3,8 ml einer Lösung von gasförmigem Bromwasserstoff in Essigsäure mit einer Konzentration von 33% werden tropfenweise zugesetzt. Das Rühren bei -4ºC wird 2 Stunden lang fortgesetzt, und das Reaktionsmedium wird dann in 50 ml eiskaltes Wasser gegossen. Die organische Phase wird abgetrennt, nachdem das Absetzen stattgefunden hat, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. Das erhaltene gelbe Oel wird ohne Reinigung in der nächsten Stufe verwendet. Jedoch ist es möglich, es zu kristallisieren, indem man es in ein wenig Ethylether aufnimmt und es in der Kälte lässt. Nach Filtration unter Stickstoff, Waschen mit ein wenig Ethylether und Petrolether und Trocknen in einem Exsikkator in der Kälte werden 310 mg weisse Kristalle erhalten (Ausbeute = 23%). Smp. 120-125ºC.

Beispiel 5

Geranyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L- rhamopyranosyl)-β-D-glucopyranosid

In einem 50 ml-Rundkolben werden die folgenden Materialien unter Stickstoff bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt:
- 665 mg Brom-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O- acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-α-D-glucopyranosid (rohes Produkt der Bromierungsreaktion);
- 1 ml Geraniol;
- 0,5 g Mercuricyanid in 10 ml Acetonitril.
Das Gemisch wird dann in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt, und der Rückstand wird in 50 ml Ethylether aufgenommen. Die Festsubstanz, die ausfällt, wird abfiltriert und mit Ethylether gespült, und das Filtrat wird in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. Der ölige Rückstand wird auf Kieselgel [mit einer Teilchengrösse entsprechend dem Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 67 um bis 199 um (70 bis 230 mesh)] chromatographiert, wobei man nacheinander mit Ethylether/Petrolether (10:90) eluiert, um das überschussige Geraniol zu entfernen, und dann mit Ethylether/Petrolether (75:25) eluiert, um das Rutinosid zu eluieren. Die Fraktionen, die das Rutinosid enthalten, werden vereinigt und bei 35ºC unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer eingeengt. 140 mg einer farblosen Paste, die sich nicht kristallisieren liess, werden erhalten (Ausbeute = 19%), wobei das Produkt rein in TLC - Kieselgel; Ether/Petrolether (3:1) Rf = 0,33 ist.

Beispiel 6

2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-D-glucopyranose

In einem 100 ml-Rundkolben wird ein Gemisch von 600 mg Heptaacetorutinose und 1,2 ml Benzylamin in 80 ml Ethylether unter Rühren mit einem Magnetrührer und unter Stickstoff 24 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen. Das Reaktionsmedium wird dann in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum eingeengt, und der ölige Rückstand wird auf einer Säule von Kieselgel [mit einer Teilchengrösse, die den Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 67 um bis 199 um (70 bis 230 mesh) entspricht] chromatographiert, wobei man mit Ethylether eluiert. Die Hexaacetylrutinose enthaltenden Fraktionen werden in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum eingeengt. 500 mg farbloses Oel werden erhalten (Ausbeute = 83%); TLC - Kieselgel - Diethylether Rf = 0,31.

Beispiel 7

O-[2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-α- und -β-D-glucopyranosyl]-trichloracetimidat

2,6 g 2,3, 4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl- α-L-rhamnopyranosyl)-D-glucopyranose, 1,6 ml Trichloracetonitril und 25 ml Methylenchlorid werden unter Stickstoff und bei Raumtemperatur in einem 100 ml- Rundkolben gemischt. 1,6 g wasserfreies Kaliumcarbonat werden dann unter Rühren mit einem Magnetrührer zugesetzt, und das Rühren wird 18 Stunden lang fortgesetzt. Das Reaktionsmedium wird dann filtriert, und der Niederschlag wird mit 10 ml Methylenchlorid gespült. Das Filtrat wird in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt, und der Rückstand wird auf einer Säule von Siliciumdioxid [von einer Teilchengrösse entsprechend dem Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 67 um bis 199 um (70 bis 230 mesh)] chromatographiert, wobei mit einem Ethylether/Methylen chlorid-Gemisch im Verhältnis 1:1 eluiert wird. Die das Imidat enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. 2,3 g eines farblosen Oels werden erhalten (Ausbeute = 71%); TLC - Kieselgel - Diethylether Rf = 0,76.

Beispiel 8

(±)-Linalyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl- α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranosid

In einem 100 ml-Rundkolben wird ein Gemisch von 550 mg (±)-Linalool, 650 mg O-[2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O- (2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-α- und -β-D- glucopyranosyl]-trichloracetimidat und 1 g 0,4 nm-(4 Å)-Molekularsieb in 3 ml Methylenchlorid unter Stickstoff bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. 22 gl einer Lösung von Bortrifluoridetherat in Methylenchlorid mit einer Konzentration von 50% werden dann zugesetzt und werden auch nach 40 Minuten Rühren mit dem Magnetrührer zugesetzt. Nach weiteren 40 Minuten Rühren werden 650 mg Natriumbicarbonat zu dem Reaktionsmedium zugegeben, das dann Volumen für Volumen mit 0,5-molarer wässriger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen wird. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. Der ölige Rückstand wird auf Kieselgel [mit einer Teilchengrösse entsprechend dem Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 67 um bis 199 um (70 bis 230 mesh)] chromatographiert, wobei man zuerst mit einem Petrolether/Diethylether-Gemisch im Verhältnis 4:1 eluiert, um das überschüssige Linalool zu entfernen, und dann mit einem Diethylether/Chloroform-Gemisch im Verhältnis 1:4 eluiert, um das acetylierte Heterosid zu eluieren. Die Fraktionen, die das letztere enthalten, werden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. 190 mg eines farblosen Oels werden erhalten (Ausbeute = 29%); TLC - Kieselgel; Diethylether/Petrolether (4:1) Rf = 0,34.

Beispiel 9

Geranyl-6-O-(α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranosid

In einem 50 ml-Erlenmeyer, der mit einem Stickstoffstrom gespült wird, werden 0,2 g Geranyl-2,3,4- tri-O-acetyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranosid unter mechanischem Rühren in 2 ml wasserfreiem Methanol gelöst.
0,3 ml einer Natriummethylatlösung (hergestellt aus 230 mg Natrium und 100 ml wasserfreiem Methanol) werden dann im Verlauf von 30 Sekunden zugesetzt, und das Rühren wird unter Stickstoff in einem Oelbad bei 68 bis 70ºC 20 Minuten lang fortgesetzt. Der Erlenmeyer wird dann in einem Wasser/Eis-Bad gekühlt, und annäherungsweise 0,2 ml feuchtes Dowex 50W x 4(H&spplus;) [mit einer Teilchengrösse entsprechend dem Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 74/147 um (100/200 mesh)] werden zugesetzt, so dass der pH-Wert der Lösung in die Region von 7 kommt. Das Harz wird dann abfiltriert, und das Filtrat wird in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 25ºC eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand wird durch Chromatographie auf einer Säule von Kieselgel 60 [mit einer Teilchengrösse entsprechend dem Durchgang durch ein Sieb mit einer Maschenöffnung von 67 um bis 199 um (70 bis 230 mesh)] gereinigt, wobei man mit einem Ethylacetat/Methanol-Gemisch im Verhältnis 3:1 eluiert. Die Fraktionen, die das Geranyl-β-rutinosid enthalten, werden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 25ºC eingeengt. 110 mg einer farblosen Paste, die sich nicht kristallisieren liess, werden erhalten, wobei das Produkt rein in TLC - Kieselgel; Ethylacetat/Methanol (3:1) Rf = 0,35 ist.

Beispiel 10

2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-α- und -b-D-glucopyranose

Man lässt gasförmiges Ammoniak 15 Minuten lang in einen 100 ml-Rundkolben perlen, der 25 ml eines Tetrahydroforan/Methanol-Gemisches im Verhältnis 7:3 enthält und in zerstossenem Eis bei 0ºC gehalten wird.
400 mg 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O- acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid werden dann zugesetzt.
Man lässt den Kolben dann auf Raumtemperatur zurückkehren, während das Rühren fortgesetzt wird.
Die Reaktion wird durch TLC (Kieselgel; Methylenchlorid/Ether, 6:4) verfolgt. Wenn kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist (nach annäherungsweise 15 Minuten), wird die Reaktion abgebrochen, und das Medium wird unter vermindertem Druck bei 40ºC zur Trockene eingeengt.
Der Rückstand wird dann auf einer Säule von Siliciumdioxid gereinigt, wobei man mit einem Methylenchlorid/Ether-Gemisch im Verhältnis 6:4 eluiert. 250 mg Produkt, das in der 1-Stellung desacetyliert ist, werden dadurch erhalten (Ausbeute: 67%). TLC - Kieselgel - Methylenchlorid/Ether (6:4); Rf = 0,36.

Beispiel 11

O-[2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-α- und -β-D-glucopyranosyl]-trichloracetimidat

250 mg 2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-α- und -β-D-glucopyranosen, 2,5 ml absolutes Methylenchlorid, 0,16 ml Trichloracetonitril und 160 mg wasserfreies Kaliumcarbonat werden in einen unter Stickstoff gehaltenen Reaktor eingeführt.
Das Medium wird 48 Stunden lang unter Rühren mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur belassen. Dass die Reaktion beendet ist, wird geprüft durch TLC (Kieselgel; Methylenchlorid/Ether, 6:4).
Das Medium wird dann mit 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgenommen und auf einer Glasfritte filtriert. Die organische Phase wird nacheinander, Volumen für Volumen, mit gesättigter wässriger NaHCO&sub3;-Lösung und mit eiskaltem Wasser gewaschen; sie wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und danach bei 35ºC unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. 264 mg eines gelblichen Oels werden dadurch erhalten (Ausbeute = 88%) - TLC - Kieselgel - Methylenchlorid/Diethylether (6:4) - Rf = 0,5.

Beispiel 12

Geranyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α- arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid

250 mg O-[2,3,4-Tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O- acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-α- und -β-D-glucopyranosyl]-trichloracetimidate, 250 gl Geraniol und 1,5 ml wasserfreies Methylenchlorid werden in einen 50 ml- Reaktor eingeführt, der unter Stickstoff gehalten wird.
Das Medium wird unter Stickstoff und unter Rühren mit einem Magnetrührer gehalten; 20 gl einer Lösung von Bortrifluoridetherat in Methylenchlorid mit einer Konzentration von 50% werden tropfenweise zugesetzt.
Nach 3 Stunden Reaktion wird durch TLC (Kieselgel, Methylenchlorid/Ether, 7:3) überprüft, dass die Reaktion beendet ist, und 50 mg Natriumbicarbonat werden zu dem Medium zugegeben. 10 ml Methylenchlorid werden zugesetzt, und das Reaktionsmedium wird Volumen für Volumen mit eiskalter 0,5-molarer Natriumbicarbonatlösung und dann mit eiskaltem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 35ºC zur Trockene gebracht. Der ölige Rückstand wird schnell auf einer Säule von Siliciumdioxid gereinigt, wobei man zuerst das überschüssige Geraniol mit einem Ether/Petrolether-Gemisch im Verhältnis 1:1 eluiert und dann das Produkt mit einem Methylenchlorid/Ether-Gemisch im Verhältnis 8:2 eluiert. 150 mg eines farblosen Oels werden dadurch erhalten (Ausbeute = 58%). TLC: Kieselgel, Methylenchlorid/Ether (8:2), Rf = 0,49.

Beispiel 13

p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-trityl-β-D-glucopyranosid

In einem 100 ml-Rundkolben werden 1,42 g p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid und 1,5 g wasserfreies Tritylchlorid in 10 ml wasserfreies Pyridin eingeführt, und der Kolben wird unter Rühren bei 40ºC im Dunkeln belassen. Die Reaktion wird durch TLC verfolgt, wobei erforderlichenfalls Tritylchlorid zugesetzt wird. Nach 24 Stunden wird der Kolben auf Raumtemperatur gebracht, und 6 ml Essigsäureanhydrid werden zugesetzt. Das Reaktionsmedium wird 48 Stunden unter Rühren gehalten, wobei die Reaktion durch TLC (Kieselgel, Ether/Petrolether, 7:3) verfolgt wird; sie wird in 500 ml eiskaltem Wasser aufgenommen und 2 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wird dann durch Celite filtriert, und das Celite wird mit Dichlormethan gespült. Die organische Phase wird nacheinander mit eiskaltem Wasser, Salzsäure mit einer Konzentration von 10%, gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung und dann eiskaltem Wasser gewaschen. Sie wird über Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. Der Rückstand wird auf einer Säule von Siliciumdioxid chromatographiert, wobei man mit einem Ether/Petrolether-Gemisch im Verhältnis 7:3 eluiert. Die das Heterosid enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum bei 35ºC eingeengt. 2,6 g eines Oels werden erhalten (Ausbeute = 83%), wobei das Produkt in TLC: Kieselgel, Ether/Petrolether (7:3), Rf = 0,33; rein ist.

Beispiel 14

1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-α,β-L-arabinofuranose

Ein Gemisch von wasserfreier L-Arabinose (10 g) und wasserfreiem Methanol (200 ml) wird mit 1,06-molarer methanolischer Salzsäure [hergestellt durch Zugabe von Acetylchlorid (4,7 ml) und wasserfreiem Methanol (63 ml) bei 0ºC] behandelt; das Gemisch wird über Nacht bei 0 bis 5ºC gerührt. Pyridin (40 ml) wird zugesetzt, um das Gemisch zu neutralisieren, das dann eingeengt wird. Der Rückstand wird mehrere Male in Pyridin aufgenommen, das durch Destillation entfernt wird, und es wird dann in 80 ml Pyridin gelöst. Essigsäureanhydrid (30 ml) wird in kaltem Zustand zugesetzt, und die Lösung wird zwei Tage lang bei Raumtemperatur belassen. Die Extraktion des Reaktionsmediums mit Ethylacetat oder Dichlormethan ergibt ein sirupöses Produkt, das dann in einem Gemisch von Essigsäure (100 ml) und Essigsäureanhydrid (25 ml) gelöst wird; 5 ml konzentrierte Schwefelsäure werden bei 0ºC zugegeben, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Die Lösung wird dann in zerstossenes Eis (150 g) eingetaucht, und das Gemisch wird 2 Stunden lang gerührt und dann mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser und dann mit wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen; der nach Einengen der organischen Phase erhaltene Rückstand wird auf einer Säule von Kieselgel chromatographiert (Eluent: Benzol/Ether-Gradient) und ergibt 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-α,β-L-arabinofuranose in Form eines Sirups (18 g, 85%), Rf = 0,46 (Eluent: Benzol).

Beispiel 15

3,5-Di-O-acetyl-1,2-O-[1-exo- und 1-endo-cyano)-ethyliden]-β-L-arabinofuranose

Wasserfreies Stannochlorid (360 mg) und Trimethylsilylcyanid (3 ml) werden zu einer Lösung von 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-α,β-L-arabinofuranose (3 g) in Acetonitril (10 ml) zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Ether verdünnt und mit wässriger Natriumbicarbonatlösung (3 x 75 ml) und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird eingeengt, und der Rückstand wird auf einer Säule (Eluent: Benzol/Ether-Gradient) chromatographiert, und ergibt das 1-exo-Cyano- (994 mg; 37%) und 1-endo-Cyano- (700 mg; 26%) Produkt. Die Kristallisation mit Ether/Pentan ergibt das 1-exo-Cyano-Isomer (35%), Smp. 66- 69ºC, [α]D-6º (C1), Rf = 0,56 (Eluent: Benzol/Ether, 3:2). Die Kristallisation mit Toluol ergibt das 1-endo- Cyano-Isomer (32%), Smp. 107-110ºC, [α]D + 51º (C1), 15 Rf = 0,37.

Beispiel 16

1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L- arabinofuranosyl)-ß-D-glucopyranose und p-Nitrophenyl- 2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid

In zwei Rundkolben, die durch ein wie eine Stimmgabel geformtes Rohr verschlossen und verbunden sind, werden einerseits (in einen der Kolben) eine Lösung von trityliertem Glucosid (0,55 mMol) und 3,5- Di-O-acetyl-1,2,-O-[1-exo- und 1-endo-cyano)-ethyliden]-β-L-arabinofuranose (0,5 mMol) in Nitromethan (2 ml) und andererseits (in den anderen Kolben) eine Lösung von Triphenylcarboniumperchlorat (0,05 mMol) in 0,2 ml Nitromethan eingeführt. Beide Lösungen werden gefriergetrocknet, und dann werden 2 ml destilliertes Benzol in jeden Kolben eingeführt, worauf die Inhalte wieder gefriergetrocknet werden; die Operation wird ein zweites Mal wiederholt; die Kolben und die Reaktionsteilnehmer werden auf diese Weise mehrere Stunden lang getrocknet. Dichlormethan (2 ml) wird in situ in jeden der beiden Kolben destilliert. Die beiden Lösungen werden dann vereinigt, und man lässt sie über Nacht bei Raumtemperatur und im Dunkeln reagieren [die Gefriertrocknung und auch die Trocknung der Reaktionsteilnehmer sowie die Destillation von Benzol und Dichlormethan über CaH&sub2; werden bei einem Druck von 0,533 Pa (4 x 10&supmin;³ mmHg)] ausgeführt. Das leuchtend gelbe Reaktionsmedium wird mit 1 ml Pyridin/Wasser (3:1) behandelt, und die entfärbte Lösung wird dann mit Chloroform (50 ml) verdünnt, mit Wasser (3 x 30 ml) gewaschen und eingeengt. Der Rückstand wird auf einer Säule von Kieselgel gereinigt, wobei man mit einem Benzol/Ether- oder Ethylacetat/Petrolether-Gradienten eluiert, und ergibt:
- aus 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O-trityl-β-D-glucopyranose: 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl- α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranose, Smp. 106,5- 108,5ºC (Ether/Pentan); TLC: Kieselgel; Benzol/Ether (3:2), Rf = 0,35.
- aus p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-trityl-β-D- glucopyranosid: p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O- (2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid; TLC: Kieselgel; Ethylacetat/Petrolether 1:1, Rf = 0,24 und p-Nitrophenyl-2,3,6-tri-O-acetyl- 4-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D- glucopyranosid; TLC: Kieselgel; Ethylacetat/Petrolether (1:1), Rf = 0,28.

Beispiel 17

Geranyl-6-O-(α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid

200 mg Geranyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri- O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid werden unter Stickstoff und unter Rühren mit einem Magnetrührer in 5 ml wasserfreiem Methanol gelöst. 0,1 ml einer methanolischen Lösung von Natriummethylat (hergestellt aus 20 mg Natrium und 10 ml Methanol) wird zugesetzt. Das Rühren wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, und die Lösung wird dann durch Zugabe von Dowex 50W x 4 (H&spplus;)-Harz neutralisiert.
Das Gemisch wird filtriert, und die Lösung wird in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird durch Chromatographie auf einer Säule von Kieselgel unter Eluieren mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch im Verhältnis 8:2 gereinigt und ergibt 105 mg Geranyl-6-O-(α-L-arabinofuranosyl)-β- D-glucopyranosid in Form eines Sirups. Ausbeute 81%, TLC: Kieselgel, Chloroform/Methanol (8:2), Rf + 0,17.

Beispiel 18

p-Nitrophenyl-6-O-(α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid

Durch Desacetylierung von p-Nitrophenyl-2,3,4- tri-O-acetyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acetyl-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucopyranosid gemäss der obigen Verfahrensweise wird p-Nitrophenyl-6-O-(α-L-arabinofuranosyl)-β- D-glucopyranosid erhalten. TLC: Kieselgel, Ethylacetat/Isopropanol/Wasser (65:30:10), Rf = 0,69.

Beispiel 19

p-Nitrophenyl-1-β-D-apiose

2 g (6,28 mMol) 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl(3')-β-D- apiose und 4 g (28,8 mMol) para-Nitrophenol in einem 100 ml-Rundkolben werden durch gemeinsames Verdampfen in Toluol getrocknet.
Dann werden 40 mg (0,2 mMol) para-Toluolsulfonsäure zugesetzt, und das Gemisch wird unter Vakuum (10&supmin;² mmHg) 50 Minuten lang auf 95ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsmedium in 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und mehrere Male mit einer gesättigten K&sub2;CO&sub3;- Lösung gewaschen.
Der ölige Rückstand wird getrocknet, eingeengt und dann durch Chromatographie auf einer Kieselgel 60- Säule (230-240 mesh) gereinigt, wobei man nacheinander mit Ethylether/Petrolether (50/50) eluiert.
- 1,4 g 2,3,5-Tri-O-acetyl(3')-O-para-nitrophenyl-1-β- D-apiose . Smp. 155-156ºC (Ausbeute: 56%) und
- 0,2 g 2,3, 5-Tri-O-acetyl(3')-O-para-nitrophenyl-1-α- D-apiose (Ausbeute: 8%) werden erhalten.
1,0 g 2,3,5-Tri-O-acetyl(3')-O-para-nitrophenyl- 1-β-D-apiose ist mittels Natriummethylat in wasserfreiein Methanol desacetyliert worden.
Nach Reinigung werden 0,65 g para-Nitrophenyl-1- β-D-apiose (Ausbeute: 95%) erhalten.

Apiofuranosylglucoside

Die allgemeine Methode, die verwendet wird, um Terpenole und Alkohole aus Apiofuranosylglucosiden zu bekommen, ist die gleiche wie diejenige, die oben für die Synthese von Rhamnoglucosiden und Arabinosylglucosiden beschrieben wurde.
Es ist möglich, diese Synthese auf die Herstellung von 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-O-(2,3,5-tri-O-acetyl(3')-β-D-apiofuranosyl)-6-β-D-glucopyranose anzuwenden durch Kuppeln der 3,5-Di-O-acetyl(3')-(endo- oder exo-cyanoethyliden)-1,2-β-D-apiofuranose und der 1,2,3,4-Tetra-O-trityl-6-β-D-glucopyranose.
Das Diholosidheptaacetat wird aus der anomeren Position der Glukose freigesetzt, in ihr Trichloracetimidatderivat übergeführt, die das Ausgangsprodukt für Kondensationen mit:
Benzylalkohol, Phenylethylalkohol, Geraniol, Nerol, (R)(S)-α-Terpineol, (R)-α-Terpineol, (R)(S)-β-Citronellol, (S)-Citronellol, (R)(S)-Linalool, (S)-Linalool sind.

Beispiel:

50 mg (0,7 mMol) Trichloracetimidat-1-[2,3,4-tri- O-acetyl-O-(2,3,5-tri-O-acetyl(3')-β-D-apiofuranosyl]- 6-O-(αβ)-D-glucopyranose) und 38 ml (8,6 mMol) (R)(S)- Linalool werden in 2 ml wasserfreiein CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und eine katalytische Menge BF&sub3;:OEt&sub2; zugesetzt. Das Reaktionsmedium wird mittels klassischer Methoden neutralisiert und extrahiert. Nach Reinigung und Einwirkung von Natriummethylat wird das Linalyldiholosid in einer Ausbeute von ca. 50% gewonnen.

B. Messung der enzymatischen Aktivitäten und Reinigung der Enzyme

1 - Messung der enzymatischen Aktivitäten

Die Glycosidaseaktivitäten werden bestimmt durch Inkubieren von 0,1 ml 4-millimolarem Substrat (Glc-pNP, Ara-pNP, Api-pNP, Rha-pNP) in einem 100-millimolaren Acetatpuffer (pH 4,2) mit 0,1 ml Enzymlösung bei 40ºC während 20 Minuten. Die Freisetzung von pNP wird abgeschätzt durch Zugabe von 0,6 ml 1-molarem Natriumcarbonat zu dem Inkubationsmedium und anschliessende Messung der optischen Dichte bei 400 nm. 1 nkat Aktivität entspricht der Freisetzung von 1 nMol pNP pro Sekunde.
Zwei Glycosidasen, α-Arabinosidase und α-Rhamnosidase, wurden aus handelsüblichen Präparaten, die komplizierte Enzymmischungen enthalten, isoliert und gereinigt.
Süssmandel-β-glucosidase (Koch-Light, Grossbritannien, Partie Nr. 2872-01), die keinerlei verunreinigende Aktivität vom Typ α-Arabinosidase, β-Apiosidase und α-Rhamnosidase zeigte (24 Stunden Inkubation bei 40ºC, pH 4,2), wurde verwendet wie sie war.
Die β-Apiosidase, die in einem handelsüblichen Enzympräparat (Klerzyme 200, Gist-brocades, Frankreich) vorhanden ist, wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

2 - Reinigung der Enzyme

2-1. Reinigung einer α-L-Rhamnopyranosidase

Die α-Rhamnosidase wurde aus Naringinase (Sigma) gereinigt, die reich an diesen Aktivitäten ist. Die β- Glucosidaseaktivitäten wurden, obgleich sie gering waren (0,1% der α-Rhamnosidaseaktivität), aber fähig zur Freisetzung von Glucose über lange Inkubationsperioden, mittels der Methode der Chromatofokussierung entfernt.

Das experimentelle Protokoll:

Reingigung von α-Rhamnosidase durch Chromatofokussierung von Naringinase auf PBE 94-Gel

50 mg Naringinase, die in 4 ml 25-millimolarem Imidazolpuffer (pH 7,4) aufgenommen waren, werden gegen den gleichen Puffer (25 ml) über Nacht (5ºC) dialysiert. Das Dialysat wird in eine Säule (1,0 x 40 cm) von Ionenaustauscher (Polybuffer exchanger PBE 94, Pharmacia, Schweden) injiziert, der mit dem gleichen Puffer äquilibriert ist. Die an dieses Gel gebundenen Proteine werden durch einen pH-Gradienten von 7,4 bis 3,7 eluiert, der während der Migration von Ampholines [Polybuffer 74 (Pharmacia), die vorher auf pH 3,7 eingestellt worden waren), bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 44 ml/h erzeugt wurde.
Nachdem der Gradient beendet ist, desorbiert das Durchleiten von 1 Mol/l NaCl in 100-millimolarem Acetatpuffer (pH 3,7) die zurückgehaltenen Proteine.
2,8 ml-Fraktionen werden gesammelt, an denen die α-Rhamnosidase- und P-Glucosidaseaktivitäten, der pH- Wert und die optische Dichte bei 280 nm gemessen werden.
Das chromatographische Profil ist in Figur 1 gezeigt, deren Legende folgendermassen ist:
α-Rhamnosidaseaktivität
β-Glucosidaseaktivität
Absorbanz bei 280 nm
pH-Gradient
Die α-Rhamnosidaseaktivitäten werden in dem pH- Gradienten eluiert, während die Gesamtheit der β-Glucosidaseaktivität bis zu pH 3,7 zurückgehalten wird (pI < 3,7) und durch Durchleiten einer 1-molaren NaCl-Lösung eluiert wird.
Diese Methode zeigt, dass Naringinase mindestens 3 (Rhamnosidase-)Isoenzyme mit isoelektrischen Punkten von pI 6,2, pI 5,7 und pI < 3,7 enthält. Das zweite (317 nkat/ml), das selbst nach mehr als 24 Stunden Inkubation bei 40ºC keine restliche β-Glucosidaseaktivität zeigt, wird für die Tests der enzymatischen Hydrolyse von natürlichen und synthetischen Glucosiden gewählt.
Die gesamte Rückgewinnungsausbeute der α-Rhamnosidaseaktivitäten beträgt annäherungsweise 62%.

2-2. Reinigung einer α-L-Arabinofuranosidase

Unter den studierten handelsüblichen Enzympräparaten erwies sich Hemicellulase REG-2 (Gist-Brocades, Frankreich) als reich an α-Arabinosidaseaktivität Nichtsdestoweniger zeigt sie wesentliche Aktivitäten des β-Glucosidase- und α-Rhamnosidasetyps. Zum Beispiel enthalten 250 mg Hemicellulase 2 327 nkat α-Arabinosidaseaktivität, 2 566 nkat β-Glucosidaseaktivität und 236 nkat α-Rhamnosidaseaktivität. Mehrere chromatographische Methoden werden nacheinander angewandt, um die α-Arabinosidase zu isolieren und reinigen.

Molekularsiebbehandlung von Hemicellulase auf Ultrogel Aca 44

Fraktionierung

Die Enzymlösung (250 mg Hemicellulase in 3 ml 100-millimolarem Citrat-Phosphat-Puffer (pH 7,2) wird gegen den gleichen Puffer (500 ml) über Nacht dialysiert (+5ºC). Das Dialysat wird dann auf eine Säule (1,6 x 100 cm) von Ultrogel Aca 44 (IBF, Frankreich) aufgebracht, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Säule wird dann mit dem obigen Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 9 ml/h eluiert. 1,2 ml-Fraktionen werden gesammelt, und die α- Arabinosidase-, β-Glucosidase- und α-Rhamnosidaseaktivitäten sowie die optische Dichte bei 280 nm werden gemessen.

Resultate

Das chromatographische Profil ist in Figur 2 gezeigt, deren Legende folgendermassen ist:
α-Arabinosidaseaktivität
β-Glucosidaseaktivität
α-Rhamnosidaseaktivität
Absorbanz bei 280 nm.
Die Molekularsiebbehandlung auf Ultrogel AcA 44 ermöglicht es, die beiden hauptsächlichen α-Arabinosidase- und β-Glucosidaseaktivitäten zu trennen. Die α- Rhamnosidaseaktivitäten werden zusammen mit den α- Arabinosidaseaktivitäten eluiert. Die Mehrheit der in der Ausgangsenzymlösung vorhandenen Proteine wird mit den α-Arabinosidaseaktivitäten eluiert.
Die Fraktion (52 ml), die den α-Arabinosidaseaktivitäten entspricht (1 750 nkat), enthält auch Spurenaktivitäten, das heisst β-Glucosidase (23,4 nkat) und α-Rhamnosidase (37,4 nkat), was 1,3% (β-Glucosidase) und 2,1% (α-Rhamnosidase), bezogen auf die α-Arabinosidaseaktivität, äquivalent ist.

Ionenaustauschchromatographie der aus der Molekularsiebbehandlung stammenden α-Arabinosidasefraktion auf DEAE-Sepharose CL-6B

Fraktionierung

Die α-arabinosidasereiche Fraktion (52 ml) wurde über Nacht (+5ºC) gegen 500 ml 25-millimolaren Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,5) dialysiert. Das Dialysat wird dann auf eine Säule (1,6 x 40 cm) von DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia), die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgebracht. Das Gel wird zuerst mit diesem Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 108 ml/h gewaschen. Die auf der Säule zurückgehaltenen Proteine werden dann durch einen linearen Gradienten von Natriumchlorid (von 0- bis 0,4-molar) in dem gleichen Puffer (Imidazol-HCl) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml/h eluiert. 4 ml-Fraktionen werden gesammelt, an denen die α-Arabinosidase-, β- Glucosidase- und α-Rhamnosidaseaktivitäten und die optische Dichte bei 280 nm gemessen werden.

Resultate

Das chromatographische Profil ist in Figur 3 gezeigt, deren Legende folgendermassen ist.
α-Arabinosidaseaktivität
β-Glucosidaseaktivität
α-Rhamnosidaseaktivität
Absorbanz bei 280 nm
Ionenstärkegradient (NaCl)
Unter diesen Bedingungen sind die drei Aktivitäten gut getrennt. Der Peak (69 ml), der unter Verwendung von 0,3-molarem NaCl eluiert wurde und der den α- Arabinosidaseaktivitäten (365 nkat) entspricht, enthält nun nur geringe β-Glucosidase- (0,43 nkat) und α-Rhamnosidase- (0,32 nkat)-Aktivitäten, die 0,1% (β-Glucosidase) und 0,08% (α-Rhamnosidase), bezogen auf die α- Arabinosidaseaktivität, äquivalent sind.
Es sollte beachtet werden, dass die α-Arabinosidasefraktion nach Beendigung dieser Stufe viel weniger Protein enthält als die Ausgangsenzymlösung.
Diese Stufe ermöglicht es, die α-Arabinosidaseaktivität annäherungsweise 14-fach zu reinigen. Da jedoch das Vorhandensein von geringen β-Glucosidase- und α-Rhamnosidaseaktivitäten die Hydrolyse von natürlichen und synthetischen Glycosiden stören kann, wurde die Reinigung durch Anwendung einer weiteren (affinitäts-) chromatographischen Methode verfeinert.

Affinitätschromatographie auf Concanavalin A-Ultrogel der α-Arabinosidasefraktion, die aus der chromatographischen Stufe auf DEAE-Sepharose CL-6B stammt

Fraktionierung

Die α-Arabinosidasefraktion (69 ml) wird in einem Dialysebeutel, der mit Sephadex G-200-Gel (Pharmacia) bedeckt ist, auf 12 ml eingeengt. Sie wird zuerst über Nacht (+5ºC) gegen einen 50-millimolaren Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 0,1 Mol/l NaCl und 0,1 mMol/l MnCl&sub2; enthält, dialysiert und dann auf ein Concanavalin A-UG- Gel (IBF, Frankreich) (1,0 x 10 cm) injiziert, das vorher mit dem obigen Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/h äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit Methyl-α-D-mannopyranosid (Serva, BRD) in dem gleichen Puffer eluiert, zuerst mit einem linearen Gradienten (0T0,15-molar) und dann isokratisch (0,15-molar). 1,5 ml-Fraktionen werden gesammelt, an denen die optische Dichte und die α-Arabinosidase-, β- Glucosidase- und α-Rhamnosidaseaktivitäten gemessen werden. Die vereinigten Fraktionen, die α-Arabinosidaseaktivitäten zeigen, werden gegen 100-millimolaren Acetatpuffer (pH 4,2) über Nacht (+4ºC) dialysiert, um das Methyl-α-D-mannopyranosid zu entfernen.

Resultate

Das chromatographische Profil ist in Figur 4 gezeigt, deren Legende folgendermassen ist:
α-Arabinosidaseaktivität
Absorbanz bei 280 nm
Methyl-α-D-mannopyranosid-Gradient
Diese Stufe hat es ermöglicht, einen grösseren Teil der Proteine und alle restlichen β-Glucosidase- und α-Rhamnosidaseaktivitäten zu entfernen, was nach Einengen der Fraktionen durch Dialyse gegen trockenes Sephadex G-200Gel verifiziert wird. Der Haupt-α-Arabinosidase-Peak (17 ml); 75 nkat) stellt 20,5% der injizierten Anfangsaktivität (365 nkat) dar. Ein Teil der Aktivität (62,5 nkat) bildet beim Eluieren mit Methyl- α-D-mannopyranosid einen Schweif und entspricht 17,1% der Anfangsaktivität. Das Enzym war fest an das Gel gebunden, und das Methyl-α-D-mannopyranosid ermöglichte es nur, 37,6% der Anfangsaktivität zu eluieren (ähnliche Resultate werden für andere Enzyme beobachtet).
Als Ergebnis dieser Endstufe ist die α-Arabinosidaseaktivität annäherungsweise 27-fach gereinigt. Die in den Hydrolysetests verwendete Enzymlösung enthält 29,9 nkat/ml Aktivität.
Die numerischen Resultate, die den verschiedenen Stufen während der Reinigung von α-Arabinosidase aus Hemicellulase entsprechen, sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 - Reinigung von α-Arabinosidase aus Hemicellulase REG-2 Stufe Volumen (ml) Gesamtaktivität (nkat) Aktivitätsausbeute (%) Gesamtproteine (1) (mg) Proteinausbeute (%) Spezifische Aktivität (nkat mg&supmin;¹) Reinigungsfaktor Rohe Hemicellulase (250 mg) Sieben auf Ultrogel AcA 44 Ionenaustausch auf DEAE-Sepharose CL-6B Affinität auf Concanavalin A-Ultrogel (1) Die Proteine werden gemäss Lowry et al. (1951) "Protein measurement with the Folin phenol reagent", J. Biochem. 193 Seiten 265-275, analysiert.

Eigenschaften der gereinigten α-Arabinosidase pH-Optimum

Die Enzymlösung wird in Gegenwart ihres Substrats (Ara-pNP) in Universalpuffer (vom Typ Britton und Robinson) mit einem von 3,0 bis 7,0 variierenden pH inkubiert. Die Aktivitätsmessungen werden bei den verschiedenen Inkubations-pH-Werten unter den am Beginn dieses Abschnitts A beschriebenen Bedingungen ausgeführt. Die restliche Aktivität wird als Funktion des pH in Figur Sa (Kurven ) gezeigt.
Die α-Arabinosidaseaktivität ist um pH 3,7 bis 4,0 maximal.

Stabilität der Aktivität als Funktion des pH

Die Enzymlösung wird 50 Minuten lang bei 60ºC in einem Universalpuffer inkubiert, dessen pH von 3,0 bis 6,5 variiert. Die Proben werden dann 5 Stunden lang (+5ºC) gegen 1 l 100-millimolaren Acetatpuffer (pH 4,2) dialysiert. Die gemessene restliche Aktivität ist in Figur 5a (Kurve ) gezeigt.
Die α-Arabinosidaseaktivität ist zwischen pH 3,8 und 4,9 verhältnismässig stabil. diese Stabilität nimmt bei pH-Werten unter 3,5 und über 5,5 schnell ab.

Temperaturoptimum

Die α-Arabinosidaseaktivität wird nach Inkubation des Reaktionsmediums bei verschiedenen Temperaturen, die von 5ºC bis 80ºC variieren, bestimmt. Die relative Aktivität als Funktion der Inkubationstemperatur ist in Figur 5b (Kurve ) gezeigt.
Die Aktivität ist maximal bei 60ºC.

Thermische Stabilität

Die Enzymlösung wird 30 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen (von 5ºC bis 80ºC) in 100- millimolarem Acetatpuffer (pH 4,2) gehalten: Die restliche Aktivität wird dann gemessen, und die Resultate sind in Figur 5b (Kurve ) gezeigt.
Die α-Arabinosidaseaktivität ist stabil bis 60ºC, und über dieser Temperatur nimmt die Stabilität abrupt ab. Sie ist nach einer Behandlung bei 70ºC während 30 Minuten fast vollständig inaktiviert.

C. Enzymatische Hydrolysen

Die separate oder sequentielle Einwirkung von vier Enzymen, einer α-L-Arabinofuranosidase (E.C.3.2.1.55, bezeichnet als α-Arabinosidase), einer α-L-Rhamnopyranosidase (E.C.3.2.1.40, bezeichnet als α- Rhamnosidase), einer β-D-Apiofuranosidase (bezeichnet als β-Apiosidase) und einer β-D-Glucopyranosidase (E.C.3.2.1.21, bezeichnet als β-Glucosidase), wurde auf verschiedenen glycosidischen Substraten studiert. Die letzteren sind einerseits p-Nitrophenyl- oder Geranyl- α-L-rhamnopyranosyl-(1T6)-β-D-glucopyranoside (bezeichnet als Rha-Glc-pNP oder Rha-Glc-Ger), Geranyl-β- D-apiofuranosyl-(1T6)-β-D-glucopyranosid (bezeichnet als Api-Glc-Ger) und p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosyl-(1T6)-β-D-glucopyranosid (bezeichnet als Ara-Glc-pNP) und andererseits ein glycosidischer Extrakt, der aus einem Muskatmost gereinigt worden ist.
Es sollte beachtet werden, dass die vier synthetischen Glycoside, die studiert wurden, die gleichen Strukturen in bezug auf ihren Kohlenhydratteil haben wie die Traubenterpenglycoside, aber sich davon in ihrem Aglycon unterscheiden, das für drei davon p-Nitrophenol (pNP) ist.
Die enzymatische Hydrolyse wird durch Dünnschichtchromatographie (TLC) und durch Gaschromatographie (GC) verfolgt.

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Die Dünnschichtadsorptionschromatographie wurde auf Stücken von Aluminiumfolie ausgeführt, die mit einer dünnen Schicht (0,2 mm) aus Kieselgel (5553 Silica Gel 60 ohne Fluoreszenzindikator, Merck) bedeckt war. Ein Ethylacetat/Isopropanol/Wassergemisch (Volumenverhältnis 65:30:10) wurde als Migrationslösungsmittel verwendet.
Die Zucker und die Glycoside werden mittels des folgenden Gemisches, das unmittelbar vor der Verwendung hergestellt wird, sichtbar gemacht: 0,2% Naphthoresorcin in Ethanol/konzentrierter Schwefelsäure (Volumenverhältnis 19:1). Auf die Anwendung dieses Sichtbarmachungsmittels folgt das Trocknen der Platten im Ofen (105ºC) während 15 Minuten. Abgesehen von ihrer Migrationsdistanz unterscheiden sich die verschiedenen Verbindungen auch durch ihre Farbe. Die Glycoside sind purpurrot, die Arabinoside sind bläulich, die Apioside sind grün, Rhamnose grünlichrosa, Arabinose blau, Apiose grün und Glucose rosa.
Ueberdies ermöglichte es die TLC, den durch die Enzyme nicht hydrolysierten Teil des glycosidischen Extraktes zurückzugewinnen. Die Zone der chromatographischen Platte, wo der entsprechende Fleck lokalisiert ist, wurde abgekratzt, das Kieselgel gewonnen und in 50 ml Methanol suspendiert. Nachdem die Suspension über Nacht unter gelindem Rühren gelassen worden ist, wird die Suspension auf einen Büchnertrichter filtriert, und das Gel wird mit 3 x 10 ml Methanol gewaschen. Die organischen Eluate werden vereinigt, unter Vakuum bei 40ºC zur Trockene gebracht und dann in 500 gl ultrareinem Wasser aufgenommen. Die dadurch erhaltene wässrige Probe ist dann bereit für die Säurehydrolyse.

Gaschromatographie (GC)

Diese Technik wurde verwendet, um sowohl die Zucker als auch die Terpenglycoside und auch die freien Terpenole zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene chromatographische Systeme verwendet.

GC der Glycoside

Glycoside und Zucker sind nichtflüchtige Verbindungen und eignen sich daher als solche nicht für eine Analyse durch GC. Es ist wesentlich, sie mit Hilfe eines ausgewählten Reagenzes in flüchtige Verbindungen überzuführen. Daher wurden Trimethylsilylderivate gemäss folgendem Protokoll gebildet:
40 ul glycosidischer Extrakt und 60 ul einer Lösung von Glc-pNP (innerer Standard) mit einer Konzentration von 50 mg/l in Ethylacetat werden in einen geeigneten Kolben eingeführt. Das Gemisch wird mit einem Stickstoffstrom bei 40ºC zur Trockene gebracht. 40 ul des Silylierungsreagenzes (Tri-sil, Pierce, Rockford, IL., USA) werden dann eingeführt; der Kolben wird dicht verschlossen und 20 Minuten lang auf 40ºC gehalten. Nach schnellem Abkühlen ist die silylierte Probe dann für die Analyse durch GC bereit.
Der verwendete Apparat besteht aus einem Series 3OC-Gaschromatographen, einem "on-column"-Injektor (injiziertes Volumen 0,5 ul) und einem Flammenionisationsdetektor (Girdel, Frankreich). Ein dünner Film (0,20 um) einer apolaren OV-1 (Girdel)-Silikonphase wird auf die innere Wandung der Kapillarsäule (50 x 0,32 mm I.D.) gepfropft. Die Ofentemperatur wird programmiert von 125 bis 305ºC mit einer Geschwindigkeit von 5ºC/Minute, dann 15 Minuten lang auf 305ºC gehalten. Schliesslich wird die Detektortemperatur auf 300ºC eingestellt, und Wasserstoff wird als Trägergas bei einem Druck von 120 kPa verwendet.

GC der Terpenole

Die hier studierten Monoterpenalkohole sind genügend flüchtig, um wie sie sind chromatographiert zu werden. Zu dem sie enthaltenden Pentanextrakt wird der innere Standard, 4-Nonanol (zur Synthese, Merck, Darmstadt, BRD) im Verhältnis von 1 ul einer Lösung bei einer Konzentration von 2,89 mg/ml in Pentan pro 50 ul Medium zugesetzt. Das Gemisch wird dann über Natriumsulfat getrocknet, durch Glaswolle filtriert und dann auf ein Volumen im Bereich von 100 ul eingeengt. Zu diesem Zweck wird das Pentan zuerst unter Verwendung einer herkömmlichen Destillationsapparatur und dann einer Säule vom Dufton-Typ mit einer Grösse, die an das Volumen angepasst ist, das noch einzuengen bleibt, entfernt.
Die Bestandteile des eingeengten Extraktes werden unter Verwendung einer Kapillarsäule (25 m x 0,32 mm I.D.), die als polare Phase ein CP wax 52 CB (Chrompack, Middelburg, Niederlande) enthält, getrennt. Der aufgepfropfte Polyethylenglycolfilm wurde dick gewählt (1,28 um), um die Injektion von grossen Probenvolumen bis zu 4 ul zu erlauben. Die Analyse wird ausgeführt unter Verwendung eines Fractovap Series 2900-Chromatographen (Carlo Erba, Mailand, Italien), der mit einem auf 250ºC gehaltenen Flammenionisationsdetektor und einem "on-column" Injektor versehen ist. Wasserstoff wurde als Trägergas bei einem Druck von 60 kPa verwendet, und die Ofentemperatur wurde folgendermassen programmiert: isothermisch bei 70ºC während 5 Minuten, gefolgt von einem Anstieg auf 195ºC mit einer Geschwindigkeit von 2ºC/Minute und einem Plateau bei 195ºC während 15 Minuten.

Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

Die Vorteile der Hochleistungsflüssigchromatographie wurden ausgenützt, um einige Terpenglycoside zu isolieren. Zu diesem Zweck wurden Fraktionen gesammelt, wie sie aus dem chromatographischen System (insbesondere nach Eluierung der Peaks A und B) während der Trennung der Bestandteile des glycosidischen Extrakts austraten (Figur 10 unten). Fünfzehn aufeinanderfolgende Injektionen von je 20 ul ermöglichten es, genügend Material für die enzymatischen Hydrolysen und die Analysen durch GC, die auszuführen waren, um die fraglichen Verbindungen zu identifizieren, zu isolieren.
Das chromatographische System besteht aus den folgenden Komponenten: einem Vista 5500-Chromatographen, der versehen ist mit einem UV/Sichtbar-Spektrophotometer mit variabler Wellenlänge (Varian Assoc., Sunnyvale, CA, USA); einem Sechsweg-Einspritzventil (Valco), das mit einer 20 ul-Oese versehen ist; eine Säule aus rostfreiem Stahl (220 x 4 mm I.D.), die gefüllt ist mit Spheri-5 (Brownlee Labs., Santa Clara, CA, USA), mit Octadecyl gepfropftem Siliciumdioxid von kleiner Teilchengrösse (5 um); sowie einer Vorsäule (37 x 4 min I.D.), die mit der gleichen stationären Phase gefüllt ist.
Die Chromatographie wird ausgeführt unter Verwendung von Wasser/Acetonitril als wässrig-organische mobile Phase (Umkehrphasen-Polaritätschromatographie) und einer Eluierung, die gemäss einer Zunahme an Acetonitrilgehalt von 30 bis 40 Vol.-% im Verlauf von 10 Minuten abgestuft ist. Das Eluierungslösungsmittel wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Minute gepumpt. Der Nachweis wird ausgeführt bei 200 nm und 0,5 Absorbanzeinheiten Vollausschlag.

1 - ENZYMATISCHE HYDROLYSEN AUF SYNTHETISCHEN SUBSTRATEN

In allen Tests, die sich auf die enzymatische Hydrolyse der synthetischen Substrate beziehen, wird für jedes der Enzyme (α-Arabinosidase, β-Apiosidase, α- Rhamnosidase, β-Glucosidase) die gleiche Glycosidaseaktivität (0,15 nkat) verwendet.
Die Hydrolysen- und Analysenprotokolle werden in Planform wiedergegeben (Tabelle 2).
Die hauptsächlichen Abkürzungen, die verwendet werden, werden hier nochmals in Erinnerung gerufen:
pNP p-Nitrophenol
Ara-pNP p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid
Rha-pNP p-Nitrophenyl-α-L-rhamnopyranosid
Api-pNP p-Nitrophenyl-β-D-apiofuranosid
Rha-Glc-pNP p-Nitrophenyl-α-L-rhamnopyranosyl- (1T6)-β-D-glucopyranosid
Rha-Glc-Ger Geranyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1T6)- β-D-glucopyranosid
Ara-Glc-pNP p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosyl- (1T6)-β-D-glucopyranosid
Ara-Glc-Ner Neryl-α-L-arabinofuranosyl-(1T6)-β- D-glucopyranosid
Ara-Glc-Ger Geranyl-α-L-arabinofuranosyl-(1T6)- β-D-glucopyranosid
Api-Glc-Ger Geranyl-β-D-apiofuranosyl-(1T6)- β-D-glucopyranosid
Glc-pNP p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid
Glc-Lin Linalyl-β-D-glucopyranosid
Glc-Ner Neryl-β-D-glucopyranosid
Glc-Ger Geranyl-β-D-glucopyranosid Tabelle 2 - Plan des Protokolls für die enzymatische Hydrolyse der synthetischen Substrate* Stufe 200 ul 4-millimolares Ara-Glc-pNP in 100-millimolarem Acetatpuffer (pH 4,2) 200 ul Rha-Glc-pNP (4-millimolar) oder Rha-Glc-Ger (Lösung nicht titriert) in 100-millimolarem Acetatpuffer (pH 4,2) Zusatz von entweder 50 ul einer Lösung von α-Arabinosidase (0,15 nkat) (TEST I) oder 50 ul einer Lösung von β-Glucosidase (0,15 nkat) (TEST II) Zusatz von entweder 50 ul einer Lösung von α-Rhamnosidase (0,15 nkat) (TEST III) oder 50 ul einer Lösung von β-Glucosidase (0,15 nkat) (TEST IV) Inkubation 40ºC, 90 min dann 12ul T TLC 30 ul T pNP, freigesetzt Inkubation 40ºC, 90 min dann Extraktion mit Pentan (5 x 250 ul) T GC 12ul T TLC 30 ul T pNP, freigesetzt Zusatz von 50 ul einer Lösung von β-Glucosidase (0,15 nkat) zu TEST I Reinkubation 40ºC, 90min, dann 15ul T TLC 36 ul T pNP, freigesetzt Zusatz von 50 ul einer Lösung von β-Glucosidase (0,15 nkat) zu TEST I Reinkubation 40ºC, 90min, dann Extraktion mit Pentan 15ul T TLC 36 ul T pNP, freigesetzt *Die Kontrollen werden unter den gleichen bedingungen in Gegenwart der inaktivierten Enzyme ausgeführt (95ºC, 30 Minuten)
Die bei der TLC erhaltenen Resultate sind in Figur 6 gezeigt, deren Legende folgendermassen ist:

Ueberwachung der enzymatischen Hydrolyse von Ara-Glc- pNP (a), Rha-Glc-pNP (b) und Api-Glc-Ger durch TLC

1a. Ara-Glc-pNP + β-Glucosidase
2a. Ara-Glc-pNP + α-Arabinosidase
3a. Ara-Glc-pNP + α-Arabinosidase + β-Glucosidase
1b. Rha-Glc-pNP + β-Glucosidase
2b. Rha-Glc-pNP + α-Rhamnosidase
3b. Rha-Glc-pNP + α-Rhamnosidase + β-Glucosidase
Die Einwirkung von β-Glucosidase auf die verschiedenen synthetischen Substrate ruft keine Modifizierung hervor.
Die Einwirkung der α-Arabinosidase auf Ara-Glc- pNP verursacht das Verschwinden dieses Substrats und das Auftreten von Arabinose und Glc-pNP.
In ähnlicher Weise ruft die Einwirkung von α- Rhamnosidase auf Rha-Glc-pNP oder Rha-Glc-Ger das Verschwinden dieser Substrate und das Auftreten von Rhamnose und Glc-pNP oder Glc-Ger hervor.
Dies stellt die erste Stufe der Hydrolyse dar.
Die aufeinanderfolgende Einwirkung von β-Glucosidase auf jedes dieser Medien, die vorher mit α-Arabinosidase oder α-Rhamnosidase inkubiert worden sind, führt zum Verschwinden von Glc-Ger und Glc-pNP und zum Auftreten von Glucose (zweite Stufe).
Was die entsprechenden Aglycone (pNP oder Geraniol) angeht, so werden sie nur nach der sequentiellen Einwirkung beider Glycosidasen freigesetzt: α-Rhamnosidase oder α-Arabinosidase und dann β-Glucosidase.
In einem anderen Aspekt führt die Einwirkung der β-Apiosidase (vorhanden in Klerzyme 200) auf Api-Glc-Ger zum Verschwinden des Substrats und zum Auftreten von Apiose und Glucose.
Diese Resultate zeigen, dass die enzymatische Hydrolyse der studierten Glycoside mit den beiden oben beschriebenen Stufen gut vor sich geht.

2 - ENZYMATISCHE HYDROLYSE EINES GLYCOSIDISCHEN EXTRAKTS

Protokoll für die Produktion des glycosidischen Extrakts

Der glycosidische Extrakt wurde erhalten durch Extraktion eines Mostes von Trauben der Sorte Muscat de Frontignan, die im Zeitpunkt der Reife von den Weinstöcken der Station Experimentale de Pech Rouge (INRA Gruissan, Frankreich) geerntet worden waren, gefolgt von Entfernung der freien Terpenole und Zucker.
Im Hinblick auf die grosse Anzahl von Experimenten, die auszuführen waren, war es wesentlich, Zugriff auf einen Glycosidvorrat zu haben, der gleichbleibend war. Zu diesem Zweck wurde die Prozedur mit einem grossen Volumen (80 Liter) von vorher zentrifugiertem und mit Sulfit (50 ppm) behandeltem Most zu haben, und die Extraktion des glycosidischen Materials wurde unter Verwendung von 80 Gramm Aktivkohle ausgeführt, die traditionell in der Oenologie verwendet wird (Aktivkohle Typ CXV; Ceca S.A., Velizy-Villacoublay, Frankreich). Das Gemisch wurde 4 Stunden lang unter Rühren gehalten und dann über Nacht stehen gelassen. Die Aktivkohle wurde dann durch Filtration durch Cellulosefilter (Porosität 40-50 um) zurückgewonnen.
Um den grössten Teil der Zucker, die auch durch die Aktivkohle extrahiert worden waren, zu entfernen, wurde die letztere mit 4 x 150 ml Wasser gewaschen und auf einem Büchnertrichter filtriert. Die Ueberwachung durch TLC ermöglichte es zu verifizieren, dass der Zuckergehalt in jeder Stufe abnahm, ohne dass eine Eluierung der Glycoside stattfand. Die letzteren wurden dann durch Waschen mit 5 x 200 ml Aceton gewonnen. Auch hier ermöglichte es die Ueberwachung durch TLC, dass die quantitative Eluierung des glycosidischen Materials überprüft werden konnte. Das Aceton wurde durch Verdampfung unter Vakuum entfernt, und die Probe wurde in 40 ml ultrareinem Wasser aufgenommen. Eine erschöpfendere Reinigung des glycosidischen Extraktes wurde dann ausgeführt durch Fraktionierung auf dem organischen Harz Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, CA, USA), das gemäss dem folgenden Protokoll vorbereitet worden war: Mahlen und Sieben der Teilchen von einer Grösse, die einem Sieb mit einer Maschenöffnung von 175 bis 350 um (zwischen 80 und 40 mesh) entsprach, gefolgt von drei Waschungen in einem Soxhlet mit Methanol, Acetonitril und Diethylether in der angegebenen Reihenfolge während 8 Stunden für jedes Lösungsmittel. Der Fraktionierungsprozess, der bei dem Laboratoire des Arômes et des Substances Naturelles (Aromas and Natural Substances Laboratory) entwickelt worden war, ist bereits im einzelnen beschrieben worden. In dieser Studie wurde er zweimal nacheinander angewandt und umfasste die folgenden Stufen:
- Ein in Methanol suspendiertes Harz wird in eine Glassäule (35 x 1 cm) gegossen, die in einem Teflon-Hahn und einem Glaswollpfropfen endet. Nach dem Absetzen misst die Harzschicht annäherungsweise 20 cm. Mehrere 50 ml-Portionen Methanol werden dann hindurchgeleitet, gefolgt von Waschen mit 50 ml Diethylether und schliesslich Aequilibrierung des Harzes unter Verwendung von 100 ml ultrareinem Wasser. Die Säule ist dann gebrauchsfertig.
- Die 40 ml glycosidischer Extrakt werden mit einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 2 und 2,5 ml/Minute durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit 100 ml Wasser gewaschen, um restliche Zucker zu entfernen, und mit 100 ml Pentan gewaschen, um die freien, durch das Harz gebundenen Terpenole zu eluieren, wobei die Strömungsgeschwindigkeit gleich wie oben ist.
- Die Glycoside werden dann durch Eluieren unter Verwendung von 100 ml Ethylacetat gewonnen. Die Zusammensetzung dieser Fraktion wird durch TLC studiert, was es ermöglicht, die Abwesenheit von freien Zuckern zu verifizieren (in diesem Fall am Ende der zweiten Fraktionierung auf XAD-2).
Die Glycosidfraktion wurde unter Vakuum zur Trokkene gebracht und dann in 18 ml Wasser aufgenommen. Der glycosidische Extrakt, der in den chromatographischen und enzymatischen Experimenten verwendet wurde, wurde dadurch erhalten.

Hydrolyse

Die experimentellen Protokolle für die enzymatische Hydrolyse des glycosidischen Extraktes sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 - Plan des Protokolls für die enzymatische Hydrolyse der glycosidischen Extrakts* Stufe 200 ul glycosidischer extrakt** Zusatz von entweder 50 ul einer Lösung von α-Arabinosidase (0,15 nkat) (TEST I) oder 50 ul einer Lösung von α-Rhamnosidase (0,15 nkat) (TEST II) oder 50 ul einer Lösung von β-Glucosidase (0,15 nkat) (TEST III) Inkubation 40ºC, 16 h dann Extraktion mit Pentan (5 x 250 ul) T GC 50 ul wässrige Phase Silylierung T GC 12 ul wässrige Phase T TLC Zusatz von 50 ul einer Lösung von β-Glucosidase (0,15 nkat) zu TESTS I und II Reinkubation 40ºC, 16 h dann Extraktion mit Pentan (5 x 250 ul) T GC 65ul wässrige Phase T Silylierung T GC 15ul wässrige Phase T TLC *Die Kontrollen werden unter den gleichen Bedingungen in gegenwart der inaktivierten Enzyme ausgeführt (95ºC, 30 Minuten) **Vor der enzymatischen Hydrolyse wird der glycosidische Extrakt wieder mehrmals mit Pentan gewaschen, um Spuren von Terpenolen zu entfernen
Diese Hydrolyse wird durch TLC und GC überwacht. Ueberwachung der Hydrolyse durch TLC
Die Resultate sind in Figur 7 gezeigt:
Ueberwachung der enzymatischen Hydrolyse des glycosidischen Extraktes durch TLC.
1. Glycosidischer Extrakt
2. Glycosidischer Extrakt + β-Glucosidase
3. Glycosidischer Extrakt + α-Arabinosidase
4. Glycosidischer Extrakt + α-Rhamnosidase
5. Glycosidischer Extrakt + α-Arabinosidase + β-Glucosidase
6. Glycosidischer Extrakt + α-Rhamnosidase + β-Glucosidase
Der glycosidische Ausgangsextrakt zeigt einen Hauptfleck (Rf 0,71, No. 2 auf TLC) und zwei kleinere Flecken (Rf 0,67 und 0,79, No. 1 und No. 3 auf TLC).
Die Hydrolyse dieses Extraktes mit β-Glucosidase ruft einen schwachen Fleck hervor, der den gleichen Rf (0,26) wie Glucose hat, und verringert den grösseren Fleck (No. 3).
Im Falle der Hydrolyse mit α-Arabinosidase wurde eine wesentliche Verringerung des Hauptflecks (No. 2) beobachtet, und das Auftreten von Flecken mit Rf-Werten (0,76, 0,79), die identisch mit denjenigen der Terpenmonoglucoside und mit dem Rf (0,31) von Arabinose sind, und eines schwachen unbekannten Flecks mit einem Rf (0,55), der kleiner als derjenige von Rhamnose ist, bemerkt.
Wenn der glycosidische Extrakt der Einwirkung von α-Rhamnosidase unterworfen wird, verschwindet der Fleck No. 1, der dem Rf von Rha-Glc-Ger entspricht, und ein schwacher Fleck mit dem Rf der Terpenmonoglucoside tritt auf. In diesem Falle ist als freigesetztes Monosaccharid nur Rhamnose (Rf 0,59) zu finden.
Die aufeinanderfolgende Einwirkung von β-Glucosidase auf jedes der Medien, die mit entweder α-Arabinosidase oder α-Rhamnosidase inkubiert worden sind, verringert die Flecken mit dem Rf von Monoglucosiden wesentlich und führt zu Glucosebildung.
Da jedoch der Hauptfleck (No. 2) des glycosidischen Extraktes nach der sequentiellen Einwirkung der Glycosidasen nicht vollständig verschwand, wurde der verbleibende Teil gewonnen und dann einer sauren Hydrolyse unter den unten beschriebenen Bedingungen unterworfen. Seine Hydrolyse bei pH 3,0 verursachte ebenfalls keine Modifizierung (verifiziert durch TLC). Andererseits verursachte die vollständige Hydrolyse mit 2-molarer Trifluoressigsäure, das dieser Fleck verschwand, und setzte Glucose, Rhamnose und eine unbekannte Verbindung (Rf 0,55) frei.
Diese TLC-Tests lieferten Information über das Schicksal des Kohlenhydratteils der Glycoside während ihrer Hydrolyse mit gereinigten Enzymen. Es geht aus diesen Resultaten hervor, dass die Hydrolyse von Terpenglucosiden eine sequentielle Hydrolyse umfasst. Der Mechanismus dieser Hydrolyse wurde genauer durch GC- Analyse bewiesen.
Ueberwachung der Hydrolyse durch GC
In jedem Stadium der Hydrolyse werden die Reaktionsprodukte (Zucker, Terpenglycoside und Terpenole) durch GC analysiert. Die Resultate sind in den Figuren 8 und 9 gezeigt:

Figur 8: Ueberwachung der enzymatischen Hydrolyse des glycosidischen Extraktes durch GC

a. Silylierter glycosidischer Extrakt
b. Glycosidischer Extrakt + α-Arabinosidase
c. Glycosidischer Extrakt + α-Arabinosidase + β-Glucosidase
I.S. Innerer Standard (Glc-pNP)
1 und 2. α- und β-Arabinose
5 und 6. α- und β-Glucose
a. Glc-Lin
b. Glc-Ner
c. Glc-Ger
A. Ara-Glc-Ner
B. Ara-Glc-Ger

Figur 9: Wie Figur 8 im Falle der sequentiellen Hydrolyse durch α-Rhamnosidase und β-Glucosidase.

3 und 4. α- und β-Rhamnose
Der (silylierte) glycosidische Ausgangsextrakt enthält weder Monosaccharide noch Terpenmonoglucoside (Figur 8a).
Die Einwirkung von β-Glucosidase modifiziert das Profil dieses Extraktes nicht wesentlich, abgesehen vom Auftreten von Glucose. Die letztere, die auch bei der TLC während der Ueberwachung der Hydrolyse des glycosidischen Extraktes durch dieses Enzym beobachtet wird, rührt somit wahrscheinlich nicht von der Hydrolyse der Terpenvorläufer, sondern von anderen Glycosiden her.
Die Einwirkung von α-Arabinosidase oder von α- Rhamnosidase ruft wesentliche Modifizierungen in bezug auf das Profil des glycosidischen Extraktes (Figuren 8b und 9b) hervor. Insbesondere verschwinden die beiden Hauptpeaks, die identifiziert worden sind (Peak A = Ara-Glc-Ner; Peak B = Glc-Ger) vollständig nach Inkubation des Mediums mit α-Arabinosidase, während Arabinose auftritt. Der Peak C, der der Retentionszeit von Rha-Glc-Ger entspricht, nimmt nach der Einwirkung von α-Rhamnosidase ab; gleichzeitig wird das Auftreten von Rhamnose beobachtet.
Die Inkubation des glycosidischen Extraktes mit jeder dieser beiden Glycosidasen ruft überdies reichliche Mengen von drei Monoglucosiden (Linalyl-, Neryl- und Geranylglucoside) hervor, die durch Vergleich mit Referenzsubstanzen identifiziert werden. Der grössere Teil (77%) dieser Terpenmonoglucoside wird durch die Einwirkung von α-Arabinosidase freigesetzt, der Rest (23%) wird durch die Einwirkung von α-Rhamnosidase erzeugt (Tabelle 4). Tabelle 4 - Terpenmonoglucoside, freigesetzt (1) durch α-Arabinosidase und α-Rhamnosidase aus einem glycosidischen Extrakt α-Arabinosidase α-Rhamnosidase % Monoglucoside (1) Die Resultate sind als Prozentsatz der Gesamtmenge jeder Verbindung ausgedrückt, die durch die beiden Enzyme freigesetzt wird.
Die Mengen an Terpenolen, die während dieser ersten Stufe der Hydrolyse nachgewiesen werden, nämlich der Hydrolyse des glycosidischen Extraktes mit jeder der drei Glycosidasen allein, waren nur vernachlässigbar.
Die darauffolgende Einwirkung von β-Glucosidase auf die glycosidischen Extrakte, die vorher entweder mit α-Arabinosidase oder α-Rhamnosidase inkubiert worden waren (2. Stufe), führt zum Verschwinden der Neryl- und Geranylmonoglucoside und einer Verringerung des Linanylmonoglucosids und der Erzeugung von Glucose (Figuren 8c und 9c) und Terpenolen in grossen Mengen.
Es ist bekannt, dass die verwendete β-Glucosidase, die aus Süssmandeln extrahiert und zum Zwecke des Studiums der sequentiellen Hydrolyse von Terpenglycosiden gewählt wird, eine geringe Affinität in bezug auf Linalylgucosid hat, was zur unvollständigen Hydrolyse des letzteren unter den angewandten Bedingungen führt.
Die reichlichsten der freigesetzten Terpenole sind Geraniol, Nerol und Linalool in der angegebenen Reihenfolge. Annäherungsweise 80% dieser Terpenole stammen aus der gepaarten Einwirkung von α-Arabinosidase und β-Glucosidase.
Andere Terpenole oder flüchtige Verbindungen wurden nach der sequentiellen Einwirkung der Enzyme ebenfalls nachgewiesen, aber in kleineren Mengen, wie α-Terpineol, Citronellol, Hydroxylinaloole, Linalooloxide (mit den cis- und trans-Furankonfigurationen und der cis-Pyrankonfiguration), Benzyl- und Phenylethylalkohole, Terpenpolyole, Norisoprenoide (3-Hydroxydamascon, 3-Oxo-α-ionol), Vinylgaiacol und Ethylphenol.
Die wesentlichen Modifizierungen der chromatographischen Profile, die nach der Einwirkung von α-Arabinosidase auf den glycosidischen Extrakt beobachtet wurden, führten zu einer Untersuchung der überwiegenden Glycoside in grösserer Tiefe. Zu diesem Zweck wurden Fraktionen gesammelt, die den Peaks A und B des HPLC- Profils entsprachen. Ein aliquoter Teil wurde silyliert und dann durch GC analysiert. Die Entsprechung zwischen den Peaks A und B der beiden Chromatogramme von Figuren 10 und 8a wurde somit festgestellt.

Legende zu Figur 10:

HPLC-Profil des glycosidischen Extrakts
A. Ara-Glc-Ner
B. Ara-Glc-Ger
Ferner wurde jede Fraktion der sequentiellen Einwirkung von α-Arabinosidase und dann β-Glucosidase unterworfen. Am Ende jeder Stufe und gemäss den beschriebenen Verfahrensweisen wurde das inkubierte Medium durch GC analysiert, um einerseits auf Zucker und Glucoside und andererseits auf Terpenole zu testen. Die Resultate sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Somit wurden die Peaks A und B identifiziert als Neryl- bzw. Geranyl-α-L-arabinofuranosyl-β-D-glucopyranoside. Die Identität des Geranylglycosides wurde zusätzlich durch gemeinsame Injektion des glycosidischen Extraktes mit der synthetischen Verbindung verifiziert. Tabelle 5 - Identifizierung der Peaks A und B, die durch HPLC gesammelt worden waren Verbindungen, die auftraten nach Einwirkung von α-Arabinosidase α-Arabinosidase und dann β-Glucosidase Identifizierte Verbindungen Peak Arabinose + Glc-Ner Glucose + Nerol Glucose + Geraniol Neryl-α-L-arabinofuranosyl-β-D-glucopyranosid Geranyl-α-L-arabinofuranosyl-β-D-glucopyranosid
In einem anderen Aspekt wurde die Einwirkung der β-Apiosidase auf einen glycosidischen Extrakt (Figur 11A) studiert nach der Einwirkung des Hemicellulasepräparats (enthaltend α-Rhamnosidase-, α-Arabinosidase- und β-Glucosidaseaktivitäten) auf diesen Extrakt. Das Hemicellulasepräparat eliminierte die Rhamnosyl- und Arabinosylglucoside (Figur 11B). Danach wurden die verbleibenden Apiosylglucoside der hydrolytischen Einwirkung der β-Apiosidase und β-Glucosidase von Klerzyme 200 unterworfen (Figur 11C). Bemerkenswert ist das Verschwinden der Apiosylglucoside und das Auftreten von Linalyloxidglucosiden, die die sequentielle Hydrolyse der Apioslyglucoside beweisen. Die Linalylmonoglucoside wurden nicht hydrolysiert im Gegensatz zu den Geranyl- und Nerylmonoglucosiden. Dies ist zurückzuführen auf die schwache Affinität der β-Glucosidase von Klerzyme 200 gegenüber den Linalylglucosiden.
Diese Resultate zusammen bestätigen, dass die enzymatische Hydrolyse von Trauben-Terpenglycosiden einen sequentiellen Mechanismus umfasst, der mit demjenigen identisch ist, der auf den synthetischen Substraten bewiesen wurde.

3 - Enzymatische Hydrolyse von natürlichen Medien

Die enzymatische Hydrolyse eines glycosidischen Extrakts, der einerseits in ein natürliches Medium (Most oder trockener Wein) und andererseits in ein Referenzmediuin (Puffer) eingeschlossen ist, durch Einwirkung von handelsüblichen Präparaten, die die erforderlichen drei Glycosidasen enthalten, wurde studiert.
Das Hydrolysenprotokoll ist folgendermassen:
Ein Saft und Wein einer Rebsorte, die keine Terpenole und Terpenglycoside enthalten, aber vorher mit einer bekannten Menge von glycosidischein Extrakt aus Muskat angereichert worden sind, werden mit handelsüblichen Enzympräparaten behandelt. Die Medien sowie die Kontrollen werden 86 Stunden lang bei 25ºC inkubiert (siehe den experimentellen Protokollplan weiter unten). Sie werden dann gemäss dem für die Produktion des glycosidischen Extraktes angewandten Protokoll durch eine Säule von Amberlite XAD-2 geleitet, und die Terpenole werden durch GC analysiert. Plan des experimentellen Protokolls + 0,5 ml Hemicellulase(1) 50 ml Most + 0,5 ml Naringinase(2) (pH 3,4: Zucker 180 g/l) Kontrolle + 2 ml 2%-iges NaN&sub3;(3) oder Trockener Weisswein + 0,5 ml Hemicellulase (pH 3,1) + 0,5 ml Naringinase + 1 ml glycosidischer Extrakt(4) + 2 ml 2%-iges NaN&sub3; + 1 ml glycosidischer Extrakt Kontrolle 50 ml Puffer + 2 ml 2%-iges NaN&sub3; (50-millimolares Citrat-Phosphat) + 0,5 ml Hemicellulase pH 3,3 + 0,5 ml Naringinase Referenz + 1 ml glycosidischer Extrakt + 2 ml 2%-iges NaN&sub3;
(1) 0,5 ml der verwendeten Lösung (bei einer Konzentration von 15 mg/ml) von Hemicellulase REG-2 besassen 70 nkat α-Arabinosidaseaktivität, 72 nkat β-Glucosidaseaktivität und 9 nkat α-Rhamnosidaseaktivität.
(2) 0,5 ml der verwendeten Lösung (bei einer Konzentration von 5 mg/ml) von Naringinase besassen 78 nkat α-Rhamnosidaseaktivität und 0,1 nkat β-Glucosidaseaktivität.
(3) NaN&sub3; wird verwendet, um das Wachstum von Mikroben zu vermeiden.
(4) Der verwendete glycosidische Extrakt wird erhalten durch Durchleiten eines Mostes von Trauben der Sorte Muscat d'Alexandrie durch Amberlite XAD-2. Die Menge an glycosidischem Extrakt (1 ml), die in den Tests zugesetzt wurde, entspricht derjenigen, die in 50 ml Most von Trauben der Sorte Muscat d'Alexandrie gefunden wird.
Unter Bedingungen, die an diejenigen erinnern, die in der önologischen Praxis gefunden werden, wird eine Freisetzung von Terpenolen beobachtet. Diese Freisetzung ist geringer im Falle von Most als in demjenigen von Wein (Tabelle 6). Ausgedrückt als Prozentsatz von Aromastoffen, der nach 86 Stunden bei 25ºC freigesetzt wird, verglichen mit der Menge, die in einem Referenzmedium freigesetzt wird, kommt dies auf 11% für den Most und 28% für den Wein. Es kann festgestellt werden, dass Geraniolglycoside befriedigender hydrolysiert werden als diejenigen von Linalool und Nerol.
Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der β-Glucosidaseaktivität durch die in grossen Mengen in dem Most vorhandene Glucose die geringere Effizienz, bezogen auf den Wein, erklären kann.
Die Resultate sind befriedigender im Falle von Wein, da es dann möglich ist, unter Berücksichtigung des Ueberwiegens von Terpenglycosiden die freie Terpenfraktion mindestens zu verdoppeln. Tabelle 6 - Hydrolyse eines glycosidischen Extrakts, der in einen Most und einen Wein einverleibt ist, durch handelsübliche Enzympräparate Freigesetzte Verbindungen, bezogen auf das Referenzmedium(1) (%) Linalool Nerol Geraniol Benzylalkohol Gesamte Terpenole Most Wein (1) Referenz: Glycosidischer Extrakt + Citrat-Phosphat-Puffer, pH 3,3 + Hemicellulase REG-2 + Naringinase.

Saure Hydrolysen

Um das mögliche Vorhandensein von Terpenglycosiden unbekannter Struktur in dem TLC-Fleck nachzuweisen, der gegen enzymatische Hydrolysen durch die gereinigten Glycosidasen resistent ist, wurden saure Hydrolysen auf die Verbindungen angewandt, die diesem durch TLC gewonnenen Fleck entsprechen.
1) Das gewonnene Medium (250 ul) wird bei 40ºC mit einem Stickstoffstrom zur Trockene gebracht. 250 ul 25-millimolarer Citrat-Phosphat-Puffer (pH 3,0) werden in den Kolben eingeführt, der dann dicht verschlossen und 20 Minuten lang bei 100ºC belassen wird. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit Pentan (5 x 250 ul) gewaschen. Ein innerer Standard wird zu dem Pentanextrakt zugesetzt, der dann eingeengt und durch GC analysiert wird. 25 ul der wässrigen Phase werden dann auf eine TLC-Platte aufgebracht.
2) Das gewonnene Medium (250 ul) wird nach dem Trocknen wie oben beschrieben mit 250 ul 2-molarer Trifluoressigsäure behandelt und dann 75 Minuten bei 120ºC belassen. Nach dem Abkühlen wird das Medium den gleichen Analysen wie oben unterworfen.

4. Technologische Anwendung

Die Einwirkung von exogenen Glycosidasen von pilzlichem Ursprung wurde während der Vergärung von natursüssen Weinen und von trockenen Weinen des Traubenmosts (Muskatsorte) studiert. Zwei enzymatische Präparate, Hemicellulase und Klerzyme 200 (beide hergestellt durch Gist-brocades) wurden getestet.

Experimentelles Protokoll

Reife gesunde Trauben der Sorte Muscat de Frontignan wurden gepresst. Der Most wurde geschwefelt (5 g/hl SO&sub2;) und zentrifugiert. Darauf folgte der Zusatz des Hemicellulaseenzympräparats [enthaltend (pro Liter Most) 467 nkat α-Arabinosidase, 296 nkat β-Glucosidase und 31 nkat α-Rhamnosidase] und 10 g/hl einer Weinhefe (Saccharomyces cerevisiae, Typ K1, Institut Cooperatif du Vin, Maurin, Frankreich).
Die natursüssen Weine werden erhalten nach Beendigung der Fermentation bei mittlerer Fermentation durch Zusatz von Alkohol, bis eine Endkonzentration von annäherungsweise 17 Vol.-% Alkohol erreicht wird.
Für trockene Weine wird die Vergärung fortgesetzt bis zur Erschöpfung der Zucker.
Die Aktivität der Glycosidasen wurde während des Verlaufs der Fermentation verfolgt. Die Glycosidasen wurden durch Fällung mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; isoliert, und danach wurden sie durch Verwendung der entsprechenden p-Nitrophenylglycoside gemessen.
Nach dem Aufbewahren während 1,5 Monaten bei 20 bis 22ºC wurden die freien und gebundenen Aromastoffkomponentenfraktionen jeder Probe auf einer Amberlite XAD-2-Säule in aliquoten Teilen von 50 ml extrahiert und mittels GC analysiert.
Die exogenen Glycosidasen waren wirksam bei der Freisetzung von Aromastoffkomponenten in der Vergärung, wenn keine restliche Glucose in dem Medium vorhanden war (wie in Falle von trockenen Weinen). Somit nahm der Gehalt an Terpenolen (zum Beispiel Nerol, Geraniol, Citronellol, α-Terpineol, Hydroxylinaloole) sowie Norisoprenoidderivaten (β-Damascenon, 3-Hydroxy-β-damascon) in dem trockenen Wein, der aus dem enzymatisch behandelten Most stammte, zu (Tabelle 8). Dieses analytische Resultat wurde durch eine Gruppe von Verkostern bestätigt. Alle Verkoster (insgesamt 15) bevorzugten den enzymatisch behandelten trockenen Wein. Die Verkoster zeigten keine Bevorzugung der natursüssen Weine, ob sie nun enzymatisch behandelt waren oder nicht. Die aus dem enzymatisch behandelten Most stammenden Weine wurden als aromatischer (blumig) und typischer beurteilt.
In süssen Weinen, die aus enzymatisch behandeltem Most stammten, war die Hydrolyse von Terpendiglycosiden nicht vollständig und wurde unterbrochen, wenn nur Monoglucoside übrigblieben (Figur 12). Bemerkenswert ist die wahrnehmbare Verringerung der hauptsächlichen Diglycoside (Arabinosylglucoside, Peaks 7 und 9) und eine entsprechende Zunahme der Nerol- und Geraniolmonoglucoside (Peaks 2 und 3). Die letzteren werden in den natursüssen Weinen nicht hydrolysiert infolge des Vorhandenseins von Glucose (30 g/l), die die Wirkung hat, die Aktivität von β-Glucosidase (stammend aus Aspergillus niger) zu hemmen. Andererseits wurden diese Glucoside im Falle der enzymatisch behandelten trockenen Weine hydrolysiert.
Jedoch war eine β-Glucosidase (die aus der Hefe Candida wickerhamii CBS 2928 stammte) fähig, Neryl- und Geranylinonoglucoside in den natursüssen Weinen bei einem pH von 3,6 und darüber zu hydrolysieren. Dies ist zurückzuführen auf die schlechte Stabilität der Candida wickerhamii-β-Glucosidase bei einem pH unter 3,6.
Bei pH 3,6 wurden sowohl die Neryl- als auch die Geranylmonoglucoside, die in den natursüssen Weinen vorhanden waren, von 19% bis 45% hydrolysiert. Bei pH 4,0 wurden zwei Drittel jedes Glucosids hydrolysiert.
Im Gegensatz zu Arabinosyl- und Rhamnosylglucosiden werden die Apioglycoside durch das enzymatische Hemicellulasepräparat nicht hydrolysiert (Figur 12, Peaks 8 und 10). Dies ist auf die Abwesenheit von Apiosidaseaktivität in diesem Präparat zurückzuführen.
In einem anderen Aspekt wurde die Einwirkung eines Enzympräparates (Klerzyme 200), das β-Apiosidaseaktivität zusätzlich zu α-Rhamnosidase-, α-Arabinosidase- und β-Glucosidaseaktivität enthielt, während der Fermentierung von trockenen Weinen aus dem Muscat de Frontignan-Most studiert. Klerzyme 200 [enthaltend (pro Liter Most) 2 770 nkat β-Glucosidase, 704 nkat β-Apiosidase, 276 nkat α-Arabinosidase und 35 nkat α-Rhamnosidase] und 10 g/hl einer Weinhefe (Saccharomyces cerevisiae, Typ K1) wurden zu dem Most zugegeben.
Der enzymatisch behandelte trockene Wein zeichnete sich durch die Zunahme der freien Aromastoffkomponentenfraktion aus (Tabelle 9), verglichen mit dem Fall, in dem das Hemicellulasepräparat verwendet wurde. Ueberdies gestattete das Vorhandensein von β-Apiosidaseaktivität in Klerzyme 200 die Hydrolyse von Apiosylglucosiden (Tabelle 10). Es ist bemerkenswert, dass das Linalylglucosid und die Linalooloxidglucoside im Gegensatz zu den anderen Glucosiden oder Glycosiden nicht hydrolysiert wurden. Dies kann durch die schwache Aktivität der β-Glucosidase in dem Klerzyme 200-Präparat auf diesen Substraten erklärt werden.
Andere flüchtige Komponenten, wie Vinylguaiacol und 3-Oxo-α-ionol, wurden in niedrigen Konzentrationen in dem enzymatisch behandelten Wein nachgewiesen.
Die wichtige Zunahme von 2-Phenylethanol in dem Wein ist die Folge seiner Synthese durch die Hefe während des Verlaufs der Fermentation des Mostes.
In einem anderen Aspekt wurde gefunden, dass die gewählten exogenen Glycosidasen bei dem sauren pH des Mostes und des Weins stabil sind. Tabelle 8 Komponenten (ug/l) Ausgangsmost Trockener Wein Linalooloxid (Furanderivat), trans Linalooloxid (Furanderivat), cis Linalooloxid (Pyranderivat), trans Linalooloxid (Pyranderivat), cis Linalcol HO-Trienol α-Terpenol Citronellol Nerol Geraniol E-8-Hydroxy-linalool Z-8-Hydroxy-linalool 3,7-Dimethyl-1,7-octandien-3,6-diol 3,7-Dimethyl-1,5-octandien-3,7-diol 7-Hydroxy-6,7-dihydrolinalool Gesamte Terpenole Andere β-Damascenon 3-hydroxy-β-damascon Benzylalkohol Z-Phenylethanol Abwesend NSW: Neutraler süsser Wein * : Kontrolle ** : Versetzt mit KLERZYME 200 (Gist-brocades) Tabelle 9 Komponenten (ug/l) Ausgangsmost Linalooloxid (Furanderivat), trans Linalooloxid (Furanderivat), cis Linalooloxid (Pyranderivat), trans Linalooloxid (Pyranderivat), cis Linalcol HO-Trienol α-Terpenol Citronellol Nerol Geraniol E-8-Hydroxy-linalool Z-8-Hydroxy-linalool 3,7-Dimethyl-1,7-octandien-3,6-diol 3,7-Dimethyl-1,5-octandien-3,7-diol 7-Hydroxy-6,7-dihydrolinalool Gesamte Terpenole Andere β-Damascenon 3-hydroxy-β-damascon Benzylalkohol Z-Phenylethanol Abwesend NSW: Neutraler süsser Wein * : Kontrolle ** : Versetzt mit KLERZYME 200 (Gist-brocades) Tabelle 10 Zusammensetzung ug/l Ausgangsmost Trockener Wein Linalylglucosid und Linalyloxid (Furanderivat) Nerylglucosid Geranylglucosid Linalylrhamnosylglucosid Nerylrhamnosylglucosid Geranylrhamnosylglucosid Linalylarabinosylglucosid Nerylarabinosylglucosid Geranylarabinosylglucosid Nerylapiosylglucosid Geranylapiosylglucosid Benzylapiosylglucosid Geranium und Nerolsäureglycosid * : Kontrolle ** : Versetzt mit KLERZYME 200 (Gist-brocades)

Claims

1. Verfahren zum Erhalten von Aromastoffkomponenten und Aromastoffen aus ihren Vorläufern glycosidischer Natur, dadurch gekennzeichnet, dass

- in einer ersten Stufe eine enzymatische Hydrolyse eines glycosidischen Substrats, das mindestens einen der genannten Vorläufer enthält, ausgeführt wird mit mindestens einem Enzym, das gemäss der Struktur des genannten Vorläufers gewählt ist, um die entsprechenden Monoglycoside durch Spaltung einer glycosidischen Bindung freizusetzen, mit der Bedingung, dass mindestens eine β-Apiosidase und ihr entsprechendes Apiosid bei der enzymatischen Hydrolyse zugegen sind;

- in einer zweiten Stufe eine enzymatische Hydrolyse des Produktes der ersten Stufe ausgeführt wird mit mindestens einem Enzym, das verschieden von oder identisch mit demjenigen der ersten Stufe ist und dazu bestimmt ist, die Aromastoffkomponenten und Aromastoffe durch Spaltung der Aglycon-Kohlenhydrat-Bindegliedbindung freizusetzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte β-Apiosidase eine β-D-Apiofuranosidase ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein β-D-Apio-β-D-glucosid als glycosidisches Substrat zugegen ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Hydrolyse direkt ausgeführt wird, ohne die erste Stufe zu durchlaufen, falls das Symbol nur Monoglycoside enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das glycosidische Substrat in einer einzigen Stufe mit dem gewählten Enzym oder den gewählten Enzymen, das bzw. die Monoglycoside ebenso wie Aromastoffe und/oder Aromastoffkomponenten freizusetzen vermag bzw. vermögen, in Berührung gebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus einer Frucht, einer aromatischen Pflanze oder einer blühenden Pflanze sowie aus ihren Derivaten oder Nebenprodukten stammendes pflanzliches Material oder alternativ ein aus in vitro-Zellkulturen stammendes Pflanzenmaterial als glycosidisches Substrat gewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus Weintrauben stammendes pflanzliches Material, wie Traubensäfte, Weine und Derivate sowie Nebenprodukte der Vergärung van aromatischen Rebsorten, insbesondere Muskate, gewählt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein glycosidischer Extrakt als glycosidisches Substrat verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Extrakt eines aus einer Rebsorte, wie Muskat, stammenden Mosts, aus dem vorher die freien Terpenole und Zucker entfernt worden sind, als glycosidischer Extrakt verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse auf einem natürlichen Medium ausgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Säfte und Weine einer Rebsorte, die Terpenole und Terpenglycoside enthalten oder nicht, als natürliches Medium verwendet werden, wobei das genannte Medium, falls es keine Terpenole und Terpenglycoside enthält, mit einem glycosidischen Extrakt, wie in Anspruch 8 definiert, angereichert ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein synthetisches Substrat verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass p-Nitrophenyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1T6)-β- D-glucopyranosid, Geranyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1T6)-β-D- glucopyranosid oder ein p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosyl- (1T6)-β-D-glucopyranosid als zusätzliches synthetisches Substrat verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in der ersten Stufe zwei aus einer α-Arabinosidase und einer α-Rhamnosidase bestehende zusätzliche Enzyme verwendet werden und in der zweiten Stufe eine β-Glucosidase als Enzym verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine α-L-Arabinofuranosidase (E.C.3.2.1.55) und eine α-L-Rhamnopyranosidase (E.C.3.2.1.40) als α-Arabinosidase bzw. α-Rhamnosidase verwendet werden und dass eine β-D-Glucopyranosidase (E.C.3.2.1.21) als ß-Glucosidase verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aromastoffkomponenten oder Aromastoffe erhält: Terpenole, wie Geraniol, Linalool, Nerol, α-Terpineol, Citronellol und dergleichen; Linalooloxide; Terpenpolyole, wie Hydroxylinaloole; Alkohole, wie Phenylethylalkohol) Ethylphenol und Benzylalkohol und dergleichen; Norisoprenoide, wie 3-Hyroxydamascon und 3-Oxo- α-ionol; und Vinylgaiacol.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man nicht wohlriechende Aglycone, wie Para-Nitrophenol, erhält.