WO2002103038A1 - Un procedimiento enzimático para obtener 4-0-b-d galactopiranosil-d-xilosa obtenida deacuerdo con el procedimiento, composiciones que la contienen y su uso en la evaluación de la lactasa intestinal - Google Patents

Un procedimiento enzimático para obtener 4-0-b-d galactopiranosil-d-xilosa obtenida deacuerdo con el procedimiento, composiciones que la contienen y su uso en la evaluación de la lactasa intestinal Download PDF

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WO2002103038A1
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xylose
reaction
galactopyranosyl
reaction mixture
mixture
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Francisco Javier CAÑADA VICINAY
Guillermo Corrales Morales
Alfonso Fernandez-Mayoralas Alvarez
Manuel Martin Lomas
Juan José ARAGON REYES
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Universidad Autonoma De Madrid
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides

Definitions

  • the present invention is comprised in the field of procedures for. obtain compounds, specifically disaccharides useful in the methods of evaluation of blood lactase activity.
  • intestinal lactase activity is of importance in pediatrics and gastroenterology and can be carried out directly, from a sample of mucosa, or indirectly, from the level of blood glucose or exhaled hydrogen, after administration of One dose of lactase to the individual.
  • Direct determination has the disadvantage of being a complex and expensive method. because it requires specific instruments and highly specialized personnel to practice the extraction of the sample, which must be subsequently analyzed, apart from being unpleasant and not without danger for the individual
  • intestinal lactase Other methods of determining intestinal lactase are based on the fact that certain disaccharides are, based on their affinity for lactase, capable of acting as a lactase substrate and are transformed, by the enzyme, into certain monosaccharides that are easily absorbed by the intestine and eliminated by the urine.
  • Said disaccharide is administered orally, acts as a substrate for intestinal lactase and therefore decomposes, in the intestinal tract, in xylose and galactose, the xylose being absorbed and eliminated in the urine in which the xylose can be directly evaluated by a colorimetric method simple.
  • the amounts of xylose excreted in urine are correlated with intestinal lactase levels.
  • Spanish patent ES-P-9001680 also describes a preparation method basically for 4-O- ⁇ - galactopyranosyl-D-xylose, comprising a synthesis from benzyl ⁇ -D-xylopyranoside and following a sequence of operations involving reactions of selective protection, glycosylation and deprotection.
  • Both the number of reaction stages, and the use of expensive reagents such as silver triflate in the glycosylation reaction, and the use of chromatography columns in the purification of intermediates and the final product, produce costs and present difficulties in carrying carry out this procedure on an industrial scale.
  • the 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose that can be obtained by the aforementioned process as well as the compositions comprising said 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose, constitute further objects of the invention.
  • a reaction medium comprising buffered water at a pH between 5.0 and 9. 0; 10 to 1,000 units of a ⁇ -D-galactosidase enzyme are added, per gram of ⁇ -D-galactopyranoside to the first reaction mixture; and obtaining a second reaction mixture; a second stage in which the second reaction mixture is subjected to a reaction at a temperature between a temperature higher than the freezing point of the second reaction mixture and 452C, for 2 to 48 hours, to form disaccharides in the second mixture of reaction; a third stage in which the reaction is stopped when the disaccharides have been formed in the desired amount, by a treatment chosen from a deactivation of the ⁇ -D-galactosidase by freezing the second reaction mixture at a temperature between -209C and -1702C, a deactivation of ⁇ -D-galactosidase by
  • the proportion of D-xylose in the second reaction mixture is preferably 7.5% by weight
  • the proportion of ⁇ -D-galactopyranoside in the second reaction mixture is 1.5% by weight.
  • 100 units of ⁇ -D-galactosidase are added, per gram of ⁇ -D-galactopyranoside.
  • the reaction medium may further comprise at least one cosolvent medium selected from dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dioxane and mixtures thereof, preferably in a proportion of 20% based on the reaction medium.
  • the reaction medium is buffered at pH 7.
  • the reaction is conveniently carried out at a constant temperature, in order to increase its reproducibility.
  • the reaction temperature is greater than the freezing point of the second reaction mixture and less than 40 seconds.
  • the reaction is carried out at room temperature, which allows good yields without the need to cool the second reaction mixture.
  • the reaction can also be performed at -52C, or at 372C.
  • the reaction temperature is preferably lower than O ⁇ C but higher than the freezing point of the second reaction mixture.
  • the ⁇ -D-galactopyranoside substrate is preferably selected from o-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside (Gal-ONP) and lactose.
  • the enzyme ⁇ -galactosidase can be ⁇ -galactosidase from E. coli or from Kluyveramyces lactis (such as AXILACT®).
  • Gal-ONP When Gal-ONP is used as a substrate, it is formed in the o-nitrophenol reaction that is removed by extraction with ethyl acetate in the event that the reaction is stopped by heating, or it is eliminated by simple filtration in case the reaction is stopped by cooling.
  • a temperature of -782C is preferably applied.
  • a temperature of 100se is preferably applied.
  • 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose can be isolated from the reaction mixture, by several alternative methods.
  • water is removed from the fourth reaction mixture to obtain a reaction residue containing the disaccharides, the reaction residue is subjected to an acetylation treatment to obtain a 4-0- ⁇ -peracetylated derivative.
  • the acetylation of the reaction residue is preferably carried out with acetic anhydride in pyridine, while, preferably, the deacetylation of the peracetylated derivative is carried out catalytically with sodium methoxide in methane1.
  • the fourth reaction mixture is subjected to a column elution with a first eluent which can be selected from mixtures of water with methanol, ethanol or isopropanol, preferably a water / isopropanol mixture with an isopropanol ratio of 1 to 10% (v / v), preferably 2% (v / v).
  • a first eluent which can be selected from mixtures of water with methanol, ethanol or isopropanol, preferably a water / isopropanol mixture with an isopropanol ratio of 1 to 10% (v / v), preferably 2% (v / v).
  • Elution is carried out in a filtration column selected from filtration columns with cross-linked dextran polymer fillers, such as a SEPHADEX filled column, columns filtration with fillers of acrylamide polymers, such as a column with BIOGEL filler, and filtration columns of activated carbon or activated carbon-celite, to obtain fractions containing 4- O- ⁇ -D-galactopyranosyl-D- Xylose
  • the fourth reaction mixture is concentrated before undergoing elution in the column.
  • celite is added to the fourth reaction mixture, the mixture thus obtained is concentrated to dryness and the residue is subjected to a solid-liquid extraction with an organic solvent in a soxhlet extractor followed by elution in a column .
  • the preferred solvent for solid-liquid extraction is ethyl acetate.
  • the column is selected from filtration columns with crosslinked dextran polymer fillers, such as a column with SEPHADEX filler, filtration columns with acrylamide polymer fillers, such as a BIOGEL filled column, and filtration columns. of active carbon or activated carbon-celite.
  • the column is activated carbon-celite, in which the carbon is deactivated by the addition of hydrochloric acid.
  • This third alternative method offers the advantage of removing most of the xylose - especially when used in excess in the reaction - before elution in the column whereupon the filling, as well as the amount of first eluent that is Need for elution is much less.
  • Another advantage of this third alternative method is that the solid-liquid extraction in ethyl acetate is completely selective since in the liquid phase there is no presence of disaccharides, but only of xylose and galactose.
  • elution in the fifth stage is performed instead of using a filler column, adding active carbon to the fourth reaction mixture once separated the agliconic fragment of the substrate in the fourth stage, thus obtaining that the 4-0- ⁇ -D-galact ⁇ piranosyl-D-xylose, is adsorbed on the active carbon and eluting the 4-0- ⁇ -D - galactopyranosyl-D-xylose of activated carbon with a second eluent.
  • Said elution is preferably carried out by consecutive washing with water and with diluted isopropanol with increasing proportion by volume of isopropanol in successive steps.
  • the volume ratio of isopropanol is between 1% and 3% in a first step, between 3% and 5% in a second step, and between 5% and 7% in a third step.
  • the preferred isopropanol concentration for washing is a 2% isopropanol sequence, followed by elution with 4% isopropanol and followed by elution with 6% isopropanol. From the residue obtained by concentration, pure 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose is obtained by crystallizing it in acetone-water.
  • o-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside is used as the substrate for the reaction.
  • the invention also relates to 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose obtained by the above-described process, and to salt or aqueous compositions and solutions, comprising a 4-0- ⁇ -
  • D-galactopyranosyl-D-xylose obtained by said procedure, as well as the use of a 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose in the preparation of compositions and solutions for the in vivo evaluation of intestinal lactase in humans.
  • ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose is combined with pharmaceutically acceptable amounts of at least one additive selected from stabilizers, protectants, flavorings, lactose, gelling agents, fluidizing agents and preservatives, pharmaceutically acceptable and conventional.
  • 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose or the compositions or solutions that contain it, are administered orally and lead to the appearance in urine of xylose which, spectrophotometrically evaluated-, is used in a specific, routine way , bloodless and simple for the diagnostic evaluation of deficiencies in lactase activity.
  • Example 1 To determine the influence of the reaction temperature the following test was performed: Samples of reaction mixtures were prepared composed of
  • reaction medium comprised of an aqueous solution buffered to pH 7
  • Example 2 To determine the influence of pH on the reaction, the following samples were prepared:
  • D-xylose 500mM: 125mg E. coli galactosidase: 1.6 u Buffered aqueous solution (50mM potassium phosphate, lmM MgCl 2 / 5mM mercaptoethanol) at pH: 8.5 l, 6ml
  • Example 3 To synthesize 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D - xylose were dissolved 6g nitrophenyl ⁇ -o-xylose D in 330ml of water buffered to pH 7 (-D- galactopyranoside (Gal-ONP) and 25 g of 0.05M KH 2 PO 4/2 2 HPO 4, LMM MgCl 2, 5mM mercaptoethanol), were added 2 mg (640U) of ⁇ - galactosidase enzyme from E. coli, and the solution thus obtained was subjected to incubation at 30s C an orbitical agitator until the Gal-ONP was practically consumed (approximately 4 hours).
  • reaction was stopped by heating in a water bath at 100SC for 10 minutes, and then the o-nitrophenol formed with CH 2 C1 2 was extracted -
  • the precipitated salts were filtered, the filtrate was concentrated to dryness and the residue was chromatographed on a silica gel column using a gradient of hexane / ethyl acetate of 4: 1 - 1: 1 as eluent. From the column, the acetylated D-xylose was eluted first and then the mixture of the acetylated disaccharides. Once the fractions containing the disaccharide mixture were concentrated, the residue was dissolved in MeOH, a solution of 1M MeONa / MeOH was added, and the mixture thus obtained was stirred until deacetylation was complete (tic follow-up with isopropanol / NH 3 / H 0).
  • the mixture was neutralized with AMBERLITE IR-120 (H + ) and concentrated to dryness.
  • the mixture of free disaccharides was crystallized twice successively with MeOH / acetone, obtaining 1.07 of 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose with a 17% yield based on the initial Gal-ONP.
  • Example 4 An active / celite column was prepared by dry mixing 200g of activated carbon (DARCO G-60) and 200 g of celite, and water was added until a homogeneous paste formed. The paste was treated with 150ml of HCl (35%) to deactivate the coal, as well as to wash traces of iron and alkaline ashes, and then washed with water until the wash waters came out neutral. Once washed, it was packed in a 5cm (a) x 50cm chromatography column, and compacted.
  • DARCO G-60 activated carbon
  • Example 3 Following the methodology set forth in Example 3, the reaction was stopped by heating at 100se for 10 minutes and the ortonitrophenol formed with ethyl acetate was extracted. The aqueous solution was concentrated to an approximate volume of 50ml, filtered through glass wool and passed through the active / celite carbon column. First, excess D-xylose was eluted with water and then, using a fractionated gradient of EtOH / H 2 0 (2% -10% EtOH), the disaccharide mixture was collected.
  • EtOH / H 2 0 2% -10% EtOH
  • the enriched fractions in the 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose regioisomer were pooled and concentrated to a reduced volume, after which acetone was added until the appearance of turbidity leaving the mixture obtained in the cold to stand.
  • the 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose crystallized purely, obtaining 970mg, that is, 19% based on the initial Gal-ONP, whose spectral data coincided with those exposed with respect to the product obtained according with example 3.
  • Example 5 A column of activated carbon / celite was prepared by dry mixing 200g of activated carbon (DARCO G-60) and 200 g of celite, and water was added until a homogeneous paste was formed. The paste was treated with 150 ml of HCl (35%) to deactivate the carbon and wash the residues of iron and 'alkaline ashes and subsequently washed with water until the wash waters came out neutral. Once washed, it was packed in a 5cm ( ⁇ ) x 50cm chromatography column, and compacted.
  • Example 3 Following the methodology set forth in Example 3, the reaction was stopped by heating at 1002C for 10 minutes and the ortonitrophenol formed with ethyl acetate was extracted. The aqueous solution was concentrated to a volume of approximately 50ml, filtered through glass wool and passed through the active carbon / celite column.
  • Supernatant produced contained only a minimal amount of 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose.
  • the 4- O- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose crystals were filtered and washed with acetone.
  • Example 6 An • activated carbon / celite column was prepared by dry mixing 200g of activated carbon (DARCO G-60) and 200 g of celite, and water was added until a homogeneous paste was formed. The paste was treated with 15Oral HCl (35%) to deactivate the carbon and wash traces of iron and alkaline ashes, and then washed with water until the wash waters came out neutral. Once washed, it was packed in a 5cm (0) x 50cm chromatography column, and compacted.
  • DARCO G-60 activated carbon
  • Example 4 Following the methodology set forth in Example 4, the reaction was stopped by heating at 1009C for 10 minutes and the ortonitrophenol formed with ethyl acetate was extracted and filtered to remove traces of the enzyme. The aqueous solution was concentrated in vacuo to an approximate volume of 45 ml, and passed through an active carbon / celite column. First, the excess D-xylose was eluted with water and then, using a fractionated gradient of EtOH / H 2 0 (2% 10% EtOH) the disaccharide mixture was collected.
  • the enriched fractions in the 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose regioisomer were pooled and concentrated to a reduced volume, after which acetone was added until the appearance of turbidity was allowed to stand the mixture thus obtained cold.
  • the crystallized 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose was filtered through a filter plate, obtaining 817mg, that is, 16% based on the initial Gal-ONP.
  • Example 7 A column of activated carbon / celite was prepared by dry mixing 200g of activated carbon (DARCO G-60) and 200 g of celite, and water was added until a homogeneous paste was formed. The paste was treated with 150ml of HCl (35%) to deactivate the carbon and wash traces of iron and alkaline ashes, and then washed with water until the wash waters came out neutral. Once washed, it was packed in a 5cm (0) x 50cm chromatography column, and compacted.
  • DARCO G-60 activated carbon
  • HCl 150ml of HCl
  • Rf (4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose): 0.17 Rf (2-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose
  • Example 3 Following the methodology set forth in Example 3, the reaction was stopped by heating at 1002C for 10 minutes and the ortonitrophenol formed with ethyl acetate was extracted and filtered to remove traces of the enzyme.
  • the aqueous solution was concentrated in vacuo to an approximate volume of 70 ml, and the concentrated solution was eluted through an active carbon / celite column. First, it was eluted with 2% isopropanol / water and 1.3 liters were collected. Then 4% fractions were collected up to 2.6 liters, using a total volume of 3.9 liters.
  • the enriched fractions in the 4-0 ⁇ ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose regioisomer were pooled and concentrated to a reduced volume, after which acetone was added until the appearance of turbidity allowing the mixture thus obtained to stand cold.
  • the crystallized 4-0- ⁇ -D-galacto ' pyranosyl-D-xylose was filtered through a filter plate, yielding 1,213mg, that is, 24% based on the initial Gal-ONP.
  • Example 8 An active carbon / celite column was prepared by dry mixing 24g of activated carbon (DARCO G-60) and 24 g of celite, and water was added until a homogeneous paste formed. The paste was treated with 18ml of HCl (35%) to deactivate the carbon as well as wash iron debris and alkaline ashes, and then washed with water until the wash waters came out neutral. Once washed, it was packed in a chromatography column and compacted.
  • DARCO G-60 activated carbon
  • HCl 18ml of HCl
  • reaction was followed by thin layer chromatography with isopropanol / NH 3 / H 2 0 (7.5 / 0.5 / 2.5) in a manner analogous to that indicated in example 7.
  • the reaction was stopped by heating at 1002C for 10 minutes, allowed to cool and the ortonitrophenol formed with ethyl acetate was extracted.
  • celite 40g
  • the mixture was concentrated to dryness.
  • the solid residue was subjected to a solid-liquid extraction using a "soxhlet" extractor equipped with a cellulose cartridge and using ethyl acetate (500ml) as the solvent.
  • Example 9 To synthesize 4-0- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose, 4.12g of o-nitrophenol ⁇ -D-galactopyranoside (Gal-ONP) and 20.6 g of D-xylose were dissolved in 272ml of water buffered to pH 7 (0.05M KH 2 P0 / K2 2 HP0, lmM MgCl 2 , 5mM mercaptoethanol), 66 units of E. coli ⁇ -galactosidase enzyme were added, and the solution thus obtained was incubated at 37 SC in an orbitical agitator until the Gal-ONP was practically consumed (21 hours).
  • Gal-ONP o-nitrophenol ⁇ -D-galactopyranoside
  • the reaction was stopped by cooling to 02c and the o-nitrophenol was filtered as a solid.
  • the mixture was filtered and the active carbon solid was washed with water (400 ml), 2% isopropanol (100 ml), 4% isopropanol (200 ml) and 6% isopropanol (200 ml).

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Abstract

Un procedimiento enzimático para obtener 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, útil en la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal en humanos, que comprende: a) hacer reaccionar durante 2-48 h, D-xilosa y un β-D-galactopiranosido en un medio tamponado a un pH 5.0-9.0 y a una temperatura que oscila entre el punto de congelación de la mezcla y 45 °C, al que se añaden 10-10.000 unidades de β-D-galactosidasa por gramo de β-D-galactopiranosido; b) detener la reacción mediante desactivación de la enzima y c) aislar y cristalizar las fracciones que contienen 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa en una mezcla de cristalización seleccionada entre acetonal/metanol (5:1-20:1) y acetona/agua (5:1-20:1)

Description

TÍTULO DE LA INVENCIÓN
UN PROCEDIMIENTO ENZIMÁTICO PARA OBTENER 4-0-β-D-
GALACTOPIRANOSIL-D-XILOSA, 4-0-β-D-GALACTOPIRANOSIL-D-
XILOSA OBTENIDA DE ACUERDO CON EL PROCEDIMIENTO, COMPOSICIONES QUE LA CONTIENEN Y SU USO EN LA EVALUACIÓN
DE LA LACTASA INTESTINAL La presente invención está comprendida en el campo de los procedimientos para. obtener compuestos, concretamente disacáridos útiles en los métodos de evaluación incruentos de la actividad lactasa intestinal.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La deficiencia o baja actividad en lactasa intestinal que resulta en una capacidad insuficiente o hasta nula para digerir lactosa, es rara como error metabólico congénito, pero es un síndrome común en humanos adultos. Sin embargo, en la mayor parte de los mamíferos existe una acusada disminución de la actividad lactasa desde el momento del destete. En humanos cuyos antepasados hayan dependido de un consumo sustancial de leche o productos ' lácteos durante largo tiempo, esta disminución es menos frecuente. Por otra parte, en lactantes es bastante infrecuente la deficiente o baja actividad en lactasa intestinal.
La determinación de la actividad lactasa intestinal es de importancia en pediatría y gastroenterología y puede llevarse a cabo directamente, a partir de una muestra de mucosa, o indirectamente, a partir del nivel de glucosa en sangre o del hidrógeno espirado, después de la administración de una dosis de lactasa al individuo. La determinación directa tiene la desventaja de constituir un método complejo y caro -. debido a que requiere instrumental específico y personal muy especializado para la práctica de la extracción de la muestra que deberá someterse a análisis posteriormente, a parte de resultar desagradable y no carente de peligro para el individuo.
Otros métodos de determinación de la lactasa intestinal se basan en que determinados disacáridos son, en base a su afinidad a la lactasa, susceptibles de actuar como sustrato de la lactasa y se transforman, por acción de la enzima, en determinados monosacáridos que son absorbidos fácilmente por el intestino y eliminados por la orina.
En la patente española ES-P-9001680 se describe la preparación del disacárido 4-O-β-galactopiranosil-D- xilosa de la fórmula (I)
Figure imgf000004_0001
OH OH
para la evaluación de la actividad lactasa intestinal. Dicho disacárido se administra oralmente, actúa como sustrato de la lactasa intestinal y por tanto se descompone, en el tracto intestinal, en xilosa y galactosa, siendo absorbida la xilosa y eliminada por la orina en la que la xilosa puede evaluarse directamente mediante un método colorimétrico simple.
Las cantidades de xilosa excretadas en orina están correlacionadas con los niveles de lactasa intestinal.
La patente española ES-P-9001680 también describe un método de preparación básicamente para la 4-O-β- galactopiranosil-D-xilosa, que comprende una síntesis a partir de bencil β-D-xilopiranósido y que sigue una secuencia de operaciones que implica reacciones de protección selectiva, glicosilación y desprotección. Tanto el número de etapas de reacción, como la utilización de reactivos caros tales como el triflato de plata en la reacción de glicosilación, y el empleo de columnas de cromatografía en la purificación de intermedios y del producto final, producen costes y presentan dificultades para llevar a cabo este procedimiento a escala industrial.
Las patentes españolas ES-P-9502185 y ES-P-9701156 describen procedimientos enzi áticos para la preparación de mezclas de disacáridos galactopiranosil-xilosas que contienen el disacárido (I) y sus regioisómeros 2-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa y la 3-0-β-D-galactopiranosil- D-xilosa que, respectivamente, presentan las siguientes fórmulas
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OH
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Los procedimientos descritos en las patentes españolas ES-P-9502185 y ES-P-9701156 permiten obtener en una sola etapa de reacción y tras purificación cro atográfica, mezclas de 2-, 3- y 4-O-β-D- galactopiranosil-D-xilosa útiles como sustratos y, por tanto, para la determinación de la actividad de la enzima lactasa intestinal. Dichos procedimientos, aunque viables a partir de sustratos y enzimas asequibles, presentan dificultades, desde el punto de vista de la síntesis industrial, en cuanto a la caracterización de las proporciones más adecuadas, la reproducibilidad de la preparación en dichas proporciones y la determinación de posibles impurezas.
Por otra parte, Gorin et al. en "The Synthesis of β- Galacto- And β-Gluco-Pyranosyl Disaccharides by Sporoboloinvces Singularis" , Can. J. Chem. 42(1964) 2307- 2319, describen la síntesis de una pluralidad de disacáridos, entre ellos 2-O-β-D-galactopiranosil-D- xilosa y la 3-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, mediante un procedimiento utilizando células. En esta publicación no se describe ninguna utilidad de los diversos disacáridos sintetizados.
OBJETO DE LA INVENCIÓN Es un primer objeto de la presente invención superar los inconvenientes del estado de la técnica anteriormente descrito. Es otro objeto de la invención, proporcionar un procedimiento mejorado que implica una reacción enzimática entre D-xilosa y un sustrato β-D- galactopiranósido y una posterior fase de aislamiento y purificación, que permite aumentar la proporción de 4-0- β-D-galactopiranosil-D-xilosa en la mezcla final de la reacción enzimática frente a los disacáridos 2- y 3-0-β- D-galactopiranosil-D-xilosa, a partir de cuya mezcla final puede aislarse la 4-0-β-D-galactopiranosil-D-χilosa mediante operaciones simples.
La 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa que puede obtenerse mediante el procedimiento anteriormente mencionado así como las composiciones que comprenden dicha 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, constituyen ulteriores objetos de la invención.
Es otro objeto de la invención usar la 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa en la preparación de composiciones y disoluciones útiles en la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los objetos anteriormente mencionados se consiguen de acuerdo con la presente invención, mediante un procedimiento enzimático para obtener 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa que comprende una primera etapa en la que se prepara una primera mezcla de reacción de
2-20 % en peso de D-xilosa
0,5-5% en peso de un sustrato β-D- galactopiranósido 75-97,5 % en peso de un medio de reacción que comprende agua tamponada a un pH entre 5.0 y 9 . 0 ; añadiéndose 10 a 1.000 unidades de una enzima β-D-galactosidasa, por gramo de β-D-galactopiranósido a la primera mezcla de reacción; y obteniéndose una segunda mezcla de reacción; una segunda etapa en la que la segunda mezcla de reacción se somete a una reacción a una temperatura comprendida entre una temperatura superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción y 452C, durante 2 a 48 horas, para formar disacáridos en la segunda mezcla de reacción; una tercera etapa en la que se para la reacción cuando se han formado los disacáridos en la cantidad deseada, mediante un tratamiento elegido entre una desactivación de la β-D-galactosidasa por congelación de la segunda mezcla de reacción a una temperatura entre - 209C y -1702C, una desactivación de la β-D-galactosidasa por calentamiento de la segunda mezcla de reacción a una temperatura entre 95 y 110se, y una separación de la J3-D- galactosidasa de la segunda mezcla de reacción por ultrafiltración; obteniéndose una tercera mezcla de reacción; una cuarta etapa en la que se separa de la tercera mezcla de reacción, mediante extracción o filtración, un fragmento aglicónico del sustrato β-D-galactopiranósido usado en la primera etapa; obteniéndose una cuarta mezcla de reacción; una quinta etapa en la que se aislan fracciones que contienen 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, seleccionada entre una adición de celita a la cuarta • mezcla de reacción, seguida de extracción sólido-líquido con un disolvente y elución con un primer eluyente en una columna; y una adición directa de carbón activo a la cuarta mezcla de reacción seguida de filtración y elución con un segundo eluyente, y una sexta etapa, las fracciones que contienen 4-0- β-D-galactopiranosil-D-χilosa se cristalizan en una mezcla de cristalización seleccionada entre mezclas de acetona/metanol en una relación entre 5/1 a 20/1, y mezclas de acetona/agua en una relación entre 5/1 a 20/1.
De acuerdo con la invención, la proporción de D- xilosa en la segunda mezcla de reacción es preferentemente de 7,5% en peso, la proporción del β-D- galactopiranósido en la segunda mezcla de reacción es de 1,5% en peso, y se añaden 100 unidades de β-D- galactosidasa, por gramo de β-D-galactopiranósido.
Opcional ente, el medio de reacción puede comprender además al menos un medio codisolvente seleccionado entre dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dioxano y mezclas de los mismos, preferentemente en una proporción del 20% referida al medio de reacción. En una realización de la invención, el medio de reacción esta tamponadσ a pH 7. La reacción convenientemente se lleva a cabo a temperatura constante, a fin de aumentar su reproducibilidad. En una realización del procedimiento de la invención, la temperatura de reacción es superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción e inferior a 40se. En otra realización, la reacción se realiza a temperatura ambiente, lo cual permite buenos rendimientos sin necesidad de enfriar la segunda mezcla de reacción. La reacción también puede realizarse a -52C, o a 372C. La temperatura de reacción es preferentemente inferior a O≤C pero superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción.
De acuerdo con la invención, el sustrato β-D- galactopiranósido preferentemente se selecciona entre o- nitrofenil β-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y lactosa. La enzima β-galactosidasa puede ser β-galactosidasa de E. coli o de Kluyveramyces lactis (como por ejemplo AXILACT®). Cuando se usa Gal-ONP como sustrato se forma en la reacción o-nitrofenol que se elimina por extracción con acetato de etilo en el caso de que la reacción se pare por calentamiento, o bien se elimina por simple filtración en el caso de que la reacción se pare por enfriamiento .
Cuando, en la tercera etapa del procedimiento la reacción se para mediante congelación de la segunda mezcla de reacción, se aplica preferentemente una temperatura de -782C. Por otra parte, cuando en la tercera etapa la reacción se para mediante calentamiento de la segunda mezcla de reacción, se aplica preferentemente una temperatura de 100se. En la quinta etapa, la 4-0-β-D-galactopiranosil-D- xilosa puede aislarse de la mezcla de reacción, mediante varios métodos alternativos .
Según un primer método alternativo, se elimina el agua de la cuarta mezcla de reacción para obtener un residuo de reacción que contiene los disacáridos, se somete el residuo de reacción a un tratamiento de acetilación para obtener un derivado peracetilado de 4-0- β-D-galactopiranosil-D-xilosa, y a una separación del derivado peracetilado en columna cromatográfica en gel de sílice. La acetilación del residuo de reacción se realiza preferentemente con anhídrido acético en piridina, mientras que, preferentemente, la desacetilación del derivado peracetilado se realiza catalíticamente con metóxido sódico en metano1. Según un segundo método alternativo, la cuarta mezcla de reacción se somete a una elución en columna con un primer eluyente que puede seleccionarse entre mezclas de agua con metanol, etanol o isopropanol, preferentemente una mezcla agua/isopropanol con una proporción de isopropanol de 1 a 10% (v/v) , preferentemente del 2% (v/v) .
La elución se lleva a cabo en una columna de filtración seleccionada entre columnas de filtración con rellenos de polímeros de dextranos entrecruzados, como or ejemplo una columna con relleno de SEPHADEX, columnas de filtración con rellenos de polímeros de acrilamida, como por ejemplo una columna con relleno de BIOGEL, y columnas de filtración de carbón activo o de carbón activo-celita, para obtener fracciones que contienen 4- O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa .
Preferentemente, la cuarta mezcla de reacción se concentra antes de someterse a la elución en la columna. Según un tercer método alternativo se adiciona celita a la cuarta mezcla de reacción, se concentra hasta sequedad la mezcla así obtenida y se somete el residuo a una extracción sólido-líquido con un disolvente orgánico en un extractor "soxhlet" seguida de elución en una columna. El disolvente preferido para la extracción sólido-líquido es acetato de etilo. La columna está seleccionada entre columnas de filtración con rellenos de polímeros de dextranos entrecruzados, como por ejemplo una columna con relleno de SEPHADEX, columnas de filtración con rellenos de polímeros de acrilamida, como por ejemplo una columna con relleno de BIOGEL, y columnas de filtración de carbón activo o de carbón activo-celita. Preferentemente la columna es de carbón activo-celita, en la que se desactiva el carbón mediante adición de ácido clorhídrico.
Este tercer método alternativo ofrece la ventaja de eliminar la mayor parte de la xilosa -sobre todo cuando se usa en gran exceso en la reacción - antes de la elución en la columna con lo cual el relleno, así como la cantidad de primer eluyente que se necesita para la elución es mucho menor. Otra ventaja de este tercer método alternativo es que la extracción sólido-líquido en acetato de etilo es completamente selectiva puesto que en la fase líquida no se observa presencia de disacáridos, sino únicamente de xilosa y galactosa.
Según un cuarto método alternativo la elución en la quinta etapa se realiza en lugar de utilizando una columna de relleno, adicionando carbón activo a la cuarta mezcla de reacción una vez separado el fragmento aglicónico del sustrato en la cuarta etapa, consiguiendo así que la 4-0-β-D-galactσpiranosil-D-xilosa, se adsorba sobre el carbón activo y eluyendo la 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa del carbón activo con un segundo eluyente. Dicha elución se lleva a cabo preferentemente mediante lavados consecutivos con agua y con isopropanol diluido con proporción creciente en volumen de isopropanol en pasos sucesivos. La proporción en volumen de isopropanol está comprendida entre 1% y 3% en un primer paso, entre un 3% y un 5% en un segundo paso, y entre un 5% y un 7% en un tercer paso. La concentración de isopropanol preferida para el lavado es una secuencia de isopropanol al 2%, seguida de elución con isopropanol al 4% y seguida de elución con isopropanol al 6%. Del residuo obtenido por concentración, se obtiene la 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa pura cristalizándola en acetona- agua.
Preferentemente, según este cuarto método alternativo se usa o-nitrofenil β-D-galactopiranósido como sustrato para la reacción.
Según este cuarto método alternativo se obtienen múltiples ventajas tales como que no es necesario calentar la segunda mezcla de reacción a 1002C para detener la reacción, ni tampoco separar el fragmento aglicónico del sustrato en la cuarta etapa mediante extracción. De igual modo, se evita la necesidad de concentrar la cuarta mezcla de reacción, con lo que no se produce caramelización de la misma. Se reduce la cantidad de carbón activo que se necesitaría para el relleno de una columna, se reduce también la cantidad total de eluyentes, y se evita el uso de celita.
De acuerdo con la invención según la sexta etapa se cristalizan las fracciones que contienen 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa obtenidas en una mezcla de cristalización elegida entre mezclas de acetona/metanol en una relación entre 5/1 a 20/1, y mezclas de acetona/agua en una relación entre 5/1 a 20/1, preferentemente una relación de 10/1. La invención también se refiere a 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa obtenida mediante el procedimiento anteriormente descrito, y a composiciones y disoluciones salinas o acuosa, que comprenden una 4-0-β-
D-galactopiranosil-D-xilosa obtenida mediante dicho procedimiento, así como al uso de una 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa en la preparación de composiciones y disoluciones para la evaluación in vivo de lactasa intestinal en humanos.
En tales composiciones y disoluciones, la β-D- galactopiranosil-D-xilosa se combina con cantidades farmacéuticamente aceptables de al menos un aditivo seleccionado entre estabilizantes, protectores, saborizantes, lactosa, gelificantes, fluidificantes y conservantes, farmacéuticamente aceptables y en sí convencionales.
La 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa o las composiciones o disoluciones que la contienen, se administran por vía oral y conducen a la aparición en orina de xilosa que, valorada espectrofotométricamente-, se utiliza de manera específica, rutinaria, incruenta y sencilla para la evaluación diagnóstica de las deficiencias en actividad lactasa.
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se describirá ahora en base a unos ejemplos que ilustrarán con más detalle algunas de las características anteriormente descritas.
Ejemplo 1: Para determinar la influencia de la temperatura de reacción se realizó el siguiente ensayo: Se prepararon muestras de mezclas de reacción compuestas por
125mg (500mM) de D-xilosa
25mg (50mM)de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido l,75ml de un medio de reacción comprendido por una disolución acuosa tamponada a pH 7
(0,05M KH2PO4/K22HPO4, l M MgCl2, 5mM mercaptoetanol ) ,
a las que se añadieron unidades de enzima β-galactosidasa de E. Coli en función de las temperaturas de reacción aplicadas, de acuerdo con el siguiente esquema:
temperatura de reacción unidades de enzima añadidas
(2C) (u)
45 1,6
37 1,6
25 1,6
5 10 -5 20
Los incrementos en la cantidad de enzima fueron necesarios para compensar la ralentización que se produce en la reacción por la bajada de la temperatura de reacción. Cabe indicar que es posible operar a temperaturas debajo del punto de congelación del agua gracias al descenso crioscópico que se produce en el medio de reacción debido a la alta concentración de azúcares en las muestras. Se determinó, para cada una de las muestras y para cada etapa del procedimiento, la relación entre 4-, 2- y 3-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, por cromatografía de gases con un cromatógrafo equipado con detector de ionización de llama y columna capilar SE-54 de 15 de longitud, 0,15mm de diámetro interno y 0,3μm de espesor. Se empleó un flujo de nitrógeno de lml/min. El programa de temperaturas utilizado era:
Temperatura inicial: 1602c Tiempo inicial: 2 min
Incremento temperatura: 5SC/min
Temperatura final: 2502C.
Las muestras se analizaron después de trimetilsililación mediante el siguiente protocolo:
Una alícuota (lOμl) se congeló a -170 se y se liofilizó hasta obtener un residuo seco, tras lo cual se añadió, al residuo seco, piridina (25μl) que contenía como referencia interna bencil β-D-xilopiranósido (lO M) y N-trimetilsilimidazol (25μl), y se continuó la calefacción a 60≤C durante 30 minutos. Los tiempos de retención de los picos asignables a los distintos disacáridos fueron los siguientes :
Bencil β-D-xilopiranósido: 12,04min
2-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa: 18,46 y 19,50min
3-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa : 18 , 30min
4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa: 20,35 y 20,50min
La siguiente tabla refleja las proporciones tomadas en el máximo de formación de disacáridos, de 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa (=compuesto I) frente a la suma de sus regioisómeros 2- y 3-0-β-D-galactopiranosil-D- xilosa que se obtuvieron: Tabla 1
Tempera tura Tiempo aproximado de relación compuesto I / reacción (minu tos) compuestos II + III
45 90 68:32
37 150 71:29
25 180 79:21
5 270 80:20
-5 120 83:17
De la anterior tabla se desprende que a medida que se bajaba, la temperatura, se produjo un aumento en la proporción de 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa.
Ejemplo 2: Para determinar la influencia del pH en la reacción, se prepararon las siguientes muestras:
Gal-ONP (50mM): 25mg
D-xilosa (500mM): 125mg Galactosidasa de E. coli : 1,6 u Disolución acuosa tamponada( fosfato potásico 50mM, lmM MgCl2/ 5mM mercaptoetanol)a pH: 8,5 l,6ml
7 1, 6ml 5 l,6ml
y se hicieron reaccionar a 372C.
El progreso de la reacción se siguió del mismo modo que se describe en el ejemplo 1. La siguiente tabla refleja las proporciones de 4-0- β-D-galactopiranosil-D-xilosa (=compuesto .1) frente a la suma de sus regioisómeros 2- y 3-0-β-D-galactopiranosil- D-χilosa que se obtuvieron: Tabla 2
PH Tiempo aproximado de relación compuesto I / reacción (minutos) compuestos II + III
8,5 60 68:32
7 150 71:29
5 180 81:19
De la anterior tabla se desprende que en medio básico (pH=8,5), la proporción del compuesto I era menor que en medio neutro (pH=7), detectándose la mayor proporción del compuesto I en medio ácido (pH=5).
Ejemplo 3: Para sintetizar 4-0-β-D-galactopiranosil-D- xilosa se disolvieron 6g de o-nitrofenil β-D- galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0,05M KH2PO4/ 22HPO4, lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol ) , se añadieron 2mg (640u) de enzima β- galactosidasa de E. Coli , y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 30s C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 4 horas). El seguimiento de la reacción se llevó a cabo por cromatografía en capa fina con isopropanol/NH3(30%)/H20 = 7,5/0,5/2,5 como eluyente y tomando como referencia los valores de Rf siguientes: Rf(Gal-ONP): 0,58
Rf (D-xilosa): 0,47
Rf (4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,17 Rf ( 2-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa + 3-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,26
La reacción se paró por calentamiento en baño de agua a 100SC durante 10 minutos, y seguidamente se extrajo el o-nitrofenol formado con CH2C12- La disolución acuosa se concentró hasta sequedad y el residuo se acetiló de manera en sí convencional (anhídrido acético/piridina = 1:1, a temperatura ambiente, durante una noche y con agitación magnética). Pasado este tiempo, la mezcla de reacción se concentró y los restos de piridina y anhídrido acético se eliminaron por adiciones y evaporaciones sucesivas de tolueno. Las sales precipitadas se filtraron, el filtrado se concentró a sequedad y el residuo se cromatografió en columna de gel de sílice utilizando como eluyente un gradiente de hexano/acetato de etilo de 4:1 - 1:1. De la columna se eluyó primero la D-xilosa acetilada y después la mezcla de los disacáridos acetilados. Una vez concentradas las fracciones que contenían la mezcla de disacáridos, el residuo se disolvió en MeOH, se añadió una disolución de MeONa/MeOH 1M, y la mezcla así obtenida se agitó hasta que la desacetilación era completa (seguimiento por tic con isopropanol/NH3/H 0) . La mezcla se neutralizó con AMBERLITA IR-120 (H+) y se concentró hasta sequedad. La mezcla de disacáridos libres se cristalizó dos veces sucesivas con MeOH/acetona, obteniéndose l,07g de 4-0-β- D-galactopiranosil-D-xilosa pura con un 17% de rendimiento basado en el Gal-ONP inicial. (Punto de fusión: 171-176SC; XHRMN (D20) : δ 5,17 Y 4,58 (2D, lh, J 3,8 y 7,8Hz, H-lα y H-lβ), 4,55 y 4,45 (2d, 1H, J 7.8 Hz , H-l'), 4,05 (dd, 1H, J 5.3 y 11.6Hz, H-5e) , 3,38 (dd, 1H, J 10,6 y 11,6 Hz ) , 3,25 (dd, 1H, J 7,8 y 9,4 Hz , H-2 ' ) .
Ejemplo 4: Se preparó una columna de activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HCl (35%) para desactivar el carbón, asi como para lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm(a) x 50cm, y se compactó. Para sintetizar 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0,05M KH2P04/K22HP04, lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol) , se añadieron 2mg (640u) de enzima β- galactosidasa de E. Coli , y se sometió la disolución así obtenida a incubación a 379 c en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 2 horas) . Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 100se durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo. La disolución acuosa se concentró hasta un volumen aproximado de 50ml, se filtró a través de lana de vidrio y se pasó por la columna de carbón ,activo/celita. En primer lugar se eluyó con agua el exceso de D-xilosa y seguidamente, utilizando un gradiente fraccionado de EtOH/H20 (2%-10% de EtOH) se recogió la mezcla de disacáridos. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron y concentraron hasta un volumen reducido, tras lo cual se añadió acetona hasta la aparición de turbidez dejándose reposar la mezcla sí obtenida en frío. La 4-0- β-D-galactopiranosil-D-xilosa cristalizó de forma pura, obteniéndose 970mg, es decir, un 19% basado en el Gal-ONP inicial, cuyos datos espectrales coincidieron con los expuestos con respecto al producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 3.
Ejemplo 5: Se preparó una columna de carbón activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HCl (35%) para desactivar el carbón y lavar restos de hierro y ' cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm(σ) x 50cm, y se compactó.
Para sintetizar 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0,05M KH2PO4/ 22HPO4, lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol) , se añadieron 2mg (640u) de enzima β- galactosidasa de E. Coli , y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 372 c en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 2 horas). Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 1002C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo. La disolución acuosa se concentró hasta un volumen de aproximadamente 50ml, se filtró a través de lana de vidrio y se pasó por la columna de carbón activo/celita.
Para cristalizar la 4-0-β-D-galactopiranosil-D- xilosa, en primer lugar se eluyó con agua el exceso de D- xilosa y seguidamente, utilizando un gradiente fraccionado de Et0H/H20 (2%-10% de EtOH) se recogió la mezcla de disacáridos. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron, se concentraron a un volumen reducido y se disolvieron en la cantidad mínima posible de agua, tras lo cual se añadió acetona gota a gota, hasta la aparición de turbidez dejándose cristalizar la mezcla así obtenida a temperatura ambiente durante dos horas . Al cabo de dos horas se comprobó, con una capa fina del sobrenadante (transparente) que aún quedaba una cantidad de 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa sin cristalizar. Se volvió a añadir acetona hasta turbidez y se dejo reposar otras dos horas. Finalmente, se añadió más acetona y se almacenó la muestra en nevera durante la noche y se comprobó que el Í9
sobrenadante producido contenía sólo una mínima cantidad de 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa. Los cristales de 4- O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se filtraron y lavaron con acetona.
La 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se obtuvo de forma pura, obteniéndose 1557mg, es decir, un 30% basado en el Gal-ONP inicial, cuyos datos espectrales coincidieron con los expuestos con respecto al producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 3.
Ejemplo 6: Se preparó una • columna de carbón activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 15Oral de HCl (35%) para desactivar el carbón y lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm(0) x 50cm, y se compactó. Para sintetizar 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa n 330ml de agua tamponada a pH 6,8 (0,05M KH2P04/K22HP04, lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol ) , se añadieron 70 unidades de enzima β- galactosidasa de Kluyveramyces lactis (MAXILACT®), y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37 s C en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (aproximadamente 2 horas). La reacción se siguió mediante cromatografía de capa fina con isopropanol/NH3/H20 (7,5/0,5/2,5) resultando los siguientes Rf ' s :
Rf (Gal-ONP): 0,58
Rf (D-xilosa): 0,47 Rf (4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,17 Rf ( 2 -0 -β-D-ga lactopiranos il -D-xi losa
+ 3 -0-β-D-galactopiranos i l -D-χilos a ) : 0 , 26
Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 4, se paró la reacción por calentamiento a 1009C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo y se filtró para eliminar restos de la enzima. La disolución acuosa se concentró a vacío a un volumen aproximado de 45ml, y se pasó por columna de carbón activo/celita. En primer lugar se eluyó con agua el exceso de D-xilosa y seguidamente, utilizando un gradiente fraccionado de EtOH/H20 (2% 10% de EtOH) se recogió la mezcla de disacáridos. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-β-D-galactopiranosil- D-xilosa se juntaron y se concentraron hasta un volumen reducido, tras lo cual se añadió acetona hasta la aparición de turbidez dejándose reposar la mezcla así obtenida en frío. La 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa cristalizada se filtró por placa filtrante, obteniéndose 817mg, es decir, un 16% basado en el Gal-ONP inicial.
Ejemplo 7: Se preparó una columna de carbón activo/celita mezclando en seco 200g de carbón activado (DARCO G-60) y 200 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 150ml de HCl (35%) para desactivar el carbón y lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía de 5cm(0) x 50cm, y se compactó.
Para sintetizar 4-0-β-D-galactopirano.sil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0,05M KH2PO4/K22HPO4, lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol) , se añadieron 80 unidades de enzima β- galactosidasa de E . col i , y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37° C en un agitador orbitálico durante 24 horas. La reacción se siguió mediante cromatografía de capa fina con isopropanol/NH3/H20 (7,5/0,5/2,5) resultando los siguientes Rf ' s :
Rf (Gal-ONP): 0,58
Rf (D-xilosa): 0,47
Rf (4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,17 Rf (2-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa
+ 3-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa) : 0,26
Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 1002C durante 10 minutos y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo y se filtró para eliminar restos de la enzima. La disolución acuosa se concentró a vacío hasta un volumen aproximado de 70ml, y la disolución concentrada se eluyó a través de una columna de carbón activo/celita. En primer lugar se eluyó con isopropanol/agua al 2% y se recogieron 1,3 litros. Después se recogieron fracciones al 4% hasta 2,6 litros, utilizándose un volumen total de 3,9 litros.
Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0^ β-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron y concentraron hasta un volumen reducido, tras lo cual se añadió acetona hasta la aparición de turbidez dejándose reposar la mezcla así obtenida en frío. La 4-0-β-D-galacto'piranosil- D-xilosa cristalizada se filtró por placa filtrante, obteniéndose 1.213mg, es decir, un 24% basado en el Gal- ONP inicial.
Ejemplo 8: Se preparó una columna de carbón activo/celita mezclando en seco 24g de carbón activado (DARCO G-60) y 24 g de celita, y se añadió agua hasta que se formó una pasta homogénea. La pasta se trató con 18ml de HCl (35%) para desactivar el carbón así como lavar restos de hierro y cenizas alcalinas, y posteriormente se lavó con agua hasta que las aguas de lavado salieron neutras. Una vez lavada, se empaquetó en una columna de cromatografía y se compactó.
Para sintetizar 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se disolvieron 5g de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (Gal-ONP) y 25g de D-xilosa en 330ml de agua tamponada a pH 7 (0,05M KH2P04/K22HP04, lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol) , se añadieren 80 unidades de enzima ñ- galactosidasa de E. Coli , y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 372 c en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (24 horas). La reacción se siguió mediante cromatografía de capa fina con isopropanol/NH3/H20 (7,5/0,5/2,5) de manera análoga a la indicada en el ejemplo 7. Siguiendo la metodología expuesta en el ejemplo 3, se paró la reacción por calentamiento a 1002C durante 10 minutos, se dejó enfriar y se extrajo el ortonitrofenol formado con acetato de etilo. A la disolución acuosa se añadió celita (40g) y la mezcla se concentró hasta sequedad. El residuo sólido se sometió a una extracción sólido-líquido usando un extractor "soxhlet" equipado con cartucho de celulosa y usando acetato de etilo (500ml) como disolvente. Al cabo de 23 horas el sólido resultante se lavó con agua (3 x 40 mi) y la disolución acuosa se eluyó a través de la columna de carbón activo-celita. En primer lugar se eluyó con isopropanol/agua al 2% y a continuación con isopropanol/agua al 4%, utilizándose un volumen total de eluyente de 400 mi. Las fracciones enriquecidas en el regioisómero 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se juntaron y concentraron hasta sequedad. El residuo se cristalizó de acetona-agua de manera similar a la descrita en el ejemplo 7, obteniéndose 0,44g de disacárido puro y cristalino.
Ejemplo 9: Para sintetizar 4-0-β-D-galactopiranosil-D- xilosa se disolvieron 4,12g de o-nitrofenol β-D- galactopiranósido (Gal-ONP) y 20,6 g de D-xilosa en 272ml de agua tamponada a pH 7 (0,05M KH2P0 /K22HP0 , lmM MgCl2, 5mM mercaptoetanol) , se añadieron 66 unidades de enzima β-galactosidasa de E. Coli , y la disolución así obtenida se sometió a incubación a 37 SC en un agitador orbitálico hasta que el Gal-ONP prácticamente se consumió (21 horas). La reacción de detuvo por enfriamiento a 02c y se filtró el o-nitrofenol como un sólido. Al filtrado se le añadieron 60 g de carbón activo y la mezcla resultante se agitó durante 30 min. Por medio de tic del sobrenadante se observó la ausencia de disacárido en disolución, al estar adsorbido sobre el carbón activo. La mezcla se filtró y el sólido de carbón activo se lavó con agua (400 mi), isopropanol al 2% (100 mi), isopropanol al 4% (200 mi) e isopropanol al 6% (200 mi). Las fracciones que contenían disacárido 4-0-β-D-galactopiranosil-D- xilosa se concentraron y el residuo (2,38 g) se cristalizó de' acetona-agua obteniéndose 1,55 g de un sólido que se cristalizó de nuevo de la misma mezcla de disolventes de manera análoga a la del ejemplo 7. Se obtuvieron 1,32 g de disacárido puro (32%).

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento enzimático para obtener 4-0-β- D-galactopiranosil-D-xilosa que comprende una primera etapa en la que se prepara una primera mezcla de reacción de
2-20 % en peso de D-xilosa
0,5-5% en peso de un sustrato β-D- galactopiranósido
75-97,5 % en peso de un medio de reacción que comprende agua tamponada a un pH entre 5.0 y 9.0; añadiéndose 10 a 1.000 unidades de una enzima β-D-galactosidasa, por gramo de β-D-galactopiranósido a la primera mezcla de reacción; y obteniéndose una segunda mezcla de reacción; una segunda etapa en la que la segunda mezcla de reacción se somete a una reacción a una temperatura comprendida entre una temperatura superior al punto de congelación de la segunda mezcla de reacción y 452C, durante 2 a 48 horas, para formar disacáridos en la segunda mezcla de reacción; una tercera etapa en la que se para la reacción cuando se han formado los disacáridos en la cantidad deseada, mediante un tratamiento elegido entre una desactivación de la β-D-galactosidasa por congelación dé la segunda mezcla de reacción a una temperatura entre - 202C y -1702C, una desactivación de la β-D-galactosidasa por calentamiento de la segunda mezcla de reacción a una temperatura entre 95 y 1102C, y una separación de la β-D- galactosidasa de la segunda mezcla de reacción por ultrafiltración; obteniéndose una tercera mezcla de reacción; una cuarta etapa en la que se separa de la tercera mezcla de reacción, mediante extracción o filtración, un fragmento aglicónico del sustrato β-D-galactopiranósido usado en la primera etapa; obteniéndose una cuarta mezcla de reacción; una quinta etapa en la que se aislan fracciones que contienen 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, caracterizado porque, la quinta etapa se selecciona entre una adición de celita a la cuarta mezcla de reacción, seguida de extracción sólido-líquido con un disolvente y elución con un primer eluyente en una columna; y una adición directa de carbón activo a la cuarta mezcla de reacción seguida de filtración y elución con un segundo eluyente, y porque en una sexta etapa, las fracciones que contienen 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa se cristalizan en una mezcla de cristalización seleccionada entre mezclas de acetona/ etanol en una relación entre 5/1 a 20/1, y mezclas de acetona/agua en una relación entre 5/1 a 20/1.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la cuarta mezcla de reacción se concentra antes de someterse a la elución en la columna.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 , caracterizado porque la mezcla de acetona/metanol presenta una relación de 10/1.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de acetona/agua presenta una relación de 10/1.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el primer eluyente es una mezcla de agua/isopropanol que contiene 1 a 10% (v/v) de isopropanol .
6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla agua/isopropanol contiene un 2% (v/v) de isopropanol.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la quinta etapa consiste en la adición de celita a la cuarta mezcla de reacción y concentración hasta sequedad, seguida de una extracción sólido-líquido con un disolvente orgánico en un extractor soxhlet que lleva un cartucho de un material compatible con dicho disolvente, y elución con un primer eluyente en una columna seleccionada entre columnas de filtración con rellenos de polímeros de dextranos entrecruzados, columnas de filtración con rellenos de polímeros de acrilamida, columnas de filtración de carbón activo o columnas de carbón activo-celita.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el disolvente es acetato de etilo.
9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el disolvente se usa en una cantidad comprendida entre 10 mi y 25 mi por gramo de xilosa inicial.
10. Procedimiento según la reivindicación 7;; caracterizado porque la celita se usa en una cantidad comprendida entre lg y 2g por gramo de xilosa inicial.
11. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la columna es de carbón activo-celita en la que se desactiva el carbón mediante adición de ácido clorhídrico al 35%.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la celita se usa en una cantidad comprendida entre 0,5g y 2g de celita por gramo de xilosa inicial .
13. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el carbón activo se usa en una cantidad comprendida entre 0,5g y.2g de carbón activo por gramo de xilosa inicial.
14. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho primer eluyente se usa en una cantidad comprendida entre 5 mi y 25 mi por gramo de xilosa inicial.
15. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el ácido clorhídrico se usa en una cantidad comprendida entre 0,5ml y l,5ml por gramo de xilosa inicial.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en la quinta etapa la cuarta mezcla de reacción se somete a una adición directa con al menos un segundo eluyente sobre carbón activo en la que la 4-0- β-D-galactopiranosil-D-xilosa se adsorbe sobre el carbón activo y el segundo eluyente es agua seguido de isopropanol diluido con proporción creciente en volumen de isopropanol en pasos sucesivos.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la proporción en volumen de isopropanol está comprendida entre 1% y 3% en un primer paso, entre un 3% y un 5% en un segundo paso, y entre un 5% y un 7% en un tercer paso.
18. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el carbón activo se usa en una cantidad comprendida entre 2g y 4g de carbón activo por gramo de xilosa inicial.
19. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el segundo eluyente se usa en una cantidad total comprendida entre 30ml y 50ml de segundo eluyente por gramo de xilosa inicial.
20. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 16, caracterizado porque la reacción se para por enfriamiento de la segunda mezcla de reacción a 02c.
21. Procedimiento según la reivindicación 1, 16, y 20, caracterizado porque la cuarta mezcla de reacción se obtiene por separación del fragmento aglicónico de sustrato β-D-galactopiranósido mediante filtración.
22. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proporción de D-xilosa en la segunda mezcla de reacción es de 7,5% en peso.
23. Procedimiento según -la reivindicación 1, caracterizado porque la proporción del β-D- galactopiranósido en la segunda mezcla de reacción es de 1,5% en peso.
24. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se añaden 20 unidades de β-D- galactosidasa, por gramo de β-D-galactopiranósido.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de reacción comprende además al menos un medio codisolvente seleccionado entre dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dioxano y mezclas de los mismos.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque el medio de reacción comprende el 20% en peso del medio co-disolvente.
27. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo a temperatura constante.
28. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 27, caracterizado porque la temperatura de reacción es de
-52C a 409C.
29. Procedimiento según la reivindicación 1, o 27, caracterizado porque la temperatura de reacción es superior a la temperatura de congelación de la segunda mezcla e inferior- a 02c.
30. Procedimiento según la reivindicación 1, 28 o 29, caracterizado porque la temperatura de reacción es de - 52C.
31. Procedimiento según la reivindicación 1 o 28, caracterizado porque la temperatura de reacción es temperatura ambiente.
32. Procedimiento según la reivindicación 1, 26 o 27, caracterizado porque el medio de reacción está tamponado a pH 7.
33. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, en la tercera etapa,-• la reacción se para mediante congelación de la segunda mezcla de reacción a una temperatura de -789C.
34. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, en la tercera etapa, la reacción se para mediante calentamiento de la segunda mezcla de reacción hasta una temperatura de 100 C.
35. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, en la tercera etapa, la reacción se para mediante una separación de la β-D-galactosidasa por ultrafiltración.
36. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato β-D-galactopiranósido se selecciona entre o-nitrofenil β-D-galactopiranósido y lactosa.
37. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima β-galactosidasa es β- galactosidasa de E. coli .
38. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima β-galactosidasa es β- galactosidasa de Kluyveramyces lactis .
39. Una 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa caracterizada porque se ha obtenido mediante el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-38.
40. Una composición para la evaluación in vivo de la lactasa intestinal en humanos, caracterizada porque comprende una 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa obtenida mediante el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-38.
41. Una disolución para la evaluación in vivo de la lactasa intestinal en humanos, caracterizada porque comprende es una disolución seleccionada entre soluciones acuosas y soluciones salinas, de una 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa obtenida mediante el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-38.
42. Uso de 4-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa preparada según cualquiera de las reivindicaciones 1-38, en la preparación de una composición para la evaluación in vivo de lactasa intestinal en humanos.
43. Uso de β-D-galactopiranosil-D-xilosa preparada según cualquiera de las reivindicaciones 1-38, en la preparación de una disolución seleccionada entre soluciones salinas y soluciones acuosas, para la evaluación in vivo de lactasa intestinal en humanos.
44. Uso según la reivindicación 42 o 43, caracterizado porque la β-D-galactopiranosil-D-xilosa se combina con cantidades farmacéuticamente aceptables de ..al menos un aditivo seleccionado entre estabilizantes, protectores, saborizantes, lactosa, gelificantes, fluidificantes y conservantes .
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