JP3967403B2 - コレステロール脱水素酵素の安定化方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコレステロール脱水素酵素の安定化方法に関する。さらに詳しくは、主として臨床検査の分野での使用を目的とし、コレステロール脱水素酵素を安定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、酵素を用いた測定方法は、反応の特異性、再現性に優れ、操作が簡便であることなどから多数開発されてきた。特に臨床検査の分野では血液試料中の成分の測定に多くの方法が知られている。
しかし、一般に、酵素は試薬にしたとき安定性が悪いため種々の工夫が必要となっていた。例えば、酵素α−グルコシダーゼの安定化のために蛋白を修飾したり、有機溶媒としてグリセリンをＬＤＨに添加し、またアセトンをベンジルアルコール脱水素酵素に添加して安定化することなどが報告されている。また、ジチオスレイトールのようなＳＨ保護剤でウレアーゼの安定化をはかったり、リパーゼはＣａなどの金属イオンを添加して安定化することも知られている。
しかし、これらの方法では、酵素が異なると効果がないことが多く、酵素によって個々に安定化方法が検討されていた。特に近年、臨床検査の日常業務の効率化を図るため、使用する試薬を従来の凍結乾燥状から液状に変えることが多くなり、ますます試薬中の酵素を安定化することが重要になってきた。
ところで臨床検査の分野では最近、脂質の検査が増え、特にコレステロールは成人病のリスクファクターとして注目されており、コレステロールの検査がその分画成分の検査も含めて多くなっている。このコレステロールの測定は現在、酵素を用いる方法が一般的であり、それにはコレステロールオキシダーゼを用いる可視部での比色測定法とともに、コレステロール脱水素酵素を用いる紫外部での吸光度測定法が知られている。前者の方法においては、酵素反応により生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下、発色基質と反応させてキノン系色素に導く工程が必要であり、操作が煩雑である。また、測定条件によっては試料中のビリルビン、アスコルビン酸などによって誤差を生じるという欠点がある。それに対して、後者の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）の存在下、コレステロールとコレステロール脱水素酵素との酵素反応により生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を測定するもので、紫外部の吸光度の変化を測定するだけで行えるので簡便であり、且つ試料中の夾雑物の影響も少ないという利点を有する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、コレステロールの測定法としてはコレステロール脱水素酵素を用いる方法が好適であるが、この方法に使用されるコレステロール脱水素酵素は従来より溶液状態では不安定な酵素として知られている。コレステロール脱水素酵素含有溶液を安定化するには、アルブミンやコール酸又はその誘導体を添加することが行われているが、いずれも低温保存でわずかに効果があるものの、試薬としては十分な安定性は得られていない。
また、クリスタリンを生理活性蛋白質の溶液に含有せしめることにより安定化させる報告もあるが（特開平７−２３６４８３号公報）、コレステロール脱水素酵素に適用すると白濁防止の効果は認められるものの、酵素の活性を維持するには問題があった。
本発明は上記の問題を解消するもので、本発明はコレステロール脱水素酵素を安定化し、試薬として臨床検査の分野に有用に貢献することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、配糖体がコレステロール脱水素酵素の安定化に寄与することを見い出し、さらに研究を重ねた結果、コレステロール脱水素酵素に配糖体を添加することにより本発明の目的が達成されることが分かり、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は、
(1)コレステロール脱水素酵素に、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート及び２−エチル−ヘキシルグルコシドからなる群より選択される少なくとも一種の配糖体を添加することを特徴とするコレステロール脱水素酵素の安定化方法；
(2)コール酸及び／又はその誘導体を添加する上記(1)記載のコレステロール脱水素酵素の安定化方法；
(3) 臨床検査用試薬に用いられる上記(1)又は(2)記載のコレステロール脱水素酵素の安定化方法；
(4)臨床検査用試薬が液状試薬又は凍結乾燥試薬である上記(3)記載のコレステロール脱水素酵素の安定化方法；
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明で安定化させるコレステロール脱水素酵素は、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性のものと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のものがいずれも対象にできる。
【０００６】
本発明でコレステロール脱水素酵素に添加する配糖体には、本発明の目的に適合するものが全て使用できる。とりわけ糖部が、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、シュークロース、マルトースなどから選ばれるものがよい。また非糖部は疎水性の構造のものがよく、それには、高価を含むアルコール、脂肪酸、ステロイド、テルペノイドなどがある。
このような配糖体として具体的には、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミドおよびｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどを挙げることができ、２種以上を併用してもよい。
【０００７】
本発明においては、コール酸及び／又はその誘導体を添加することにより、さらにコレステロール脱水素酵素の安定性を向上させることができる。このようなコール酸誘導体としては本発明の目的を達成できるものなら全て用いることができる。とりわけ、コール酸の塩類（例えば、ナトリウム塩など）、デオキコール酸又はその塩類（例えば、ナトリウム塩など）、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルフォネート(CHAPS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルフォネート(CHAPSO)、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド(デオキシ-BIGCHAP)が好ましい。コール酸とその誘導体は併用することができる。
【０００８】
本発明における配糖体のコレステロール脱水素酵素の安定化作用は、コレステロール脱水素酵素の液状試薬において顕著な効果を奏するが、凍結乾燥試薬においても効果を発現し得る。液状試薬の場合、適当な緩衝液（ヘペス緩衝液など）に溶解したコレステロール脱水素酵素溶液に配糖体を添加することにより調製できる。また、凍結乾燥試薬の場合、コレステロール脱水素酵素溶液に配糖体を添加したのち常法に準じて凍結乾燥することにより調製できるが、凍結乾燥物に配糖体を添加してもよく、さらに凍結乾燥前の溶液及び凍結乾燥物の両方に配糖体を添加してもよい。
【０００９】
本発明でコレステロール脱水素酵素に添加する配糖体の添加量は、配糖体の種類、試薬中のコレステロール脱水素酵素含量、試薬の保存条件などに応じて適宜設定できる。液状試薬において、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを使用する場合は０．０１〜５０ｍＭが好ましく、より好ましいのは０．１〜２０ｍＭである。また、シュークロースモノラウレートを使用する場合は０．０５〜１００ｍＭが好ましく、より好ましいのは０．５ｍＭ〜５０ｍＭである。凍結乾燥試薬における配糖体の添加量は、上記の量に準じて設定することができる。
コール酸及び／又はその誘導体の添加量としては、０．０１〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％である。
【００１０】
本発明の方法及び組成物は、血中コレステロールの測定などに使用されるコレステロール脱水素酵素含有試薬の調製に有用であり、従来、コレステロール脱水素酵素は、緩衝液に溶解した場合は冷蔵条件で保存しても１ヵ月もすると残存活性が消失したが、本発明の方法で配糖体を添加することにより、残存活性を著しく高めることができる。その残存活性値は、添加する配糖体の種類により異なるが、あらかじめ残存活性値から予測した酵素量を試薬の分量にすることにより、試薬化ができる。
【００１１】
【発明の効果】
本発明によれば、コレステロール脱水素酵素を安定化することができ、試薬化が可能となり、とりわけ液状での試薬供給が可能となる。従って、従来、安定化ができなかったため凍結乾燥状で製品にしていたのに比べ、液状試薬を供給できるので、使用性が著しく向上し、臨床検査の分野に貢献できる。
【００１２】
【実施例】
次に実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
コレステロール脱水素酵素１単位／ｍｌを、５０ｍＭ、ｐＨ７．０のＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液に溶解する。それに配糖体として、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシドをそれぞれ１０ｍＭ加えて溶解し、サンプルとする。
それぞれ冷蔵、２５℃に所定期間放置後、以下に示す方法によりコレステロール脱水素酵素の残存活性を求めた。その結果を表１に示す。表１に示されるように、配糖体を添加すると残存活性が高いことが分かる。
【００１３】
コレステロール脱水素酵素活性の測定方法
１．試薬
以下の組成の試薬を使用した。
▲１▼基質液
コレステロール ０．１％
トリトンＸ−１００ ０．２％
▲２▼補酵素液
トリスヒドロキシメチルアミノメタン 300 mmol/l
ＮＡＤ 2 mmol/l
２．測定法
補酵素液１．０ｍｌと基質液２．０ｍｌを混和し２５℃に恒温する。恒温した混液にサンプル５０μｌを加えてよく混和し、精製水を対照に３４０ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化量を求める。サンプルに代えて生理的食塩水を使用して試薬ブランクを求める。サンプル調製直後の酵素活性量を１００％として保存後の残存酵素活性量を相対値で表した。
【００１４】
【表１】

Claims (4)

1. コレステロール脱水素酵素に、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート及び２−エチル−ヘキシルグルコシドからなる群より選択される少なくとも一種の配糖体を添加することを特徴とするコレステロール脱水素酵素の安定化方法。
2. コール酸及び／又はその誘導体を添加する請求項１記載のコレステロール脱水素酵素の安定化方法。
3. 臨床検査用試薬に用いられる請求項１又は請求項２記載のコレステロール脱水素酵素の安定化方法。
4. 臨床検査用試薬が液状試薬又は凍結乾燥試薬である請求項３記載のコレステロール脱水素酵素の安定化方法。