【発明の詳細な説明】
新規なグリコシダーゼの単離及び組成物技術的分野
本発明は新規なグリコシダーゼ類及びそれらの使用に関する。発明の背景
糖質が生物体の生物活動の基幹的な役割を果たすことが認識されたため、糖質
の研究が医学及び基礎科学で極めて重要視されるようになっている。分子が限り
なく複雑で多様でありまた科学研究者が1つの形態を他の形態から識別できるよ
うな分析ツール及び合成ツールが入手可能でないため、糖質の研究は他の種類の
生物分子の研究に立ち遅れている。糖質の天然形態
実際、糖質は、グリコシド結合によって共有結合して分枝状及び直鎖状の高分
子を形成する一連の単糖類から成り多糖類として知られる重合体として存在する
。更に、多糖類、またはより一般的にオリゴ糖類は、タンパク質または脂質のよ
うな高分子に結合して糖タンパク質または糖脂質を形成し得る。天然に産する多
糖類と違って、タンパク質または脂質と結合したオリゴ糖類は、単糖類の比較的
小さ
いサブセットから成る。
糖タンパク質と結合したオリゴ糖類は、分子の生物学的特性が多様でありまた
比較的短い単糖配列であるため研究し易いことを主な理由として、今日までの多
くの糖質研究の中心的役割を果たしている。糖タンパク質の構造的特徴
糖タンパク質は、タンパク質との結合に従って2つのグループに大別される。
ムチン型オリゴ糖、プロテオグリカン型、コラーゲン型及びエクステンシン型の
ようなO−グリコシル結合したオリゴ糖は、L−セリンまたはL−トレオニンの
ヒドロキシル酸素に結合している。N−グリコシル結合したオリゴ糖は、一般に
はAsn−Xaa−Ser/Thr(Xaaは任意のアミノ酸)の形態のトリペ
プチド中のアスパラギンのアミド窒素に結合している。N−結合したオリゴ糖は
更に、高マンノース型、複合体型及びハイブリッド型の3つのサブグループに分
類される。N−結合したオリゴ糖は多くの場合分枝状であり、分枝は一般にマン
ノース残基またはN−アセチルグルコサミン残基で生じる。これらの分枝状構造
は、分枝が2つの場合にはバイアンテナリーと呼ばれており、分枝が3つの場合
にはトリア
ンテナリーと呼ばれている。
オリゴ糖はその単糖配列によって特性決定され得る。オリゴ糖は、その還元末
端でタンパク質のアミノ酸残基に結合し、非還元末端はオリゴ糖の他端の末端単
糖中に見出される。オリゴ糖の他の重要な特徴は、個々の単糖類を結合させてい
るグリコシド結合である。グリコシド結合は、結合が生じる単糖環中の炭素に従
って番号付けされる。炭素は右回り方向で1から6までの番号を有している。こ
れらの炭素はいずれもグリコシド結合に関与し得るが、一般にはオリゴ糖の非還
元末端に近い方の単糖の炭素1が還元末端に近い方の単糖の他の任意の炭素とグ
リコシド結合を形成する。単糖上の各炭素は不斉炭素であるから、グリコシド結
合はαアノマーとβアノマーとから成る2つのアノマー配置で生じる。アノマー
形態は炭素上の反応性ヒドロキシル基の位置によって決定される。図1は、2つ
の単糖間の可能な結合配置を示す。オリゴ糖の合成及び分解
オリゴ糖は、グリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼとして知られ
る細胞中の酵素系によって合成される。典型的には、オリゴ糖が脂質キャリアー
に集合し、グリコ
シル化されるタンパク質内部の適当なアミノ酸に転移される。次いで、グリコシ
ダーゼによる切断及びグリコシルトランスフェラーゼに媒介される合成が生じ、
個々の単糖または予め集成されたオリゴ糖ユニットが除去または付加される。更
に、通常は加水分解酵素であるエキソグリコシダーゼが合成機能におけるトラン
スフェラーゼとして作用するときは微視的可逆性が生じ得る(Ichikawa
ら,1992,Anal.Biochem.202:215−238)。いくつかの
場合には、単糖の除去によって、次の鎖合成を容易にするようなコンホメーショ
ン変化が生じる(Camirandら,ch.,1992)。他の理論によって解釈
できる可能性も否定はしないが、1種類のタンパク質のグリコシル化パターンが
細胞内多様性を示す原因の1つは、任意の単一細胞中に種々の量及び種類の可用
なグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼが存在することにあると考
えられる。
個々のグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼの有効性は、細胞の
栄養環境(Goochee and Monica 1990,Bio/Tech
nology 6:67−71)、細胞の種類(Sheares and R
obbins 1986,PNAS 83:1993)及び細胞の恒常性状態(K
obata 1988,Gann Monogr.Cancer Res.34:3
−13)に依存する。これらの細胞内酵素の量及び種類の多様性に関連して、単
一糖タンパク質の多数の配糖形態が生じる(Parekhら,1987,EMBO
6:1233−1244)。これらの配糖形態は、オリゴ糖配列、結合特性並
びにオリゴ糖とタンパク質との結合部位の位置及び数などに違いを有している。
構造的な不均一性は生物機能に衝撃を与える可能性があるので、種々の細胞中で
得られる単一糖タンパク質のグリコシル化の多様性は、組換えタンパク質治療薬
製造の重要な一面である(Sasakiら,1987,J.Biol.Chem.26
2:12059−12076;Dubeら,1988,J.Biol.Chem.2
63:17516−17521;Lundら,1993,Human Antib
.Hybridomas,4:20−25;Parekhら,1989,Bioch
em.28:7644−7662;Kagawaら,1988,J.of Biol.
Chem.263:17508−17515;Parekhら,1989,Bio
chem.28:7662−7669;Parek
hら,1989,Biochem.28:7670−7679)。
どの細胞の内部で合成されるかに従って単一タンパク質のグリコシル化パター
ンが変化するだけでなく、個々のグリコシル化イベントはある種の進化的に近縁
の動物種にのみ特有であろう。Galiliら,1987,Immunolog
y 84:1369−1373及びGaliliら,1988,J.Biol.Ch
em.263:17755−17762は、非霊長類の哺乳動物及び新世界の猿
にGalα1−3Galが発生することを同定し、これはヒト及び旧世界の猿に
は存在しなかったグリコシル化パターンであることを確認した。この二糖がヒト
の免疫応答を誘発することからこの構造の欠如が証明された。非定型グリコシル
化パターンに対する免疫応答は、非霊長類ソースに由来するかまたは該ソース中
で製造される糖タンパク質の使用に起因する未解決の抗原性の問題を提示する。
オリゴ糖は、リコシド結合及びオリゴ糖の立体化学にしばしば極めて特異的な
グリコシダーゼによって分解される。遠方に位置する単糖がオリゴ糖の消化に与
える影響の一例は、フコシド蓄積症に罹患したヒト患者に見出される。こ
れらの患者では、エンドグリコシダーゼによる消化に先立ってN−結合オリゴ糖
からフコースを除去するために必要なエキソグリコシダーゼが欠損している。フ
コースはエンドグリコシダーゼの酵素活性を妨害し、未消化のオリゴ糖を尿中に
排泄させる(Kobata 1984,The Biology of Carboh
ydrates,Eds.,Ginsberg and Robbins,Wiley
,NYvol.2,pp.87−162)。タンパク質のグリコシル化の生物学的衝撃
オリゴ糖の正しい合成及び分解が生物に対して重要であることは、糖質構造の
誤ったプロセシングを生じる1つの欠損グリコシダーゼに起因する疾患の存在に
よって証明された。上記に引用した例では、糖タンパク質の誤ったプロセシング
を生じるフコシダーゼの欠如が疾患の原因となっている。他の例としては、主要
なリソソーム性α−マンノシダーゼ活性が顕著に欠損しているヒトα−マンノシ
ド症がある(Gasperiら,1992,J.of Biol.Chem.267:
9706−9712)。異常オリゴ糖構造は癌にも関連を有している(Sanoら
,1992,J.Biol.Chem.267:1522−1527)。
糖タンパク質のオリゴ糖側鎖はこのような細胞プロセスにおいて、ペプチド鎖
をタンパク質分解性攻撃から保護し、細胞表面への分泌を容易にし、生物学的活
性形態のタンパク質のコンホメーションを誘発及び維持し、血漿から糖タンパク
質を除去し、分化及び発達中に抗原決定基として機能すると推定されている。実
際、発達の任意の段階で、細胞は、1つの糖タンパク質を合成するだけでなく1
つのタンパク質の多数の可能形態をコードすることによって、調節された変異と
いう生合成の問題を解決してきたと考えられる。各変異体は異なる共有結合オリ
ゴ糖(配糖形態)を有している。1つのペプチドの多数のグリコシル化部位また
は実際には1つのグリコシル化部位の多数の形態に起因する多様性の範囲は、R
ademacherら,1988,Ann.Rev.Biochem.57:785
−838に組換えタンパク質に関して記載されている。糖タンパク質の特性並び
にその生物学的特性及び機能は結合したオリゴ糖の配列及び構造に従って変化す
るので(Cumming 1991,Glycobiology1:115−13
0)、糖タンパク質構造の分析が組換え医薬用タンパク質のキャラクタリゼーシ
ョンの重要な要件となっている。
製造された医薬グレードの組換えタンパク質の品質管理を容易にするためには
、極めて近縁の構造を識別するためのオリゴ糖の迅速、廉価かつ信頼性の高いキ
ャラクタリゼーションを可能にするような分析方法が必要である(Spellm
an 1990,Anal.Chem.62:1714−1722)。細胞からの産
生レベルを向上させ、治療薬としてのタンパク質の生物機能を最適化するために
、糖タンパク質に対してオリゴ糖を操作及び修飾する方法が望まれている。
糖タンパク質及び糖質一般の合成の指令及び機能の分析を行うため、更に、種
々の生物、器官、細胞並びに単一細胞内で産生されたグリコシル化分子中の微細
な不均一性(microheterogeneity)の原因及び関連を理解するために、オリゴ糖の
配列及び結合を分析する迅速で簡単な方法が有用であろう。糖質構造の分析方法
糖質構造の既存の分析方法は複雑な多段階手順に依存している。これらの手順
としては、質量分析、NMR、高速原子衝撃、複合クロマトグラフィー法(高圧
液体クロマトグラフィー、気相クロマトグラフィー、イオン交換及び逆
相クロマトグラフィー)、複合化学反応系(メチル化分析、過ヨウ素酸塩酸化及び
種々の加水分解反応)などの方法があり、これらはいずれもオリゴ糖の配列及び
それらのグリコシド結合の特徴を決定するために種々の組み合わせで使用されて
いる。各方法は糖質構造に関していくつかの断片的情報を与えるが、各々が欠点
を有している。例えば、高速原子衝撃は(Dell 1987,Advances
in Carbohydrate Chemistry and Biochemi
stry 45:19−73)、大きさ及び配列に関するいくつかのデータを与え
るが、結合位置またはアノマー配置に関する情報を与えない。NMRは糖質を分
析するための最も強力なツールであるが(Vliegenthartら,1983
Advances in Carbohydrate Chemistry 41
:209−375)、比較的感度が鈍く大量の分析液を要する。これらの方法は
、Spellman 1990,Anal.Chem.62:1714−1722;
Leeら,1990,Applied Biochem.and Biotech.2
3:53−80;Geisow 1992,Bio/technology 10
:277−280:Kobata
1984に概説されている。上記手順の多くは高価な装置を必要としており、ま
たそれらの操作にはかなりの技術的熟練及び技術的支援が必要なので、それらの
使用は少数の専門研究機関に限定される。グリコシダーゼを用いる糖質分析
多段階分析の一段階を構成する糖質分析の種々の段階で酵素が使用されている
。これらの酵素は、結合タンパク質のグリカン部分とアミノ酸(普通はアスパラ
ギン)との間を開裂する能力を有するグリコアミダーゼである。エンドグリコシ
ダーゼ及びエキソグリコシダーゼは双方ともヒドロラーゼであり、糖質構造の内
部(エンド)または分子の非還元末端の末端単糖(エキソ)でグリコシド結合を
開裂する能力を有するのでこのように呼ばれているが、これらは極めて重要であ
る。
エンドグリコシダーゼは、ペプチドのアミノ酸結合部位に対して最後から二番
目の単糖の還元末端でオリゴ糖を開裂すると記載されている。各々が異なる基質
特異性を有する5種類のエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼは構造研
究で使用するために十分に精製された(Kobata 1984)。更に、エンド
−α−N−アセチルガラク
トサミニダーゼも単離された(Umemotoら,1977,J.Biol.Che
m.252:8609−8614;Bhavanandanら,1976,Bio
chem.Biophys.Res.Commun.70:738−745)。これ
らのエンドグリコシダーゼの特異性はオリゴ糖構造の分析の強力なツールとなり
得る。現状では、特性決定された市販の酵素の数が少ないのでエンドグリコシダ
ーゼがあまり使用されていない。種々の特異性を有する多数の特性決定されたエ
ンドグリコシダーゼを得ることは糖質の分析に役立つであろう。
エンドグリコシダーゼ消化によってまたは化学的手段によって遊離されたオリ
ゴ糖はエキソグリコシダーゼ消化によって更に特性決定され得る。エキソグリコ
シダーゼは、オリゴ糖類及び多糖類の非還元末端から単糖ユニットを開裂するヒ
ドロラーゼである。エキソグリコシダーゼは種々の末端単糖類及び種々のアノマ
ー形態に対して既知の特異性を有するので、オリゴ糖を配列決定するために使用
されている。ゲル浸透クロマトグラフィーを併用するエキソグリコシダーゼの順
次消化は、Yashitaら,1982によって初めて記載された(Method
s in Enz
ymology 83:105−126)。Edgeら(1992,PNAS 89
:6338−6342)は、多重酵素反応消化物及び酵素消化物系列の分析によ
る配列の分析を記載した。グリコシダーゼを用いたオリゴ糖の配列決定の機能は
、十分に特性決定された基質特異性をもつ酵素の入手可能性によって限定されて
いた。グリコシダーゼ活性の分析に使用できる基質が少ないので単糖間のグリコ
シド結合に関するデータは不完全であった。その結果として、配列分析後にグリ
コシド結合を決定するためにメチル化分析が必要であった。
エキソグリコシダーゼは、細菌、ウイルス、植物及び哺乳類などの多様なソー
スから単離され、シアル酸(αアノマー)、ガラクトース(α及びβ)、N−アセチ
ルグルコサミン(α及びβ)、N−アセチルガラクトサミン(α及びβ)、マンノー
ス(α及びβ)に対して特異性を有している(Sanoら,1992,J.Biol.
Chem.267:1522−1527;Moremenら,1991,J.Bio
l.Chem.266:16876−16885;Camirandら,1991,
J.Biol.Chem.266:15120−15127;Gasperiら,1
992,J.B
iol.Chem.267:9706−9712;Zieglerら,1991,G
lycobiology 1:605−614;Schatzleら,1992,
J.Biol.Chem.267:4000−4007)。
従来技術のグリコシダーゼは多くの実例でこれらの基質特異性によって定義さ
れているが、酵素のキャラクタリゼーションは適当な基質の入手可能性及びアッ
セイの複雑さによって制約を受けている。更に、従来技術の酵素は任意の名称で
呼ばれることが多く、その場合、名称は、証明されていない生物学的活性を示唆
している。従来技術における粗抽出物または精製酵素のキャラクタリゼーション
の制約は、任意の1種類の酵素によってどの基質が開裂されどの基質が開裂され
なかったかを同定する適当なアッセイが存在しないことに起因する。酵素の特性
決定という問題に関連して、夾雑グリコシダーゼ活性の同定に関する問題が発生
する。更に、グリコシダーゼ調製物は一般に他の夾雑グリコシダーゼを含むだけ
でなく、夾雑プロテアーゼも含む。従来技術で引用された酵素の特性決定に関す
る制約及び実質的に純粋なグリコシダーゼ調製物を得ることの難しさが市販のグ
リコシダーゼのリストの貧弱さに反映されて
いる(表1参照)。
従来技術において最も一般的に使用されている基質は、誘導体化された単糖類
(p−ニトロフェニル−単糖または4−メチルウンベリフェリル単糖)である。こ
れらの基質は、グリコシダーゼによって認識される単糖類のいくつかに関する情
報を提供するであろうが、単糖は色素産生マーカーに化学結合しグリコシド結合
を介して第二の単糖に結合しないので、グリコシド結合開裂特異性に関する情報
は得られない。更に、グリコシダーゼの認識部位を特性決定するための誘導体化
された基質の使用には制約がある。単糖誘導体を開裂するグリコシダーゼは、1
つのオリゴ糖の必ずしも同じ単糖を開裂しない。同様に、1つのオリゴ糖を開裂
するグリコシダーゼが、誘導体化された基質を開裂しないこともあり得る(Ga
speriら,1992,J.Biol.Chem.267:9706−9712)。
グリコシダーゼの認識部位及びグリコシド開裂部位を特性決定するための適当
な標識オリゴ糖の一群を開発する体系的な方法が必要である。適当な基質を提供
する以外に、多数の基質に対する1つのグリコシダーゼのスクリーニングまたは
1種類基質に対する多数のグリコシダーゼのスク
リーニングを行うために単一または多重グリコシダーゼ反応の産物を簡単にかつ
迅速に分析する方法が必要である。
現在可用な多くのグリコシダーゼは分析試薬としては重大な問題を有している
(Jacobら,1994,Methods Enzymol.230:280−2
99)。これらの問題としては、
(1)エキソグリコシダーゼ調製物が他の夾雑エキソグリコシダーゼ不純物を含
み、その結果として消化結果が不明瞭になること、及び、
(2)特定のグリコシド結合に対するエキソグリコシダーゼの特異性が欠如して
いること、がある。特性決定されたグリコシダーゼは多数の結合を認識し、いく
つかの結合が他の結合よりも優先的に認識されると考えられている。従って、所
与のグリコシダーゼが優先度を有している1つの結合を同定するのが望ましい。
更に分析試薬としては、種々の特異性を有する入手可能なエキソグリコシダー
ゼの種類は、天然に産する多くの直鎖状または分枝状構造を分析及び識別するた
めに十分ではない。
入手可能なグリコシダーゼに関しては、糖質分析を行う
ための明確で再現的な基質特異性を有する実質的に純粋で高度に特異的な酵素が
不足している。糖質分析に関するこれらの酵素の可用性が不足している原因の少
なくとも一部は、新規なグリコシダーゼを単離しそれらの基質特異性を特性決定
するために可用な方法が欠如していることにある。単糖及びグリコシド結合に対
して明らかな優先性を有する広い範囲のグリコシダーゼが入手可能であるならば
、オリゴ糖を完全に特性決定するために現状では必要とされているメチル化のよ
うな追加分析が不要になり、新規な糖質構造及びそれらの生物学的特性の迅速な
キャラクタリゼーションの強力なツールが提供されるであろう。エキソグリコシダーゼのソース
少数のエキソグリコシダーゼは市販されている(表1参照)。更に、上記のよう
な種々の生物から多数のエキソグリコシダーゼが単離された。配列決定に有用で
あることか分かっているエキソグリコシダーゼの部分的リストは、Linhar
dtら,1992の国際特許出願公告WO/92/02816に提示されている
。エキソグリコシダーゼの追加リストは、Haughland,1993の国際
特許出願公告WO/93/04074に提示されている。グ
リコシダーゼに関する包括的な概説は、Conzelmanら,1987,Adv
ances in Enzymology 60:89;Flowersら,197
9,Advances in Enzymology48:29;Kobata 1
979,Anal.Biochem.100:1−14に提示されている。
現在入手可能なグリコシダーゼは概して天然ソースから単離され製造されてい
るが、Schatzleら,1992,J.Biol.Chem.267:4000
−4007は、Dictyosteliumdiscoideumから単離され
たリソソーム酵素α−マンノシダーゼのクローニング及び配列決定を報告した。
Schatzleらは、酵素の構造的特性を特性決定したが、グリコシド結合に
対する基質特異性は解明されなかった。
上記の理由から、明確な基質特異性を有しており再現的な開裂活性をもつ形態
の精製酵素調製物を与える試薬として適当な実質的に純粋な新規なグリコシダー
ゼが必要とされている。更に、天然に産する多様な糖質構造の分析に適した広汎
な酵素系列を単離及び製造する方法が必要とされている。更に、酵素の基質特異
性を決定するため、糖質構造を配列決定する迅速廉価な方法を提供するため、糖
タンパク質及び糖脂質のような分子の生物学的特性を改変する目的で糖タンパク
質及び糖脂質の糖質部分を修飾するための迅速廉価簡単な糖質分析方法が必要と
されている。迅速
廉価簡単な糖質分析方法が利用できれば、天然に産する多様な糖質構造の分析、
これらの分子の機能の理解、これらの構造の操作による有用な目的の生物学的特
性の修飾、などの機会が数多く提供されるであろう。発明の概要
本発明の目的は、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な新規なグリコ
シダーゼに対する要望を満足させる組成物及び方法を提供することである。
好ましくは本発明は、Xanthomonasから得られる実質的に純粋なグ
リコシダーゼを提供する。1つの形態のグリコシダーゼは、第1の生物からDN
Aを単離し、第2の生物中でDNAから遺伝子ライブラリーを形成し、グリコシ
ダーゼ活性を有する第2の生物の組換えクローンを同定することによってクロー
ニングされる組換えグリコシダーゼである。
好ましくは本発明は更に、GlcNAcβ1−Xに基質特異性を有し、Glc
NAcβ1−Xに対してGalNAcβ1−Xの100倍の特異性を有する実質
的に純粋なグリコシダーゼを提供する。
本発明は更に、Xanthomonasから得られうる
実質的に純粋なガラクトシダーゼ、フコシダーゼまたはマンノシダーゼから成る
組成物を提供する。
本発明は更に、Manα1−3Rグリコシド結合、Manβ1−4Rグリコシ
ド結合またはXylβ1−2Rグリコシド結合に基質特異性を有する実質的に純
粋なグリコシダーゼを提供する。
本発明の目的の1つは、Xanthomonasから誘導された少なくとも1
種類のグリコシダーゼを選択し、糖質の構成単糖間の選択されたグリコシド結合
をグリコシダーゼ消化によって開裂し、修飾された糖質を形成する段階から成る
糖質の修飾方法を提供することである。
本発明はまた、糖質基質中のグリコシド結合を選択的に開裂するために、グリ
コシド結合に基質特異性を有するXanthomonas由来のグリコシダーゼ
を選択し、グリコシダーゼを糖質基質と反応させ、糖質基質を開裂する段階から
成る方法を提供する。
本発明はまた、糖質からGlcNAcβ1−Xを選択的に開裂するために、G
lcNAcβ1−Xに対してGalNAcβ1−Xに対する基質特異性の少なく
とも100倍の基質特異性を有するグリコシダーゼを選択し、グリコシ
ダーゼを糖質と反応させ、GlcNAcβ1−Xを開裂する段階から成る方法を
提供する。
本発明はまた、Manα1−3RまたはManα1−6R結合をManα1−
6RまたはManα1−3Rに比べて少なくとも100倍の優先度で選択的に開
裂し得るグリコシダーゼを選択することによって糖質中のManα1−3Rまた
はManα1−6R結合を開裂する方法を提供する。
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は以下の記載及び添付の請求の
範囲より更に十分に理解されよう。図面の簡単な説明
本発明の上記の特徴は、以下の記載、添付の請求の範囲及び添付図面より更に
十分に理解されよう。
図1は、2つの単糖間に形成されることが可能なグリコシド結合を示す。
図2は、グリコシド活性の存在を判定するためにXanthomonasの粗
抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
図3は、酵素濃度を測定するために倍加系列希釈の精製酵素を用いて行ったα
1−3,6ガラクトシダーゼの基質
(109)に対する力価の測定を示す。
図4は、基質120、95及び113を用いて行ったα1−2フコシダーゼ(I
I)及びα1−3,4フコシダーゼ(I)のキャラクタリゼーションを示す。
図5は、直鎖状βGlcNAc1−Xの選択的開裂をβGalNAc1−Xと
の比較によって証明するために基質118及び167を用いて行ったβ−Glc
NAcアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
図6は、直鎖状及び分枝状の基質を用いて行ったβ−GlcNAcアーゼのキ
ャラクタリゼーションを示す。
図7は、付加的夾雑グリコシダーゼを含む市販のソースに由来のヘキソサミニ
ダーゼとの比較によって行ったXanthomonas由来のβ−GlcNAc
アーゼのキャラクタリゼーションを示す。
図8は、Xanthomonas由来のβ1−3>>4ガラクトシダーゼのキ
ャラクタリゼーションを示しており、Galβ1−4R結合に比較したGalβ
1−3R結合に対する基質優先性が証明され、ニワトリ肝臓及びウシ睾丸から得
られた市販の酵素との違いが示されている。
図9は、α1−3,6ガラクトシダーゼのキャラクタリ
ゼーションを示しており、他のソース(コーヒー豆)から得られたガラクトシダ
ーゼ中に見出されるGalα1−4R結合に対する酵素活性の欠如を示す。
図10は、直鎖状基質に対するα−マンノシダーゼI、II及びIIIの活性のキ
ャラクタリゼーションを示す。
図11は、分枝状基質上に対するα−マンノシダーゼI、II及びIIIの活性の
キャラクタリゼーションを示す。
図12は、Xanthomonas由来のβ−グルコシダーゼのキャラクタリ
ゼーションを示しており、Gluα1−4R、GlcNAcβ1−4R結合に比
較したGluβ1−4R結合に対する基質優先性が証明されている。
図13は、グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Xanthomon
as及びBacillusの粗抽出物をオリゴ糖基質300と共にインキュベー
トした結果を示す。
図14は、グリコシダーゼ活性を測定するために、X.campestris
の粗抽出物をp−ニトロフェニルグリコシド基質と共にインキュベートした結果
を示す。
図15は、グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、X.campest
risの粗抽出物をオリゴ糖基質と共
にインキュベートした結果を示す。
図16は、基質300及び264を用いたXanthomonas由来のβ−
キシロシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
図17は、基質259及び300を用いたXanthomonas由来のβ−
マンノシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。特定実施態様の詳細な説明
本文及び請求の範囲において、グリコシダーゼの「基質特異性」とは、特定の
単糖またはオリゴ糖を認識し、糖質構造中に位置する特有のグリコシド結合を開
裂するグリコシダーゼの能力と定義される。
本文及び請求の範囲において、「グリコシダーゼ」とは、隣合う2つの単糖間
のグリコシド結合の加水分解を触媒し得る酵素と定義される(この場合、単糖類
はオリゴ糖類、多糖類中に存在してもよくまたは糖タンパク質もしくは糖脂質の
ような糖質複合体中に存在してもよい)。
本文及び請求の範囲において、「糖質」とは、オリゴ糖類、多糖類または複合
構造を意味すると定義されており、これらの分子は遊離状態でて存在してもよく
またはタンパ
ク質もしくは脂質のような第2の分子に結合していてもよい。
本文及び請求の範囲において、「オリゴ糖」とは、2個以上からほぼ30個ま
での範囲の単糖から成る鎖長を有する結合単糖系と定義される。
本文及び請求の範囲において、「1−X」は、特定された単糖の炭素1と隣接
の不特定単糖の不特定炭素との間の結合と定義される。
本文及び請求の範囲において、「1−3R」は、特定された単糖の炭素1と隣
接の不特定単糖の炭素3との間の結合と定義される(不特定単糖“R”はオリゴ
糖内に存在する)。炭素3以外の炭素原子に対する他の結合も特定される限り使
用できる。
本文及び請求の範囲において、「生物からの調製物」とは、細胞抽出物または
培地と定義される。
以下の略号を使用した。Glcはグルコース、Galはガラクトース、Fru
はフルクトース、Manはマンノース、GlcNAcはN−アセチルグルコサミ
ン、GalNAcはN−アセチルガラクトサミン、Xylはキシロース、Fuc
はフコース、β−GlcNAcaseはβ−N−ア
セチルグルコサミニダーゼ、β−GalNAcaseはβ−N−アセチルガラク
トサミニダーゼ、β−Glcaseはβ−グルコシダーゼ、Coはクマリン、A
MCは7−アミノメチルクマリン、TLCは薄層クロマトグラフィーである。グリコシド活性アッセイの開発
本発明の好ましい実施態様の1つは、グリコシダーゼ反応の消化産物を迅速、
簡単及び正確に決定する方法である。基質を標識し、グリコシド活性を測定する
ために適当なマーカーを選択した。迅速かつ再現的な分離方法を用いて反応生成
物を検出した。アッセイ方法は十分な感度を有しており、夾雑酵素活性の検出(
図7)、系列希釈による酵素力価の測定(図3)、単一及び多数のグリコシド結合
に対する1種類の酵素の相対的親和性の測定(実施例4、図2、4−11)が可能
であることが判明した。グリコシダーゼ活性のスクリーニングに適した標識基質
グリコシダーゼ活性を測定するためにいくつかの酵素標識方法が存在する。例
えば以下の標識を使用し得る。
(a)色素産生単糖誘導体。グリコシダーゼをスクリーニングする既存の方法で
は単糖類の色素産生誘導体、例えば.
p−ニトロフェニルグリコシドを最も普通に使用する(Advanced En
zymology 60:89;Tronsmoら,1993,Anal.Bio
chem.203:74−79)。色素産生単糖類の開裂は特定単糖に対するグリ
コシダーゼの特異性に関する情報を提供するが、これらの基質は、グリコシド結
合に対する酵素の特異性に関してはほとんど情報を与えない。更に、誘導体化さ
れた単糖類の開裂は隣接の単糖類または他の分枝構造によって酵素活性が受けた
影響に関してはいかなる情報も与えない。その結果として、合成基質に対して活
性のいくつかのグリコシダーゼがオリゴ糖基質に対して不活性なこともあり、ま
たその逆もある(Montreuilら,Carbohydrate Anal
ysis:A Practical Approach,Chaplinら,Ed
s.,ch.5,pg.143)。本発明の実施態様においては、選択された単糖類に
対する新しく単離されたグリコシダーゼの特異性を測定するためにp−ニトロフ
ェニル基質を使用した。
(b)蛍光標識オリゴ糖類。還元性アミン化によってオリゴ糖を蛍光アミンで標識
する方法が可用である。このような蛍光アミンの例としては、7−アミノ−メチ
ルクマリン
(AMC)(Prahashら,1983,Anal.Biochem.128:41
−46)、2−アミノピリジン(Reinholdら,1983,J.Carboh
ydr.Chem 2(1):1−18、p−アミノアセトフェノン、p−アミ
ノ安息香酸エチルエステル及びアニリン(Wangら,1984,Anal.Bio
chem.141:360−361)、並びに、Klock(1993)の国際特許
出願WO93/05076、Haugland(1993)の国際特許出願(WO
93/04077)及びWO93/04074に参照によって含まれる他のアミ
ンがある。
(c)放射性標識オリゴ糖類。複合オリゴ糖の構造決定に使用される種々の分析方
法ではオリゴ糖の還元末端をNaB3H4で化学量論的に放射性標識した(You
ngら,1971,Biochemistry 10:3457;Tyrco 1
981,Anal.Biochem.118:278−283;Wellsら,19
81,Anal.Biochem.110:397−406)。代替方法ではトリチ
ウム標識オリゴ糖類を使用する(Yamashitaら,1980,J.Biol.
Chem.255(12):5635−5642;Fukuda 1985,Bio
chemistry
24:2154−2163)。
本発明の好ましい実施態様においては、オリゴ糖基質の還元末端を標識するた
めに蛍光発色団、7−アミノクマリン(AMC)を使用した。AMC標識の利点は
、高い量子効率及び優良な光安定性、還元末端から除去される2つ以上の単糖類
から成るグリコシド結合の酵素開裂を殆どまたは全く阻害しない、発色団で標識
されたオリゴ糖は薄層クロマトグラムで容易に検出できる、などである。グリコシダーゼの反応生成物の分析
(1種以上の)標識基質をグリコシダーゼと反応させ、反応生成物が得られた場
合には、この反応生成物を適当な分離方法を用いて特性決定した。オリゴ糖と単
糖との分離方法には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、濾紙電気泳動、下降式
濾紙クロマトグラフィー、毛細管電気泳動、TLC及びHPLCがある。標識基
質の特性が分離技術の選択をある程度決定する。例えば、Jackson(Bi
ochem.J.1990,270:705−713)は、フルオロフォア8−アミ
ノナフタレン−1,3,6トリスルホン酸(ANTS)を用いてオリゴ糖及び短い多
糖類の還元末端の共有結合的標識を要する方法を記載した。このフルオロフォ
アは、ラベルによって付与されるイオン電荷が電界中でのオリゴ糖の分離を容易
にするのでポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離に好適であった。この方
法は実際、少量の材料を用いて単一の単糖から26残基のポリマーまでの種々の
大きさの分子を単一ゲル上で解明することが可能であった。残念なことに、基質
の還元末端を比較的大きい荷電マーカーで標識する必要があるため、エキソグリ
コシダーゼ反応が妨害され得る。Linhardt(国際特許出願公告WO92
/02816)は、オリゴ糖を配列決定するためにJacksonの方法と同様
の方法を記載した。この方法では、複合糖質から遊離されたオリゴ糖成分の還元
末端に負の電荷をもつ蛍光基を付加し、次いで、細管式動的篩分け(capillary d
ynamic sieving)電気泳動によってポリアクリルアミドゲル上の種々のオリゴ糖
を分離する必要がある。この方法の修正方法が最近O'Neil(AAAS会議,
1993年8月)及びHiggins(AAAS会議,1993年8月)によって
報告された。上記方法の欠点は手順がコスト高なことである。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の代替方法として、低圧浸透クロマトグラフ
ィーがある。この方法は、試薬系列
分析方法を用いてオリゴ糖を配列決定するためにEdgeら,1992,PNAS
89:6338−6342によって使用された。Edgeらは、放射性オリゴ
糖を種々の組み合わせのエキソグリコシダーゼの混合物と混合し、次いで消化産
物をBio−Gel P4カラムクロマトグラフィーによって分析した。
本発明の好ましい実施態様においては、薄層シリカゲルクロマトグラフィー(
TLC)を、分子量及びヒドロキシル基の数に基づくグリコシダーゼ反応の加水
分解産物の高速分離方法として選択した。この方法は、UV光下で容易に検出で
きる7−アミノメチルクマリン標識した種々の長さのオリゴ糖を分離し得る(実
施例2参照)。
上記方法の感度は実施例において、市販の基質中の夾雑酵素の存在を解明でき
ること(図7)、また、1つのグリコシダーゼが1つのグリコシド結合に対して他
のグリコシド結合に対するよりも高い親和性を有する(図8)と証明できることを
示した。
本発明の方法に対するTLCの重要な利点は、膨大な時間的及び設備的投資を
要せずに(少量の基質を用いて)多数のサンプルをグリコシダーゼ活性に基づいて
速やかにスク
リーニングできることである(図2参照)。25〜30個という多数のサンプルを
標準サイズの1つのシリカゲルTLCプレートに充填し1つのバッチで分析する
ことが可能である。1〜30個の糖質残基から成る大きさのAMC標識オリゴ糖
を最適に分離するために、非修飾オリゴ糖を最適に分離するような極性溶媒系を
本発明によって調合した(表2)。
本発明の方法の1つであるTLCを使用しグリコシド開裂に基づいて迅速、簡
単及び正確に多数のオリゴ糖をスクリーニングする能力は、糖質の配列決定の全
自動化を実現する新規な方法を提供する。
TLC上のクマリン標識基質の分析を利用する全自動化
方法は主として以下の段階から成る。所定のエキソグリコシダーゼ混合物と混合
した標識基質のアリコートから成る一次系列を形成する。この系列は、オリゴ糖
の種類(例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド)を決定するように、
または、結合特異的でないグリコシダーゼを用いてマンノース、ガラクトースな
どの領域に関してオリゴ糖の全体構造を決定するように選択される。反応混合物
のサンプルをTLCプレートに滴下し、(オリゴ糖の大きさに基づいて)種々の溶
媒中で処理する。次に、UV光によって蛍光を検出し、ディジタル化し、記録し
得るように編制したグリッドにTLCプレートを配置する。コンピュータ処理し
たデータベースに記憶されたパターンとグリッドの区画とを比較し、可能なすべ
ての理論的配列を決定し得る。不明確な配列構造は、選択されたグリコシド結合
及び分枝状または直鎖状分子に基質特異性を有するエキソグリコシダーゼを用い
る第2ラウンドのグリコシダーゼ反応で解明する。
この種の全自動化分析方法は多くの利点を有する。即ち、一段階配列決定方法
であること、広い範囲の特性決定されたグリコシダーゼ及び基質を使用できるこ
と、基質の必要
量が少ないこと、などがある。
しかしながら、蛍光マーカーとしてAMC、分離方法としてTLCを選択する
ことは、本発明方法によるグリコシド活性の検定に他のマーカーまたは他の分離
方法を使用することを排除しない。グリコシダーゼのスクリーニング及びキャラクタリゼーション
本発明の特定実施態様は、グリコシダーゼのスクリーニング及び特性決定方法
である。一連のグリコシダーゼを産生する確率の高い生物を選択する。この方法
では、生物の粗調製物からのグリコシダーゼ加水分解産物を、所定の長さ、組成
及び二次構造を有する標識オリゴ糖基質または誘導体化した単糖類を用いて分析
する。次いで、グリコシダーゼを単離し、更に特性決定し、それらの基質特異性
を更に定義する。新規なグリコシダーゼ用生物のスクリーニング
本発明の1つの実施態様は、食物資源として糖質を選択的に利用する生物が新
規なグリコシダーゼのソースを提供するという認識である。この特徴は表3及び
表4に例示されている。これらの表においては、Xanthomona
s及びBacillusの種々の菌株の細胞抽出物を、実施例2に記載のような
クマリン標識オリゴ糖群を基質として用いてスクリーニングした。反応生成物を
TLCによって同定した。細胞抽出物以外に、細胞調製物から収集した培地をグ
リコシダーゼ活性に基づいてスクリーニングしてもよい。
反応基質の薄層クロマトグラフィー後にXanthomonas抽出物から多
数の新規なエキソグリコシダーゼを同定した(図2)。基質群で試験したすべての
Xanthomonas菌株は少なくとも1つのグリコシダーゼ活性を有してい
た。7つの菌株のうちの6つが(86%)、N−アセチルグルコサミニダーゼ、フ
コシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びマンノシダーゼ活性を含むグリコシダーゼ活
性を少なくとも3種類有していた。対照的に、土壌由来のBacillus菌株
のグリコシダーゼ活性を試験すると、9つの菌株のうちの2つだけが少なくとも
1つのグリコシダーゼ活性を有していた。
表3及び表4に関連して、近縁生物または非近縁生物から得られた広範囲の細
胞抽出物、培地または他の調製物を、既知の構造及び配列を有する蛍光標識され
たオリゴ糖群に
対するグリコシダーゼ活性に基づいて体系的にスクリーニングし得るランダムス
クリーニング方法が開発された。
この新規な方法では、近縁生物の種々の菌株中で多重酵素活性が判明した(X
anthomonas)(図2)。これらを生物の1つの菌株、例えばXanth
omonas manihotis中で更に特性決定した。本発明の範囲はXa
nthomonasに限定されるものではなく、Xanthomonasは本発
明の1つの使用例を示すだけである。逆に、本発明は広範囲の生物及び細胞に適
用可能である。グリコシダーゼの産生
本発明のランダムスクリーニング方法によって同定し、次いで単離し、精製し
、選択基質に対して更にスクリーニングしたグリコシダーゼを、酵素の組換え形
態を調製するために、部分または完全タンパク質配列及びDNAコーディング配
列を与えるタンパク質配列決定によって更に特性決定し得る。本発明の1つの実
施態様においては、クローンを同定し単離するために、グリコシダーゼをクロー
ニングし、組換えクローンをスクリーニングする方法が記載されている(実施例
5)。特定のグリコシダーゼを発現する生物
だけが利用し得る特定の食物資源上で組換えライブラリーを増殖させることによ
って組換えクローンの単離効率を更に改良し得る。このようなスクリーニング基
質の実例としてはパントテン酸に結合した二糖(実施例5参照)またはオリゴ糖が
ある。更に、既知のDNA配列を有するクローン化グリコシダーゼの入手が可能
になったので、これらのDNA配列の遺伝子操作を行うことによって改変された
基質特異性を有する突然変異酵素を形成し得る。グリコシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
粗抽出物中の酵素活性の同定に引き続いて、本発明では、(Xanthomo
nas由来のグリコシダーゼについて)実施例3でより十分に記載された当業界
で公知の方法によってグリコシダーゼの単離及び精製を行う。グリコシダーゼの
単離及び精製後、基質特異性によって更に進んだ酵素のキャラクタリゼーション
を行った(図4〜11)。また、表5及び実施例4に記載したように反応の補因子
を決定し最適pHも確認した。
本発明の範囲は後述する基質または酵素に全く限定されない。実際、記載のス
クリーニング方法から得られる新規な酵素は、新規な標識オリゴ糖基質を構築す
る手段を提供し、これらの基質は更に、反復プロセスで生物または細胞の粗抽出
物を分析するために使用され得る。
本発明に従ってXanthomonasから単離し特性決定した新規なグリコ
シダーゼは以下の特徴を有していた。
(a)種々の単糖類に対する選択的基質特異性。本発明のグリコシダーゼは、ピ
ラノース単糖類の立体異性体を識別し得る。特に、本発明のβ−N−アセチルグ
ルコサミニダーゼはβ−N−アセチルグルコサミン(GlcNAcβ1
−X)に対してβ−N−アセチルガラクトサミン(GalNAcβ1−X)に対す
る親和性の少なくとも100倍の選択的親和性を有している。これは、双方の形
態を容易に識別できなかった従来技術のβ−N−アセチルグルコサミニダーゼと
対照的である(図7)。
(b)1つの単糖のアノマー形態を識別する能力。検定した基質群のうちで、1
つのグリコシダーゼは1つの単糖の1つのアノマー形態(αまたはβ)にだけ特異
性を有している。
(c)選択されたグリコシド結合に対する基質特異性。本発明のグリコシダーゼ
は、1つのグリコシド結合(例えば、XanthomonasのFucα1−2
R、Manα1−6R)、または、2つ以上のグリコシド結合(例えば、Xant
homonasのManα1−3RとManα1−6R、またはGalα1−3
RとGalα1−6R、またはFucα1−3RとFucα1−4R)に対して
選択的特異性を示した(図4、9〜11;表6、8)。
いくつかの場合には、1つの結合に対する選択的優先性が確認される。いくつ
かの酵素の場合、複数の結合を開裂することが観察され、1つの結合に対する作
用が第2の結
合に対する作用よりも優先することが確認された(例えば、Xanthomon
asから得られたβ−ガラクトシダーゼは、Galβ1−4Rに比べてGalβ
1−3Rに優先性を有することが定量された(Galβ−3>>4R)(図8)。更
に、本発明のグリコシダーゼのいくつかは、直鎖状系列中の基質を優先的に開裂
し、他のグリコシダーゼはオリゴ糖中の分岐点を開裂し得る(α1−3,4フコシ
ダーゼ、α1−3,6マンノシダーゼ)。本発明のグリコシダーゼは、入手可能な
オリゴ糖モチーフを用いて再現的な開裂プロフィルを提供するが、基質が糖質構
造(単糖類、オリゴ糖もしくは多糖類)またはタンパク質、脂質または立体配置的
に酵素活性に影響を与える合成マーカーと結合しているときは開裂パターンの変
化が生じるであろう。
1つの新規なグリコシダーゼを、予想される全種類の基質に対してスクリーニ
ングすることは可能ではないが、本発明では本発明のグリコシダーゼを特性決定
するために、共通の糖質モチーフを有する選択基質を使用した。しかしながらこ
の分析は、本発明のグリコシダーゼがスクリーニングアッセイに含まれない追加
の基質を認識できるという可能性を排除しない。または、既知の基質がより大き
い分
子の一部分に含まれている場合、同一構造中で分子が遠く隔たっていることに起
因する立体効果のためにグリコシダーゼが既知の基質を認識できないこともあり
得る。
本文中に記載のグリコシダーゼとしては、Fucα1−2R結合を分岐点で開
裂する能力を有するα1−2フコシダーゼがある。分枝状Fucα1−2Rの開
裂は、保存血液の免疫原性を減少させるために有用であり、この基質を選択的に
開裂するα−フコシダーゼが入手可能になれば、血液バンクに保存された血液の
ABO反応性を修飾する方法が得られる。上記のグリコシダーゼのうちで、α1
−3,6ガラクトシダーゼは、ヒト以外の細胞系において作製された組換え糖タ
ンパク質の通常は末端に位置する抗原性Galα1−3R結合を開裂する能力を
有しているので、臨床的に重要である。Galα1−3R結合の除去によって治
療用の組換えタンパク質に対する望ましくない免疫応答が除去されるであろう。
α1−3,6マンノシダーゼ、α1−2,3マンノシダーゼ、α1−3マンノシ
ダーゼ及びα1−6マンノシダーゼの同定は、高マンノース及びハイブリッド構
造中の特異的マンノース結合に結合したアンテナ状分枝を同定し配列決
定する能力を初めて提供し、酵素法で従来可能であったよりも有意に優れた構造
解明を可能にする。グリコシダーゼの用途
本発明の1つの実施態様においては、同定された基質特異性を有する実質的に
純粋な多くの単離グリコシダーゼと迅速で簡単な反応生成物同定アッセイとを組
み合わせることによって以下の目的に適う改良方法が提供される。
(a)天然に遊離状態で産するかまたはタンパク質もしくは脂質から開裂された
糖質構造を配列決定する。
(b)分子が治療用タンパク質を含有する場合にオリゴ糖類の生物学的役割の確
認のためまたは分子の生物学的特性値の変更のために、天然に遊離状態で産する
糖タンパク質、糖脂質または糖質分子のオリゴ糖を修飾する。
(c)カラムクロマトグラフィーを用いるかまたは解糖活性を含む画分の他の分
析手段を用いて、望ましいグリコシダーゼを精製したり、不要な夾雑グリコシダ
ーゼを検出したりする。
(d)製紙産業における植物材料からのセルロース製造のような天然産糖質構造
の分解を要する工程で使用する。
(e)選択されたオリゴ糖リガンドに特異性を有する細胞
上の糖質レセプターを特性決定する。
(f)Varki 1993,Glycobiology 3:97−130に
記載されたような特徴的糖質構造に依存する生物系に対する作用メカニズムを研
究する。引用の文献は参照によって本明細書に含まれるものとする。
上記方法をより容易に実施するためのキットを調製し得る。キットは、天然ソ
ースまたは組換え手段から単離され、糖質の配列決定に適した基質特異性が同定
された実質的に純粋なグリコシド酵素群を含む(組換え形態は、形質転換微生物
の発酵によってまたはトランスジェニック動物及び植物から作製される)。この
ようなキットは、タンパク質、脂質または糖質からオリゴ糖を開裂しかつ還元末
端に蛍光ラベル(クマリン)を付加させる適当な試薬を単独または組み合わせて含
む。
更に、天然ソースからまたは組換え手段によって単離され糖質部分の生物学的
役割の同定または治療用タンパク質を含む高分子の生物学的特性の改変に適した
基質特異性が同定された実質的に純粋なグリコシド酵素群を含むキットを作製し
得る。
更に、酵素の精製中にカラムクロマトグラフィーまたは
解糖活性含有画分の分析を要する他の手段を用いるグリコシダーゼ活性の迅速な
検定に適したクマリン標識基質のような蛍光標識基質群を含むキットを作製し得
る。
天然産または合成の糖質構造の工業規模処理に適した酵素を含むキットを作製
し得る。実施例 実施例1
:酵素アッセイ用基質の調製:
オリゴ糖のAMC−標識
0.25〜1mgのオリゴ糖(Accurate Chemical and
Scientific Corp.,Westbury,NY;Sigma Ch
emical,St.Louis,MO;Pfanstiehl Labs,Wau
kegan,IL;及びV−Labs Inc.,Covington,Laから商
品として得られるか、または、Carbohydrate Analysis:
A Practical Approach(1986)Eds.Chaplin,
M.F.Kennedy,J.F.(IRL Press Limited,Engl
and)pp.150−151から参照によって本明細書に含まれる方法に従って
単離される)。
0.1〜5.0μモルのオリゴ糖を100μlのH2Oに溶解した。糖質水溶液
を、300μlのメタノールと、20mgの(0.11μモル)のAMC(East
man Kodak−Rochester NY)と、35mg(0.55μモル)
のNaCNBH3と、41μlの氷酢酸とを含む溶液に添加した。混合物を、ネ
ジ蓋付き微量遠心管にシールし、乾燥器(dry block)中で80℃で45分間加熱
した。脱イオン水で平衡させたG−25カラム(2×50cm)に反応物を充填し
た。生成物を脱イオン水で溶出させ、1mlの画分を収集した。5μlの画分を
シリカゲル60TLCプレートに慎重に滴下し(バンドを形成するため)、画分の
純度を検定した。実施例2に記載の手順でプレートをTLCによって展開した。
適当な画分をプールし、真空によって約0.1〜1μモル/mlまで濃縮した。
原液を−20℃で保存した。実施例2
:グリコシダーゼ活性に基づく生物のスクリーニング方法 スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
0.1〜0.5gの細胞ペーストを解凍し、3倍容のバッファA″(20mMの
Tris−HCl,pH7.5、50m
MのNaCl、1mMのEDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液を短時間音波処理
し、エッペンドルフ微量遠心管に入れて14,000rpmで4℃で10分間遠
心した。グリコシダーゼ消化反応
1〜5μlの細菌細胞抽出物または細胞増殖培地または部分精製した抽出物を
、50mMのクエン酸ナトリウムバッファ(種々のpH及び補因子、表5参照)中
に1ナノモルのAMC−標識基質を含む10μlの反応混合物に添加した。反応
物を37℃で5分間〜20時間の期間インキュベートした。2〜3μlの反応物
を後述するようなシリカゲルTLCプレートにバンドとして滴下した。37℃、
1時間でオリゴ糖基質から1ナノモルの末端単糖を遊離させるために必要な酵素
の量を酵素1単位と定義した。AMC−標識オリゴ糖の消化産物の薄層クロマトグラフィーによる分析
2〜3μl(=0.25ナノモルの基質)のグリコシダーゼ消化反応物をガラス
裏面をもつシリカゲル60TLCプレート(0.25mm厚、20×20cm)に
緻密なバンド(0.5cm幅のレーン)として滴下した。温風ガン(温度70℃以下
)でバンドを完全に乾燥させた。オリゴ糖の大き
さに基づく種々の割合のイソプロパノール:エタノール:H2O混合物(表1)中
で溶媒前縁が10cm移動するまでTLCプレートを展開させた。手持ち型の3
14nm紫外線ランプでバンドを可視化した。この方法を用いると最も少ない場
合で0.1ナノモルの消化産物を検出できた。
非消化二糖(92b)(Galβ1−4GlcNAc−Co)、四糖(167)(G
alβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)、及び、六糖(
197)(Galβ1−4GlcNAcβ1−6(Galβ1−4GlcNAcβ
1−3)Galβ1−4Glc−Co)から成るマーカーを対照として用いた。非
消化の基質も対照として使用した。
Xanthomonas及びBacillusの種々の細菌株から得られた1
6個の細胞抽出物のスクリーニングの結果を表3及び表4にまとめる。Xant
homonasの全部の抽出物は、試験した14種の基質の少なくとも1つを開
裂し、いくつかの抽出物は10種類もの基質を開裂する多重酵素活性を示した。
図2は、基質113(Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3
Galβ1−4Glc−Co)及び
基質167(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)
に対して試験したXanthomonas菌株に由来の7つの粗抽出物の分析結
果を示す。
実施例3:Xanthomonas manihotisからのグリコシダーゼ の精製方法 Xanthomonas manihotisの発酵
1g/lの酵母エキス、2g/lのトリプトン、6g/lのリン酸ナトリウム
(二塩基性)、3g/lのリン酸カリウム(一塩基性)、0.5g/lのNaCl、
1g/lの塩化アンモニウム、2g/lのグルコース、1mMの塩化カルシウム
、1mMの硫酸マグネシウムから成る培地でXanthomonas mani
hotis菌NEB257株(ATCC#49764)を増殖させた。細胞を30
℃で通気及び撹拌しながら後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心
分離によって採取し−70℃で凍結保存した。粗抽出物の調製
以後のすべての手順を氷上または4℃で行った。上記で得られた254gの細
胞ペーストを2倍容のバッファA(20mMのTris−HCl(pH7.5)、5
0mMのNaCl、0.1mMのEDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液をGaul
inホモジナイザー(M−15モデル)に12,000psiで2回通した。Sh
arples連続遠心機
で溶菌液を1,300gで40分間遠心した。500mlの上清が得られた。グリコシダーゼの精製
疎水性及び電荷に従って酵素を分画する一連の分離方法を利用することによっ
て粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表5に記載の条件を用
い実施例2に記載の方法に従って酵素を検定した。
バッファA(20mMのTris−HCl,pH7.5、50mMのNaCl、
0.1mMのEDTA)で平衡させたDEAE Sepharose CL−6B
カラム(5.0×25cm)に粗抽出物(500ml)を充填した。カラムを2,00
0mlのバッファAで洗浄し、次いで、2,000mlのバッファAと1MのN
aClを含有する2,000mlのバッファAとによって形成されたNaClの
直線勾配で処理した。画分(21ml)を流速3ml/分で収集した。画分のα1
−2フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラムから
0.35−0.5MのNaClに溶出した。α1−2フコシダーゼ活性を含有する
画分をプールし、以下のA項に記載の手順で酵素を更に精製した。DEAE S
epharoseカラムの通過物
を収集し、他のすべてのグリコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。存在する
全部のグリコシダーゼを定量した後で、バッファAで平衡させたHeparin
Sepharose CL−6Bカラム(2.6×35cm)にDEAE通過物
を直ちに導入した。カラムを400mlのバッファAで洗浄し、次いで500m
lのバッファAと0.95MのNaClを含有する500mlのバッファAとに
よって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(12ml)を流速2ml
/分で収集した。画分のβ−GlcNAcアーゼ、α1−6マンノシダーゼ及び
α1−3,6ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。β−GlcNAc
アーゼ及びα1−6マンノシダーゼのピークはカラムから0.3−0.45MのN
aClに同時溶出した。双方の活性を含む画分をプールし(130ml)、酵素を
以下のB項及びC項に記載の手順で更に精製した。α1−3,6ガラクトシダー
ゼ活性のピークはHeparin Sepharoseカラムから0.45−0.
55MのNaClに溶出した。α1−3,6ガラクトシダーゼ活性を含む画分を
プールし、酵素を以下のD項に記載の手順で更に精製した。カラム通過物とHe
parin Sepharoseカラ
ムの洗浄液(350ml)とを収集し、β1−3>>4ガラクトシダーゼ、α1−
2,3マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ及びα1−3,4フコシダーゼ活性を
上記の手順で検定した。カラム洗浄液中に全部の酵素活性が見出された。46.
25gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度1Mまでカラムに添
加した。次いで、バッファB(20mMのTris−HCl,pH7.5、1Mの(
NH4)2SO4、0.1mMのEDTA)で平衡させたPhenyl Sephar
oseカラム(1.6×15cm)に洗浄液を導入した。カラムを60mlのバッ
ファBで洗浄し、次いで、120mlのバッファBと0.001Mだけの(NH4)2
SO4を含有する120mlのバッファBとによって形成された硫酸アンモニウ
ムの漸減直線勾配で処理した。画分(4ml)を流速2ml/分で収集した。画分
のβ1−3>>4ガラクトシダーゼ、α1−2,3マンノシダーゼ及びβ−グル
コシダーゼ活性を上記の手順で検定した。β1−3>>4ガラクトシダーゼ及び
α1−2,3マンノシダーゼ活性のピークはカラムから0.6−0.35Mの(NH4
)2SO4に同時溶出した。双方の活性を含有する画分をプールし、以下のE項及
びF項に記載の手順で酵素
を更に精製した。β−グルコシダーゼ活性のピークはカラムから0.25−0.0
01の(NH4)2SO4に溶出した。β−グルコシダーゼ活性を含有する画分をプ
ールし、以下のG項に記載の手順で酵素を更に精製した。カラム通過物とPhe
nyl Sepharoseカラムの洗浄液とを収集し、α1−3,4フコシダ
ーゼ活性を上記の手順で検定した。洗浄液はα1−3,4フコシダーゼのピーク
を含むことが判明した。この酵素を以下のH項に記載の手順で更に精製した。
A.α1−2フコシダーゼ
α1−2フコシダーゼ活性を含有する上記のDEAE Sepharoseプ
ール(300ml)に、40gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃
度1Mまで添加した。次いで、バッファBで平衡させたPhenyl Seph
aroseカラム(1.6×15cm)にプールを導入した。カラムを60mlの
バッファBで洗浄し、次いで、120mlのバッファBと0.001Mだけの(N
H4)2SO4を含有する120mlのバッファBとによって形成された硫酸アンモ
ニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(4ml)を流速2ml/分で収集した。
画分のα1−2
フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.
001Mの(NH4)2SO4で溶出させた。バッファC(20mMの酢酸ナトリウム
H5.2、0.1mMのEDTA)に一夜透析後、プールした酵素を、バッファC
で平衡させたS−Sepharose(1.0×10cm)カラムに充填した。カ
ラムを20mlのバッファCで洗浄した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、酵
素活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム洗浄液中で検出され
た。バッファAに一夜透析後、洗浄液を、バッファAで平衡させたMono Q
HR5/5(1ml)カラムに充填した。カラムを2mlのバッファAで洗浄し
、次いで、40mlのバッファAと0.6MのNaClを含有する40mlのバ
ッファAとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1.5ml
)を流速1ml/分で収集し、α1−2フコシダーゼ活性を検定した。酵素活性
のピークをプールし、カラムから0.05−0.15MのNaClに溶出させた。
バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4
℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量1,500単位の実質的に純粋な酵素が
得られた。
B.β−N−アセチルグルコサミニダーゼ
β−N−アセチルグルコサミニダーゼとα1−6マンノシダーゼの双方の活性
を含む上記の酵素プール(130ml)をバッファAに一夜透析した。透析後、酵
素プールを、バッファAで平衡させたQ−Sepharoseカラム(1.6×1
5cm)に導入した。カラムを60mlのバッファAで洗浄し、次いで、120
mlのバッファAと1MのNaClを含有する120mlのバッファAとによっ
て形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(4ml)を流速2ml/分で
収集した。カラム通過物を収集し、β−GlcNAcアーゼ及びα1−6マンノ
シダーゼ活性を上記の手順で検定した。Q−Sepharoseカラム通過物中
でα1−6マンノシダーゼ活性だけが検出された。この酵素を以下のC項に記載
の手順で更に精製した。Q−Sepharoseカラムから得られた画分のβG
lcNAcアーゼ活性を上記の手順で検定した。β−N−アセチルグルコサミニ
ダーゼ活性のピークをプールし、カラムから0.15−0.3MのNaClに溶出
させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたHe
parin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラム
を6mlのバッファAで洗浄し、次いで、45mlのバッファAと0.6MのN
aClを含有する45mlのバッファAとによって形成されたNaClの直線勾
配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、βGlcNAcア
ーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから0
.25−0.3MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウム
アジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に収
量30,000単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
C.α1−6マンノシダーゼ
上記のB項に記載のQ−Sepharose通過物を、バッファD(20mM
のリン酸カリウムpH6.0、10mMのNaCl、0.1mMのEDTA)に一
夜透析した。透析後、通過物を、バッファDで平衡させたS−Sepharos
eカラム(1.6×12cm)に導入した。カラムを40mlのバッファDで洗浄
し、次いで、80mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する80mlの
バッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(2.5m
l)を流速2ml/分で収集し、α1−6マ
ンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.
15−0.3MのNaClに溶出させた。バッファE(20mMのTris−HC
l,pH7.5、10mMのNaCl,.0.1mMのEDTA)に一夜透析後、酵
素プールを、バッファEで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに
導入した。カラムを6mlのバッファEで洗浄し、次いで、45mlのバッファ
Eと0.6MのNaClを含有する45mlのバッファEとによって形成された
NaClの直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、
α1−6マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプー
ルし、0.15−0.2MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナ
トリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。上記プロトコ
ルを用いて収量200,000単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
D.α1−3,6ガラクトシダーゼ
α1−3,6ガラクトシダーゼを含有する上記のHeparinプールをバッ
ファDに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファDで平衡させたS−S
epharoseカラム(1.6×12cm)に導入した。カラムを40
mlのバッファDで洗浄し、次いで、80mlのバッファDと0.6MのNaC
lを含有する80mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で
処理した。画分(3ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,6ガラクトシダ
ーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.25−0.
35MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッ
ファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラム
を6mlのバッファAで洗浄し、次いで、45mlのバッファAと1MのNaC
lを含有する45mlのバッファAとによって形成されたNaClの直線勾配で
処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,6ガラクトシ
ダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素ピークをプールし、0.15−0.25
MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.
02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量67,
500単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
E.β1−3>>4ガラクトシダーゼ
β1−3>>4ガラクトシダーゼ及びα1−2,3マン
ノシダーゼの双方の活性を含有する上記のPhenyl Sepharoseプ
ールをバッファDに一夜透析した。透析後、プールを、バッファDで平衡させた
S−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを20m
lのバッファDで洗浄し、次いで、50mlのバッファDと0.6MのNaCl
を含有する50mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処
理した。カラム通過物を収集し、β1−3>>4ガラクトシダーゼ及びα1−2
,3マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。S−Sepharoseカラ
ム通過物中でα1−2,3マンノシダーゼ活性だけが検出された。
この酵素を以下のF項に記載の手順で更に精製した。画分(2ml)を流速1m
l/分で収集し、β1−3>>4ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した
。酵素活性のピークをプールし、0.15−0.25MのNaClに溶出させた。
バッファDに一夜透析後、酵素プールを、バッファDで平衡させたMono S
HR5/5(1ml)カラムに導入した。カラムを2mlのバッファDで洗浄し
、次いで、25mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する25mlのバ
ッファDとによって形成されたNaClの直線
勾配で処理した。画分(1ml)を流速1ml/分で収集し、β1−3>>4ガラ
クトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.
0−0.1MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを
バッファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カ
ラムを6mlのバッファAで洗浄し、次いで、45mlのバッファAと0.6M
のNaClを含有する45mlのバッファAとによって形成されたNaClの直
線勾配で処理した。カラム通過物を収集し、β1−3>>4ガラクトシダーゼ活
性を検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中に検出された。通過物を次に
バッファAに一夜透析した。ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を
4℃で保存した。実質的に純粋な酵素の収量は45,000単位であった。
F.α1−2,3マンノシダーゼ
α1−2,3マンノシダーゼ活性を含有する上記のS−Sepharoseカ
ラム通過物をバッファEに一夜透析した。透析後、通過物を、バッファEで平衡
させたQ−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラム通
過物を収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性
を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中で検出された。通
過物を次に、バッファEで平衡させたHeparin Sepharose C
L−6Bカラム(1.0×10cm)に導入した。通過物を収集し、検定すると、
酵素活性のピークを含むことが判明した。通過物を次に、バッファEで平衡させ
たMono Q HR10/10(8ml)カラムに充填した。カラム通過物と洗
浄液とを収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。M
ono Qカラム洗浄液が酵素活性のピークを含むことが判明した。4.36g
の硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら洗浄液に最終濃度1Mまで添加した
。洗浄液を、バッファBで平衡させたPhenyl Sepharoseカラム
(1.0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファBで洗浄し、次い
で、1Mから0.001Mまで漸減する硫酸アンモニウムを含有する50mlの
バッファBによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画
分(2ml)を流速2ml/分で収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を上記
の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.55−0.3Mの(NH4)2
SO4に溶出させた。バッファDに一夜透析
後、酵素プールを、バッファDで平衡させたPoly−Cat A(3ml)カラ
ムに導入した。通過物を収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を検定した。
カラム通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。4.62gの硫酸アン
モニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度1Mまで通過物に添加した。通過物を
次に、バッファBで平衡させたPhenyl Superose HR10/1
0(8ml)カラムに導入した。カラムを20mlのバッファBで洗浄し、次いで
、50mlのバッファDと0.001Mだけの(NH4)2SO41Mを含有する50
mlのバッファBとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理
した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−2,3マンノシダーゼ
活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、0.65−0.5Mの(NH4)2S
O4に溶出させた。バッファEに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで
添加し、酵素を4℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量4,000単位が
得られた。
G.β−グルコシダーゼ
β−グルコシダーゼ活性を含有する上記のPhenyl Sepharose
プールをバッファDに一夜透析した。
透析後、プールを、バッファDで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.
0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファDで洗浄し、次いで、
50mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する50mlのバッファDと
によって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1ml)を流速1ml
/分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピ
ークをプールし、0.1−0.1MのNaClに溶出させた。バッファDに一夜透
析後、酵素プールをMono S HR5/5(1ml)カラムに導入した。カラ
ムを2mlのバッファDで洗浄し、次いで、20mlのバッファDと0.6Mの
NaClを含有する20mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線
勾配で処理した。画分(1ml)を流速1ml/分で収集し、β−グルコシダーゼ
活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.05−0.1M
のNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッファA
で平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラム通過物
及び洗浄液を収集し、βグルコシダーゼ活性を上記の手順で検定し、洗浄液が酵
素活性のピークを含むことを検出した。
洗浄液をバッファAに一夜透析した。ナトリウムアジドを0.02%まで添加し
、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に500単位の収量が得られた。
H.α1−3,4フコシダーゼ
α1−3,4フコシダーゼ活性を含有する上記のPhenyl Sephar
ose洗浄液をバッファCに透析した。透析後の洗浄液を、バッファCで平衡さ
せたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを2
0mlのバッファCで洗浄し、次いで、50mlのバッファCと0.6MのNa
Clを含有する50mlのバッファCとによって形成されたNaClの直線勾配
で処理した。画分(2ml)を流速2ml/分で収集し、α1−3,4フコシダー
ゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.15−0.2
5MのNaClに溶出させた。バッファCに一夜透析後、酵素プールを、バッフ
ァCで平衡させたMono S HR5/5(1ml)カラムに導入した。カラム
を2mlのバッファCで洗浄し、次いで、35mlのバッファCと0.6MのN
aClを含有する35mlのバッファCとによって形成されたNaClの直線勾
配で処理した。画分(1ml)を流速1ml/分で
収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピ
ークをプールし、0.25−0.35MのNaClに溶出させた。バッファAに一
夜透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたHeparin−TSK(3
ml)カラムに導入した。カラム通過物を収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性
を上記の手順で検定した。通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。1
.19gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度1.5Mの(NH4)2
SO4となるまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファF(20mMcのT
ris−HCl,pH7.5、1.5Mの硫酸アンモニウム、0.1mMのEDTA
)で平衡させたPhenyl Superose HR10/10(8ml)カラ
ムに導入した。カラムを20mlのバッファFで洗浄し、次いで、50mlのバ
ッファFと0.002Mだけの(NH4)2SO4を含有する50mlのバッファFと
によって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(1.5m
l)を流速1ml/分で収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性を上記の手順で検
定した。酵素活性のピークをプールし、0.6−0.5Mの(NH4)2SO4に溶出
させた。バッファAに一夜透析後、
ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の
精製後に60,000単位の収量が得られた。α1−3,6マンノシダーゼの精製
上記で得られた280gの細胞抽出物を3倍容のバッファA′(20mMのT
ris−HCl,pH7.5、50mMのNaCl、1mMのEDTA)に懸濁さ
せた。細胞懸濁液をGaulinホモジナイザー(M−15モデル)に12,00
0psigで2回通した。溶菌液をSharples連続遠心機で13,000
gで40分間遠心した。700mlの上清が得られた。
粗抽出物(700ml)を、バッファA′で平衡させたDEAE Sephar
ose CL−6Bカラム(5.0×26cm)に充填した。カラムを2,500m
lのバッファAで洗浄し、次いで、2,000mlのバッファA′と1MのNa
Clを含有する2,000mlのバッファA′とによって形成されたNaClの
直線勾配で処理した。画分(21ml)を流速3ml/分で収集し、α1−3,6
マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラムから0
.15〜0.25MのNaClに溶出した。酵素
活性を含有する画分をプールし、バッファA′に一夜透析した。透析後、酵素プ
ールを、バッファA′で平衡させたHeparin Sepharose CL
−6Bカラム(2.6×25cm)に導入した。カラムを300mlのバッファA
′で洗浄し、次いで、250mlのバッファA″と0.95MのNaClを含有
する250mlのバッファA′とによって形成されたNaClの直線勾配で処理
した。画分(6ml)を流速2ml/分で収集し、α1−3,6マンノシダーゼ活
性を検定した。酵素活性のピークは0.4−0.6MのNaClに同時溶出した。
活性を含む画分をプールし、バッファA(20mMのTris−HCl(pH7.
5)、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA)に一夜透析した。透析後、酵
素プールを、バッファE(20mMのTris−HCl,pH7.5、10mMの
NaCl、0.1mMのEDTA)で平衡させたQ−Sepharoseカラム(
1.0×10.0cm)に導入した。カラムを20mlのバッファEで洗浄し、次
いで、60mlのバッファEと0.6MのNaClを含有する60mlのバッフ
ァEとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(2ml)を流速
2ml/分で収集し、α1−3,6マンノシダー
ゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.15−0.2
5MのNaClに希釈した。バッファEに一夜透析後、酵素プールを、バッファ
Eで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラムを6
mlのバッファEで洗浄し、次いで45mlのバッファEと0.6MのNaCl
を含有する45mlのバッファEとによって形成されたNaClの直線勾配で処
理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,6マンノシダー
ゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.1−0.2M
のNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.0
2%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に、1,000単位
の実質的に純粋な酵素が得られた。
実施例4:グリコシダーゼの特性決定
A.フコシダーゼ
α1−3,4フコシダーゼ(I)及びα1−2フコシダーゼ(II)に対する反応条
件を最適にした。50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中の1.0ナノモルの
基質を酵素で消化した(2単位のα−フコシダーゼII(図4、レーン2)、100
単位のα−フコシダーゼI(図4、レーン3)、2単位のα−フコシダーゼI(図
4、レーン5、6、9、10)、20単位のα−フコシダーゼII(図4、レーン7
、11)、及び、2単位のβ−ガラクトシダーゼ(図4、レーン6、10)(ウシ睾
丸、BMB))。(1単位は、37℃、1時間でオリゴ糖から1ナノモルの末端糖
を遊離するために必要な酵素の量と定義される)。補因子は全く不要であること
が判明した。インキュベーションを37℃で4時間及び24時間行った。4時間
後、Xanthomonas manihotisのフコシダーゼによる基質の
消化が完了していた。活性の弱いβ−ガラクトシダーゼによる消化が完了できる
ようにインキュベーションを24時間まで延長した。
図4は、Xanthomonas manihotis
から単離されたα−フコシダーゼI及びIIの基質特異性を示す。これらの2つの
酵素は選択されたグリコシド結合に対して異なる特異性を有している。クマリン
標識オリゴ糖基質の開裂及び薄層クロマトグラフィーによる反応生成物の分離に
よって証明されるように(レーン3、5、9)、α−フコシダーゼIはFucα1
−3R及びFucα1−4R結合を選択的に開裂し、α−フコシダーゼIIはFu
cα1−2R結合を選択的に開裂する。α−フコシダーゼIIは、TLC上のバン
ドが1つの単糖の喪失に対応するより高い位置に泳動したことによって証明され
るように、三糖の末端α1−2結合を開裂したが(レーン2)、分枝状のFucα
1−3RまたはFucα1−4R結合を認識しなかった(レーン7、11)。α−
フコシダーゼIIと対照的にα−フコシダーゼIは、Fucα1−2R結合を消化
することができなかった。
α1−3,4フコシダーゼIがフコースを除去したが末端ガラクトースを除去
しなかったことを確認するために、基質をα−フコシダーゼI及び0.5単位の
ウシ睾丸β−ガラクトシダーゼ(BMB)によって消化して、末端β−ガラクトー
ス及びフコースの双方を基質から除去した。図4
において、レーン6及び10は、α−フコシダーゼI及びβ−ガラクトシダーゼ
による処理後に第二の単糖(末端ガラクトース)が除去されたことを示し、レーン
5及び9はα−フコシダーゼI消化後に1つの単糖だけが除去されたことを示す
。
3種類の基質、120:Fucα1−2Galβ1−4Glc−Co;95:
Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−
Co;及び113:Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Ga
lβ1−4Glc−Coを用いて基質特異性を証明した。非消化基質を対照とし
た(レーン1、4、8)。
B.β−N−アセチルグルコサミニダーゼ
Xanthomonas manihotisから上記のごとく精製した10単
位のβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(β−GlcNAcase)は、50m
Mのクエン酸ナトリウムpH4.5中で補因子の非存在下に0.5〜1ナノモルの
基質と反応することが判明した。pH4〜6のpH範囲で酵素は同様に活性であ
った。インキュベーションを37℃で4時間行った。
図5は、TLCによって分析されたこれらの反応の結果を示す。レーン1及び
3は夫々、非消化の基質118(GlcNAcβ1−4GlcNAcβ1−4G
lcNAc−Co)及び167(Galβ1−3GlcNAcβ1−4Glc−C
o)を示す。レーン2は末端GlcNAcβ1−4R結合が開裂されるという結
果を示す。レーン4は、0.5単位のウシ睾丸β−ガラクトシダーゼを用いた末
端Ga1β1−3Rの開裂を示し、レーン5はβ−ガラクトシダーゼによる開裂
後のβ−N−アセチルグルコサミニダーゼによるGlcNAcβ1−3R結合の
付加的な開裂を示す。
図6は更に、GlcNAcβ1−2R、GlcNAcβ1−3R及びGlcN
Acβ1−6R結合を含む基質を用
いてβ−GlcNAcに対するβ−N−アセチルグルコサミニダーゼの特異性を
試験した結果を示す。GlcNAcβ1−6R結合は分岐点を形成している(2
00:Galβ1−4GlcNAcβ1−2Manα1−6Manβ1−4Gl
cNAc−Co;197:Galβ1−4GlcNAcβ1−6(Galβ1−
4GlcNAcβ1−3)Galβ1−4Glc−Co)。これらの基質は、Xa
nthomonas manihotisのβ−GlcNAcアーゼによる開裂
に先立ったβ−ガラクトシダーゼ(ウシ睾丸)によって開裂される末端Galβ1
−4残基を有している。レーン1及び4は、開裂されない基質200及び197
を夫々示しているが、レーン(m)は大きさのマーカーとして二糖及び四糖を有し
ている。レーン2及び5は夫々、β−ガラクトシダーゼによって消化された基質
200及び197を示し、レーン3及び6は夫々、β−ガラクトシダーゼとβ−
GlcNAcアーゼとによって消化された基質200及び197を示す。
図7は、Xanthomonas manihotisから得られたβ−Gl
cNAcアーゼはβ−N−アセチルガラクトサミン(β−GalNAc)を消化し
ないが、ウシ
腎臓から得られたβ−GlcNAcアーゼはこの基質を消化することを示す。レ
ーン1及び4は夫々、非消化の基質96(GalNAcβ1−3Galα1−4
Galβ1−4Glc−Co)及び205(GalNAcβ1−4Galβ1−4
Glc−Co)を示す。レーン2及び5は夫々、Xanthomonas ma
nihotisのβ−GlcNAcアーゼで消化した基質96及び205を示す
。開裂反応は全く検出されない。しかしながら、ウシ腎臓のβ−GalNAcア
ーゼを用いると(レーン3及び6)、基質96及び205の双方のβ−GalNA
cの開裂が観察される。二糖及び四糖から成るマーカー(m)は、ウシ腎臓のβ−
GalNAcアーゼによって96及び205の1つの単糖が開裂されることを示
している。
結果を表7にまとめる。Xanthomonasのβ−GlcNAcだけはP
NP−GalNAcに対して検出可能な活性を示さなかったが、市販の酵素類は
この基質に対して活性を有していた。
実施例2で定義したように1NEB単位の酵素を37℃で1時間使用してアッ
セイを実施した。
ND=検出不能
10mMのPNP基質、25μlの反応容量を使用し、75μlの0.2Mホ
ウ酸ナトリウムpH9.8で反応を停止させ、得られた吸光度をOD400で測
定した。
*Xanthomonas manihotisから精製した50NEB単位の
酵素をPNPβGalNAcに対して検定した。(一夜インキュベートした場合
であっても、PNP−GalNAcに対する測定可能な活性は検出できなかった
)。
C.マンノシダーゼ直鎖状構造に対する特異性
クマリン標識オリゴ糖を用いXanthomonas manihotisか
ら単離した3種の酵素の基質特異性を試験した。基質を表8に示し、開裂を(+
)によって記録する。この表を導いたTLCデータを図10に示す。TLCに示
されたマーカーは、二糖、四糖及び六糖から成るオリゴ糖混合物である。レーン
1、7及び11は非消化の基質である。
50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0のバッファ中で調製した1ナノモル
の基質を後述の濃度の酵素によって消化させた。α1−3,6マンノシダーゼ(I
)及びα1−2,3マンノシダーゼ(III)の場合には5mMのCa++をインキュベ
ーション混合物に添加した。
レーン2、8及び14は夫々、消化産物が得られた場合の基質134、114
及び200に対するマンノシダーゼIの消化産物を示す。この酵素は、比較的高
い濃度(15単位)の酵素の存在下に長時間(20時間)のインキュベーションを行
っても基質134上の末端Manα1−2R結合を開裂できない。対照的に、こ
の酵素は、基質114の
末端Manα1−2R結合、及び、Galβ1−4GlcNAcβ1−2が除去
された後の基質200の末端Manα1−6R結合を開裂できる。これらの実施
例では、1.5単位という少量の酵素を基質と共に2時間インキュベートしたと
きにも開裂が生じる。
レーン5、10及び16は、α−マンノシダーゼIIの消化産物を示す。この酵
素は、100単位の濃度で20時間インキュベーションを行ったときにもMan
α1−2RまたはManα1−3R結合を開裂しない。対照的に、この酵素は、
Galβ1−4GlcNAcβ1−2の除去後の基質200からManα1−6
R結合を開裂する。
レーン3、4、9及び15は夫々、消化産物が得られた場合のα−マンノシダ
ーゼIIIの消化産物を示す。この酵素は、基質134の末端Manα1−2R結
合、及び、基質114の末端Manα1−3R結合を開裂するが、Galβ1−
4GlcNAcβ1−2の除去後にも基質200を開裂しない。開裂が観察され
る場合には、1.5単位の酵素を基質と共に2時間インキュベートする。活性が
全く観察されない場合には、15単位の酵素を20時間使用した。
上記の開裂活性に従って、α−マンノシダーゼIはα1
−3,6マンノシダーゼと同定され、α−マンノシダーゼIIはα1−6マンノシ
ダーゼと同定され、α−マンノシダーゼIIIはα1−2.3マンノシダーゼと同定
された。
分枝状構造に対する特異性
図11に示すように、基質213及び216に対するα−マンノシダーゼIの
インキュベーション(2時間)は、この酵素が分枝状構造を開裂し得ることを証明
した。レーン2及び8は2個のマンノース残基の除去を示す。インキュベーショ
ンを更に継続(20時間)すると、第2の対の分枝状マンノースが除去された(レ
ーン13、19)。この消化
は部分的であり、その理由は還元末端の隣接標識マンノースの負の作用にあると
考えられるが、天然産オリゴ糖基質の第2の分枝が開裂されていたと考えること
もできる。
α−マンノシダーゼIIのインキュベーション(2時間及び20時間)は基質21
3及び216の開裂の証拠を示さなかった。(レーン6、11、17及び23)。
他の理論で解釈できる可能性も否定はしないが、α−マンノシダーゼII(α1−
6マンノシダーゼ)は直鎖状分子を開裂し得るが分枝状分子を開裂できないと推
測される。この酵素の使用は、分枝状及び直鎖状のManα1−6Rグリコシド
結合を識別する手段を提供し得る。
α−マンノシダーゼIIIと基質213及び基質216とのインキュベーション(
2時間及び20時間)の結果は(レーン4、9、15及び21)、基質が部分開裂
されて216から1つのマンノースが除去されたことを示し、これはManα1
−2R及びManα1−3Rに対する酵素の特異性と一致する。結果は、この酵
素が分枝状基質よりも直鎖状基質に対してより大きい親和性を有することを示す
。α−マンノシダーゼIIの存在下で、基質213ではいくつかの付加的開裂が観
察されたが、基質216では観察されな
かった。
D.α1−3,6ガラクトシダーゼ
図9に示すように、α1−3,6ガラクトシダーゼはGalα1−3R及びG
alα1−6R結合(レーン3、6及び9)を優先的に開裂する。5mMのCaC
l2を補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中の1ナノモルの基質に
10単位の酵素を添加し37℃で2時間インキュベートしたときに、基質109
(Galα1−3Galβ1−3GlcNAc−Co)から1つの単糖が遊離した
ことがレーン3に示されており、また、基質181(Galα1−6Glcα1
−2Fru−Co)から単糖開裂産物が得られたことが示されている。対照的に
、酵素の量を10単位に比べて100単位に増加しインキュベーション時間を2
時間に比べて20時間に延長したときであっても酵素が基質193(Galα1
−4Galβ1−43Gal−Co)を開裂しないことがレーン5に示されてい
る。これらの結果は、コーヒー豆(BMB)に由来の市販のα−ガラクトシダーゼ
と対照的である。コーヒー豆のα−ガラクトシダーゼはレーン6に示すように基
質193のGalα1−4R結合を容易に開裂する。対照レーン1、4及び7
は酵素非添加の非消化基質を示す。マーカーは二糖、四糖及び六糖を含む。
E.β1−3>>4ガラクトシダーゼ
図8に示すように、β1−3>>4ガラクトシダーゼはGalβ1−3R結合
を優先的に開裂する。レーン2は、50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5中
の1ナノモルの基質に1単位の酵素を添加し37℃で2時間インキュベートした
ときに基質167(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc
−Co)から少なくとも1つの単糖が遊離されることを示す。対照的に、酵素の
濃度を1単位に比べて100単位に増加したときに酵素が基質202(Galβ
1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)を部分的にしか開裂
しないことがレーン6に示されている。これらの結果は、ニワトリ肝臓(cl)及
びウシ睾丸(bt)に由来の市販のβ−ガラクトシダーゼと対照的であり、これら
の酵素はいずれも基質167及び202を同様に十分に切断する(レーン3、4
、7及び8)。レーン1及び5は酵素非添加の非消化基質対照を示す。
F.β−グルコシダーゼ
図12に示すように、Xanthomonas manihotisに由来の
粗抽出物は少なくともGlcβ1−4R結合に特異性を有することが判明した。
50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5及び5mMのCaCl2中に1ナノモル
の基質を含むインキュベーション混合物中で37℃で2時間の酵素消化を行った
。酵素を種々の濃度で使用した。次いで、反応混合物をTLCプレートに滴下し
た。酵素非添加の基質を陰性対照として添加し、更に、基質とβGlcNAcア
ーゼとから成る陽性対照(レーン7)、及び、基質とβ−ガラクトシダーゼ(ウシ
睾丸)とから成る陽性対照(レーン10)を添加した。レーン2、4、6及び9は
夫々、1単位のβ−ガラクトシダーゼ(β−Glcアーゼ)を179(Glcβ1
−4Glcβ1−4Glc−Co)と混合した場合、5単位のβ−Glcアーゼ
を180(Glcα1−4Glcα1−4Glc−Co)と混合した場合、5単位
のβ−Glcアーゼを118(GlcNAcβ1−4GlcNAcβ1−4Gl
cNAc−Co)と混合した場合、及び、5単位のβ−Glcアーゼを202(G
alβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)と混合した場
合の反応生成物を示す。試験した4
種の基質のうちで末端Glcβ1−4結合を含む基質179だけがβ−Glcア
ーゼによって開裂された。実施例5
:エキソグリコシダーゼ遺伝子のクローニング
天然産グリコシダーゼのソースとしてXanthomonasを用いるエキソ
グリコシダーゼ遺伝子のクローニング方法を記載する。しかしながらこの方法は
、このソースだけでなく、上記の手順で少なくとも1種類のグリコシダーゼを検
出できると判断された任意の生物に応用できる。
A.DNA精製
Xanthomonas manihotisのDNAを作製するために、1
gの細胞ペーストを5mlの0.1MのTris−HCl、0.1MのEDTA,
pH7.6中で30分間穏やかに撹拌することによって再懸濁させた。上清を各
3.0mlの2つのアリコートに分割した。0.1MのTris−HCl、0.1
MのEDTA,pH7.6中の1.7mg/mlのリゾチーム3.5mlを各アリコ
ートに添加し、夫々を37℃で15分間インキュベートした。SDSを1%まで
添加し、プロテイナーゼKを0.13mg/mlまで添加し、次いでアリコート
を37℃で1時間インキュベートした。10%SDSと8%サルコシルとの
溶液0.4mlを各々に添加し、インキュベーションを55℃で2時間継続した
。次いで、2つのアリコートを一緒にし、DNAバッファ(10mMのTris
−HCl、1mMのEDTA,pH8.0)を4回交換しながら24時間透析した
。透析したDNA溶液を次に、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心の準
備として、DNAバッファで総量を40mlに増量し、次いでDNA溶液を各2
0mlの2つのアリコートに分け、各アリコートに20gの塩化セシウムと0.
2mlの5mg/ml臭化エチジウムとを添加した。DNA溶液を44,000
rpmで48時間遠心し、得られたDNAのバンドを注射器及び18ゲージ針で
採取した。氷冷し水で飽和した等容量のN−ブタノールで4回抽出することによ
って臭化エチジウムを除去した。透析によって塩化セシウムを除去した。次に、
NaClを0.5Mまで添加し、上部に0.55倍容のイソプロピルアルコールを
重層させることによってDNAを沈殿させた。沈殿したDNAをガラス棒に巻取
った。2mlの10mMのTris、1mMのEDTA,pH8.0中でDNAを
最終濃度約76μg/mlまで溶解した。
B.部分消化
精製DNAをSau3AIで開裂し部分消化するために、100mMのBis
Trisプロパン−HCl,pH7.0、10mMのMgCl2、100mMの
NaCl、1mMのジチオトレイトールバッファ中で76μg/mlの濃度の1
24μlのDNAを、100μg/mlのBSAによって処理し、、400μl
のアリコートと各200μlの4つのアリコートとに分割した。400μlの管
に2単位のSau3AIを添加して、DNA4.75μgあたり1単位の酵素が
含まれる濃度にした。第1の管から取り出した200μlを第2の管に移して4
.75mgあたり0.5単位のSau3AIが含まれる濃度にし、以後同様にして
、継続する管が直前の管の半量のSau3AIを含むようにした。管を37℃で
15分間インキュベートし、72℃で15分間熱処理し、次いでTris−ホウ
酸塩−EDTAバッファ中の0.7%アガロースゲル中で電気泳動処理した。D
EAEアニオン交換濾紙に2時間電気泳動させることによって約9〜2kbの大
きさを有するDNAフラグメントを収集した。濾紙を0.1MのNaCl、10
mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTAを含む150μlのバッファで
2回洗浄した。次いで、濾紙を1.0
MのNaCl、10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTAを含む75
μlのバッファで4回洗浄することによって濾紙からDNAを溶出させた。得ら
れたDNAフラグメント含有溶液を、300μlのフェノール/クロロホルムで
抽出し、300μlのクロロホルムで抽出し、ドライアイス/エタノール浴に1
5分間入れることによって1mlの無水エタノールで沈殿させた。DNAを14
Krpmで5分間ペレット化した。ペレットを70%エタノールで洗浄し、風乾
し、10mMのTris,pH8及び1mMのEDTAの最終容量10μlに再
懸濁させた。精製フラグメントを以下の段階3に記載の手順で使用した。
C.結合
フラグメント化したDNAを以下の手順でpUC19に結合させた。3μgの
Sau3AIで部分消化したXanthomonas manihotisのD
NA(10μl)を、1.5μgのBamHI開裂し脱リン酸化したpUC19(1
μl)と混合した。4μlの10×結合バッファ(500mMのTris,pH7.
5、100mMのMgCl2、100mMのDTT、5mMのATP)を添加し、
更に25μlの滅菌蒸留水を加えて最終濃度39μlとした。
1μlの濃縮T4DNAリガーゼ(2×106U/ml)を添加し、混合物を37
℃で2時間インキュベートした。Millipore VS 0.025μMフ
ィルターを用いた滴下透析によって10μlの結合混合物を脱イオン化した。次
いで、DNAを大腸菌ED8767に電気穿孔させた。電気穿孔の準備として1
リットルの大腸菌細胞をLブイヨン中でKlett50−80まで増殖させた。
細胞を氷上で15〜30分間冷却し、次いで低温下で4,000rpmで15分
間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水で2回及び10%グリセロールで1回
洗浄した。洗浄したペレットを1〜2mlの10%グリセロール中で最終濃度3
×1010細胞/mlまで再懸濁させた。必要になるまで細胞を100μlのアリ
コートとして−70℃で凍結保存した。準備した細胞にDNAを電気穿孔するた
めに、細胞を静かに解凍し氷に載せた。40μlの細胞を結合及び透析した10
μlのDNAと混合した。混合物を低温の0.2cm電気穿孔キュベットに導入
した。12.5kv/cmの電気パルスを4〜5ミリ秒の時定数でDNA細胞混
合物に印加した。大腸菌を直ちに1mlのLブイヨンで希釈し、37℃で30分
間増殖させ、選択培地を含む150m
mのL寒天プレート上で平板培養した。37℃で一夜インキュベーション後、エ
キソグリコシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
D.エキソグリコシダーゼクローンのスクリーニング
エキソグリコシダーゼ活性を発現するクローンをスクリーニングするために、
異なる3種の色素産生指示基質を使用した。色素産生基質の1つとして、5−ブ
ロモ−4−クロロ−3−インドリル−B−D−ガラクトピラノシド(X−gal)
を使用した。この基質を50μg/mlの濃度で、形質転換細胞を平板培養する
前の選択寒天培地に添加した。X−galを含む寒天プレート上で増殖するβ−
ガラクトシダーゼ発現コロニーは青色を呈するであろう。この手順でスクリーニ
ングした9×104個のコロニーのうちで、1つのコロニーだけが青色を呈した
。また、エキソグリコシダーゼ活性をスクリーニングするための色素産生基質と
して4−メチルウンベリフェリル(4−MU)基質も使用した。これらの基質は、
コロニー形成後に1μg/mlの濃度で選択プレートの表面に噴霧してもよく、
または1.5%寒天に添加しコロニー含有選択プレートに重層させてもよい。噴
霧または重層後に、活性エキソグリコシダ
ーゼを産生するコロニーを、長波紫外光(366nm)でコロニーを観察すること
によって同定した。この実験では、4−MU基質の混合物を1.5%寒天に添加
して重層させた。混合物としては、4−MU−N−アセチル−β−D−グルコサ
ミニド、4−MU−β−D−マンノピラノシド、4−MU−α−D−グルコシド
、4−MU−β−D−グルコシド、4−MU−α−D−ガラクトシドを使用した
。これらの基質の1つを開裂し得る活性β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、
β−マンノシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼまたはα−ガラ
クトシダーゼを産生するコロニーはUV光下で青色の蛍光を発するであろう。こ
れらの基質を用いてスクリーニングした2×104個のコロニーから、8つの蛍
光コロニーを単離した。3つの単離コロニーはα−ガラクトシダーゼを産生し、
2つはβ−グルコシダーゼを産生し、1つはβ−N−アセチルグルコサミニダー
ゼを産生し、残りの2つは、夫々の4−MU基質開裂能力及び夫々のp−ニトロ
フェニル基質開裂能力から判断して検出可能なエキソグリコシダーゼ活性を有し
ていなかった。
エキソグリコシダーゼ活性を発現するが合成基質を開裂
しないクローンをスクリーニングするためには他の方法を使用しなければならな
い。Xanthomonas manihotis由来のα−マンノシダーゼI
またはIIを発現するクローンをスクリーニングするためには、分画平板培養培地
を使用した。使用した培地は、ラクトースを炭素ソースとして利用できない大腸
菌突然変異体(lac-)をスクリーニングするために使用したEMB寒天の変種
である。旧来のEMB寒天はラクトースと2種類の指示色素、エオシンイエロー
及びメチレンブルーを含む。ラクトースを発酵させ得る大腸菌の株(lac+)が
EMB寒天上で増殖するとき、コロニーは暗紫色から黒色を呈する。しかしなが
ら、lac-コロニーは、ラクトースを発酵させることができないので白色であ
る。α−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、培地
1リットルあたり100mgのカルベニシリン、0.4gのエオシンイエロー、
0.065gのメチレンブルー及び1gのα−マンノビオースを含有するM9最
小培地にライブラリー(上記)を約30,000cfu/mlの濃度で平板培養し
た。マンノビオースを宿主によって発酵されるマンノースに開裂するクローン化
α−マンノシダーゼを発現しない大
腸菌は、二糖マンノビオース(マンノースα1−6マンノース)を炭素ソースとし
て利用することができない。プレートを37℃で2〜4日間インキュベートした
。15,000cfuで平板培養したコロニーのうちの11個のコロニーが濃紫
色を呈した。これらのコロニーを採取し、100μg/mlのアンピシリンを含
むLB寒天上に単離コロニーとして画線培養し、37℃で増殖させた。試験した
11個のコロニーのうちで、2つのコロニーからの粗抽出物がα1−3,6マン
ノシダーゼ(ManI)活性を示した。Xanthomonas manihot
isから他のマンノシダーゼ(α1−2,3及びα1−6特異的)を発現するクロ
ーンは単離されなかった。この方法は、合成基質を開裂しない他のエキソグリコ
シダーゼを単離するために使用できる。以下の制約だけがある。(1)エキソグリ
コシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない。
(2)エキソグリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一の炭
素ソースでなければならない、(3)エキソグリコシダーゼを発現する宿主を増殖
させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければならない
。
本発明をいくつかの好ましい実施態様について説明したが、本発明の要旨及び
範囲はこれらの記載に限定されない。例えば、適正に標識された基質に対して細
胞抽出物をスクリーニングするエンドグリコシダーゼの単離は、Xanthom
onasからの一般的なグリコシダーゼ単離方法に包含される。更に、適正に標
識された基質を用いたエンドグリコシダーゼのクローニングは、一般的なグリコ
シダーゼクローニング方法に包含される。実施例6
:酵素アッセイ基質の調製
: オリゴ糖のAMC−標識
基質は、Accurate Chemical and Scientific
Corp.(Westbury,NY),Pfanstiehl Labs(Wauk
ega,IL),V−Labs,Inc.,(Covington,LA)から購入する
か、または、Carbohydrate Analysis:A Practic
al Approach(1986)Eds.Chaplin,M.F.Kenned
y J.F.(IRL Press Limited,England)pp.150−
151)から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離した。調製用シ
リカゲル60プレ
ート(1,000μm厚、20×20cm)はEM Science(Gibbst
own,NJ)から得られた。7−アミノメチルクマリン(AMC)はEastma
n Kodak(Rochester,NY)から得られた。西洋ワサビペルオキシ
ダーゼはSigma Chemical Company(St.Louis,MO)
から購入した。
オリゴ糖(0.1〜5.0μモル)を、100μlのH2Oに溶解した。300μ
lのメタノール、20mgの7−アミノメチルクマリン(AMC)、35mgのN
aCNBH3及び41μlの氷酢酸を含む溶液に糖質水溶液を添加した。混合物
をネジ蓋付き遠心管にシールし、乾燥器に入れて85℃で45分間加熱した。反
応物をH2Oで平衡させたSephadex G−25カラム(2×50cm)に
充填した。生成物をH2Oで溶出させ、1mlの画分を収集した。後述するよう
にTLCによって画分の純度を検定した後で、適当な画分をプールし、0.1〜
1μモル/mlに真空濃縮し、−20℃で保存した。
西洋ワサビペルオキシダーゼから得られたオリゴ糖は、加ヒドラジン分解及び
再アセチル化によってタンパク質から遊離された(A Carbohydrate
Analy
sis:A Practical Approach(1986)Eds.Chap
lin,M.F.Kennedy J.F.(IRL Press Limited,En
gland)、前出)。Sephadex G−25カラム(2.5×3cm)で糖質
を脱塩した後、マイクロタイタープレートフォーマットを用いて修飾された中性
糖(Duboisら,1956,Anal.Chem.,28:350−356)によ
って画分を検定した。要約すると、サンプルをH2Oで最終容量90μlに調整
した。5μlの85%フェノール/H2O(v:v)を添加し、次いで180μl
のH2SO4を速やかに添加した。OD490で吸光度を読み取って糖濃度を測定し
た。種々の濃度のマンノースを使用して標準曲線を作成した。オリゴ糖含有画分
をプールし上記のように標識した。Sephadex G−25クロマトグラフ
ィー処理後、調製用吸収層クロマトグラフィーを用いてサンプルを1,000μ
m厚の20×20cm準備用シリカゲル60プレートに画線培養することによっ
て更に精製した。イソプロパノール:エタノール:H2O(2.3:1.0:0.7
、v:v:v)中で更にクロマトグラフィー処理した後、適当なバンドを切除し
、シリカを粉砕した。50%イソプロパ
ノール:水(v:v)で溶出剤が蛍光を発光しなくなるまでシリカを洗浄すること
によって糖質を溶出させた。溶出剤を0.1μモル/mlに真空濃縮し、−20
℃で保存した。オリゴ糖構造(Kurosaka,J.Biol.Chem.(199
1)266:4168−4172)をエキソグリコシダーゼ消化及びTLC分析に
よって以下のごとく確認した。実施例7
:グリコシダーゼ活性に基づく生物のスクリーニング方法
Fガラス裏面をもたないシリカゲル60のTLCプレートをEM Scien
ce(Gibbstown,NH)から購入した。p−ニトロフェニルグリコピラ
ノシドをSigma Chemical Co.(St.Louis,MO)から購入
した。対照グリコシダーゼは、Boehringer Mannheim(Ind
ianapolis,IN)、Oxford GlycoSystems(Rose
dale,NY)またはSeikagaku(Rockville,MD)から得ら
れた。カラム及びクロマトグラフィー試薬は、Pharmacia(Pisca
taway,NY)またはTosoHaas(Montgomeryville,
PA)から購入した。スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
細胞ペースト(0.1〜0.5g)を解凍し、3倍容のバッファA′(20mMの
Tris−HCl〔pH7.5〕、50mMのNaCl、1mMのNa2EDTA
)に懸濁させた。短時間の音波処理後、細胞懸濁液をエッペンドルフ微量遠心管
で14,000rpmで4℃で10分間遠心した。グリコシダーゼ消化反応
細胞抽出物、細胞増殖培地または部分精製抽出物のグリコシダーゼ活性を、5
0mMのクエン酸ナトリウムpH5.5(種々のpH及び補因子、表5参照)中の
1ナノモルのAMC−標識オリゴ糖を含む10μlの混合物に1〜5μl添加す
ることによって検定した。37℃で5分〜20時間の範囲の期間インキュベーシ
ョン後、反応物を後述するようにTLCによって分析した。β−キシロシダーゼ
活性の最終収量を定量するために、50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5中
のXylβ1−4Xylβ1−4Xylβ1−4Xyl−Coを基質として使用
した。37℃、1時間でオリゴ糖基質から1ナノモルの末端キシロースを遊離す
るために必要な酵素の量を1単位のβ−キシロシダーゼ
と定義する。β−マンノシダーゼ活性の最終収量を定量するために、100μg
/mlのウシ血清アルブミンを補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH5.
5中のManβ1−4Manβ1−4Man−Coを基質として使用した。30
℃、1時間でオリゴ糖基質から1ナノモルの末端マンノースを遊離するために必
要な酵素の量を1単位のβ−マンノシダーゼと定義する。AMC−標識オリゴ糖類の消化産物の薄層クロマトグラフィー(TLC)による 分析
ガラス裏面をもつシリカゲルTLCプレート上に少量のグリコシダーゼ消化反
応物(2〜3μl)を緻密なバンドとして滴下した。バンドを温風ガン(温度70
℃以下)で完全に乾燥した。イソプロパノール:エタノール:H2O(2.5:1.
0:0.5、v:v:v)中で溶媒前縁が10cm移動するまでプレートを展開さ
せた。クロマトグラフィー処理後、原点の近傍に残存するAMC−基質、及び、
移動相と共に上方に泳動した加水分解産物を、314nmのUVランプで可視化
した。非消化の二糖(Galβ1−4GlcNAc−Co)、四糖(Galβ1−
3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)及び六糖(Galβ1
−4GlcNAcβ1−6〔Galβ1−4GlcNAcβ1−3〕Galβ1
−4Glc−Co)のマーカーを対照として用いた。非消化の基質も対照として
用いた。
Xanthomonas及びBacillusの種々の細菌株からのManα
1−6(Manα1−3)(Xylβ1−2)Manβ1−4GlcNAcβ1−4
GlcNAcβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc−Coに対して細胞抽出物
をスクリーニングした結果を図13に示す(表3及び4参照)。Bacillus
菌株からの細胞抽出物は活性がないことを示したが、1つの菌株X.manih
otisからの細胞抽出物はAMC−基質から3つの糖を除去できた。他の2つ
の菌株X.holicola及びX.oryzaeからの細胞抽出物は4つの糖を
除去することが可能であり、これはα−マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ、
及びα−フコシダーゼまたはβ−マンノシダーゼ活性の存在を示唆する。実施例8
:p−ニトロフェニルグリコシド基質を用いる生物のスクリーニング
エキソグリコシダーゼは典型的には、p−ニトロフェニルグリコピラノシドの
ような誘導体化された単糖を基質と
して同定及び精製された(Hayward,A.C.(1977)J.Appl.Bac
teriol.43:407−411)。これらの基質は、特異的単糖をそのアノ
マー性と共に認識し得る酵素の能力に関する情報を与える。しかしながら、単糖
は第2の糖に結合せずむしろ色素産生マーカーに結合するので、酵素の結合特異
性に関する情報は全く得られない。単糖誘導体を開裂し得るグリコシダーゼはし
ばしば、糖残基がオリゴ糖の一部であるときに糖残基を加水分解できない(Ta
lbot,G. & Sygusch,J.(1990)Appl.Environ.Mi
crobiol.56:3505−3510)。
Hayward(前出)によって証明されたように、Xanthomonas
campestris菌株は複数のp−ニトロフェニルグリコピラノシド基質を
開裂するであろう。実施例2のように調製した細胞抽出物(5μl)を、250ナ
ノモルのp−ニトロフェニルβ−D−ガラクトピラノシド、p−ニトロフェニル
α−D−グルコピラノシド、p−ニトロフェニルβ−D−グリコピラノシド、p
−ニトロフェニルβ−D−キシロピラノシドまたはp−ニトロフェニルN−アセ
チル−β−D−グルコサミニドを含む25μ
lの50mMのクエン酸ナトリウムpH5.5と共に37℃で4時間インキュベ
ートした。75μlのホウ酸ナトリウムpH9.8を添加して反応を停止させ、
反応混合物の吸光度を410nmで測定した。X.campestrisの2つ
の菌株NEB420及びNEB497に対するこのスクリーニングアッセイの結
果を図14に示す。双方の菌株が、試験した全部のp−ニトロフェニルグリコピ
ラノシド基質を開裂し、これは、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びβ−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼ活性の存在を示唆する。
しかしながら、実施例2に記載のようにAMC−基質を使用したとき、2つの
菌株の細胞抽出物は図14及び図15に示すようにα−及びβ−グルコシダーゼ
活性だけを示した。50mMのクエン酸ナトリウムpH5.5中に1ナノモルの
AMC−基質を含む10μlの反応混合物に細胞抽出物(5μl)を37℃で4時
間添加し、実施例2に記載の手順でTLCによって分析した。図15は、細胞抽
出物NEB420及びNEB497を、基質202:Galβ1−4GlcNA
cβ1−3Galβ1−4Glc−Co
(夫々レーン2及び3)、167:Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ
1−4Glc−Co(夫々レーン5及び6)、180:Glcα1−4Glcα1
−4Glc−Co(夫々レーン8及び9)、179:Glcβ1−4Glcβ1−
4Glc−Co(夫々レーン11及び12)、及び233:GlcNAcβ1−4
GlcNAcβ1−4GlcNAc−Co(夫々レーン14及び15)に対して試
験した結果を示す。非消化の基質(レーン1、4、7及び10)を対照として用い
た。図15において、レーン8、9、11及び12だけが末端単糖の遊離を示し
た。レーン8及び9は、α−グルコースの除去を示し、レーン11及び12はβ
−グルコースの遊離を示し、これらは、双方の菌株にα−及びβ−グルコシダー
ゼ活性が存在することを示唆する。他の全部のAMC−基質は2つのX.cam
pestris菌株からの細胞抽出物とインキュベートしたときに加水分解耐性
であり、これによって、特定の単糖誘導体について測定したグリコシダーゼ活性
は、この糖残基がオリゴ糖の一部であるときは必ずしも糖残基に対する活性に翻
訳されないことを示す。同様に、オリゴ糖基質を開裂する能力が発見されたグリ
コシダーゼは、誘導体化された単
糖を必ずしも加水分解しない(Sanoら,(1992)J.Biol.Chem.2
67:1522−1527)。実施例9
:Xanthomonas Holcicolaからのグリコシダーゼ の精製方法 Xanthomonas holcicolaの発酵
Xanthomonas holcicola菌NEB121株(ATCC#1
3461)を、10g/lのトリプトン、5g/lの酵母エキス、5g/lのN
aCl及び0.3g/lのNaOHから成る培地中で増殖させた。細胞を通気及
び撹拌を伴って後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心によって採
取し、−70℃で凍結保存した。粗抽出物の調製
以後の手順はすべて氷上または4℃で行った。上記で得られた細胞ペースト(
191g)を2倍容のバッファA(20mMのTris−HCl〔pH7.5〕、
50mMのNaCl、0.1mMのNa2EDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液を
Gaulinホモジナイザー(M−15モデル)に12,000psiで2回通し
た。溶菌液をSharples連続遠心管で1,300gで40分間遠心した。
565
mlの上清が得られた。グリコシダーゼの精製
酵素を疎水性及び電荷に従って分画する一連の分離方法を使用して、粗細胞抽
出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表5に記載の条件を用い実施例7
に記載の方法に従って酵素を検定した。
粗抽出物(565ml)をバッファBで平衡させたDEAE Sepharos
e CL−6Bカラム(5.0×15cm)に充填した。β−キシロシダーゼ及びβ
−マンノシダーゼの双方を含有するカラム通過物を、バッファAで平衡させたH
eparin Sepharose CL−6Bカラム(2.6×15cm)に導入
した。カラムを160mlのバッファAで洗浄し、次いで、400mlのバッフ
ァA中のNaClの直線勾配(0.05−0.95M)によって処理した(流速1m
l/分;8ml画分)。NaCl勾配(0.35−0.6M)で溶出したβ−キシロ
シダーゼを含有する画分をプールし、酵素をA項に記載の手順で更に精製した。
β−マンノシダーゼ活性はヘパリンカラム通過物中に存在し、これをB項に記載
の手順で更に精製した。
A.β−キシロシダーゼ
上記の酵素プールをバッファAに2時間透析し、次いでバッファAで平衡させ
たQ−Sepharoseカラム(1.6×12cm)に導入した。酵素活性を含
有するカラム通過物を、バッファC(20mMのリン酸カリウム〔pH6.0〕、
25mMのNaCl、0.1mMのNa2EDTA)に2時間透析し、バッファC
で平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カ
ラムを20mlのバッファCで洗浄し、次いで、150mlのバッファC中のN
aClの直線勾配(0.025−0.95M)で処理した(流速1ml/分;2ml
の画分)。酵素は0.4−0.55Mに溶出し、プールした画分をバッファAに2
時間透析した。透析後、プールをバッファAで平衡させたHeparin−TS
K(3ml)カラムに充填した。カラムを6mlのバッファAで洗浄し、次いで9
0mlのバッファA中のNaClの直線勾配(0.05−0.95M)で処理した(
流速1ml/分;1ml画分)。酵素活性は0.2−0.3Mに溶出し、プールし
た画分をバッファAに一夜透析した。ナトリウムアジドを0.02%まで添加し
、次いで酵素を4℃で保存した。4,000単位の収量の実質的に純粋な酵素が
得られた。
B.β−マンノシダーゼ
(NH4)2SO4(66g)をカラム通過物(500ml)に最終濃度1Mの(NH4)2
SO4となるまで添加し、バッファB(20mMのTris−HCl〔pH7.5
〕、0.95Mの(NH4)2SO4、0.1mMのNa2EDTA)で平衡させたPh
enyl Sepharoseカラム(1.6×15cm)に導入した。カラムを1
60mlのバッファBで洗浄し、次いで800mlのバッファB中の(NH4)2S
O4の漸減直線勾配(0.095−0.001M)で処理した。酵素が0.9−0.7
Mに溶出し、プールした画分をバッファCに4時間透析した。プールした酵素を
、バッファCで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に
充填した。カラムを20mMのバッファCで洗浄し、次いで150mlのバッフ
ァC中のNaClの直線勾配(0.025−0.95M)で処理した(流速1ml/
分、2ml画分)。プールした酵素をバッファD(20mMのTris−HCl〔
pH7.5〕、25mMのNaCl、0.1mMのNa2EDTA)に4時間透析し
、次いでバッファDで平衡させたMono Q HR5/5(1ml)のカラムに導
入した。活性はカラム通過物中で検出された。0.8gの(N
H4)2SO4を通過物に添加し、次いで、バッファBで平衡させたPhenyl
Superose HR10/10(8ml)カラムに導入した。活性はカラム通
過物中で検出された。0.8gの(NH4)2SO4を最終濃度1.5Mに添加し、次
いで、バッファE(20mMのTris−HCl〔pH7.5〕、2.0Mの(NH4
)2SO4、0.1mMのNa2EDTA)で平衡させたPhenyl Supero
se HR10/10カラムに導入した。カラムを10mlのバッファEで洗浄
し、次いで100mlのバッファE中の(NH4)2SO4の漸減直線勾配(2.0−
0.02M)で処理した(流速1ml/分、1.5ml画分)。酵素活性は1.0−0
.85Mに溶出し、プールした画分をCentriprep濃縮装置(Amico
n,Inc.Beverly,Massachusetts)を用いて1mlに濃縮
した。濃縮した酵素をバッファAに一夜透析した。ナトリウムアジド(0.2%)
及びBSA(0.1mg/ml)を添加し、酵素を4℃で保存した。500単位の
収量の実質的に純粋な酵素が得られた。実施例10
:グリコシダーゼの特性決定
A.β−キシロシダーゼ
図16は、Xanthomonas holcicolaから単離されたβ−
キシロシダーゼが、AMC−基質300:Manα1−6(Manα1−4)(X
y1β1−2)(Manβ1−4GlcNAcβ1−4(Fucα1−3)GlcN
Ac−Co(レーン1−4)、及び、264:Xy1β1−4Xy1β1−4Xy
1β−4−Co(レーン5及び6)を開裂する能力を示す。5mMのCaCl2を
補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中に1ナノモルのAMC−基
質300(レーン3及び4)を含むか、または、50mMのクエン酸ナトリウムp
H4.5中に1ナノモルのAMC−基質264(レーン6)を含む10μlの反応
混合物に5単位のβ−キシロシダーゼを添加した。β1−3キシロシル結合がβ
−キシロシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、X.manih
otisから単離された2単位のα1−2,3マンノシダーゼ(実施例4)を含ん
でいた(レーン2及び4)。非消化の基質を対照として用いた(レーン1及び5)。
二糖191:Galα1−3Gal−Co及び四糖202:Galβ1−4Gl
cNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Coをマーカー(M)として用いた。反
応物を37℃で2時間インキュベー
トし、次いで実施例2に記載の手順でTLCによって分析した。図16に示すよ
うに、β−キシロシダーゼは反応物にα1−2,3マンノシダーゼが含まれてい
るときにのみ(レーン2及び3)AMC−基質300のβ1−2結合を開裂した(
レーン3)。α−マンノシダーゼ非含有でインキュベートしたときは開裂が全く
観察されなかった(レーン4)。β−キシロシダーゼはまたAMC−基質264の
β1−4結合を開裂した。
B.β−マンノシダーゼ
図17は、β−マンノシダーゼがAMC−基質259:Man1−4Man1
−4Man−Co(レーン1及び2)、及び、300:Manα1−6(Manα
1−4)(Xy1β1−2)Manβ1−4GlcNAcβ1−4(Fucα1−
3)GlcNAc−Co(レーン3−8)を開裂する能力を示す。50mMのクエ
ン酸ナトリウムpH5.5中に1ナノモルのAMC−基質259(レーン2)を含
むかまたは5mMのCaCal2を補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH
6.0中に1ナノモルのAMC−基質300(レーン7及び8)を含む10μlの
反応混合物に2.5単位のβ−マンノシダーゼを添加した。β1−4マンノシル
結合がβ−マンノシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、X.m
anihotis(実施例4)から単離された2単位のα1−2,3マンノシダー
ゼ(レーン4−7)、X.holcicola(上記)から単離された2単位のβ−
キシロシダーゼ(レーン5−7)、X.manihotis(実施例4)から単離さ
れた10単位のα1−6マンノシダーゼ(レーン6及び7)を含んでいた。非消化
基質を対照として用いた(レーン1及び3)。二糖191:Gal
α1−3Gal−Co及び四糖202:Galβ1−4GlcNAcβ1−3G
alβ1−4Glc−Coをマーカー(M)として用いた。反応物を30℃で2時
間インキュベートし、次いで実施例2に記載の手順でTLCによって分析した。
図17に示すように、β−マンノシダーゼは、反応物にα1−2,3マンノシダ
ーゼ、β−キシロシダーゼ及びα1−6マンノシダーゼが含まれているときにの
みAMC−基質300のβ1−4結合を開裂した(レーン7)。これらの酵素を伴
わずにインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン8)。β−
マンノシダーゼはまたAMC−基質259のβ1−4結合を開裂した(レーン2)
。実施例11
:Xanthomonas oryzaeからβ−マンノシダーゼ及 びβ−キシロシダーゼを精製する方法 Xanthomonas oryzaeの発酵
Xanthomonas oryzae菌NEB416株をDifco栄養ブ
イヨンで増殖させた。通気及び撹拌を伴って細胞を30℃で後期対数増殖期まで
インキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、−70℃で凍結
保存した。β−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼの精製
100リットルの発酵物から得られた378gのXanthomonas o
ryzae細胞からβ−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを精製した。細
胞を1,144mlのバッファA(20mMのTris,pH7.5、50mMのN
aCl及び1mMのEDTA)に再懸濁させ、Gaulinプレスを通すことに
よって溶解した。Sharples遠心管中の遠心分離によって細胞破片を除去
した。上清をバッファAで平衡させたDEAE−Sepharose FFカラ
ム(5.0×16.0cm)に通した。カラムを1,500mlのバッファAで洗浄
した。DEAEカラムの通過物と洗浄液の最初の500mlとを収集し、バッフ
ァAで平衡させたHeparin Sepharose CL6Bカラム(2.5×
29.0cm)に充填した。Heparin−Sepharoseカラムを750
mlのバッファAで洗浄した。β−マンノシダーゼを精製するために、Hepa
rin−Sepharoseカラムから収集した通過物及び洗浄液(2,300m
l)に1,203gの硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、硫酸アンモニウ
ムの濃度を80%飽和にした。沈殿物を撹拌しながら4℃で一夜インキュベート
した。15,000×gで20分間遠心分離することによって沈殿物を収集した
。ペレットを350mlのバッファAに再懸濁させ、1Mの硫酸アンモニウムを
含有するバッファB(20mMのTris,pH7.5及び1mMのEDTA)に一
夜透析した。透析後に残存する沈殿物を15,000×gで20分間遠心分離す
ることによって完全に除去した。次のカラムがオーバーロードにならないように
、上清(270ml)を2組に分け、以後は等しく処理した。135mlの上清を
、1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBで平衡させたPhenyl−S
epharose 6高速流(low sub)カラム(2.5×29cm)に充填し
た。Phenyl−Sepharoseカラムを、1Mの硫酸アンモニウムを含
有する1,000mlのバッファBで洗浄した。1M−0.05Mの硫酸アンモニ
ウムの漸減直線勾配でカラムからβ−マンノシダーゼを溶出させた。14mlの
画分を流速2ml/分で収集し、活性を検定した。0.6−0.5M硫酸アンモニ
ウムに溶出する活性のピークをプールし、バッファC(20mMのKPO4,pH
6.0、0.1mMのEDTA及
び10mMのNaCl)に透析し、バッファCで平衡させたSP−Sephar
oseカラム(1.5×10cm)に充填した。カラムを80mlのバッファCで
洗浄し、酵素を0.01−0.95MのNaCl直線勾配でカラムから溶出させた
。3mlの画分を流速1ml/分で収集した。0.15〜0.13Mに溶出する活
性のピークをプールし、1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBに4時間
透析した。透析したプールを1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBで平
衡させたPhenyl−Superose HR10/10カラムに充填した。
1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBでカラムを洗浄し、酵素を1M−
0.05Mの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムから溶出させた。1.5m
lの画分を流速1ml/分で収集し、活性を検定した。0.7−0.6Mの硫酸ア
ンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、0.02%のナトリウムアジド
を含有するバッファAに透析し、酵素を4℃で保存した。実質的に純粋なβ−マ
ンノシダーゼの収量は1.2×103単位であった。
実質的に実施例9に記載のプロトコルに従ってXanthomonas or
yzaeからβ−キシロシダーゼを
精製した。実施例7に記載の方法に従って測定した収量は500単位であった。精製したβ−マンノシダーゼの特性決定
Xanthomonas oryzaeから上記の手順で精製した10単位の
β−マンノシダーゼは、50mMのクエン酸ナトリウムバッファpH5.4中で
補因子の非存在下に0.5ナノモルの基質(Manβ1−4Manβ1−4Man
−Coと反応することが判明した。酵素は4.5〜6.0のpH範囲で同様に活性
であった。37℃で1時間インキュベーションを実施した。β−マンノシダーゼ遺伝子のクローニング
1.DNA精製:Xanthomonas oryzaeのDNAを調製するため
に、1gの細胞ペーストを3mlの0.3Mショ糖、25mMのTris(pH8
.0)、25mMのEDTA及び2mg/mlのリゾチームに再懸濁させた。懸濁
液を37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、4mlの2
×Kirbyミックス〔2gのトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウ
ム、12gの2−アミノ−サリチル酸ナトリウム、5mlの2MのTris−H
Cl,pH8、6mlのフェノール(Tr
is,pH8.0で中和)〕を細胞懸濁液に添加し、渦流ミキサーで1分間撹拌し
た。中和フェノールとクロロホルムとの1:1混合物(フェノール/クロロホル
ム)8mlを管に添加し、混合物を15分間撹拌した。細胞溶解液を12,000
×gで10分間遠心処理した。水相を3mlのフェノール/クロロホルムを入れ
た新しい管に移し、渦流ミキサーで15秒間撹拌した。懸濁液を12,000×
gで10分間遠心した。上方の相を新しい管に移し、1/10倍容の3Mの酢酸
ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを管に添加した。管を倒立させて管の
内容物を混合した。DNAの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り
出し、10mlの70%エタノールを入れた管に移した。DNAを一度洗浄し、
5mlのTE(10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTA)に溶解し、
RNアーゼを最終濃度40mg/mlに添加した。DNAを37℃で30分間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、1.5mlのフェノール/クロロホ
ルムを15秒間渦流させることによってDNA溶液と混合した。懸濁液を12,
000×gで10分間遠心し、水相を新しい管に移した。1/10倍容の3Mの
酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノ
ールとを水相に添加した。DNAの凝塊をシールしたパスツールピペットで管か
ら取り出し、10mlの70%エタノールを入れた管に移した。DNAを一度洗
浄し、2mlのTEに溶解させた。
2.部分消化:精製したDNAをSau3AIで開裂して以下のごとく部分消化
した。10mMのBis Tris Propane−HCl,pH7.0、10m
MのMgCl2、100mMのNaCl、1mMのジチオトレイトールバッファ
中に76μg/mlの125μlのDNAを100μg/mlのBSAと共に含
む溶液を、400μlのアリコートと4つの200μlのアリコートとに分割し
た。400μlの管に2単位のSau3AIを添加し、4.75μgのDNAあ
たり1単位の酵素が含まれるようにした。第1の管から200μlを取り出して
第2の管に移し、4.75μgあたり0.5単位のSau3AIが含まれるように
し、以後同様にして、連続する管の各々が直前の管の半量のSau3AIを含む
ようにした。管を37℃で15分間インキュベートし、72℃で15分間熱処理
し、次いで、Tris−Borate−EDTAバッファ中の0.7%アガロー
スゲルで電気泳動にかけた。DEAEアニオン交
換濾紙に2時間電気泳動させることによって約9〔2kb範囲の大きさのDNA
フラグメントを収集した。0.1MのNaCl、10mMのTris,pH8.0
及び1mMのEDTAを含む150μlのバッファ中で濾紙を2回洗浄した。次
いで、1.0MのNaCl、10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDT
Aを含む75μlのバッファ中で濾紙を4回洗浄することによって濾紙からDN
Aを溶出させた。得られたDNAフラグメント含有溶液を300μlのフェノー
ル/クロロホルムで抽出し、次いで300μlのクロロホルムで抽出し、ドライ
アイス/エタノール浴に15分間入れることによって1mlの無水エタノールで
沈殿させた。DNAを14Krpmで5分間ペレット化した。ペレットを70%
エタノールで洗浄し、風乾し、最終容量10μlの10mMのTris,pH8
及び1mMのEDTAに再懸濁させた。精製したフラグメントを以下の段階3で
使用した。
3.結合:フラグメント化したDNAを以下の手順でpUC19に結合した。S
au3AIで部分消化した3μgのXanthomonas oryzae DN
A(10μl)を、1.5μgのBamHI開裂し脱リン酸化したpUC
19(1μl)と混合した。4μlの10×結合ミックス(500mMのTris,
pH7.5、100mMのMgCl2、100mMのDTT、5mMのATP)を
添加し、更に25μlの滅菌蒸留水を添加して最終容量を39μlとした。1μ
lの濃縮T4DNAリガーゼ(2×106U/ml)を添加し、混合物を37℃で
2時間インキュベートした。10μlの結合物をMillipore VS 0.
025μMフィルターを用いて滴下透析することによって脱イオン化した。次に
、DNAを大腸菌ED8767に電気穿孔した。電気穿孔の準備として1リット
ルの大腸菌細胞をLブイヨン中でKlett50−80まで増殖させた。細胞を
氷上で15〜30分間冷却し、次いで低温下で4,000rpmで15分間ペレ
ット化した。ペレットを氷冷滅菌水中で2回及び10%グリセロール中で1回洗
浄した。洗浄したペレットを1〜2mlの10%グリセロールに最終細胞濃度3
×1010細胞/mlに再懸濁させた。必要になるまで細胞を100μlのアリコ
ートにして−70℃で凍結した。準備した細胞にDNAを電気穿孔するために、
細胞を静かに解凍し、氷に載せた。40μlの細胞と10μlの結合及び透析し
たDNAとを混合した。混合物を低
温の0.2cmの電気穿孔キュベットに入れた。時定数4〜5ミリ秒で12.5k
V/cmの電気パルスをDNA細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに1mlの
Lブイヨンに希釈し、37℃で30分間増殖させ、選択培地を含む150mmの
L寒天プレートで平板培養した。37℃で一夜インキュベーション後、β−マン
ノシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
4.β−マンノシダーゼクローンのスクリーニング。パラ−ニトロフェニル糖の
ような合成基質を開裂し得るβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリー
ニングするために、先ず、色素産生基質4−メチルウンベリフェリル(4−MU)
β−D−マンノピラノシドを試験した。この基質を1.5%寒天に添加し、コロ
ニーを含む選択プレートに重層した。重層後、長波紫外光(366nm)でコロニ
ーを観察することによって活性β−マンノシダーゼを産生するコロニーを同定し
得る。この実験では2×104コロニーをこの基質を用いてスクリーニングした
が、蛍光コロニーは単離されなかった。この方法でクローンが全く単離されなか
ったので、他の方法を使用しなければならなかった。X.oryzaeのβ−マ
ンノシダーゼを発現するクロー
ンをスクリーニングするために、分画平板培養培地を使用した。使用した培地は
ラクトースを利用できない炭素ソースとして大腸菌突然変異体(lac-)をスク
リーニングするために使用したEMB寒天の変種である。旧来のEMB寒天はラ
クトースと2種類の指示色素、エオシンイエロー及びメチレンブルーを含む。ラ
クトースを発酵させ得る大腸菌の菌株(lac+)をEMB寒天で増殖させたとき
に、コロニーは暗紫色から黒色を呈するが、lac-大腸菌コロニーはラクトー
ス発酵能力がないので白色である。β−マンノシダーゼを発現するクローンをス
クリーニングするために、ライブラリー(上記)を100mgのカルベニシリン、
0.4gのエオシンイエロー、0.065gのメチレンブルー及び1gのα−マン
ノビオースを培地1リットルあたりに含むM9最小培地に約30,000cfu
/mlの濃度で平板培養した。二糖マンノビオース(マンノースβ−1−4マン
ノース)は、マンノビオースを宿主によって発酵させられるマンノースに開裂す
るクローン化したβ−マンノシダーゼを発現しなければ大腸菌によって炭素ソー
スとして利用されない。プレートを37℃で7日間インキュベートした。15,
000cfuの平板培養コロニーのう
ちの2つのコロニーが、暗赤色を呈した。これらのコロニーを採取し、100μ
g/mlのアンピシリンを含有するLB寒天上で単離コロニーとして画線培養し
、37℃で増殖させた。単離コロニーをアンピシリン含有の5mlのLBに採取
し、37℃で6時間増殖させた。2つの試験コロニーのうちで、一方からの粗抽
出物はβ−マンノシダーゼ活性を示した。アンピシリン含有LBに採取し37℃
で18時間増殖させた単離コロニーから調製した粗抽出物はβ−マンノシダーゼ
活性を全く示さなかった。この方法は、合成基質を開裂しないかまたは大腸菌中
で不安定な他のグリコシダーゼ(Xanthomonas manihotisか
らのエキソ−α1−6マンノシダーゼ及びエキソ−α1−2,3−マンノシダー
ゼ)を単離するために使用された。以下の制約だけが存在する。(1)エキソ−グ
リコシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない
。(2)エキソ−グリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一
の炭素ソースでなければならない。(3)エキソ−グリコシダーゼを発現する宿主
を増殖させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければな
らない。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C12R 1:19)
(C12N 9/24
C12R 1:64)
(C12N 1/21
C12R 1:19)
(72)発明者 ランドリー,デイビツド
アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・
01929、エセツクス、ストーリー・アベニ
ユー・73
(72)発明者 テロン,クリストフアー・ヘンリー
アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・
01945、マーブルヘツド、ワシントン・ス
トリート・192
(72)発明者 ギユアン,チユウデイ
アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・
01984、ウエンハム、グレート・ポンド・
ロード・10
(72)発明者 ロビンズ,フイリツプス・ウエズリイ
アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・
01915、ビバリー、ブラツケケンベリイ・
レーン・17